Page 16, ligne 8, il faut lire "hydrolyse" au lieu de "convertit"
Page 16, lignes ll à 14, il faut lire "l'hydrolysat ait une valeur de 17. E.D. environ, exprimée en le pouvoir réducteur des matières sèches dis- soutes dans la liqueur selon la méthode de Fehling modifiée.." au lieu de "la liqueur de conversion ait une valeur de 17 E.D environ, c'e s t - à- dire la valeur réductrice des solides dissous dans la liqueur selon l'essai bien connu de Fehling.."
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Page 17, ligne 3, il faut lire "charbon actif." au lieu de "carbone," Page 17, lignes 21 et ZZ, il faut lire "usuels d'hydrolyse acide enun seul stade et.. Il au lieu de "usuels de conversion acide avec un seul stade de conversion acide et..
Il Page 19, lignes 6 et 7, il faut lire "jusqu'à' ce qu'un dosage des sucres réducteurs indique une valeur E.D. d'environ.. Il au lieu de "jusqu'à une valeur E.D. à l'essai des réducteurs d'environ.." Page 19, ligne 11, il faut Lire "à 45 C", au lieu de "de 45 C".
Page Z 0, ligne 1, ilfaut lire "tels que le dextrose au cours de l'hydra- lyse.." au lieu de "comme le dextrose dans l'hydrolyse.." Page 20 lignes 6 et 7, il faut lire "ne provoque le clivage que de motifs de dextrose) hydrolyse complètement cette.." au lieu.de "ne provoque que le clivage des motifs de dextrose) hydrolyse complètement de cette.. "
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La présente invention se rapporte à des procédés nouveaux de purification d'une préparation enzymique contenant de l'amylo- glucosidase et d'hydrolyse de l'amidon au moyen d'enzymes avec obtention d'un hydrolysat contenant plus de dextrose que dans les procédés antérieurs.
La présente invention se propose principalement de four- nir un procédé de traitement de préparation contenant une enzyme du type des amyloglucosidases de manière à obtenir l'amylolu- cosidase pure et un procédé perfectionné de production du dex-
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trose, ou de sirops en contenant, par hydrolyse en ymique de l'amidon, ou de produits amylacés, au moyen de préparations con- tenant de l'amyloglucosidase.
Les améliorations principales qui en résultent sont l'obtention d'hydrolysats contenant sensiole- ment moins de composants ou d'impuretés indésirables qui compli- quent le raffinage et qu'on trouve dans les hydrolysats d'ami- don obtenus par les procedés antérieurs enzymiques et, dans les hydrolyses prolongées, des rendements potentiels plus élevés et des rendements réels plus élevés en dextrose quand on procède au raffinage,,à la concentration et à la cristallisation des hy- drolysats, puis à la séparation du dextrose cristallisé des liqueurs-mères, que dans le cas des hydrolysats obtenus par les procédés antérieurs.
Ainsi, l'invention se propose plus spécia- lement de fournir un procédé industriel de production de dextro-, se cristallisé par hydrolyse enzymique, donnant des rendements plus élevés en sucre que les procédés antérieurs.
D'autres buts apparaîtront dans la suite.
L'axistance d'une enzyme hydrolysant les molécules d'ami- don ou les molécules d'amidon converti par un acide directement en dextrose monomère est connue depuis au moins quinze ans.
Dès 1941. Kerr et Schink (Ind.Eng.Chem. 33, 1418 (1941) et plus tard ibid.34,1232 (1942) ) ont montré la présence dans certains extraits cryptogamiques d'une alpha-glucosidase qui paraît provoquer le clivage des motifs de dextrose directement, à partir des grosses molécules de polysaccharides présentes dans l'amidon pré-hydrolysé au moyen d'un acide et indiqué qu'il sem- blait qu'il n'y ait pas de limite à l'action jusqu'en un point très proche de l'hydrolyse complète en dextrose. En dépit de certains désaccords cette conception est maintenant acceptée.
Depuis ces premières recherches, cette enzyme hypothétique a été désignée par des noms variés par différents chercheurs. On
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l'a dénommée alpha-glucosidase, amyloglucosidase, gluco-amylase, amidon-glucogénase et maltase. Ce dernier nom a été utilisé par certains des chercheurs antérieurs en raison de cette conception,' qui n'a pas été démontrée erronée, que l'enzyme produisant le glucose à partir de l'amidon n'était pas différente d'une enzyme déjà connue, dénommée maltase, laquelle produit le dextrose à partir du maltose mais est spécifique pour ce disacharide. Dans ce qui suit, cette enzyme hydrolysant l'amidon sera désignée sous le nom d'amyloglucosidase.
Cette.enzyme se trouve dans des extraits aqueux, cultu- res ou filtrats de microorganismes, en particulier de mycètes.
Certaines souches de A. niger par exemple constituent une très bonne source. Naturellement, d'autres enzymes provenant des cel- lules vivantes figurent dans ces extraits et la séparation de l'amyloglucosidase, même d'autres carbohydrases comme les alpha- amylases, les transglucosidases et les dextrinases limites a été récemment présentée comme un problème insurmontable. En fait, l'amyloglucosidase est une des carbohydrases restant en très faible nombre qu'on n'a pu encore séparer sous une forme suffisamment pure pour'être cristallisée.
En dépit des brillantes prédictions de certains des cher- cheurs antérieurs en cette matière, qu'il n'y a pas de limite à l'hydrolyse de l'amidon jusqu'à hydrolyse presque complète en dextrose, et qu'un procédé enzymique de production de dextrose serait très supérieur au procédé classique d'hydrolyse acide pour ce qui concerne le rendement en dextrose et les problèmes de raffinage, les résultats fournis par les procédés antérieurs produisant enzymiquement le dextrose nbnt pas rempli ces espoirs, et il est apparu que le procédé enzymique comportait des pro- blèmes analogues à l'hydrolyse acide.
Les problèmes posés par le procédé acide ordinaire ont été décrits par Kerr (Chemistry and Industry of Starch, 2ed., chapter XIV). Il y a d'abord le problème posé par une hydrolyse
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incomplète en raison de la plus grande résistance à l'hydrolyse de la liaison anormale 1-6-alpha-glucoside présente dans l'amidon .
Il y a l'action de synthèse, ou réversion, produite par l'acide en vertu de laquelle le dextrose et les sucres inférieurs se recombinent en donnant des dimères ou des polymères plus stables aux acides. Ces deux résultats seuls altèrent non seulement sen- siblement le rendement potentiel en dextrose de l'hydrolysat, mais,quand on fait cristalliser et sépare le dextrose de ces hydrolysats, réduisent fortement le rendement réel en sucre obtenu (Chem. and Ind. of Starch, p. 385). Quand on hydrolyse l'amidon au moyen d'extraits de mycètes, l'examen des hydroly- sats montre la présence de quantités substantielles de dimères et de polymères du dextrose avec des liaisons irrégulières, ce qui indique une hydrolyse incomplète, une faction de synthèse, ou les deux.
Dans le procédé d'hydrolyse acide, il se produit des réactions "destructrices" dans lesquelles les impuretés protéi- ques ou azotées jouent un rôle. Ces réactions et la présence de sels compliquent le raffinage de l'hydrolysat et contribuent à réduire les rendements en sucre fini. Evidemment, quand on ajoute délibérément des protéines et des sels étrangers aux liqueurs amylacées au moyen d'extraits de mycètes ou de filtrats de leur culture, il n'est pas surprenant que les problèmes ci-avant, pour ce qui concerne le rendement en dextrose et le raffinage, s'en trouvent aggravés dans les procédés enzymiques antérieurs.
Divers brevets ont été pris récemment aux états-Unis d'A- mérique sur des procédés perfectionnés d'hydrolyse de l'amidon au moyen d'enzymes, à savoir les n 2.305.168 du 15 décembre 1942, 2.531.999 du 28 novembre 1952, 2.583,451 du 22 janvier 1952 et 2.717.852 du 13 septembre 1955.
Quand on applique les procédés enzymiques antérieurs
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de fabrication du dextrose à l'hydrolyse de l'amidon ou des pro- duits amylacés, on obtient des hydrolysats ne contenant pas plus de 85% environ de dextrose, en poids sec, même dans les condi- tions opératoires les meilleures. L'analyse de ces hydrolysats pour ce qui concerne les sucres totaux, ou substances réductri- ces totales, au moyen de l'essai bien connu de Fehling modifié par Lane et Eynon et le calcul des résultats en équivalent de dextrose (E. D.) montrent qu'il y a 5% ou plus supplémentaires de sucres non-dextrose ainsi que des polysaccharides et des subs- tances qui ne sont pas des hydrates de carbone à titré d'impure- tés pour un total de 100%.
Quand on raffine ces hydrolysats par passage sur du noir animal, filtration et concentration et quand on fait cristalliser par les procédés classiques, les rendements en dextrose cristal- lisé ne dépassent pas 60% en produit sec. C'est sensiblement le même rendement que celui obtenu dans une conversion classique de l'amidon par un acide et par l'application de procédés compara- bles de raffinage et de cristallisation. Dans les deux cas, les solides non-dextrose présents dans les hydrolysats empêchent la cristallisation de 25 à 30% environ du dextrose (poids sec) qu'on sait figurer dans l'hydrolysat.
Quand on reconcentre et fait recristalliser les liqueurs- mères provenant des procédés enzymiques, on peut obtenir un ren- dement en sucre de seconde qualité atteignant 80%. en produit sec. des matières sèches originales de l'hydrolysat. On obtient., ainsi un rendement total en sucre atteignant 80%. Quand on raffi- ne, rehydrolyse par un acide, concentre et cristallise, des li- queurs-mères provenant du procédé de conversion par un acide, on obtient également un rendement supplémentaire de sucre de seconde qual ité pouvant atteindre 20%, cequi donne un rendement glo- bal en sucre de première et de deuxième qualité de 80%.
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On peut évidemment répéter un grand nombre de fois les opérations de reconversion, de raffinage et de cristallisation, . pour augmenter le rendement au-delà de 80% aussi bien dans les procedés acides que das les procédés enzymiques, mais le coût augmente proportionnellement avec chaque renouvellement d'opé- ration.
Un examen critique d es techniques antérieures fait manifes tement ressortir que ces chercheurs pensaient que les rendements d'une faiblesse décourageante en dextrose trouvé dans les hydro- lysats provenant des conversions enzymiques, et le fait que les rendements réels en produit cristallisé ne dépassaient pas ceux fournis par des procedés d'hydrolyse acide comparables, étaient dùs à un ou deux ou plusieurs des facteurs suivants ;
1. Que l'enzyme produisant le dextrose est -incapable par elle-même de porter la conversion à un niveau quelconque plus élevé, c'est-à-dire qu'il existe une "limite de conversion" ana- logue à la limite obtenue avec l'enzyme produisant le maltose, la bêta-amylase.
2. Que la limite de conversion varie avec la source de la glucosidase et qu'on pourrait peut être obtenir des rendements plus élevés en dextrose en recherchant un extrait cryptogamique présentant une limite de conversion plus élevée.
3. Que l'enzyme produisant le dextrose est un substratum de maltase spécifique pour le maltose ou un polysaccharide in- férieur, de sorte que le rendement en dextrose à partir de l'ami- don dépendrait entièrement de la présence dans les extraits cryptogamiques d'autres enzymes connues pour produire du maltose, par exemple l'alpha-amylase.
4. Que par suite des conditions nécessairement appliquées dans la pratique pour des raisons d'économie ou toute autre rai- son, dans un ou plusieurs stades du procédé de production
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du dextrose, on ne pourrait obtenir des rendements en dextrose supérieurs à ceux actuellement trouvés. Les conditions envisa- gées sont par exemple la concentration en amidon ou produit amy- lacé utilisé dans l'hydrolyse 'enzymique, le degré ou la manière dont l'amidon est pré-traité avant l'hydrolyse enzymique, par exemple au moyen d'un acide, le pH, la température et d'autres variables de l'hydrolyse enzymique et la manière dont la fer- mentation donnant l'extrait cryptogamique a été effectuée.
5. Que, bien qu'une des fonctions de la molécule d'amylo- glucosidase soit d'hydrolyser l'amidon en dextrose, cette action est celle d'une transférase, de sorte qu'on pourrait s'attendre à ce que cette même molécule d'enyme manifeste une activité de transglucosidase à titre de fonction secondaire, ce qui rédui- rait le rendement en dextrose.
Toutes ces théories et autres théories similaires sont en opposition avec les découvertes qui sont à l'origine de la pré- sente invention.
Il a été découvert que la molécule d'amyloglucosidase ne possède qu'une fonction, qui est d'hydrolyser les liaisons des molécules d'amidon de manière à produire du dextrose et que tou- tes les autres enzymes présentes dans les extraits cryptogami- ques (ou toute autre activité enzymique) peuvent être séparées de cette molécule d'amyloglucosidase. Il a été découvert que l'amyloglucosidase attaque les extrémités terminales non-réduc- trices des molécules d'amidon, sépare le dextrose directement de ces extrémités, et procède ainsi le long de la molécule d'amidon jusqu'à ce qu'elle soit hydrolysée de manière sensiblement com- plète en dextrose.
Les rendements inférieurs en hydrolysats d'ami' don obtenus à l'aide des extraits cryptogamiques bruts contenant de l'amyloglucosidase sont en conséquence dùs à d'autres enzymes interférentes, comprenant les transglucosidases, qui donnent des
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produits finals autres que le dextrose. Quand on hydrolyse l'a- midon ou des produits amylacés à l'aide d'extraits "purifiés" ne contenant que l'activité de l'amyloglucosidase, on obtient des rendements inférieurs à 100% et des hyarolysats qui posent cer- tains problèmes de raffinage, ce résultat étant dû principale- ment aux protéines et sels étrangers ajoutés avec l'extrait "pu- rifié" et qui finalement passent dans l'hydrolysat.
La présente invention fournit un procédé de traitement des préparations enzymiques contenant de l'ainyloglucosidase de manière à en obtenir de l'amyloglucosidass pure, qui consiste à ajouter à une solution hydro-acétonique à 50% en volume de ladite préparation, environ 0,25 g d'un éiectrolyte pour 100 ml de solu- tion acétonique de manière à précipiter l'amyloglucosidase, à séparer et laver l'amyloglucosidase, à la redissoudre dans un mélange hydroacétonique à 50% en volume, à ajouter 0,25 gr d'é- lectrolyte pour 100 ml de solution de manière à précipiter l'a- myloglucosidase, puis à séparer l'amyloglucosdase purifiée préci- pitée.
La présente invention fournit en outre un procédé de pro- duction du dextrose à partir a'amidon dans lequel on hydrolyse l'amidon en systeme aqueux au moyen d'une preparation enzymique contenant de l'amyloglucosidase jusqu'à une valeur maximum E.D. et une teneur maximum en dextrose vrai, on clarifie l'hydrolysat, on le concentre par évaporation et on le laisse cristalliser, puis on sépare le dextrose cristallisé de la liqueur-mère, pro- cédé dont le perfectionnement est l'application pour l'hydrolyse de l'amidon d'une préparation enzymique contenant de l'amyloglu- cosidase purifiée par le procédé défini ci-avant, ladite hydrolyse donnant un hydrolysat final ayant une valeur E.D. maximum de 93 à 96% environ et une teneur en dextrose vrai maximum de 'ci? à 94% environ, en produit sec.
Plus particulièrement, l'invention fournit un procédé
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enzymique perfectionné pratique de production du dextrose avec un rendement exceptionnellement élevé à partir d'amidon et de produit amylacés, dans lequel on utilise une préparation contes nant de l'anyloglucosides prétraitée de manière à en éliminer les enzymes interférentes,comprenant par exemple la transglu- cosidase,qui produisent des sucres autres que le dextroseoDe préférence également, l'amyloglucosidase doit être purifiée des protéines et sels étrangers qui, s'ils passaient dans les liqueurs hydrolysées, compliqueraient le raffinage de ces li- queurs, de sorte qu'on obtienne facilement le dextrose cristal- lin pur.
Le présent traitement de purification de l'enzyme consiste à précipiter l'enzyme à partir d'une culture en contenant,, Il est fondé sur cette découverte surprenante que l'amyloglucosidase environ est soluble dans un mélange hydroacétonique pur à 50%/en volume mais est presque complètement insoluble dans ce solvant en pré- sence d'une quantité d'un électrolyte neutre, tel que le chlorure de sodium, le sulfate de sodium, le chlorure de potassium, etc, ne dépassant pas 0,25 gr pour 100 ml dudit mélange de solvants.
Il est préférable de traiter d'abord la liqueur brute au moyen d'une petite quantités de "Magnesol" à titre d'absorbant et de centrifuger, ou simplement de centrifuger la liqueur. On uitilse 3,74 à 18,7 gr de "Magnesol" à titre d'absorbant par litre de liqueur dans ce traitement préliminaire de clarification. On ef- fectue la clarification dans des conditions acides, de préfé- rence à un pH de 4,0 à 4,2, l'enzyme étant stable dans des con- ditions acides. (Le "Magnesol" est un absorbant constitué par insoluble un silicate de magnésium hydraté synthétique/dans l'eau, fabri- qué par la Westvaco Chlor-Alkali Division of Food Machinery Che- mical Corporation).
Le produit centrifugé limpide obtenu à l'aide de cette clarification est mélangé avec un volume égal d'acétone. A ce
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point, il existe usuellement suffisamment d'électrolyte dans l'extrait de culture pour assurer le minimum nécessaire à la précipitation de l'ainyloglucosidase dans l'acétone à 50%. On sé- pare le précipité des liqueurs par décantation ou autre moyen et on lave en l'agitant dans de l'acétone aqueuse à 50% dans laquel- le on a ajouté 0,2 gr de chlorure de sodium pour 100 ml de mélan- ge hydroacétonique. On rejette la liqueur de lavage.
On agite le précipité lavé dans de l'eau de manière à re- dissoudre l'amyloglucosidase. On peut utiliser un volume d'eau égal au quart environ à la moitié du volume original de filtras de culture. On centrifuge le mélange aqueux et on rejette l'in- soluble.
On ajoute à la liqueur centrifugée un volume égal d'acé- tone et, après quelques minutes d'agitation, on centrifuge de nouveau les liqueurs et on rejette le précipité éventuel. On ajoute alors, en agitant, à la liqueur centrifugée limpide U,25 gr de chlorure de sodium pour 100 ml de liqueur. On laisse ensuite reposer après agitation de manière à laisser l'amyloglucosidase floculer et précipiter. On recueille le précipité, par exemple par centrifugeage, et on le redissout dans une petite quantité d'eau, en éliminant l'insoluble éventuel. La solution d'amylo- glucosidase est alors prte pour l'application à l'hydrolyse de l'amidon; elle peut être utilisée pour un usage ultérieur, de préférence après élimination des traces d'acétone présentes par distillation sous pression réduite à basse temperature.
La pré- paration enzymique peut également être conservée après concen- tration ou dessication à température inférieure.
La quantité d'eau utilisée pour redissoudre l'amyloglucoJ sidase précipitée dans la mise en oeuvre du procédé ci-avant n'est pas critique. Elle est commandée par l'activité d'amylo- glucosidase du filtrat de culture original et par la quantité d'impuretésprésente. Si cette activité est basse, il n'est pas
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désirable de faire des solutions d'enzyme,inutilement très dilu- ées en raison.ae ce qu'il est coûteux d'ajouter de grands volu- mes d'acétone pour reprécipiter l'enzyme ou qu'il peut être fastidieux d'avoir à manipuler de grands volumes d'une solution très étendue de l'enzyme.
D'autre part, on ne doit pas utiliser des volumes d'eau faibles au point qu'on obtienne des sépara- tions relativement médiocres des impuretés dans les opérations qui suivent ou que lamyloglucosidase ne se dissolve pas complè- tement
On peut aussi, au lieu de redissoudre l'amyloglucosidase dans l'eau, procéder au centrifugeage, ajouter de l'acétone et centrifuger de nouveau de manière à obtenir une solution de l'a- myloglucosidase dans un mélange hydroacétonique à 50%, on peut redissoudre directement l'amyloglucosidase mais en agitant de manière plus prolongée dans de l'acétone aqueuse à 50% et centri- fuger .
On peut également,dans les procédés de purification, répé- ter plusieurs fois la précipitation de l'amyloglucosidase dans l'acétone aqueuse par addition de traces d'électrolyte de maniè- re à obtenir la plus grande pureté possible.
Au moyen de la technique de purification ci-avant décrite; on a obtenu de l'amyloglucosidase purifiée au point que, lors- qu'on ajoute environ 10 à 15 unités de cette amyloglucosidase pour 100 gr de substratum à une dispersion aqueuse de substance amylacée à pH 4. et 60 C, la comparaison des hydrolysats au bout de soixante-douze heures, avant et après purification, montre que l'équivalent de dextrose de l'hydrolysat obtenu à l'aide de l'en- zyme purifiée est augmenté de 2 à 7% environ, en produit sec,et que la teneur en dextrose de cet hydrolysat est augmentée de 3 à 10% relativement à l'hydrolysat obtenu au moyen de l'enzyme n'ayant pas subi de purification, les conditions d'hydrolyse étant
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par ailleurs les mêmes.
Les unités d'activité d'amyloglucosidase se déterminent de la manière suivante. Le substratum est un hydrolysat acide à 15-18 E.D. d'amidon de mais dissous dans l'eau et etendu à 4 gr de substance sèche pour 10U ml de solution. On pré- lève à l'aide d'une pipette exactement 50 ml de solution qu'on place dans une fiole jaugée de 100 ml. On ajoute dans le ballon 5 ml de tampon acétate de sodium-acide acétique IM de pH 4,3. On place le ballon dans un bain-marie à 60 C et,au bout de 10 minu- tes on ajoute la quantité appropriée d'enzyme. Exactement deux heures apres l'addition de la préparation enzymique, on règle la solution au virage de la phénolphtaléine au moyen d'hydroxyde de sodium normal.
On refroidit alors la solution à la température ambiante et on l'amène au volume. On détermine la valeur des sucres réducteurs, calculés en dextrose, sur l'écnantillon étendu et sur un témoin auquel on n'a pas ajouté de préparation enzymi- que. L'activité d'amyloglucosidase se calcule comme suit ;
A= S-E 2 x E où A représente les unités d'activité d'amyloglucosidase par ml ou gramme de préparation enzymique, S représente les sucres ré- ducteurs dans l'échantillon converti par l'enzyme en grammes pour 100 ml, B représente les sucres réducteurs dans le témoin én grammes pour 100 ml, et E est la quantité de préparation en- zymique utilisée, en ml ou en grammes,
La concentration des sucres réducteurs dans l'échantillon converti par l'enzyme ne doit pas être supérieure à 1 gr pour 100 ml.
On peut utiliser toutes les variétés d'amidon ou de pro- duits amylacés dans le présent procédé appliquant l'hydrolyse au moyen d'amyloglucosidase, Il est toutefois préférable, pour ob- tenir le dextrose, d'utiliser un amidon pur et de préférence,pour
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des raisons économiques,un amidon pur ayant été déjà partielle- ment hydrolysé ou converti par quelque autre moyen de manière à réduire la viscosité très élevée de l'amidon natif quand il est dispersé ou dissous dans l'eau.
La réduction de la viscosité facilite l'usage de teneurs plus élevées en solides de la subs- tance amylacée dans l'hydrolyse par l'amyloglucosidase. Le prétraitement de l'amidon peut être effectué d'un certain nombre de manières connues, par exemple hydrolyse acide préliminaire, prétraitement au moyen d'une alpha-amylase purifiée qui se com- porte d'une manière très analogue à celle de l'acide sur l'ami- don au moins dans les phases initiales de l'hydrolyse, ou prétrai tement par un moyen physique, par exemple passage dans une ma- chine "Votator" ou un homogénéiseur. Le prétraitement peut être une combinaison de deux ou de plusieurs procédés, par exemple un traitement acide sous pression ou un traitement à l'alpha-amylase associé au passage dans un "Votator"En tout cas,
le prétraitement doit être tel qu'il réduise la viscosité du substratum à un ni- veau tel qu'on obtienne des fluidesmanipulables ayant une concen tration en solides de 25 à 50% en poids et de préférence environ 35% en poids quand la température de la liqueur est de l'ordre de 45 à 60 C. Toutefois,ce prétraitement ne doit pas être prolon- gé au-delà du niveau indiqué sous peine que des caractères quel- conques indésirables d'hydrolyse ou de conversion préliminaire se superposent aux résultats obtenus dans l'hydrolyse par l;amylo glucosidase qui suit.
Ainsi, par exemple, dans un moae de mise en oeuvre préféré de l'invention, on convertit l'amidon au moyen d'acide très éten- du sous 'pression de la manière classique dont on fabrique un si- rop d'amidon et on hydrolyse le sirop à 35% de solides en dex- trose au moyen d'amyloglucosidase purifiée.Quand l'amidon est ainsi converti en dispersions relativement fluides à un taux d'environ 10 à 20 E.D., le produit peut être ajusté pour l'hydro.
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lyse par l'amyloglucosidase à la concentration préférée et peut donner des hydrolysats ayant une teneur en dextrose exception- nellement élevée de 90 à 98% en produit sec.
Toutefois, si le traitement acide est beaucoup plus pouusé, bien qu'on puisse utiliser des solutions plus concentrées, l'hydrolyse par l'amylo- glucosidase ne paratt pas être complète parce que le traitement acide a produit une certaine quantité de produits de réversion résistant aux enzymes dans les phases plus prolongées du traite- ment acide.
En tout cas, le substratum amylacé doit être dispersé dans l'eau et la solution doit être ajustés à un taux d'acidité et une température tels que l'amyloglucosidase puisse achever l'hydrolyse dans le temps le plus court possible et avec la meilleure économie pour ce qui concerne la quantité d'enzyme utilisée. L'acidité et la température sont des variables inter- dépendantes. Le carbonate de sodium, l'hydroxyde de sodium, etc, sont des matières alcalines appropriées et l'acide chlorhique constitue un acide approprié pour le réglage du pH des liqueurs en vue de l'hydrolyse par l'amyloglucosidase.
La température optimum d'hydrolyse au moyen d'amylogluco- sidase pure est comprise entre 35 et 60 C bien qu'elle dépende du pH, comme c'est le cas pour beaucoup d'autres enzymes. Réci- proquement, la gamme optimum de pH,qi est en général de 4 à 6,5, dépend de la température. En général, on obtient les taux optimum d'hydrolyse pour l'amyloglucosidase pure dans la gamme inférieure de pH de 4 à 5 quand la température utilisée est dans la gamme inférieure de 35 à 45 C et, la température augmentant, on obtient les taux optimum en augmentant en conséquence la valeur du pH.
Dans l'hydrolyse de l'amidon ou des produits amylacés au moyen d'amyloglucosidase de manière à produire le dextrose, il existe une autre limitation pour ce qui concerne le taux de pH et la température en raison de ce que le produit, le dextrose,
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est moins stable aux pH et aux températures supérieurs . Ainsi, dans l'application de l'invention, les gammes opératoires préfé- rées pour l'hydrolyse au moyen d'aniyloglucosidase sont un pH de.
4 à 4,8 et une température de 45 à 60 C
La durée de l'hydrolyse de l'amidon dépend de diverses variables opératoires. Les plus importantes sont le rapport de l'amyloglucosidase au substratum, le prétraitement de l'amidon, l'addition d'enzymes assistantes, la température et le pH utili- sés et la concentration du sustratum, Toutefois, et en tout cas, l'hydrolyse peut être suivie dans la pratique par les détermina- tions analytiques'bien connues, par exemple par la méthode de Sichert-Bleyer en vue de-la détermination du dextrose et l'hy- dralyse est poursuivie jusqu'à ce que l'analyse montre que l'ac- tion de l'amyloglucosidase est sensiblement terminée dans les conditions opératoires choisies, c'est-à-dire que la concentra- tion en dextrose de l'hydrolysat a atteint la valeur optimum.
L'optimum pratique est en général atteint quand les solides so- lubles de l'hydrolysat indiquent à l'analyse une teneur de 90 à 98% en dextrose.Le temps nécessaire pour arriver à cette valeur optimum varie entre dix et quatre-vingt-dix heures selon les variables opératoires, telles que celles dont on a parlé.
Une gamme opératoire ,commode d'addition d'amyloglucosidase ' purifiée est de 10 à 20 unités d'activité d'amyloglucosidase pour 100 gr de substratum amylacé, soit environ 100 à 200 uni- tés par kilogramme.
Le stade d'hydrolyse du procédé terminé, l'hydrolysat est raffiné, concentré, cristallisé et centrifugé de manière à récu- pérer le dextrose cristallisé à l'état pur au moyen de l'instal- lation et des procédés généraux bien connus dans l'industrie du raffinage du glucose, compte tenu de ce que les hydrolysats pro- ,duits conformément à l'invention contiennent moins de corps colorés, d'électrolytes et autres impuretés et sont ainsi plus
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---------------------------concentrés en dextrose, de sorte qu' ils cristallisent plus facilement et plus complètement que les hydrolysats obtenus par les techniques antérieures.
Les exemples caractéristiques suivants illustrent la pré- sente invention mais ne sont pas limitatifs.
EXMEPLE I
Selon un mode préféré de mise en oeuvre (le l'invention, on convertit de l'amidon de mats lavé à fond, mis en milieu a- queux à 10 Bé et réglé à une valeur de 0,02 N d'acide chlorhy- drique, dans un autoclave sous une pression de vapeur de 1,4 kg/cm2 au manomètre jusqu'à ce que la liqueur de conversion ait une valeur de 17 E.D. environ, c'est-à-dire la valeur réductrice des solides dissous dans la liqueur selon l'essai bien connu de Fehling (Fetzer W.J.,Analytical Chemistry, 24, 1129-1137 (1952), référence n 37 à 41). et une teneur calculée en dextrose (Le 17%, en produit sec. On traite alors les liqueurs au moyen de 0,5%. en poids sec, de bentonite et on filtre sur filtre pré- enduit au moyen de "Dicalite" à titre d'adjuvant de filtration.
On règle les liqueurs à pH 4,5 et on concentre par évaporation sous pression réduite à environ 36% de substance sèche. Les li- queurs, réglées à 60 C et pH 4,5 sont traitées au moyen d'une quantité d'amyloglucosidase purifiée égale à 200 unités par kilo- gramme d'amidon sec ce qui est suffisant pour que la valeur ré- ductrice de la liqueur en E.D. et que le rendement en dextrose, en produit sec, atteignent la valeur maximum en quarante-huit heures environ. Ces valeurs maximum sont de 95 96 E.D. et de 93 à 94% de dextrose, en produit sec, selon l'essai de Sichert- Bleyer (Sichert K. et Bleyer B.,2Anal, Chem 107, 328 (1936)).
L'amyloglucosidase est purifiée par les procédés donnés précé- demment de clarification et de précipitation des liqueurs de cul- ture de A. ni er.
Les liqueurs contenant le.dextrose, à 50-55 0, sont beau- coup moins colorées, ont moins de goût, contiennent moins de pro- téines et de sels que les liqueurs de conversion obtenues par les
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procédés d'hydrolyse acide ou les procédés enzymiques antérieurs pour la production du dextrose, mais sont néanmoins traitées au moyen de 1% de carbone, filtrées et évaporées à environ 70 à 75% de matières sèches avant d'être envoyées dans l'appareil de cristallisation.
En raison de la pureté plus élevée de ces li- queurs comparativement aux liqueurs à cristalliser antérieures, le dextrose tend à cristalliser beaucoup plus facilement, carac téristique qui nécessite l'usage de liqueurs un peu moins concen-' trées qu'il n'est communément utilisé dans les procédés usuels de cristallisation du dextrose.
On utilise une température ini- tiale d' environ 42 C dans le cristallisoir, avec l'addition usuelle de cristaux de dextrose d'ensemencement, et les liqueurs sont refroidies sous agitation en deux jours à environ 16 à 18 , les liqueurs sont alors centrifugées de manière à récupérer les cristaux de dextrose'et les liqueurs-mères soumises à une nou- velle cristallisation après concentration à 75 à 80% de matière sèche par agitation et refroidissement de 42 à 18 0 en quatre jours.
Ce procédé donne des rendements en dextrose cristallisé très pur supérieurs à 85%, c'est-à-dire au moins 20% de plus de dextrose qu'on en obtient à partir de l'amidon par les procé- dés usuels de conversion acide avec un seul stade de conversion acide et des procédés de raffinage comparables, et 5 à 10% de plus que dans les procédés enzymiques antérieurs.
EXEMPLE II
Dans un second mode de mise en oeuvre de l'invention,on mélange une liqueur aqueuse d'amidon de mats bien lavé d'une concentration de 35% en poids, à pH 6,5. avec une préparation relativement pure d'alpha-amylase obtenue à partir d'une bactérie thermophile, telle que par exemple B. subtilis, on fait passer dans un "Votator" à environ 88-90 .,puis on maintient pendant environ trente minutes à cette température avant de refroidir à
60 Ce La quantité d'alpha-amylase ajoutée est suffisante pour
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gélatinisé réduire la viscosité de l'amidon/au point qu'on obtienne un fluide manipulable à 60 C. Cette viscosité n'est pas critique.
L'acidité de la liqueur est réglée à pH 4 par addition d'acide chlorhydrique et additionnée dé 132 unités de préparation d'amy- loglucosidase purifiée par kilogramme de substance amylacée sè- che, quantité suffisante pour que, en maintenant le mélange d'en- zyme et d'amidon pendant trois jours à 55-60 C, on obtienne une valeur E.D. maximum de l'hydrolysat résultant de l'ordre de 95.
L'amyloglucosidase purifiée utilisée est préparée à l'aide de filtrats de culture d'A. niger par le procédé de précipitatio acétonique décrit ci-avant. Les liqueurs sont filtrées, puis raffinées, concentrées par évaporation, cristallisées et centri- fugées de manière à récupérer le dextrose cristallisé à l'état pur. La pureté et les rendements sont comparables à ceux obte- nus dans le premier procédé donné.
EXEMPLE III
L'exemple suivant a pour but de montrer (a) que l'amylo- glucosidase peut etre effectivement séparée des autres enzymes modifiant l'amidon par le procédé de précipitation à l'acétone et au chlorure de sodium précédemment décrit et (b) quton ob- tient un rendement exceptionnellement élevé en dextrose dans l'hydrolyse de l'amidon prétraité au moyen d'acide à l'aide de cette enzyme.
On mélange un filtrat de culture de A, niger NRRIL 330 d'une teneur élevée en amyloglucosidase, avec un volume égal d'acétone et on recueille le précipité formé par centrifugeage et on le lave à Il,aide d'acétone aqueuse à 50% en volume conte- nant 0,25% de NaCl. On évapore la liqueur centrifugée originale sous pression réduite pour chasser l'acétone et on la met de côté pour l'analyse. On reprend le précipité lavé par l'eau, on centrifuge et on mélange la liqueur centrifugée avec un volume égal d'acétone, puisun centrifuge de nouveau. A la liqueur cen-
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trifugée, ou ajoute 0,25 gr de chlorure de sodium pour 100 ml, .
Il se sépare un précipité qu'on reprend par l'eau. On utilise la solution contenant l'amyloglucosidase pour hydrolyser l'amdon de la manière suivante..
On fait bouillir exactement 2 gr, produit sec, d'amidon prétraité au moyen d'acide jusqu'à une valeur E.D. à l'essai des réducteurs d'environ 10 (connu dans le commerce sous le nom d'amidon soluole de Lintner) avec de l'eau pour le dissoudre, puis on refroidit la solution et on l'amène à un volume de 500 ml à l'aide d'eau contenant un tampon à l'acétate de sodium pour régler le pH à 5A une portion de 200 ml de 45 C, on ajoute 1 ml de la solution d'amyloglucosidase au temps zéro'et,à une autre portion de 200 ml.on ajoute 1 ml de la liqueur centrifugée ori- ginale, contenant probablement l'alpha-amylase, les glucosidases non précipitées par l'acétone et le sel, d'autres enzymes hydro- lysant l'amidon, ainsi que la transglucosidase et d'autres car- bohydrases.
Aux intervalles de temps indiqués dans le tableau, on prélève des parties aliquotes d'hydrolysat en vue des dosages' La valeur réductrice totale est évaluée par oxydation au terri - cyanure (H.C. Gore et H.K. Steels, Ind. Eng. Chem. Anal. Ed.,7, 324 (1935)) et les résultats figurant au tableau sont exprimés en pourcentage d'amidon hydrolysé en dextrose et en rendement en dextrose en pourcentage de produit, sec. Le cours de l'hydro- lyse est également suivi par traitement de parties aliquotes à l'aide d'iode et mesure du changement de la couleur du bleu au jaune au cours de l'hydrolyse.
Un évalue la couleur en déter- minant la transmission de lumière minimum pour cent de la solu:- tion au spectrophotomètre de Goleman, Cet essai général a été décrit de manière complète par lier; et autres, (Kerr, Cleveland et Katzbeck, J. Am. Chem. Soc., 73, 3916 (1951)).
Cet essai est significatif en ce qu'il distingue Inaction de l'amyloglucosidase de celle de toutes les autres enzymes connues produisant des
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sucres réducteurs comme le dextrose dans l'hydrolyse de l'ami- don ou combinaison d'enzymes, sauf la bêta-amylase dont on sait en l'espace qu'elle est absente. L'amyloglucosidase agit de ma- nière exceptionnelle en ce qu'une uiolécule de l'enzyme attaque une molécule d'amidon et (par une attaque des extrémités, .qui ne provoque que le clivage des motifs de dextrose) hydrolyse com- plètemdnt de cette molécule avant d'attaquer une autre molécule d'amidon.
Par conséquent, si on hydrolyse de l'amidon en dextro- se au moyen dtamyloglucosidase, la couleur due à l'iode de l'hy- drolysat reste bleue (longueur d'onde environ 620 à 630 m pour l'amidon entier) jusqu'à ce que l'hydrolyse de la substance amylacée soit presque complète en raison de ce que l'amylogluco- sidase provoque le clivage de chaque molécule d'amidon en dex- trose avant que la molécule d'enzyme attaque une autre molécule d'amidon.
Par conséquent, s'il reste de l'amidon non hydrolysé, par exemple à une hydrolyse de 50%, on.obtient une coloration bleue presque identique à celle donnée par l'échantillon originale Si l'amidon était hydrolysé par un mécanisme quelconque autre que le mécanisme unique de l'amyloglucosidase, l'action sur l'amidon des autres enzymes se faisant au hasard, cette action réduirait rapidement la "longueur de caîne" ou le poids molécu- laire de toutes les molécules d'amidon et la couleur bleue de la solution amylacée avec l'iode virerait rapidement du bleu au rouge et au jaune, c'est-à-dire que la longueur d'onde se dépla- cerait rapidement de: 630 m environ à 450 m environ.
Les résultats montrent que l'enzyme hydrolysant l'amidon présente dans le précipité acétone-NaGl du filtrat de culture d'A. niger est essentiellement de l'amyloglucosidase pure étant donné que l'amidon est rapidement hydrolysé en dextrose et que, même quand presque 50% du poids sec de l'amidon ont été hydroly- sés en dextrose, les molécules colorées par l'iode présentes dans l'hydrolysat donnent une coloration bleue sensiblement iden-
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tique (mesurée par la longueur d'onde de la transmission minimum de lumière) à l'échantillon d'amidon original au commencement de lhydrolyse enzymique.
D'autre part, la fraction de filtrat de culture de A,niger qui ne précipite pas par i'acétone-NaCl hydrolyse également l'amidon prétraité par un acide 'en dextrose mais il s'agit alors d'une action au hasard s'exerçant sur pres- que toutes les molécules d'amidon étant donne que dès la pre- mière prise d'essai ( à 8,5% d'hydrolyse)il ne reste plus de molécules d'amidon donnant avec l'iode la coloration bleue carac- téristique. Cette action n'est pas caractéristique de l'amyloglu- cosidase mais au contaire des alpha-araylases et autres carbohy- drases dont on sait qu'elles sont présentes.
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TABLEAU
EMI25.1
<tb> Hydrolyse <SEP> de <SEP> l'amidon <SEP> prétraité <SEP> au <SEP> moyen <SEP> d'acide <SEP> (amidon <SEP> soluble <SEP> de <SEP> Lintner) <SEP> au <SEP> moyen <SEP> d'amyloglucosidase
<tb> purifiée <SEP> par <SEP> précipitation <SEP> par <SEP> NaCl <SEP> en <SEP> milieu <SEP> acétonique
<tb>
EMI25.2
Hydrolyse au moyen d'amylogluoosidase Hydrolyse au moyen de filtrat centrifugé précipitée par acétone-Naol de culture de A.niger Durée de l'hydro- Pourcentage d'ami- Rea. en dex-I- couleur,Pourcent.d'a-nidon Rend. en I-couleur
EMI25.3
<tb> lyse <SEP> en <SEP> minutes <SEP> don <SEP> hydrolysé <SEP> en <SEP> trose <SEP> en <SEP> long.d'onde <SEP> hydrolysé <SEP> en <SEP> dextrose <SEP> long. <SEP> onde
<tb>
EMI25.4
à 45 C dextrose produit sec mt-t- dextrose ou pro- m u.
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ duit sec 41
EMI25.5
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 635 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 635
<tb> 15 <SEP> 12,6 <SEP> 14,0 <SEP> 635 <SEP> 8,45 <SEP> 9,4 <SEP> , <SEP> 555 <SEP>
<tb> 45 <SEP> 32,0 <SEP> 35,6 <SEP> 630 <SEP> 24,8 <SEP> 27,6 <SEP> 465
<tb> 120 <SEP> 48,5 <SEP> 53,9 <SEP> 620 <SEP> 57,0 <SEP> 65,4 <SEP> 450
<tb> 1440 <SEP> 96,5 <SEP> 107,1 <SEP> 450 <SEP> 92,1 <SEP> 102,3 <SEP> 450
<tb>
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En appliquant les procédés de Corman et Langlykke (Corman J.
et Langlykke A.F., Gereal Chem., 25,190 (1848)) dans lesquels on mesure l'activité de l'amyloglucosidase par hydrolyse du mal - tose, on détermine qu'environ 64% de l'amyloglucosidase présente dans le filtrat de culture original sont rércuperés dans le procé- dé de précipitation à l'acétone-NaCl utilisé pour la purification.
Les résultais du tableau montrent en second lieu que l' amyloglucosidase purifié hydrolyse l'amidon prétraité au moyen d'acide en dextrose au taux exceptionnellemnt élevé de 96,5.
Ceci correspond à un rendement de 107,1% en dextrose, en produit sec, relativement à l'amidon sec. On doit se souvenir que le rendement maximum théorique en dextrose rapporté à l'amidon est de 111,1% par suite du gain chimique d'une molécule d'eau (18) par motif d'anhydroglucopyranose (poids mole 162) présent dans la molécule d'amidon.
EXEMPLE IV
L'exemple suivant a pour but de montrer comment on peut préparer l'amyloglucosidase débarrassée de toute autre activité de carbohydrases par la désactivation sélective au moyen d'acide dont on a parlé et de montrer les rendements exceptionnellement élevés en dextrose qu'on peut obtenir quand on utilise cette préparation purifiée d'amylogluscosidase dans l'hydrolyse de l'amidon.
Or/refroidit à 5 C un filtrat de culture de A.niger NRRL 330 n 1 provenant du Northern Région Research Laboratory et on ajoute avec précaution, en agitant énergiquement, une quantité d'acide chlorhydrique suffisante pour maintenir un pH de 2,25 à 2,75 quand on conserve la solution pendant sept jours au réfri- gérateur à 5 C environ. Au bout de ce temps, on ajoute goutte à goutte une solution froide d'hydroxyde de sodium, en agitant soit très énergiquement, juuqu'à ce que le pH/d'environ 4.8. On cen- trifuge la liqueur pour séparer une boue brunâtre de matière protéique que le traitement a précipitée.
Un soumet la solution
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clarifiée à l'essai pour vérifier qu'elle contient del'amylo- glucosidase sensiblement exempte d'alpha-amylase et impuretés analogues d'une manière analogue à celle utilisée dans l'exemple précédent. Un fait une solution'd'amylase de mais en en dissol- vant 2,5 gr dans 615 ml d'eau et en réglant à pH 5 et à une tem- pérature de $45 C. A une portion de cette solution,on ajoute une partie aliquote du filtrat de culture traité à l'acide et,à une autre portion,une partie aliquote du filtrat de culture original.
On prélève des échantillons à divers intervalles et on teint au moyen d'iode. On examine les colorations selon la longueur d'on- de de la transmission minimum de lumière pour cent à l'aide du spectrophotomètre. On détermine dans les deux cas l'hydrolyse pour cent en dextrose. Dans l'hydrolyse utilisant le filtrat de culture traité au moyen d'acidde, même quand elle atteint 47%, l'hydrolysat donne avec l'iode une coloration bleue avec une longueur d'onde de transmission minimum sensiblement iden- tique à celle donnée par le substratum original, soit 640 m , alors que l'hydrolysat contenant le filtrat de culture original à 44% d'hydrolyse donne une coloration allant vers le rouge de 550 m pour la transmission minimum pour cent de lumière.
Il est manifeste que l'action du filtrat de culture traté à l'acide co est caractéristiquement celle de l'amyloglu sidase relativement pure.
On utilise le filtrat de culture d'A. niger traité à l'acide dans d'autres études d'hydrolyse.
On prépare de l'amylose cristallisée (R.W.Kerr et G.M.
Severson, J.Am. Chem. Soc., 65el93 (1943)), une fraction solu- ble dans l'eau d'amidon de mats préparée par chauffage de l'ami- do dans l'eau et précipitation au moyen de butano, en vue de l'hydrdyse enzymique en dissolvant exactement 600 mg, en produit sec, du produit dans 300 ml d'eau chaude, en réglant à pH 5 et
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45 C, ajoutant une partie aliquote de la préparation d'amyloglu- cosidase purifiée décrite ci-avant et réglant le volume total à exactement 312,5 ml. On maintient la température de l'hydroly- se à 45 C et on prélève des prises d'essai en vue de l'analyse aux intervalles indiqués sur le tableau.
Le tableau indique également la teneur en dextrose vrai des liqueurs d'hydrolyse en produit sec, déterminée par la méthode de Sichert-Bleyer, ainsi que la valeur E.D. qui est l'équivalent en dextrose de
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toutes les substances réductriceqbréseqtes. Hydrolyse au moYen dlâmloglucosi dase préparée par désactiva- tion sélective des filtrats de culture au moyen d'un acide.
EMI28.2
<tb>
Durée <SEP> de <SEP> Composition <SEP> % <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> dex- <SEP> Rend. <SEP> (c) <SEP> calculé
<tb>
<tb> l'hydro- <SEP> de <SEP> l'hydrolysat <SEP> trose <SEP> vrai <SEP> (b) <SEP> en <SEP> dextrose <SEP> % <SEP> subs-
<tb>
<tb> lyse <SEP> pds.sec, <SEP> en <SEP> de <SEP> l'hydrolysat, <SEP> tratum <SEP> sec..
<tb>
EMI28.3
minutes E.1J. (a) %.pds sec. ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI28.4
<tb> 60 <SEP> 8,3 <SEP> 7,8 <SEP> 8,61
<tb>
<tb> 120 <SEP> 16, <SEP> 17,3 <SEP> 19,3
<tb>
<tb> 195 <SEP> 27,7 <SEP> 29,5 <SEP> 32,8
<tb>
<tb> 270 <SEP> 39,4 <SEP> 35,6 <SEP> 39,5
<tb>
<tb> 1260 <SEP> 99,5 <SEP> 97,8 <SEP> 18,7
<tb>
(a) équivalent en dextrose des substances réductrices.
(b) par la méthode de Sichert-Bleyer.
(c) le maximum théorique est de 111,1%; exprimé en dextrose vrai par l'essai de Sichert-Bleyer,
Le pourcentage exceptionnellement élevé de dextrose formé par hydrolyse et l'accord étroit entre les substances réductri- ces totales calculées en dextrose (E.D.)et le dextrose réelle- ment trouvé à l'analyse, enpourcentage de substance sèche de l'hydrolysat, montrent cl/airement que l' enzyme produc- trice' de dextrose, l'amyloglucosidase, a sensiblement été déar rassée de toutes les autres enzymes interférentes qui auraient produit des sucres autres que le dextrose.
Pour confirmer ce résultat, on a analysé un échantillon.
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de l'hydrolysat final par chromatographie sur papier. On utilise comme solvant un mélange de 6 parties de butanol, 4 parties de pyridine et 3 parties d'eau comme solvant pour développer les bandes de papier et de l'acide 3;5-dinitro-salicylique alcalini- sé pour asperger les bandes de papier pour situer les taches de sucre sur la bande. Dans les conditions où le dextrose pur donne une valeur RF moyenne d'environ 0,3, on ne peut déceler qu'une seule tache de sucre sur les bandes utilisées pour analyser l'hy- drolysat et dont la valeur RF moyenne est de 0,31. A titre de comparaison, même la disaccharide; le maltose, essayés par ce procédé, donnent une tache très éloignée de l'emplacement noté ci-avant, la valeur R étant de 0,24.
Par conséquent, édant donné qu'on n'observe qu'un seul sucre, le dextrose, dans l'hy- drolysat utilisant Itamyloglucosidase (la faible valeur réduc- trice restant correspondant à ae l'amidon bien moins converti), il ne pouvait exister en quantité appréciable dans la préparation d'autres enzymes interférentes comme l'alpha-amylase qui produit également du maltose et ses homologues et la transglucosidase qui produit le trisaccharide, le panose, et ses homologues.
EXEMPLE V
L'exemple suivant a pour but de montrer le degré moindre de raffinage nécessaire pour les hydrolysats obtenus par le pré- sent procédé que pour les hydrolysats obtenus par les procédés antérieurs et l'application de l'invention à la production à bas prix d'un sirop contenant du dextrose propre même à l'alimen- tation.
On applique les procédés décrits dans l'exemple 2 mais en terminant l'hydrolyse par l'amyloglucosidase quand la valeur E.D.
- -se rapproche de 60. On utilise à cette fin une quantité d'enzyme inférieure à celle utilisée que on hydrolyse jusqu'à une valeur
E.D. de 90 et plus et en chauffant l'hydrolysat. Un filtre les
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liqueurs à l'aide d'une petite quantité d'un adjuvant de filtra- tion, on concentre par évaporation jusqu'à obtention d'un sirop épais et on met en flacons.
Le sirop ainsi produit qui n'a subi sucré essentiellement aucun raffinage est d'un goût/agréable, sans odeur nuisible, de couleur très claire, alors que les sirops produits par les procédés antérieurs, pour être consommés, vaient être soumis à plusieurs opérations de raffinage telles qu'un traitement au carbone ou un passage/sur des filtres à noir animal, avant et après l'évaporation finale, de manière à enle- ver ou réduire la coloration ou les impuretés donnant des colo- rations et une saveur et une odeur désagréable ou rédhibitoires.
EXEMPLE VI
L'exemple suivant a pour objet de montrer la très grande amélioration de couleur et de pureté des hydrolysats d'amidon quand on utilise une amyloglucosidase obtenue à partir des ex- traits cryptogamiques bruts par précipitation en milieu acétoni- que au moyen de concentrations déterminées en électrolyte.
On ajoute un échantillon de liqueur de culture brute de A.niger à une solution aqueuse de sirop de maïs dont la concen- tration en solides est de 35%. en poids et le pH de 4.0 Le sirop de maïs est préparé par conversion aciae d'amidon de mais sous pression à une valeur E.D. de 17%, en produit sec. On laisse l'hydrolyse enzymique se poursuivre pendant soixante-douze heures à 60 C On filtre alors les liqueurs et on les analyse.
La densité optique de la liqueur hydrolysée à pH 4,- est de 0,208, à une longueur d'onde de # = 390 m , au spectrophoto- mètre de Coleman modèle 14. On recueille 35,6% en poids de subs- tance sèche. La valeur E.D. est de 90,2% en produit sec, selon l'essai de Fehling modifié par Lane-Eynon et la teneur en dex- tros.e vrai est de 84,0% en produit sec,selon l'essai defermen- tation à la levure de Smogyi.
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On ajoute une partie aliquote d'une amyloglucosidase pu- rifiée, préparée à l'aide de la même liqueur de culture brute de A, niger directement par précipitation par l'audition d'acé-
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tone' à 50% de concentration en v.olume et enprésence de 0,25 gr de NaCl pour 10U ml, à une autre portion du même sirop de mais que celui utilisé ci-avant et on laisse l'hydrolyse se poursui- vre à pH 4,0 et 60 C. Au bout de soixante-douze heures l'hydro- lysat filtré à pH 4.- possède une densité optique qui n'est que de 0,111 au spectrophotomètre de Coleman modèle 14 à la longueur d'onde de # = 390 m .La concentration est de 35,11 pour cent de matière sèche en poids.
La valeur E.D. est de 92,5, en produit sec, et la teneur en dextrose vrai de 87,2% en pro- duit sec. Par conséquent, la couleur de la liqueur d'hydrolysat d'amidon obtenue en utilisant des extraits cryptogamiques non raités dans l'hydrolyse est environ double de celle qu'on obtient quand on utilise de l'amyloglucosidase purifiée, et dans ce der- nier cas on obtient un gain de dextrose vrai de plus de 3% dans les hydrolysats.
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J:#VENDrO.à'.L'IUNS 1. Procédé de traitement de préparations enzymiques conte-
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nant de l'amyloglucosidase, destiné à fournir de l'amyloglucosi- dase pure, dans lequel on ajoute à une solution hydro-acétonique à 50% (en volume) de ladite préparation, environ 0,25 gr d'élec- trolyte pour 100 ml de solution acétonique, de manière à précipi- ter l'amyloglucosidase, on sépare et on lave l'amyloglucosidase, on la redissout dans un mélange hydro-acétonique à 50% en volume, on ajoute 0,25 gr d'électrolyte pour 10U ml de solution pour re-
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précipiter lfamyloglucosiduse, et on sépare l'amyloglucosidase purifiée précipitée.
2. Le procédé de la revendication 1, dans lequel la solu- tion aqueuse de préparation enzymique est traitée au moyen de 0,5 à 2% environ d'un silicate de magnésium hydraté synthétique
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insoluble dans l'eau à un pH d'environ 3,8 à 4,5, le mélange est centrifugé et la phase liquide obtenue contenant l'amyloglucosida- se est soumise audit traitement à l'acétone et à l'électrolyte.
3. Procédé de production de dextrose à partir d'amidon, dans lequel l'amidon en système aqueux est hydrolysé avec une préparation enzymique d'amyloglucosidase jusqu'à une valeur E.D. maximum et une teneur maximum en dextrose vrai, l'hydrolysat est clarifié, concentré par évaporation, et laissé à cristalli- ser, et le dextrose cristallisé est séparé de la liqueur-mère, ca procédé ractérisé par l'hydrolyse de l'amidon avec une prépara- tion enzymique d'amyloglucosidase qui a été purifiée par le pro- cédé suivant les revendications 1. ou 2, cette hydrolyse donnant un hydrolysat final ayant une valeur E.D. maximum de 93 à 96% et une teneur maximum en dextrose vrai d'environ 87 à 94% en pro- duit sec.
4. Un procédé de traitement de préparations enzymiques d'amyloglucosidase en vue d'en obtenir de l'amyloglucosidase pu- re, tel que décrit ci-avant avec référence spéciale à l'un quel- conque des exemples.
5. Le procédé perfectionné de production de dextrose à partir d'amidon, tel que décrit ci-avant avec référence spéciale à l'un quelconque des exemples.
6. Amyloglucosidase sensiblement pure, lorsqu'elle est préparée par le procédé des revendications 2 ou 4.
7. Dextrose, lorsqu'il est préparé par le procédé des revendications 3 ou 5.