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Publication number: BE621438A
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Description


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  "Procédé pour préparer la   glutamine   par fermentation" 

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 La prduoiite invention est relative à un procédé pour la préparation de la If+) glutamina. 
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 Plus particulièrement, elle SI) rapport , à un procédé 
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 pour la production directe de la L-glufcaaina par fermentation, à partir de saccharide3 et de source3 d'asota. Plus spéciale- :sent l'invention se rapport'" à un procédé pour obtenir \:.ne t..gluti1miJ:I,e par ferraentation, en cultivant un miero-crgaiaBte producteur d'ecide glutluzlqtie, dans un milieu nutritif appro- prié, contenant une concentration élevée eu ions d' <luuaon1um. 



  On a constaté que la 1&lutamir.c est d'une très grande utilité en tant que  (SCLlcassent;, en particulier conima rersèda 
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 prophylactique et curatif pour l'ulcère de l'estomac. Il 
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 s'ensuit que lft3bli5LI(t;nt d'un procède de production écho- nomiqu.e de la. L"iluta:11ne offra un grand intérêt du point de 
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 vu } commercial. 
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  Les auteurs de la présente ont déjà découvert antérieu- rement des micro-organismes qui produisent ilacidt glut.nai.que directement, avec un h;1.lt rezidi,-mti4t, dans iL'1 milieu de  uiture contenant un saccharide et une source d'azote, ainsi qu'! ia procéda industriel pour produire l'acide gluts!t1ique en utili- sant ces micro-orgsàiismea. (Voir le brevet américain No 3.003.925). 



  Les inventeurs ont an outre étudia un procédé viaauk à accumuler de la glutanine direct;::oI\1; dcuié un milieu de cul- ture, en une quantité importante, en utilisant les souchns en qusstiol', et ont désormais découvert que ces aicro-orgsuis'Bes peuvent produire et accusuler une quantité remarquable do -ltz. tamins dans un milieu de culture lorsque 'ce milieu contiMtt tanontiellement certaiiis sacd:ft.r1defl et est additionné d'une source d'azote telle que les cals d'Jon1um, etc., en uns 
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 quantité supérieure à celle requise pour la croissance du micro-organisme et pour la production de l'acide glutamique. 

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  Partant de Co qui précède, la présent iuvtntîon a peur objet d'établir un procédé pour produire la gluta3in* à un prix de revient modéra, en utilisant une source d'azote bon marché, telle que lea sol$ d'aon1um, conjointement avec le saccharids. Un autre objet de la présente invention est Il'.... 
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 tablir un procédé pour produira la glutamine directement. dans un milieu de culture liquide. D'autre  objets de l'invention ressortiront au cours de la description ci-après. 
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  Pour la raie  en oeuvre de la présent* invention,, on. peut employer  cornac t18;;cbaride, diverses matière:! amyLwd*40 telles que les pornos de terre, les patates, le froment) :Le malge et analogues, l'amidon obtenu à partir da ces produit.:, na lî- ' queur saccharifiée, le saccheircaee le glucose, le .iactoi  , 1  j m4lasse, et analojju 3  La source d'azote peut 3tr1I confltitul.. ;

   par divers compo3(.s azotés inorganiques, tels que 1$ sulfate, d'.;U'.i111oniu!1l, la chlorure d$a.'!!.'1!.oni\U!l, le siitrate d'aaxsoniua, 1< .. phosphate dtammonium, le carbouete d'ammou4-um, le tertrate d'ammonium, l'acheta d'c.n:.n:oulu.m., l'hydroxyds dammonium, le gaz ammoniac et ainsi que 1091 composta  notas org.1iques, tels que Iturde, et analogues. d'atitres termes, on peut amployer n'importa quel de ces composée) pour autant qu'il soit aaeîmîlable par la couche que l'on désira employer, La fermentation peut 3tro effectuée dans des conditions 
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 aérobies, par exemple par un culture secoure ou agitée, avec 
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 aération. Une gamma de températures coavenable pour cettt culture s'étend de 24* à 37&0, en particulier da.28* A 3300. 



  Pour obtenir la çlutaxaine avec wi rendement élevé  il 
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 est préférable d'ajuster le pH du milieu de culture dans la 
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 g'1mme s'étendant da 5,5 z 8,5, par l'addition d'un agent neu- 
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 tralisant au début de la culture ou au cours de colle-ci. 
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 L'agent neutralisant peut etre le gaz ammoniac ou une solution 

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 aqueuse d'ammoniac, un alcali caustique (hydroxyde de sodium, hydroxyde de potassium,   etc.),   le carbonate   d'ammonium,   le carbonate de calcium, l'hydroxyde de calcium, ou d'autres pro- duits. L'addition de l'urée, en vue d'apporter de l'ammoniac et, simultanément, ajuster le pH, est plus efficace pour la production de la glutamine. 



   Après une période de culture de deux à trois jours, une quantité remarquable de glutamine s'accumule dans le milieu de culture, en tant que produit principal. On filtre le bouil- 
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 lon de culture La glutamlne soutenue dans le filtrat est ad- sorbe* sur une résine éehangeuse d'ion(l, puis élude. On con- contre l'éluat tout en le   maintenant     à   l'état presque neutre, on l'additionne d'alcool et le   refroidit,   pour produira la 
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 cristallisation de la glutamine, que l'on sépare par centritu- galion et que l'on purifie ensuite par   recristallisation,   de maniera à obtenir la   glutamine   pure. 



   En substance, les souches employées dans la présente in- 
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 vention pont des miro-orgallis.:ne3 producteurs d'acide gluta- mique. Lors de la formation de l'acide glutamique à partir d'un saccharidd et d'une source d' /nou1..c, ces micro-organis- mes ont évidamaent besoin d'un apport d'ions d'ammonium, re-   ' quia   pour la formation du radical   amine   dans l'acide   glutami-   que.

   Pour assurer l'accumulation de l'acide glutamique   ave@   un rendement élevé, il est préférable   d'effectuer   l'apport des ions d'ammonium par portions ot de façon continuelle, étant donné que la production de l'acide glutamique est interrompue 
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 si les ions d f lumoniul!1 sont présente dans le bouillon de cul- ture en une concentration plus élevés que celle requise pour la formation da l'acide glutamique. En effet, lorsque les 
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 ions d'ammonitua sont pr,;3ents darts le bouillon de culture à une concentration beaucoup plus élevée, une quantité remar- quable de g2utau.dr,e s'accumule dans ce bouillon, avec diminu- 

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 tien de   1' accumulation   de   l'acide   glutamique. 



   Un   résultat   expérimental montrant la   corrélation     @ntre   
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 la quantité d'azote incorporée et le formation de la glutamine et celle de l'acide glutamiaue ressortira du tableau 1 ci-aprém.- Tableau , 
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 sulfate dt-mmo-0 G1utamina Acide glutamique Poi4* de  e  XXu- ! nium ajout* <1 JmK/ml) "....,.w JLBJ!####, 1,0 2,0 20,0 ' .( . 10,0 , , ' . 2.0 \ 5,4 IX ,0 1. : , , 3,0 7,0 6,0 ...< :"1.,0, 4,0 10,0 3,0 A.0,0 500 12,0 2,0 zur0 1 6,0* , 13,0 1,0 use3 7,0* 14,0 2,0 11<4 8,0  13,0 1,0 11,4 9,0' i6,t3 ),0 10,0 
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<tb> 10,0* <SEP> 15,0 <SEP> 2,0 <SEP> . <SEP> 10,0 <SEP> 
<tb> 
 Le sulfate d'ammonium a   été   ajouté après la croissance des cellules. 
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  Dans cet essai. la Micro coccua glutemieus ATCC N. 14751 a été cultivé dans un milieu ayant la composition   suivante,   avec agitation, dans des flacons ou fioles, pendant 70   heur ,.   
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 à 30 C : Glucose 10,0% 
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 KH2 PO4 0005%      
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 K2HP04 0,05% MgS0487H20 0105% }fuS0484H20 Qe002% FeS04.7H20 0,002vii Urée . 0,5% 
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 Biotine 2,;ï t /1 (NH4)ZS04 (voir tableau l) 

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 Comme il ressort du tableau   1,   la présente invention 
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 convertit la fermentation glutnmiqu3 habituelle f-a une i srx  tation glut.1lC1inique, en élevant la concentration en ions dtazn.

      monium   dans le milieu de culture jusqu'à un niveau supérieur à celui requis pour la prolifération des cellules et pour la 
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 formation de l'acide blutM1ique. Par conséquent, on peut af-      
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 !'1nner que la présente invention   établi un nouveau procédé pour la production industrielle de la glutamine.. 



   Il résulte de ce qui précède que le milieu de culture employé dans la   présente   invention contient, en plu3   d'un   
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 acchrid8, une source d'azote en une quantité supérieure à celle requise pour la prolifération des cellules. La quantité 
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 du produit formant la source deazote correspond à une propor- tion non inférieurs à 5 parties en poids d'azote assimilable pour 100 parties en poids de carbone assimilable, dans le   mi-   lieu. 



   Dans le procédé   suivit   la présente invention, l'addition d'un excès de source d'azote, soit au stade initial de la cul-   ture,   soit après la prolifération des cellules, constitue une 
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 mesure efficace. Lorsquto4t-mploàe une concentration particu- lièrement élevée de sulfate d'ammonium par exemple, il est pré- ' ±érable d'opérer l'addition, après la prolifération des cellules.; 
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 On n'08 pas limité à un micro-organisme particulier de- vant être employé pour la fermentation suivant l'invention, pour autant que ce micro-organisme soit capable de produire 
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 ltkaide glutja#ique.

   Etant donné que la fermentation suivant   l'invention   est effectuée en présence d'un sel   d'ammonium   en une concentration élevée,   corne   indiqué plus haut, la biotine est tout   aussi   efficace dans la production de la glutamine que 
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 da.n8 la fermentation glutamique* La présente invention sors décrite d'une façon plus dé- 

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 taillée, en se reportant aux exemples ci-après, lesquels ne sont cependant exposés qu'à titre indicatif, mais non dans un but limitatif, Exemple 1 
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 --r Le Ilierococcus LutatHicus ATCC NQ 14751 - d'autres chercheurs classent éventuellement ce même organisme comme ;

  tant un l,ücrococcu$, un Brevibacterium, un Corynebact6ri-im ou un sactsri um -. a servi à l'ensemencement d'un milieu de culture contenant 2,0% de glucose, 1,01 de peptone, 0,5% d'extrait de viande et 0,25% de :,nul, et mis en culture pendait 24 haures, avec agitation. La culture de semence   obtenue,   en une quantité de   300   ml a été utilisée pour ensemencer 3 litre:) de milieu de culture de la composition suivante, placé dans un vase de fermentation d'une contenance delitres; 
Glucose   10,0%   
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 . (Hj^a0 ,17 l# f-O O,t)5% K2HP04 6,05$ :4:gS. f HCt ' 0,05% M."1SC 4 . 4H20 0, C?02,6 YeS04.7H2o O.02.. 



  Urée 0,5% 
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 Biotine 2,5*/l   Caca)   2,0% Le milieu ensemence a été mis en incubation à   30*Ci   aveu 
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 agitation à 600 tt 11"5 par minute, l'air étant i*,foul6 à travers le milieu avec un t ébit d'environ 3 litres/m1ri. La quantité de gl1fJ.t:.amiI16 dans le milieu augmente .d'une façon remarquable gaz partir de la 3se hure et atteint le maximum au bout de 70 heu- res, à savoir, li 19/ml.

   Te quantité d'acide 4,,lutaeoue pro- duite à ce moment 'eprêsente 7,0 Kg/#l, Le milieu de culture est filtré,   conce   ré sous pression réduite, dans des   condi-   

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 tiona de neutralité et est ajusté â un pH de 3 à 4 par l'ad-   ditiou   d'un acide, à la suite de quoi l'acide glutamique pré- 
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 sent dans le bouillon cristallise. Après séparation de liacide,, la   glutamine   contenue dans le bouillon a été adsorbée sur une résine échangeuse d'ions, et éluée. L'éluat a été concentré, additionné d'alcool éthylique et refroidi, pour fournir 35 g de cristaux bruts de glutamine. 



    Exemple   2 
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 Le Kicrococcus glutamicus ATCC N  14752 a été utilisé pour ensemencer 300 ml de milieu de culture de la composition ci-après, placé dans une fiole   d'Erlenmeyer   d'une capacité de 
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 2.000 ml, et mis en incubation à .30C-, avec agitation :

   Glucose   10,0%   
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 NH4Cl h, 0n KH2P04   0,05%     K2HP0 0,05%     MgS04.7H20   0,05% 
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 I nS0404H20 07002% 
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 F850p s7H0 0,002% Urée   0,5%   Biotine 1,0   [gamma]     /1   Thiamine 1 mg/litre 
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 caco3 2,0% 
Après une incubation de 72 heures, la quantité de gluta- mine produite était de 23   mg/ml.   Le traitement du milieu de culture, effectué comme dans l'exemple 1, fournit 5,0 g de glutamine. 
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  P.x.n 3.e 3   On   a effectué la culture comme dans l'exemple 1, mais   @n   
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 a adopté) dr..L-4s la composition du milieu de culture, une cox centration de Q,!>'5± de (lJHl)2S04 et l'on a ajouté du (UH4)2[1\ au milieu de   c@lture     âpres   la prolifération des cellules 

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   (20.  heures après   :La   commencement de la mise   en     culture),  de 
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 manière à porter la conct-.,nt.ration à 6%. Au bout de trois' jours d'incubation, on a obtenu 18 mg/ml de glutamine. 



  Exemple 
Une souche de   B&cillus.   subtilis a été   utilisée   pour ense- mencer 20 ml   d'un   milieu de culture ayant la composition   sui-   
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 vante et placé dans une fiole d'Erlenmeynr d'une capacité de 250 ml   Glucose   5,0% 
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 (IdH4)50 >,,c$ .# ¯' '¯' l¯ - ## P.H2F''ü G f C?5h,' ',.-;\'-.''.;:':.''.-:' î;2hpo4 0 C5% *.-V.' , Extrait de le-vura 0,1 :fSl).7HZC) 0,05% buriso 4* 411 z 0 0, C:.r ra0.?Hfi 0,001% caco 2, C;4 pH 7,0 
Après   uno   incubation de 72 heures, avec   agitation,     à     28,,ce   on a obtenu 1 mg/ml de glutamine. 



  Exemple 
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 La souche E2cherichia coli 1J  128 a été cultivée comine      dans l'exemple 4. On a obtenu 1,5  mg/cl   de glutamine au bout de 60   heures   d'incubation. 



  Exemple¯ 6 
 EMI9.5 
 Une souche de Streptolayees tansshiensia a été cultivée conformément à l'exemple 4, sauf que   l'on   a utilisé, en guise 
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 de saccharide, une solution d'amidon de patate, aaccharifiga par l'action d'un acide. Au bout d'une incubation de 82 heu- res, on a obtenu 2 mg/ml de glutamine. 



  Exemple 
Une souche de   Torulopsia     utilis   a été mise en culture 

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 comme dans l'exemple 4. Au bout d'une incubation de 78   heures, :   on a obtenu 1,2 mg/ml de glutamine. 



   Exemple 8 
On a ensemencé avec la souche Aspergillus   oryzae   N  3216   un   milieu préparé en dissolvant 100 g de glucose, 2 g de li-   queur   de "corn steep", 40 g de (NH4)2304, 1 g de K2HP04, 
0,5 g da MgS04.7H20 et   20   g de   CaCO,   dans 1 liera d'eau, et l'on a mis en incubation à 33 C, à l'état submergé, tout en agitant et en faisant passer de l'air. Au bout de 4 jours . d'incubation on a obtenu dans le bouillon de fermentation 
3 mg/ml de   glutaminé.   



    Exemple,$   
On a opéré une culture comme dans   1'exemple   1, en rempla- çant, dans le milieu de culture de ce dernier exemple, le (NH4)2S04   gaz   4,0% de NH4C1, tandis que le pH du bouillon de fermentation était contrôlé en introduisant de   l'urée   ou moyennant un apport de gaz   ammon@ac.   25   mg/ml   de glutamine ont été obtenus après une incubation de 72 heures. 



   REVENDICATIONS --------------------------- 
1. Procédé pour produire la L-glutamine par fermentation, ce procédé comprenant les dispositions qui consistent à mettre ;      en culture dans des conditions aérobies un micro-organisme      producteur d'acide glutamique, dans un milieu de culture ap- . proprié ayant une concentration en ions d'ammonium plus grande que celle requise pour la prolifération des cellules et à ajua- ter le pH du milieu de culture dans les limites s'étendant de 
5,5 environ à 8,5 environ, l'incubation étant opérée à une ; température comprise entre 24 C environ et 37 C environ. 

**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.

Claims

2. Procédé pour produire la glutamine à l'aide de micro*- organismea, comprenant la disposition qui consiste à mettre <Desc/Clms Page number 11> en culture un micro-organisme producteur d'acide glut@mique EMI11.1 dans un milieu de culture contenant un aacchar1de et une tour. çe d'azote, la quantité de la source d'azote correspondant à une proportion non inférieure à 5 parties en poids d'azote assimilable pour 100 parties en poids de carbone assimilable présent dans la milieu.

3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel une partie de ladite source d'azote est ajoutée au ailier sprès la prolifération des cellules.

4. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le EMI11.2 micro-organisme est une souche de Hicrococcua lutymiicua 5. Procédé suivant la revendication 1, Jans ± quel le EMI11.3 micro...organisme est une couche de aç,!:.l11!. subtil!; 6. Procédé suivant la revendication 1, 1anlS leqtxel ledit micro-organisme est une souche de Esche qt4i:a òli..

7. Procéda su.i vart la revendication le dans ledit,* micro-organisme eet uns souche d4t Stztspzomyctis t!.J1J1"hi!!Hi!.

8. Procédé suivant la revendication le dans lequel lotit micro-organisme est un.9 souche de T 1:lopsi8 Utîlî-.1.

9. Procédé suivant la revendieMion 1, dans l quel ledit micro-organisme o5t une souche de ka2ereîllus or±tat.