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La présente invention concerne, de manière géné-i rale, des procédés pour obtenir des antibiotiques à partir de solutions brutes de ceux-ci. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux procédés améliorés pour écupé- rer et concentrer des antibiotiques à partir de bouillons de fermentation contenant des antibiotiques élaborés, des myceliums de microorganismes et des milieux nutritifs appropriés.
Précédemment, l'isolement et la séparation d'antibiotiques à partir de bouillons de fermentation, avaient dans lesquels-les antibiotiques . /. été élaborés, se faisaient par des processus d'extraction par des solvants et dtéchange ionique, qui impliquaient le traitement de bouillons récoltés filtrés ou non.
La présente invention concerne, de manière gé- nérale, une nouvelle technique pour isoler des antibioti- ques, qui ont été produits par des processus de fermenta- tion.
L'invention a pour objet un nouveau procédé perfectionné pour la séparation et la purification d'an- tibiotiques à partir de bouillons de fermentation dans lesquels ces antibiotiques ont été élaborés.
L'invention a encore pour objet un procédé pour l'isolement d'antibiotiques avec des rendements élevés.
L'invention a aussi pour objet un procédé com- mercialement applicable pour récupérer l'activité anti- biotique de bouillons de fermentation dans lesquels ces antibiotiques sont élaborés.
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D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description détaillée sui- vante. @
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Il a été constaté à présent que des antibioti- ques peuvent être isolés des bouillons de fermentation, concurremment/ dans lesquels ils sont élabores,/avec la fermentation.
En d'autres termes, le processus d'isolement peut être exécuté pendant l'élaboration de l'antibiotique. Ceci se fait en ajoutant la résine d'échange ionique choisie au bouillon de fermentation et en permettant à la fermenta- tion de se poursuivre pendant un certain temps après l'ad- dition de la résine.
La caractéristique surprenante de la présente invention réside, en plus de la facilité opératoire accrue et de l'économie de temps et d'équipement, dans les ren- dements accrus obtenus en suivant la pratique de la pré- sente invention. On a constaté que les rendements sont augmentés d'environ 25 % par rapport aux rendements ob- tenus si l'adsorption est exécutée sur du bouillon récol- té. Cette augmentation de rendement est produite en exé- cutant la fermentation en présence d'une résine échan- geuse d'ions, qui adsorbe l'antibiotique à mesure qu'il est élaboré. Une nouvelle augmentation du rendement est obtenue en supprimant le stade de filtration du bouillon de fermentation avant traitement ultérieur.
Au surplus, l'adsorption par la résine est accouplée plus efficace- ment en appliquant ce processus à cause des temps de con- tact plus longs entre le bouillon et la résine qui résul- tent de l'adsorption pendant la fermentation. Un autre avantage du procédé suivant l'invention résidé dans le fait que la fermenur lui-même est utilisé comme endroit d'adsorption, ce qui élimine la nécessité de transférer. le bouillon de fermentation dans un autre récipient pour la mise en contact avec la résine.
Les possibilités les plus complètes de la pré- sente invention peuvent être réalisées avec un antibioti-,
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que instable, tel que la pénicilline, l'adsorption de l'antibiotique au fur et à mesure de sa formation ayant pour effet de l'extraire de la solution dans laquelle il est instable et sujet à l'action dégradante d'agents chimiques et enzymatiques.
Pour l'utilisation efficace du procédé suivant la présente invention, il est essentiel que la résine échangeuse d'ions soit ajoutée au bouillon de fermenta- tion à un moment tel que la fermentation du bouillon puisse se poursuivre en présence de la résine. La rési- ne peut être ajoutée soit dès le début de la fermenta- tion, soit plus tard, par exemple une heure avant le temps de récolte du bouillon de fermentation. Le mini- mum d'une heure est le temps qui s'est avéré nécessaire pour obtenir une récupération substantielle de l'activité antibiotique contenue dans le bouillon de fermentation.
Dans une forme d'exécution préférée de la présente in- vention, la résine d'échange ionique doit être ajoutée à un moment compris entre 48 heures environ après le début de la fermentation et 24 heures environ avant la récolte du bouillon de fermentation.
La résine peut être ajoutée au bouillon de fer- mentation en n'importe quelle concentration désirée, de préférence à des concentrations comprises entre environ 1% en volume et environ 5 % en volume, en fonction prin- cipalement de la concentration en activité antibiotique élaborée dans le bouillon.
La caractéristique nouvelle et unique du pro- cédé suivant l'invention réside dans le fait que la ré- sine échangeuse d'ions est ajoutée pendant la fermenta- tion, cette dernière étant alors poursuivie en présence de..la résine. Certains milieux de fermentation pour la
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production d'antibiotiques sont cependant sensibles à une contamination par des microorganismes étrangers. Ces derniers microorganismes peuvent même aller jusqu'à pro- voquer la perte complète du rendement du produit de fer- mentation désiré, comme cela est le cas pour la pénicil- line. Il est par conséquent souhaitable de stériliser - la résine échangeuse d'ions avant de l'introduire dans' ... l'appareil de fermentation. Cette stérilisation peut s'effectuer en traitant la résine par de la chaleur ou de la vapeur.
Cependant, si la résine est instable en présence de chaleur, l'emploi d'un antiseptique, tel que l'alcool aqueux, est recommandé.
Après adsorption, la résine échangeuse d'ions avec l'antibiotique adsorbé sur elle peut être soumise aux techniques usuelles pour ltisolement de l'antibioti- que. Le bouillon de fermentation et la résine peuvent être séparés par exemple par tamisage. Là résine ainsi séparée peut être lavée pour en éliminer les traces de mycelia ou d'impuretés chimiques non absorbées, après quoi elle peut être éluée à l'aide d'une solution ayant la faculté d'éluer de la résine toute activité antibioti- que adsorbée sur celle-ci. L'éluat peut être soumis à un certain nombre de @ de traitements appropriés, par exemple @ des cristallisations ou des extractions par solvants, en vue de récupérer l'antibiotique pur de 'éluat.
La résine ainsi débarrassée de l'activité an- tibiotique peut alors être régénérée par traitement à l'aide d'une solution de régénération appropriée, après quoi elle peut être utilisée à nouveau pour l'aosorption d'antibiotique; ou bien de la résine fraîche peut être ajoutée avec la résine régénérée dans l'appareil de fer- mentation, si on le désire. Le bouillon épuisé peut être
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remis en contact avec de la résine fraîche ou régénérée et à nouveau séparé de la manière décrite plus haut.
L'invention sera décrite à présent plus en dé- tails, en utilisant de la novobiocine comme antibiotique, pour la facilité de l'exposé.
Les résines échangeuses d'ions qui conviennent pour la mise en oeuvre du procédé suivant la présente in- vention, dans le cas de la novobiocine, sont des résines sous forme de particules de la classe des résines échan- geuses d'anions azotées, polymères et fortement basiques.
Il s'agit ordinairement de résines dans lesquelles des groupes ammonium quaternaires sont attachés à un système' styrène-divinylbenzène. Comme résines de ce type, on peut citer à titre d'exemples les résines "Dowex" four- nies/par la société Dow Chemical Co., Midland, Mich., no- tamment le "Dowex 1-X2", le "Dowex 1-X4", et le "Dowex 2-X4"; les résines "Amberlite" fournies par la société Rohm & Hass Co, Philadelphie, Pa., notamment "Amberlite
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IRA-400", lt trAmberlite IRA-401" et l'Amberlite XE-9't; ainsi que les résines "Dusolite", fournies par la société Chemical Process Co., Redwood City, Californie, notam- ment le "Duolite A-40", l" "Duolite A-101" et le. "Duolitq A-102".
Bien que les résines mentionnées ci-avant aient été citées comme des exemples illustratifs des résines échangeuses d'ions qui peuvent être utilisées pour l'ab- sorption de novobiocine, d'autres résines échangeuses ,d'ions du type fortement basique peuvent également être utilisées.
,Les spécialistes comprendront que d'autres antibiotiques peuvent exiger d'autres types de résines échangeuses d'ions. Ainsi, alors que la pénicilline G, un autre antibiotique acide, peut être adsorbée sur des résines échangeuses d'anions basiques du type utilisé
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pour l'absorption de la novobiocine, des antibiotiques basiques, tels que la streptomycine, la néomycine, l'eulicine et la citovirine, par exemple, requièrent l'utilisation d'une résine d'échange cationique acide pour obtenir une absorption efficace.
Bien que les dimensions des particules de rési- ne ne soient pas critiques, il a été constaté que des résines dent les particules ont des grosseurs comprises entre environ 10 mailles et 200 mailles et, de préféren- ce, entre environ 35 mailles et 100 mailles, sont parti- culièrement intéressantes pour l'absorption.
Pour séparer la résine sur laquelle est adsor- bée l'activité antibiotique, du bouillon épuisé, il est souhaitable de diluer d'abord le bouillon par addition d'un diluant, tel que l'eau. Ce stade de dilution, bien qu'il ne soit pas nécessaire pour la mise en pratique de la présente invention, facilite la séparation du bouillon épuisé et de la résine. Il a été constaté que l'adjonc- tion au bouillon épuisé d'un volume égal d'eau améliore la séparation de la résine du bouillon épuisé contenant des mycelia de microorganismes, des agents nutritifs non utilisés et diverses autres impuretés solides.
Le bouillon contenant la résine peut alors être séparé de celle-ci par tamisage ou par toute autre métho-. de désirée. Le tamisage du mélange à l'aide d'un tamis à mailles de grandeur telle que la résine soit retenue et que les mycelia puissent passer, à savoir un tamis comportant normalement d'environ 10 mailles à environ 200 mailles, s'est révélé efficace pour la séparation, étant donné qu'il ne se produit aucun colmatage ou bou- chage du tamis à l'aide de mycelia ou de bouillon épuisé, comme on a pu l'observer. Pour faciliter davantage cette
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séparation, un tamis du type Vibrant peut être utilisé.
Si on le désire, on peut utiliser encore d'autre dispo- sitif de séparation, notamment des cyclones, des tables à secousse ou des classeurs.
Pour éluer de la résine échangeuse d'ions l'ac- ticité antibiotique adsorbée sur cette résine, on fait usage d'une solution d'élution aqueuse contenant un élec- trolyte. Dans le cas de la novobiocine, des solutions acides a ueuse; contenant un solvant organique pour la no- tobictine se sont avarées efficaces. Ainsi, des solu- tions aqueuses d'acide chlorhydrique ou d'acide acétique mélangées à un solvant organique approprié miscible à l'eau, tel qu'un alcool ou une cétone, se sont révélées satisfaisantes pour l'élution de l'activité novobioini- que adsorbée sur la résine échangeuse d'ions. La concen- tration du composé acide dans la solution d'élution est, de préférence, comprise entre environ 1 % en poids/volu- me et environ 10 % en poids/volume.
La phase organique peut être constituée d'environ 70 % à environ 98 % du solvant organique avec environ 30 % à environ 2 % d'eau.
Dans le cas d'autres antibiotiques que la novo- biocine, des solutions d'élution appropriées peuvent être utilisées pour éluer de la résine échangeuse d'ions l'activité antibiotique absorbée sur cette résine. Ainsi,) dans le cas de la néobicine et de la cytovirine, l'ammo- niac en solution aqueuse constitue une solution d'élu- tion satisfaisante. D'un autre côté, l'acide chlorhydri- que en solution méthanolique est efficace pour l'élution de l'eulicine et de la streptomycine.
L'élution peut se faire soit en colonne, soit par lots, bien que l'élution en colonne soit préférée, à cause des plus petits volumes qui sont nécessaires et à cause de la facilité relative des analyses périodiques
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de l'éluat et de la division de celui-ci en fractions, qui se fait aisément dans le cas où une colonne est uti- lisée pour l'élution.
. L'éluat peut être soumis à un traitement subsé- quent en vue de le purifier davantage. Ainsi, dans le cas de novobiocine, on peut faire passer l'éluat à tra- vers une colonne chromatographique, telle qu'une colonne d'alumine qui a été lavée avec de l'acide sulfurique di- lué et avec de l'eau, après quoi on peut traiter l'éluat purifié et décoloré à l'aide d'une solution acide, telle qu'une solution de méthanol et d'acide acétique, en vue de cristalliser la novobiocine acide. Les cristaux ré- sultant peuvent être filtrés et lavés, par exemple avec une solution méthanolique aqueuse, puis filtrés et séchés, Si on le désire, divers sels de novobiocine peuvent être préparés à partir de cette novobiocine acide, par des techniques de neutralisation appropriées.
Le procédé suivant la présente invention sera illustré davantage dans les exemples suivants. Ces exem- . ples sont donnés à seul titre illustratif et ne doivent pas être considérés comme limitant la portée de l'inven- tion. Ainsi, d'antres antibiotiques que la novobiocine, notamment la streptomycine, la néomycine, l'eulicine, la cytovirine, la pénicilline et analogues, peuvent être isolés de bouillons de fermentation, pendant la fermenta- tion, selon le procédé de la présente invention.
EXEMPLE 1
A 29 ml d'un bouillon de fermentation de novobio cine, on a ajouté 1 ml de résine "Dowex 1-X2" (50-100 mailles ; cycle chloryre) préalablement stérilisée par traitement avec de l'éthanol anhydre. On a laissé la fer- mentation se poursuivre pendant une période totale de
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168 heures. La résine a ensuite été séparée du bouillon épuisé à l'aide d'un tamis à 70 mailles et placée dans une colonne dtun diamètre d'l cm et dtune hauteur de 6 pouces. La résine a été lavée par le bas à l'aide de méthanol et éluée au moyen d'une solution aqueuse à 16 % dtacide chlorhydrique dans une solution méthanolique (2 N) à raison de 0,2 ml par minute.
On a constaté que l'éluat contenait 20. 000 unités d'activité novobiocinique.
Cette détermination de la teneur de l'éluat en activité mao biocinique représente un rendement (par rapport à l'éluat) de 75 %, en comparaison d'un essai parallèle effectué en l'absence de résine.
Le tableau suivant résume les résultats obtenus en opérant par le procédé décrit dans l'exemple I, avec des additions de résine à des moments différents.
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Moment <SEP> de <SEP> l'addi- <SEP> Temps <SEP> de <SEP> Volume <SEP> Volume <SEP> de <SEP> Rendement <SEP> par
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<tb> culation)
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<tb> 156 <SEP> 168 <SEP> 2.721 <SEP> 35#3 <SEP> 85#4
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*1 Résine stérilisée à l'aide de vapeur.
#2 Basé sur essai parallèle en l'absence de résine.- #3 Résine non stérilisée.
#4 Basé sur l'activité dans le bouillon au moment de l'addition de résine.
EXEMPLE II
A 3.000 ml de bouillon de fermentation de néomycine, on a ajouté 180 cc de résine "Duolite C-25", (cycle sodium), préalablement stérilisée par traitement avec une solution à 70 % d'alcool, éthylique et 30 % d'eau. La résine échangeuse d'ions "Duolite C-25"
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est une résine échangeuse de cations du type polystyrè.- ne-divinylbenzène sulfoné ayant une structure fortement poreuse. Cette résine est fournie par la société Chemical rocess Company, Redwood City, Californie. La résine a été ajoutée 48 heures après l'inoculation et le bouillon a été récolté 163 heures après l'inoculation. La résine a été séparée du bouillon épuisé à l'aide d'un tamis à 28 mailles.
Après lavage à l'eau, elle a été placée dans .une colonne d'un pouce et lavée à l'aide d'un courant ascendant d'eau, de manière à éliminer les solides rési- duaires de la fermentation. La résine a ensuite été éluée à l'aide d'un courant ascendant d'une solution 1 N d'am- moniaque, à une vitesse de 3 ml par minute. On a consta- té que l'éluat contenait une activité correspondant à un rendement de 90 %, sur la base d'un essai parallèle effec,; tué en l'absence de résine.
La néomycine peut également être adsorbée sur la résine "Amberlite IRC-50", qui est une résine échan- geuse de cations du type polystyrène-divinylbenzène aci- de, qui tire ses caractéristiques d'échange ionique principalement de groupe acide carboxylique. Cette résine est fournie par la société Rohm & Haas Co , Philadelphie, Pennsylvanie. L'antibiotique en question peut également être absorbé sur d'autres résines de la classe des rési- nes échangeuses de cations acides.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.