BE562963A - - Google Patents

Description

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   La présente invention est relatuve à des procé- dés très avantageux de production de 1-déhydrostéroides de la série du prégnadiène. Ces dérivés sont des compo- sés connus, qui sont physiologiquement actifs ou sont uti- lisables dans la préparation de stéroides physiologique- ment actifs par des procédés connus dans la technique. 



   Il a été constaté que des stéroides hydroxylés de la série du 3-céto-¯4-prégnène (spécialement les ¯4-prégnène-3,20-diones) peuvent être transformés en dé- rivés correspondants de ¯1,4-prégnadiène, en soumettant les premiers à l'action d'enzymes d'une nouvelle espèce de bactérie, ci-après dénommée "Bacterium cyclo-oxydans". 



  L'action des enzymes peut être utilisée soit en mettant en présence, au sein d'un milieu nutritif aqueux, le sté- roide, de l'oxygène et des enzymes ou des cellules non   proliférantes   de Bacterium   cyclo-oxydans,     soit,,,(de   préfé- rence) en incorporant le stéroïde dans une culture aérée de Bacterium   cyclo-oxydans.   



   La nouvelle espèce de bactérie, Bacterium cyclo- oxydans, suivant la présente invention a été déposée dans la collection dite "American Type Culture Collection", à Washington, D.C.   EtatsÚnis   d'Amérique, où elle a reçu le numéro d'identification :   12.6?3   etoù elle est à la disposition du public.

   Comparé aux bactéries classifiées connues, le Bacterium   cyclo-oxydans   ressemble le plus au Bacterium   zenkeri,   dont il se différencie par les points suivants : 

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 Bacterium cyc10oxydans Bacterium zenkeri - ne se présente pas en - se présente en chaînes chaînes - liquéfie la gélatine - ne liquéfie pas la géla- tine - tournesol réduit et lait- pas de changement dans du protéolysé lait tournesolé - croissance limitée gris- - bonne croissance blanche jaunâtre'sur pomme de sur pomme de terre terre - croissance mince gris- - bonne croissance blanche bleuâtre sur milieux in- sur milieux inclinés de clinés de gélose gélose. 



   Le Bacterium cyclo-oxydans peut en outre être caractérisé par les propriétés résumées dans le tableau suivant : - Bâtonnets - 0,5 à 0,8 sur 1,0 à 2,0 microns, ne se présentant pas.en chaînes, formés après deux jours d'incu- bation sur un milieu incliné de gélose nutritive; mobiles; à gram positif ou à gram variable ; non résistants aux acides ; nonsporulants.    



  Culture sur pomme de terre- croissance bonne lisse, luisante translucide et blanche.   



   . Gélose ou agar de Bennett- croissance abondante, lisse, lui- (extrait de levure, 1 g.; ex- sante, plane, opaque et blanche; trait de boeuf, 1 g.; NZ Ami- petites colonies individuelles à ne A, 2 g.; glucose, 10 g.; bords arborescents. gelose, 15 g.; eau distillée, 
1 litre ; pH : 7,3). 



  - Gélose nutritive (extrait de - bonne croissance lisse, plane; boeuf, 3 g.; peptone, 5 g.; translucide et blanche; traînée 
NaC1. 8 g.; gelose, 15 g.; filiforme. eau distillée, 1 litre; pH : 
7,3) 
Bouillon nutritif (extrait de - pas de croissance en surface; pe- boeuf, 3 g.; peptone, 5 g.; tite quantité de sédiment blanc eau distillée, 1 litre, pH : compact ; milieu légèrement trou- 
6,8) ble. 



   . Gélose de Gould (glucose, 10 g - culture abondante, luisante,lisse extrait de levure,2,5 g.; plane, translucide et blanche; 
K2HP04, 1 g.;   gelose,   20 g.; traînée filiforme. eau distillée, 1 litre). 



  - Lait au tournesol - pas de changement après 1 heure   @   à 25  C ; après plusieurs semaines tournesol réduit et protéolyse. 

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   Gélatine - partiellement liquéfiée après 1 semaine à 25  C; totalement li- quéfiée après 2 semaines. 



    -   Amidon - pas d'hydrolyse. 



    -   Bonne croissance sur agar ou gélose de Gould à 25  C, 30  C et 
37  C..... 



    @   Pas de décomposition de la tyrosine. 



  - Pas de-réduction des nitrates. 



  - Pas de production d'hydrogène sulfuré. 



    -   Pas de production d'indol. 



  - Pas de formation d'acide ou de production de gaz à partir des sucres ordinaires et des alcools de sucres (tels que glucose, lactose, sucrose, maltose et mannitol). 



   En général, les conditions de culture du Bacte- rium   cyclo-oxydans   pour les besoins de la présente inven- tion, sont (sauf pour l'incorporation du stéroïde à   déshy   drogéner) les mêmes que les conditions de   culture   de bac- téries pour la production d'antibiotiques ou de vitamines, par exemple la bacitracine ou la vitamine B12; ainsi, on fait pousser le Bacterium cyclo-oxydans au contact (dans ou sur) un milieu nutritif approprié en présence d'oxygène (air). Un milieu nutritif approprié comprend essentiellement une source de facteurs azotés et une sour-' ce assimilable de carbone et d'énergie. Cette dernière peut être un hydrate de carbone (tel que sucrose, mélasses glucose, maltose, amidon ou dextrine) et/ou le stéroide lui-même.

   Cependant, le milieu contient, de préférence, une source assimilable de carbone et d'énergie, en plus du stéroïde. 



   La source de facteurs azotés peut être organi- que (par exemple, farine de graines de soja, liqueur de macération de mais, extrait de viande, solubles de distil- lateur, peptone et/ou extrait de levure) ou synthétique (par exemple constituée de composés inorganiques ou   organi-   ques simples--et--synthétisables, comme les sels d'ammonium, 

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 les nitrates de métaux alcalins, les   amino-acides   ou   l'urée).   



   Parmi les stéroides hydroxylés de la série du 
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 3-céto-,'-prégnène, qui peuvent être convertis en décri- vés   1-déshygrogénés   par le procédé suivant l'invention, on peut citer les monohydroxyprogestérones (telles que la 
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 11 o( -hydroxyprogestérone, les 9 0{ .- et 12 0{ .halo-11 3 - hydroxyprogestérones, la désoxycorticostérone et la 21- fluoro-17 Ó   -hydroxyprogestérone);

     les   dihydroxyprogesté-   rones (telles que la corticostérone, les 9 Ó- et 12   o( -     halocorticostérones,   le composé S de Reichstein, la 11 ss, 17 Ó- dihydroxyprogestérone, la cortisone, les   9 -   et 
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 12 0( .. halocortisones, la l-fluoro-ll f3.

   ' 17 tu - dindro- xyprogestérone et la 9,21-difluoro-11 fi', 17 q - dihydro- xyprogestérone), les trihydroxyprogestérones (telles que l'hydrocortisone, la ,"'-prégnëne-.11 c{ , 17 c( , 21-triol-   3,20-dione   et les 9 Ó et 12   o(-halohydrocortisones),   et les tétrahydroxyprogestérones (telles que la 9 Ó-fluoro- 
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 l6 d-hydroxyhydrocortisone, ainsi que les dérivés esté- rifiés en 21 de ces stéroides contenant un groupe 21-hy- droxyle (tels que l'acétate du composé S, le 21-acétate 
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 d'hydrocortisone, le 21-acétate de 9 q f1uorohydrocorti- sone et le 21-acétate'de 9 c( -ï'luorocortisone).

   Les 21- esters préférés sont ceux d'acides carboxyliques d'hydro- carbures contenant moins de 10 atomes de carbone, tels que les acides aliphatiques inférieurs (comme les acides acé- tique et propionique), les acides carboxyliques aryliques monocycliques (comme les acides benzoique et Ó   -toluique)   les acides alcanoiques inférieurs aryliques monocycliques (comme les   acides phénacétique     et /   -phénylpropionique), les acides carboxyliques de cycloalcanes et de cycloalcè- nes. 



   Les exemples suivants illustrent l'invention 

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 (toutes les températures étant indiquées en degrés Centi- grade) : 
EXEMPLE 1 
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 L le4 - prégnadiène-.11 d -ol-3,20-dione. 



  (a) Fermentation 
Une culture en surface de Bacterium cyclo-oxy- dans   A.T.C.C.   n  12. 673 vieille de trois jours sur un mi- lieu incliné de gélose (extrait de boeuf, 1,5 g :   de levure, 3 g; peptone, 6 g ; 1 g; gélose, 20 g;   eau distillée, 1 litre) est mise en suspension dans 5 ml. d'une solution saline physiologique stérile. Des frac- tions de 1 ml de la suspension sont utilisées pour inocu- ler quatre fractions de 50 ml. du milieu suivant contenu dans des flacons coniques d'une capacité de 250 ml : glucose 20 g. peptone 5 g. tryptone 5   g.   extrait de levure 5 g. 



   CaC03 0,25 % 
Eau distillée H.s. pour 1 litre 
Iles flacons inoculés sont incubés à 25 , en les soumettant à une agitation par rotation à raison de 280 cycles par minute dans un rayon d'environ 2 pouces. Après 19 heures, un transfert de 6 % (vol./vol.) est fait à 1950 ml du milieu suivant contenu dans trente neuf flacons coniques de 250 ml : extrait de levure 1,0 g. glucose 1,0 g. 



   KH2P04 1,0 g. 



   Eaù distillée q.s. pour 1 litre pH réglé à'7,0 à l'aide de NaOH à 10% traitement en autoclave à 120  C pendant 20 minutes 
L'incubation est poursuivie de la manière dé- 

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 crite plus haut pendant 24 heures, après quoi une partie aliquote d'une solution de 488 mg de 11 Ó -hydroxyproges- térone dans 19,5 ml de méthanol absolu est ajoutée en fractions de 0,5 ml au contenu de chacun des flacons. 



  Trois heures après l'addition du stéroide, les contenus des flacons ont été réunis, le pH est ramené de 6,7 à en- viron 3 à l'aide d'acide sulfurique 12 N et tout le bouil- lon est chauffé dans de la vapeur en circulation pendant 15 minutes et filtré à chaud sur un filtre clarificateur   Seitz.   Les flacons, le filtre et les cellules sont lavés avec 4 fractions de 50 ml d'eau chaude. Le volume total de filtrat et de liqueurs de lavage est d'environ 1900 ml L'analyse chromatographique sur papier révèle que le sub- strat a été complètement utilisé et que deux produits ma- jeurs ont été formés. 
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  (b) Isolement de la ,'s' prégnadiëne-11 c(-ol-3)20-dione et de la 134-prégnadiène-11 20 -diol-3-one : 
Le filtrat et les liqueurs de lavage combinés (environ 1900 ml) sont extraits avec quatre fractions de 600 ml de chloroforme et le chloroforme est évaporé jus- qu'à siccité. Le résidu (environ 540 mg) contient, comme le révèle le chromatogramme sur papier,   des   quantités sen- 
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 siblement équivalentes de Lil,4...prégnadiène-ll c( -ol-3,20- dione et d'une fraction plus polaire. Par cristallisation fractionnée dans de l'acétone, on obtient deux composés purs.

   Le composé moins polaire est la Ó 1,4-prégnadiène- 11 Ó   -ol-3,20-dione   et, après nouvelle cristallisation dans de l'éthanol à 95 %, ce composé a les propriétés sui- vantes : P.F. environ 228- 230 ; Ó 23   +   93    (0,43   
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 dans CHC13 ) ; .t 1'\ µµj  : 2@6 mu ( 1- = 16.100); à 1 '294 , e 5189 6,05 t ' 6119 / 6,$ ja.. 

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 EMI7.1 
 . Analyse : calculé pour CZlHZ8D3 (1' .M:..328,4l.),: .C -= 76 379 ; H = 8J59 %. Trouvé : C = 77,05 jÉ; 'H = 8>,.36 fa-. 



  La substance plus polaire, identifiée comme étant de la ,1-prégnadiér.e-1T c(v ^diQl-3-one, a les propriétés suivantes après.recristallisation dans 
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 1'acétone : P.F. : environ 227 - 229.. id ¯7 É + 410 (De52 dans CHCL 3 À S 24.7'' ( - 1$;400')., . 



  Analyse : calculé pour 0 2lH300 '(P'Y" 3'p,.,6') : C = 76,32 l H = 9,15 % Truvê : =..b'7. H = ,6ë %' EXEMPLE 2 
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 ,1-.prégnadiène-11 , 17 q 21-triol-3,20-dione (a) Fermentation 
En suivant le mode opératoire de la   partie .(a)   de l'exemple   1,   mis en remplaçant la 11 Ó -hydroxyproges- térone par l'hydrocortisone, on obtient un filtrat conte- nant de la   1-déhydrohydrocortisone,.   
 EMI7.4 
 



  (b) Isolement de la llL,4-:prégnadiène-ll /3 ' 17 d , 21- triol-3,20-dione. 



   Le filtrat .et les liqueurs de lavage combinés (environ 2 litres provenant d'un  .milieu   de fermentation auquel on a ajouté   450.mg.   d'hydrocortisone) sont extraits à l'aide de quatre fractions de   500   ml de chloroforme. Les extraits   chloroformiques   combinés sont évaporés jusqu'à siccité sous vide et le résidu est lavé avec de l'hexane et recristallisé dans de   l'éthanol   à 95   %) en   sorte qu'on obtient un produit cristallin pur identique à de la ¯1,4 
 EMI7.5 
 prégnadiène-11 / , -17 c( , 2î-triol=3y20-dione (prednisolo- ne) authentique. 



   EXEMPLE 3 
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 9 c( 1-4 -pregnadiène-11 , T7 c( , 21-triol- 3,20-dione. 

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  (a) Fermentation 
En suivant le mode opératoire de   la   partie (a)   de   l'exemple 1, mais en remplaçant la 11 Ó -hydroxyprogesté- rone par de la 9 Ó -fluoro-hydrocortisone,.on obtient un filtrat contenant de la 9   c(     -fluoro-1-déshydrohydrocorti-   sone. 
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  (b) Isolement de la 9 o( -fluoro-\. -prégnadiène-11 , 
17 d ,   21-triol-3,20-dione.   



   Le filtrat contenant les liqueurs de lavage (en- viron 2 litres) est extrait avec quatre fractions de 500 ml de méthyl isobutylcétone et les extrait combinés sont évaporés jusqu'à siccité sous vide. Le résidu est lavé avec du chloroforme. Par recristallisation du résidu dans du méthanol, on obtient de la 9   0( -fluoro-   ¯ 1,4- prégnadiène-11 ss, 17 o( ,   21-triol-3,20-dione,   identique à un échantillon authentique. 



    EXEMPLE /,.    
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  1''-prégnad3ène-17 c( , 21-diol-3,20-dione. 



   En remplaçant la 11 Ó -hydroxyprogestérone par le composé S de Reichstein (¯4-prégnène-17   o( ,   21-diol- 3,20-dione) dans le mode opératoire de l'exemple 1, on 
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 obtient de la 1'-prégnadiène-17 c( , 21-diol-3,20-dione, identique à un échantillon authentique.'   EXEMPLE 5    
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 ,1''-prégnadiène-17 4 ,21-diol-3,11,20-trione. 



   En suivant le mode opératoire de l'exemple 2, mais en remplaçant l'hydrocortisone par de la cortisone, on ob- 
 EMI8.5 
 tient de la /'\ 134-prégnadiène-17 c( ,21-diol-3,.1,20-trzo-   he,identique'à   un échantillon authentique   de prednisone.   



   -EXEMPLE 6 
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 21-acétate de 1$4, -prégnadiène-1 ,17 1,21-trio 3,20 dione. 

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   En suivant le mode opératoire de l'exemple 2, mais en remplaçant l'hydrocortisone par de l'acétate d'hy- drocortisone, on obtient du 21-acétate de ¯1,4-prégna- 
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 diène-11 /j , 17 ca( , 21-tr.ol.3,?0-dione,idn'cique à un échantillon authentique. 



   De même, on peut utiliser le Bacterium cyclo- oxydants pour convertir d'autres stéroides hydroxylés de la 
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 série du 3-céto- '.prêgnêne et, en particulier, de la sé- rie des progestérones hydroxylées, en leurs dérivés de 
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 1-déhydrogénés (tels que les 1-déhydroprogestéi-ones hydro- xylées). 



   L'invention peut être mise en oeuvre de diverses manières sans sortir du cadre des revendications suivan- tes. 



    REVENDICATIONS.   



  1. Procédé pour préparer un stéroide hydroxylé de 
 EMI9.4 
 la série du 3"céto-L11,4""prégnadièna, dans lequel on soumet un stérolde hydroxylé de la série du 3-céto-z" L pré-

Claims (1)

1. gnêne à l'action d'enzymes de Bacterium cyclo-oxydans, en présence d'oxygène, et on récupère le stéroide déhydro- géné résultant, 2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le stéroïde est une progestérone hydroxylée.

   3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel EMI9.5 le stéroide est de la 11 c( -hydroxyprogestéronew 4. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le stéroide est de lthydrocortisone.

   5. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le stéroide est de la 9 o(-fluorohydrocortisone.

   6. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le stéroïde est le composé S de Reichstein.

   7. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le stéroide est de la cortisone. <Desc/Clms Page number 10>

   8. Procédé, en substance, tel que décrit plus haut.

   9. Stéroides hydroxylés de la série du 3-céto- ¯1,4-prégnadiène, préparés par le procédé suivant l'une ou l'autre des revendications précédentes.