BE628482A - - Google Patents

Description

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   La présente invention est relative à la production d'une substance destinée a être utilisée en. médecine, pour augmenter la résistance à l'infection. 



   Il a été démontré que des préparations dérivées de levure possèdent une certaine activité, lorsqu'elles sont injec- tées par la voie parentérale, et stimulent la résistance humai- ne à l'infection. De nombreux travaux ont été effectués sur 
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 l'action anticomplémentaire de préparations de parois de cellu- les de levure, conjointement avec la protéine (jullet lc propor- dine. La préparation dénouée "zYl':1osan ", qui est un produit provenant des parois de cellules de levure, insoluble dans l'eau et sensiblement exempt de protéines et d'hydrates de 
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 carbone, est la matière active principale de ce cenre. On a montre que   l'activité   protectrice du produit eut principalement   due 3   des effets tels que la   stimulation   De la phagocytose et 
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 de l'action an4.-ie,iiique.

   Le produit eot un mélance complexe de lipides, de protéines, de polysaccharides, etc.,, et il exerce un effet pyrogène lors de l'injection. in raison deu effets pyrogène et antigène, ce produit présente deo inconvénients considérables pour l'utilisation en addecinc. 



  La demanderesse a découvert à présent qu'un facteur peut être isolé de la matière constituant la paroi de cellules 
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 de mycètea, cette matière étant aoluble dana l'eau, non pyroè- ne et non antique, tout en exeerçant une action protectrice non spécifique vi3-à-vis de l'infection. Le nouveau facteur peut, par conséquent, dtre utilisé en médecine, pour conférer une immunité non spécifique, aaia induire dea effets indvairabict quelconques. 

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   La présente invention a pour objet un procédé pour   @   la production d'une matière polypeptidique sensiblement non pyrogène et non antigène, possédant une action immunisante   non   spécifique, caractérisè en ce qu'on fait digérer une matière provenant de parois de cellules ue mycètes insoluble   dans   l'eau dans une matière acide ou alcaline, de façon à produire une fraction soluble dans l'eau, qui est ensuite séparée   d-   -a ma- tière aoluble dans l'eau et dont la matière polypeptidi   @e   non pyrogène et non antigène est récupérée. 



   Comme on l'a indiqué plus haut, au point de vu chi- mique, le produit est un polypeptide ou un   mélange   de pol   @ep-   tides, le terme "polypeptide" étant utilisé dans un sens   @@rge   pour définir des substances ayant une structure polypepti   @que        de base, indépendamment du fait que d'autres groupes, tel, que doe hydrates de carbone, sont également présents. 



   La matière provenant de parois de cellules de mycé- i   -ces,   qui est utilisée comme matière de   départ,est   constituée avantageusement do levure ou d'une matière dérivée ae levure, étant donné qu'une telle matiere donne des procuits partieu- librement effieaces, mais d'autres mycètes, par exemple des pénicillia, streptomyees,   utc. ,   pouvont   également     Être   utili- sés. 



   Le facteur actif se présente sous une forme   insolu-   ble, lorsqu'il se trouve dans la cellule   longique   et il con- vient, comme stade préliminaire, ae traiter les cellule.4, après lyse, de manière à eliminer les protéines, les hydrates de car- bone solubles dans l'eau,   etc.,   par exemple par lavage à   l'eau.   



  Il est également   avantageux   ae Traiter la matière provenant ae parois de cellules fongiques à l'aide d'une enzyme   protéoly-   tique, telle que la pepsine, la papaine, etc., avant de la laver 

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 à l'eau, en vue d'éliminer la matière protéinique insoluble par ailleurs. Un autre traitement de purification qui peut. avantageusement être effectue avant digestion, conformément à la présente invention, est un lavage à l'aide d'un alcool, tel que l'éthanol, le méthanol, etc., le lavage étant effectue, de préférence, avec de l'éthanol aqueux à environ 95 
Une matière de départ de provenance cellulaire spé- cialement préférée est la substance communément dénommée "zy- mosan".

   Ce terme s'applique à des préparations de parois de cellules de levure purifiées, qui se   caractérisent   pricipale- ment par le fait qu'elles sont sensiblement exemptes de   protéi-   nes et d'hydrates de carbone solubles dans l'eau. 



   La plupart des formes de   zynosan   se préparent, en soumettant de la levure, par exemple de la levure de boulanger de Pleichmann à une lyse, en utilisant, par exemple, une solution aqueuse bouillante de phosphate   aisodique,   puis en soumettant les débris cellulaires   insolubles à   une incubation à l'aide d'une enzyme protéolytique, telle que la trypsine, ordinairement en présence de toluène. L'incubation s'effectua normalement pendant une durée prolongée, par exemple pendant environ 16 jours, à uno température ae 37 C. La matière est ensuite bien lavée avec de l'eau chaude et finalement elle est lavée avec du méthanol à 95 %. La préparation de zymosans est décrite, par exemple, par Pillemor et al (J. Exp.   Médeci-   ne, 103, (1956) 1). 



   Lorsqu'une substance acide est utilisée pour la digestion de la matière provenant des   perois   cellulaires de le- vure dans le présent procédé, cette substance est constituée, de préférence, par un composé faiblement acide, tel qu'un acide aliphatique, comme l'acide acétique, l'acide propionique, etc., ou mieux encore par un phénol, tel qu'un mono- ou di- hydroxy- 

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 benzène. Le phénol à   90-100 'le*   est préféré. 



   Il a été constaté que, lorsqu'on utiliao dea phénols 
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 pour la diecetion, le produit est 80uvont insoluble dans les noidue, étant donv6 qu'il ao prûuento 130UO lu l'onao alun pro- duit poooudunt un poids moléculaire partioulioromont Glovû. 



  Lorsque d'autres acides sont utilisés pour la digestion, le 
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 polypeptide libéré est insoluble, jusqu'à ce que l'ac' le soit neutralisé ou jusqu'à ce que la dégradation en produl pré- sentant des poids moléculaires moine élevés ait ou lir , Parmi les substances alcalines qui peuvent être utilisées pro la digestion, on peut citer, par exemple, les hydroxyaes, \rbo- nazee, etc., de métaux alcalins ou d'ammonium en soluti aqueuse diluée, notannent l'hydroxyde de sodium, par ex nie cous Tonne d'une solution 0,05N à 0,5 N. 



  Le iacteur actif coluble dans l'eau peut être -paré en solution de la matière cellulaire résiduelle insoluble 
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 dans l'eau, par exemple, par centilugation liltration, etc., et, si on le oestre, le facteur solide peut être isolé, par 
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 exemple par Gvnporution, lyophilisation, précipitation, etc. lorsqu'on utilise au phénol comme agent alextraziont 1- fac- veur uotif eut vulLtl!l.ul't1I;On yr4niptttS ll/d.du d'un vivant ,non pulaixe, t...1 (tU'UII oUtr, liri hydl'OOt1l'tJ\.&rll, II(J., 0 lago f'f- rntven, l'athar dlüthyl1rut:. Lu solution phdnollque peut úVIn- rageusement être ajoutée à un mélange à deux phases d'éther 1Îlél.hyliquc et d'eau, do sorte qu'il se lorme un précipité dans la phase aqueuse.

   Ce précipita peut, si on le désire, être purl1i6 par addition d'nydroxyde umrnonique pour dissoudre le précipite, par extraction a l'aide d'un solvant non miscible, zel que 1'éther, pour éliminer les traces de phénol, et par lyophilisation pour isoler le facteur actif. 

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  Le facteur soluble dans l'eau peut, si ''n le dédirop 8tre noumia à un ou plusieurs traitements BUboô!10nto, on vue d'une purification ultérieure. Ainoi, par exemple, une mutiure do poido moléculaire Fouu faible peut tôt rt 'tJ:r'1.rn ,n0ft par don techniques do tamioaco nioléculairo, par exemple par dialyae, ultrafiltration, etc. ou, de manière avantageuse, par traite- ment à l'aide de matières pour tamis moléculaire, de préférence sous forme de particules, par exemple le dérivé de dextrane 
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 réticulé par de l'oxyde d'éthylenpdénommé Sephadox G50 (vondu par A.B. Pharnacia, Uppsala, Suède), la matière de poids molé- culaire bas étant absorbée dans les particules, tandis que le facteur actif reste non absorbé.

   La matière de tamisage molécu- 
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 laire est, de préférence, inpornéable à des substances possé- dant un poids moléculaire supérieure à 1000 et, do préférence, supérieur à 8000. On peut ainsi faire passer une solution aqueuse du facteur actif à travers une colonne de dextrane   @é-   ticulé, la première traction à laver étant constituée par le facteur actif désire, la matière de raible poids moléculaire   étant   retenue dans la colonne. Dans ce procédé, le facteur actif peut être lavé dans la colonne à   l'aide     d'une     solution   
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 nlutiline l111uJd, l4r OXOMIJIQ 14rio uolutl n u,0-p,", lit 'l'un nlol111, iloti4t'iminsit unu nulutlun  '(ueuo 0, 1M Ja J3\1Ut'u ()IHU"l1- que.

   Le dextrane réticulé ewt t e.vuntbL:Ul3èm6n uiu en colituot avec une solution aqueuse d'un sel de métal alcalin avant le fractionnement et l'élimination des aniono par lavage. Un électrolyte eot, do préférence, présent dans la solution à traiter, cet électrolyte étant avantageusement   constitué   par le même sel que celui qui est mis en contact avec la coloane. 



   La matière active présente un caractère acide et peut, si on le aésire, être adsorbée sur une matière   échaneu-   
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 se d'ions cellulosique Iaiblemer.: basique, par exemple au type décrit par Peterson & Sobor J.A.U.S. 751, (1956) c' 3t-i-diro 

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 une cellulose modifiée chimiquement ae manière à porter un ou plusieurs groupes   amino,   dialkylamino ou dialkylamino   @kyle,   par exemple de la diméthylaminoéthyl cellulose ou le produit de la   réaction   d'épichlorhydrine, de   triéthanolamine   et ce cellu- lose sodique, cette matière étant   eluée   après avoir été lavée jusqu'à être exempte d'impuretés non absorbées.

   Le produit d'élution est avantageursmenet un électrolyte aqueux,   @ar   exem- 
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 ple une solution aqueuse faiblement alcaline, telle ( 'une solution aqueuse diluée d'un hydroxyde ou carbonate cl n métal alculin ou a'n.^..caonium, pnr exemple une solution a'une ornalité de 0,05 à 2 N, ou une solution neutre contenant un ou usieurs sels, par exemple un nalognure ae métal alcalin, 'tol le chlorure rie sodium, dans une solution tamponnée à un pi. ' 7, notamment un phosphate tendre. La matière échanoeuse dl as est, ae prférence, tamponnée à un pH compris entre 6 et 10 et, de préférence, entre 6,5 et 8,5 et la solution à traiter est, de préférence, tamponnée au mené pH. La concentration en matières solides de la solution est de prérérencu de 1 a 2 # en poids. 



  Un autre traitement de purification, qui pue"' tre avantageusement utilisé, est l'adsorption dù facteur actif sur une substance qui adsorbe sélectivement les matières de poids moléculaire élevé, par exemple, un silicate complexe, tel que de l'amiante, de la bentonite, de la   célite,   de la montmorillonite, etc., cette adsorption étant suivie d'une élution, après lavage jusqu'à ce que le produit soit exempt d'impuretés de faible poids moléculaire.

   La matière adsorban- te préférée est l'amiante, cette matière étant spécialement erficace et permettant l'adsorption du facteur actif à des pH   neutres,' par   exemple de 4 à 7 et, de préférence de   5 à   6, tan- dis que l'élution peut s'effectuer avec des liquides basiques, par exemple avec des solutions aqueuses diluées d'hydroxydes 

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 et de carbonates de métaux alcalins ou d'ammonium ou avec dès phénol tels que le phénol lui-même. L'éluant peut aussi être conatitué par une solution à concentration élevée en électro- lyte, -telle qu'une solution aqueuse de chlorure de sodium. 



  Un traitement ae purification qui peut ausoi être appliqué est celui qui consiste à ajouter un agent de précipitation pro- téinique inerte à une solution aqueuse de la matière polypep- tiaique, de manière à la séparer de l'extrait aqueux. 



   L'agent de précipitation proteinique peut 8tre ajou- té, tous forme d'une substance solide, telle qu'une substance inorganique soluble dans l'eau, par exemple un sel, comme le sulfate ammonique, le chlorure ammonique,   etc.,   ou sous forme d'un acide phosphotungstique, cet agent de précipitation pou- vant aussi être un liquide, par exemple une solution concentrée des substances précitées. 



   La matière de poids moléculaire élevé contenant la matière polypeptidique peut   cire   précipitée dans l'extrait aqueux et séparée, par exemple, par filtration, centrifugation, etc., Ou bien, elle peut être amenée à se dissoudre aana une phase organique distincte. La phase organique peut être cons- tituée par un liquide non miscible à l'eau ou, de préférence, par un liquide polaire qui est normalement miscible à l'eau, mais forme une phase distincte, lorsque la phase aqueuse con- tient de grandes quantités de matière dissoute, comme cela est le cas lorsqu'un agent de précipitation constitué par un sel minéral est utilisé. De tels solvants polaires possèdent une plus grande solubilité pour le facteur que les solvants non polaires. 



   Dans un mode d'exécution de ce procédé, l'agent de précipitation protéinique est ajouté à une solution aqueuse contenant le facteur actif et un solvant miscible à l'eau, de façon qu'il se forme deux phases, la phase organique étant sé- 

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 * par do ot la .a tière active en étant récupérée. 



  L'n gdnéral, le pH de l'extrait aqueux affecte la 3-DZ.- ration et la (luantit4- d'agent do précipitation utiiiaoo aoit 6tre en corrélation avu le pli. La présence d'aufreo Huca-can- ces aisoouteo, par exemple ue liquides or,,an.Lcluus miacibluo l'eau, tela que llethaziul, l'acétone, etc., affecte au;,jl la concentration d'ncnt ue qui donne lec a v.1 - tate optimao. 
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  En général, lorsqu'on utilisa du sulfate #lm( -que comme agent de précipitation, la concentration optimal au col cot oomprioo entre 25 et 60 ;'< du la saturation, lo 5tnnt, vu IIl'Ól'v,'/.IIlO'7, 'J().I)J.'10 ontru 5  t U' Lorsqu'on \1'.. ino auaai un solvant organique miucible h. l'eau, t,,l quu 11... ,a- nol, la quantité de co solvant est Qvanta.2euocnont compr..ze entre 30 et 60 % de la phase aqueuse, les proportions exactes 
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 de sulfate aniaonique et de liquide miscible à l'eau étant   choisieo   pour que l'on obtienne deux phases. Ainsi, lorsqu'une concentration de 46% en éthanol est utilisée, la concentra- 
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 tion en sulfate amnonique peut être de 25 en poids. 



  La quantité de liquide organique ajoutée est, de 
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 préférence , calculée, de façon à obtenir un volume relat.'. #"<##- 
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 ctent faible dans la phase suparéo, de façon qu'une ccncentrrx- tion du facteur actif ait lieu. Il est à noter que lorsqu'un ajoute de   l'éthanol,   une certaine quantité de matière   indéai-   rable est normalement précipitée et peut être jetée, avant fractionnement au moyen d'un sel minéral. L'addition de l'a- gent de précipitation s'effectue, ae préférence, à la tempé- rature ambiante et les concentrations prérérées en agent ae précipitation, qui sont indiquées plus haut, ne sont pas tou- 
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 jours applicables oeu tcapuraturca plus ..:lev0ea.

   Cependant, le palypopcide cat stable jusqu'à 90 C et des tenpératuroa plus élevées peuvent être utilisées, sans que se produise une 

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   inactivation*   
La matière active préparée par le procédé suivant l'invention cet une   cub@tance   nouvelle qui tombe dnnu la por- 
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 te de l'invention. Cotte aubutanco peut etro caractéricco par oa 00lubi11tú dana l'eau, on particulier dans Ico alcalis dilués, dans lelhluelo elle produit une iluorceconce jauno- verdâtre, par non caractère acide, et plus   spécialement,   par le fait qu'elle possède une activité protectrice vis-à-vis (le l'infection, tout en ne possédant sensiblement pas d'activité pyrogène et antigène.

   Le facteur actif eat une matière poly- 
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 peptidique compoa.:o d'un nombre relativement petit u' ruQ1no- uoidtiu notamment I.1'Miùu (jlulanihiuo, (Ilttoidu {\UlIlH'1.!11UI1, d' uu- l. /111111 0, de lyoine, d'hiutidino, do (] J l Y c 1. n'J, au 0 Ut. l' 1 no, do pru- lino, a'alanine, ce valine, ue tyrouinc, ae zhre-otiine, do pnényl-alanine, ae leucine et aliso-leucine. La mdihionine et la cystéine y sont absentes. Le produit dans une réaction po- sitive au biuret sur une base pondérale sèche de 80 à 90% de 
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 sel de l'albumine. Ils pousèue une teneur zon azota de 12 et contient environ 2 d'hexose, ce pourcentage étant aéter- miné par le procédé de l'antnrone. Il se colore par addition du réacti: aaiao-Schnarz (réactif teignant les protéines). 



  L'élel,;"tIophorè6c our papier avec un t aapon de vrrunal il un psi de 6,7 deaontie que le produit est charnu négativement. Il est stable a la chaleur jus ,u'à 10v*C. t.;ont;a1I't::1ent a ce qui se passe avec ces at1rec par ailleurs très ceolablc3, prpa- rées au départ de foie et   ae     sang,   de la manière   accrite   dans le brèves belge n  501 063, la matière obtenue par extraction au phénol de zymosan précipite en solution acide. Elle est, 
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 par conséquent, précipitée par l'acide oulfosaliov,rlique.

   C,!pl2n- dant, la matière obtenue par extraction au phénol de myceline de   pénicilline     pa.aiz   coluble dans leo acides   aqueux   et   n'est   pas précipitée par l'acide   sulphoaalicylique.   Cependant, toute 
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 Aa latibr-o est précipitée :',r l'acide ,hoIJÍ,1.oiun,..;st1<iuC 

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 et par le sulfate arqonique à ci-saturation, comme indiqua 
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 plue haut. 
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  Les pi'opriiit 5o biologiques de la nouvelle substance sont los u1vtùs: Inhibition de ito3e. La matière empcche la mitose de cellules d'iléla lori,tulelleu pouoscunt dans le milieu de puck à uno con- contration de 0,75 li1/rnl 0,33 ne/ml proauioont une tilbition à 5 0 i. 



  Proxeotion contre le virus de la variole. 
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  (il) embryon de noulet. 
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  Quantité de matière adminiotrde à des embryons de ulet3; 3,3 jag. 
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  (b) Peau do lapin. 
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  Protection contre l'infection de B.Coli chez la souris. 



  Dose bactérienne 1,25 x 10 organismes par souris. 



  On a injecté z ng de natiere par voie intrapérizonrnle avnr.t administration de la aosa bactérienne . 

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<tb> souris <SEP> suryivahtes/nombre <SEP> total
<tb> 
<tb> do <SEP> souris.
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  Matière <SEP> injectée <SEP> 24 <SEP> heures
<tb> 
<tb> 
<tb> avant <SEP> administration <SEP> dooe
<tb> 
<tb> 
<tb> bactérienne <SEP> 6/18
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Matière <SEP> injectée <SEP> 24 <SEP> heures
<tb> 
<tb> 
<tb> avant <SEP> administration <SEP> dose
<tb> 
<tb> 
<tb> bactérienne <SEP> 5/18
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Matière <SEP> injectée <SEP> 6 <SEP> heures <SEP> avant
<tb> 
<tb> 
<tb> administrution <SEP> dose <SEP> bactérienne <SEP> 0/18
<tb> 
 Toxicité. 10 mg ont été injectée par voie intraveineuse à qua- tre lapins sans aucun symptome toxique. 



     Cornue   indiqua plus haut, le produit est sensiblement non-pyrogène et ne révèle sensiblement pas d'activité antigè- ne. Lorsqu'il est injecté, il confère de l'immunité   vis-à-vis   du virus de la variole veccinique, de l'E.Coli et d'un nombre considérable d'autres   bactéries   et virus. On a constaté aussi qu'il confère une résistance aux virus courants du rhume, pur exemple par pulvérisation directe dans la muqueuse nasale. 



   Le nouveau produit suivant la présente invention peut être formulé, en vue de son administration, avec un ou plusieurs excipients pharmacoutiques, La nature au ou des excipients utilisés dépendra du type de préparation voulu. Les compositions peuvent avantageusement se présenter sous forme d'unités de dosage ou de   Josos   posolgoiques contenant chacune avantageusement 5 à 20 mg de polypeptide actif.

   En général, les préparations peuvent être composées en vue de l'adminis- tration par la voie parentérale, auquel cas l'excipient est constitue par un liquide parentéralement acceptable, tel que de l'eau apyrogène stérile, ou pour l'administration par la voie buccale, auquel cas les excipients peuvent être consti- tués par de l'eau, un ou plusieurs agents d'aromatisation, de conservation, de dispersion, de coloration, d'édulcoration, etc., pouvait être ajoutés. Les préparations peuvent egalement 

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 ao présenter souo forme do préparation solides, par exenpic noue forme de comprima contenant le facteur actif.

   DanD #u-\<i forme do rdalirtation pr,3±cr(o, la coluttoit finuler.;onz obzenuo est lyophilio:c, <<:-diucoutc d=z3 de l'eau apyrone oterile et etériiii6c par pilooii-,o danu des filtres en verre fritte 
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 approprié. 
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  Le facteur actif peut aussi être formulé <# vue l'une administration topique, par exemple en uolution aquc ,o pulvériser, cette solution aqueuse pouvant contenir : agent do conservation toi que do l'uthanol ou du p-hydroxy. izooto du )n'hyln ou a'iUhyle, La solution de puLvSriortion peut, par exmi - , conte- nir 0,01 t 10 ; on poids, et de préférence, 0,05 à 0,5 ., ':1l poilu de natiùre active. 



  Les exemples suivants, qui sont donnas à seul titre 
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 illustratif, pemst iront de bien comprendre l'invention: r:x.à;.rpL3 1. 



  On ajoute 0,2 C de zymosan Z.Lifht & Co. Ltd., l:;ng111nd; rov:n< nt <le lovure .:.ru!chr.: (type A de ,:'leic{lflF1.n.n) l 25 fil de phénol 2ï 9... 5 et on a la3r,6 le :.i l#ine 6. 3- ', pen- aarit 2 jour;:. La raati6rc non d19:JOut a c;tC 3parco par :;er.- trifuation et le rÚ31du a Ótù lave avec 5 mi d'd-4ha-iol 'a 90 >. 



  L'extrait nhOnaliquo a ESt,; ajouté i l.)0 ni d '6thcr et 150 ni d'euu et agites dnjia un entonnoir séparateur. La couche aqueu- se; contenait un ,.orJc1..i t. A la oolution ou cruche a(jaeuse, on a ajouté une solution d' a!."'J.10nlac 2N, en aorte que toute la matière non diascoute a sensiblement été rlise en solution. Pour éliminer les tracca ce phénol, la solution a été eX1:rai te avec ce l'éther et aéchée pc:r congélation. On a ainsi obtenu 17 t: d'une .:;1f.ltioro:: uolidc lr....'1c:'.e. 

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   (b) La matière solide obtonuo en a) a donné, lors- qu'elle a été injectée à 4 lapins à une dose do 0,1 mg par lapin)   l'augmentation   maximale suivante   (le   température:   0,7'U,   0,6 C,   O,y C,     0,3 C,   ce qui montre que la substance présente un caractère proygène négligeable. 



   La matière soliae obtenue en (a) ne révèle aucune réaction antigène, ai l'on en juge par   l'eoaai   sur la peau, lorsqu'elle est administrée, par injection, à l'être humain à une dose de u,l ng. 
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  (c) PJ.'o<1ction contre l'infeoLion par le .Coli uhez lu fi 1I)U)'lI1. la mu liera solide obtenue en \0) c!)Hfro un pouvoir protecteur, ainsi que le   revoient   les chiffres suivants. 



   Dose bactérienne 1,25 x 108 organismes par souris. 
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  On a injecté U,ul6 a&- de matière solide par vole intraperitoné- ale par souris. A un groupe de 6 souris, on a administré la ma- tière solide, trois heures avant la dose bactérienne, tondis que 6 autres souris ont reçu la matière solide 6 heures   avant   la dose bactérienne.   Enfin,   6 souris n'ont reçu que la dose 
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 bactérienne et ont servi de contrcles. Les roultat3 de cet essai sont indiqués ci-aprèo. 
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 aourid :urv:vrw,tsjr,>.-.bre n nourin Centrale 1/6 3 heures avant dose bactarierme 5/6 
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<tb> 6 <SEP> heures <SEP> avant <SEP> dose <SEP> bactérienne <SEP> 3/6
<tb> 
 
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 (d) Protection contre virus de la variole vraccin.

   La matière solide obtenue en \(1) pro'3 les embryons de poulets contre le virus de la variole   vaccinique.   
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<tb> Dilution <SEP> de
<tb> 
 
 EMI13.8 
 la variole Fraction ph6no:ique de 'lomb,-t!uL3er3 colonisa vaccine. gynogar. ¯¯ 10 7-.ort.,i ''t vivilnte vaccine. Quelques colonies uh:,fi- 10 :-.OLt.:' t 2 vivrr.t réea; lo vivait:; et 2 10 :::f)rta t 2 ViVf.1l1tl! 
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<tb> morts.
<tb> 
 

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 î*Jl±*u*r j2i 2 
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 Digestion Je zta03Fln avec T;uCI:. 1 g de zyaoaan a été 4vempe.-ature ambiante 
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 EMI14.4 
 avec 100 ml de I.;AOH 0,11; pendant 24 heures. Le liquide surna- géant a été neutralisé avec de l'acide chlorhydrique 3N jus- 
 EMI14.5 
 qu'il un pH de 7,5, puis concentré sous vide jusqu'à un volume ' de 20 ml et filtré.

   La solution a été versée sur un- 'donne de Sephadex (2,8 cm x 32,5 cm: diamètre x hauteur, ilibrée avec de l'eau contenant 0,3 de tricrésol) et la col ne a été lavée avec do l'eau contenant O. 3 de tricrésol. Dec 'raclions de 5,8 ml ont ét recueillies. Les 13 premières fract::. i3 ont ôté réunies et concentrées sous vide, après iuoi le pI-: été ré6-lé ù 7,5 à l'aide de 1%aOH 0,,ils, puia la solution a - fil- trée et 0 échée par congélation. Poida de la satire inc ore: 
 EMI14.6 
 $5 mc.

   Kn solution, cette matière a révdls une fluorescence jaune-verdttre en lumière ultru-violetto. 
 EMI14.7 
 EXEMPLE 
 EMI14.8 
 Extraction de matière de résidus de fermentation de péniciline, 25 g de mycélium de pénicilline séché ont eté adan- gés à 20U ml de phénol aqueux à 90 ; et la solution a z 
 EMI14.9 
 laissée à 37 C pendant 2 jouro. 90 ml de liquide su:-nat:;."",.,t on; été séparée' par centrifugation et 750 ni d'éther ont 6t ajou- 
 EMI14.10 
 tes. Le précipité, qui pesait 2,8 g, a ité ajouté à 400 m: d'eau et le pH a été résie a une valeur de 8,5, la matière non dissoute étant séparée par filtration. Aprèu addition de cul.- fritte ammonique solide jusqu'à une saturation de 60 , le : ré- cipité a été redisjoun dans ae l'eau, diulyau à +4 C et céch6 
 EMI14.11 
 par congélation.

   Rendirent: 45 me, Une solution de la matière n'a pas pu être coagulée h chaud et n'a donné qu'une troc ae 
 EMI14.12 
 réo1piaion avec ae l'acide sulphoealicylique à 20 ô, aucun précipité n'étant obtenu avec ae l'acide chlorh...dr1que 0,lN (c.f. de la matière obtenue à partir de zymosan). 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 
EXEMPLE 4. 



  Solutionde   pulvérisation     nautile.   
 EMI15.1 
 On a dissous 0,3 fi de matière a échue jar congélation, préparée par le procédé de l'exemple 1, dans 100 ml a'une solution aqueuse contenant   5   d'éthanol à   96   et 5% de gly- céroi. 
 EMI15.2 
 



  B:.V';Ic;kTIG'.i5. 



  Procédé de production d'une matière polypepti- 
 EMI15.3 
 ûique senuiblement non pyrogène et non antigène, possédant une   act'.   immunisante non spécifique, caractérisa en ce qu'on lait digérer de la matière insoluble dans l'eau provenant de   paroio   de cellules de   mycètea   dans une matière acide ou aloa- line, de façon à produire une fraction soluble dans l'eau, en ce qu'on sépare cette fraction de la matière insoluble dans l'eau et on en récupère la matière polypeptidique non pyrogène et non. antigène.

Claims (1)

1. 2. - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait digérer la matière de départ dans un mono- ou EMI15.4 di- hydro xfbenzàne.

   3. - Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en co qu'on fait digérer la matière de depart dans du phénol.

   4. - Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce qu'on fait digérer la matière de départ avec du phénol à 90-100 .

   5. - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait digérer la matière de départ avec un acide carboxylique aliphatique liquide ou un hydroxyde ou un carbona- te de métal alcalin ou d'ammonium.

   6. - Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'on fait digérer la matière de départ avec de l'hydroxy- de de sodium ou de potassium on solution 0,05-0,5N. <Desc/Clms Page number 16> EMI16.1

   7. - Procède suivant l'une ou l'autre des revend* ci- EMI16.2 tions procedentea, caractérisa en ce que la mai3bre dé départ eat de la levure ou une matière arrivée ae levure.

   3.- Proc6d suivant l'une ou l'autre des revondica.- EMI16.3 tiono précédentes, caractérisé en ce que la matière ae départ EMI16.4 est soumise a une lyac ec traitée ae manière à en H miner, avant dicoation, les hydrates de carbone et protéine .i/aroao- lubies.

   9.- Procédé suivant la revendication 8, car -46ris6 en ce que la matière ae aépart est soumise à une lyse , lavée à l'eau avant digestion. EMI16.5

   10. - Procède suivant la revendication 9, cara- ;risé EMI16.6 en ce que la mrvti")rl:1 du départ ost xruitue a l'aide d'u enzyme protéolyticlue, av nt a'Otic C lf't;..:J à l'eau.

   11.- Procéd suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, uaratori3 en ce ue la matiére de d6pALt EMI16.7 EMI16.8 est lavue avec un alkanol liquide avant digestion, 12.- Procédé suivant la revendication 11, uractri6 ! en ce que l' al.:anol cal. de l' ét;:ar.ol aqueux :.1. 95 ','#># 13.- Procède nuivant l'une ou l'autre dea rCV').lÜ:,C3- tiona pr cod nte3, cartlct!'i3;:: en ce ,,u.L. :ua"io.:'e ae départ ent obtenue à partir as levure, par ly3-: des cellules a l'aide d'une solution aqueuse bouillante 0. phosphate: clisocique.

   14.- Procédé suivant 1' u^o ou l'autre des Ll3vcndtcú- tiona prÓl.:6centae, t.:arE\C .c:risv en ce qua, lorsque la matière de cépart eot soimise a une algs10n aveu du phénol, la sauièrw polypop vidiquo uot précipitée i.s:r addition d'un solvant :.on EMI16.9 polaire. EMI16.10

   1;.- Proct';u- juivrj-.t la revendication 14, caractérisa un ue que le 30iv:jit non polaire eijt un cthCL' ou un hydrowrbu:.. <Desc/Clms Page number 17>

   16. - Procédé suivant la revendication 15, caractérisé EMI17.1 en ce qu'on ajoute do l'6hQr et du l'eau a la solution ph6no- lique, en aorte qu'un précipite de la matière polypeptiaique se rorme clans la phase aqueuse.

   17.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revcndica.- tions précédentes, caractérisa en ce ue la matière plyepep- EMI17.2 tiaique est uounise à une purification ultérieure après diecs- tion. EMI17.3 18.- Procédé suivrait la revendication 17, caroctérise en ce que la matière polypeptidique est précipitée en solution aqueuse, par addition d'un aent de précipitation protéinique inerte.

   19.- Procède suivant la revendication 18. caractérisé en ce quo l'agent de précipitation est un ce! smmonique ou de l'acide phosphotungstique.

   20.- Variante du procède suivant l'une ou l'autre EMI17.4 des revendication 18 et 19, caractérisé en ce nue la matière polypeptidique est traitée en solution aqueuse h. l'aide d'un liquide organique, qui force une phase qiotincte, en présence de concentrations notables de l'agent de précipitation protéi- nique, en sorte que, lors de l'a41ition de cit at:ent de pr- cipitation, la natière polypeptiaique est amenée à ce dicnoudre dans ladite phase distincte.

   21.- Procédé suivant la rcvendicf. t1011 20, caractérisé en ce que le liquide organique est un t!olvll1t organique polaire qui est miscible à l'eau, Bais non miociblc h une solution aqueuse de l'agent do précipitation en concentration notable. EMI17.5 22.- procédé suivant la revendication 21, c(,ruct('r1aÓ en ce que le liquide organique est de l'éthanol. EMI17.6 23.- Procéda suivant l'une ou l'autre dua revendica-- tiona 20 à 2, caractérisé en ce que le de liquide orn- EMI17.7 ,Ac:.{r-') *#"* inférieur à celui de la 30luic:' a;ut-u3C initiale. <Desc/Clms Page number 18>

   24. - Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tione 18 à 23, caractérisé en ce que l'agent ae précipitation es du suliate ammonique, qui eat ajouté en une quantité 'celle qu'une concentration de 25 à 60 % en poids eoit obtenue. EMI18.1

   25.- Procdé suivait la revendication. 24, 1 caric # ..- et en oc que lo pH de la solution est de 5 à 8.

   J6.- Procède Huivant l'une ou l'autre des ru'". :,.1..'' tions précédentes, caractérisa en ce que l'extrait aqueux est purifié par contact avec un adsorbant servant à adsorber la matière de poids moléculaire élevé, afin d'adsorber la ma tière polypeptidique active, cette adsorption étant suivie d'une ûlution à l'aide d'un liquide baoique ou acide ou d'une solution forte concentration en électrolyte.

   27.- Procédé suivent la revendication 26, caractérisé en ce que la matière adsorbante est un silicate complexe.

   28.- Procédé suivant la revendication 27, caractérisé en ce que la matière adsorbante ect de la Montmorillonite, de la bentonite ou de la colite.

   29. - Procédé suivant la revendication 27, caractéris en ce que la matière adsorbante est de l'amiante.

   30. - Procède suivant l'une ou l'autre dea revendicr-- tions 26 à 29, caractérisé en ce que le pH ae l'extrait est de 4 à 7 au cours do l'adaorption.

   31.- Procède suivant -La revendication 30, caractérisa en ce que le pH est de 5-6 au cours de l'adsorption.

   32.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 6 à 31, caractérisé en ce que l'extrait contient une fore proportion ae matières solides, immédiatement avant adsorption.

   33.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 2b à 32, caractérisa en ce que l'élution s'effectue à l'aide d'un hydroxybenzène liquide. <Desc/Clms Page number 19>

   34.- Procédé suivant la revendication 33, caractéri- aé en ce que l'hydroxybenzène est au phénol anhydre.

   35.- Procédé suivant la revendication 33, caractéri- se en ce que l'hydroxybenzène eat du phénol aqueux à 90 %.

   36.- Procede suivait l'une ou l'autre dos revendica- @ions 26 a 32, caractériel en co que l'élution s'effectue a l'aide d'une case inorganique aqueuse ou d'ammonlao en sou= tion diluée ou à l'aide d'une solution de chlorure de sodium.

   37.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 17 à 25, caractérisé en ce que la purification s'effec- tue en mettant l'extrait aqueux en contact avec une matière de tamisage moléculaire imperméable aux molécules d'un poids mo- léculaire supérieur à 1000 de façon à séparer ces molécules des substances possédant un poids moléculaire moins élevé.

   38.- Procède suivant la revendication 37, caract6ri- sé en ce que la matière de tamisage moléculaire est imperméa- ble aux substances possédant un poids moléculaire supérieur à 8000.

   39.- Procédé suivant l'une ou l'autre des r3vendica- tions 37 et 38, caractérisé en ce que la matière de tanisage moléculaire est un dextrane réticulé ù l'aide d'oxyde d'éthy- lène.

   40. - Procédé suivant la revendication 39, caractérisé en ce que la matière de tamisage moléculaire est du Séphadex G50.

   41.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 37 à 40, caractérisé en ce que la matière de tamidage moléculaire est utilisée sous forme de particules .

   42. - Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 39 à 41 , caractérisé en ce que le dextrane réticulé est mis en contact avec une solution aqueuse d'un sel de métal alca- lin avant fractionnement et en ce que les anions de ce sel <Desc/Clms Page number 20> EMI20.1 sont 61imin4a par lavage. 43.- I?rocéd4. suivant la revendication 42, carac( EMI20.2 EMI20.3 en ou que ledit uc7. ut un. ad do oodiun. EMI20.4 44.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendiez- ] EMI20.5 tionn 39 à 43, (3n ce que l'extrait a traiter con- tient un 6lctroJ.;te. EMI20.6

   45.- l' rOG(;t!(j 8111 '!pnt in revendication 44, c :otrilJ on oe que Ion 01\ t!Qn:J C10 Il 4 1.00 t'o ly \;0 :.sont leu mnr.1C lun ceux du sel avec lequel le dcxtrano réticulé est trai 46.- Procédé suivant l'une ou l'autre des re di- cations 44 et 45, cftrartériié en ce que la concentracic en électidyte de l'extrait est 0,05 à 0,5 N.

   47.- Procd suivant l'une ou l'autre deo rev JiC3- tiona 39 à 46, caractérise cri ce que la solution de la Ii tire EMI20.7 polypcptidique dec:irée est débarrassée du dextrose réticulé, j par lswe6e avec une solution alcaline.

   40.- Procédé nulvant l'une ou l'autre dea revendra- t.1ono 17 ' , curuct4riaG on cn qu'une solution h'l'...r"4IJC cc.r,- t(.'nnnt lo polyr,y idv d..:tllr0 eut; ni. ce on contact avec 'mo rnntiùre úch!\:r.;U!3'1 d'iona ct')llulod.'\uf1 lr.dblo!:1f:1nt acldo, 1t' mnniorc d uaaoroer, lo polypnpido d':.Jlr8, co (nrni<jr <5t::;t enouite s..5!lrÓ, par Clution, de la na-Dièro char.L:euae d' ,") '.3 à l'aide d'un t41cctrolyte o.r;.ll0UX.

   4.- ro'.'d cuivant la revendication 48, cllro.r.;tr1oé en ce que la Litière ûchanjeuae d'ions est constituée ocr de la celiuloue CLl:2.uicue:::.c:r.t.. modifiée ae asjtiëre à porter un ou pluoieurs rou,e3 anino, dialtyl aino ou c:.alylir.o alkyle EMI20.8 50. - Procède suivant la revendication 49, caractérisé EMI20.9 en ce que la matière 'chanGu3e d'ions est le produit de la réaction <1' 6 JichlorhJd-'1n'J, ue trithll.'101a.r;Üne et de cellulose ood1quc ou '.'2t ce la dityls.raCnathyl cellulose. <Desc/Clms Page number 21> EMI21.1 51. - Procédé ouivant l'une ou l'autre aoo revendica- EMI21.2 tions 48 à 50, carnetorioû en co que la U\:tiel'o 6chlln61:.tuoo d'ions eut tn:rpon.a0C A un pl comprit! entre 6 eu 10.

   52.- PrOC0<Í!." suivant la revendication 51, caractéri- sé en ce que le pi: eat de b,5 . 0,5. EMI21.3

   3.- Procédé suivent l'une ou l'autre des revendi- EMI21.4 cationo 51 et 52, (:,,!\d(:1'1ul) en co quo la t30.lutiol'l b. craitdr ont tOIllPO n1ll." Ju...)' 1 \ 11\ JJl"Í ..HIlL t 1) 1.' C'I on 1)1 bl orn/," in mfhtto vU que .La matière Jch,Cusc d' ion3. EMI21.5

   54. - Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 48 à 53, caractérisé en ce que la solution à traiter EMI21.6 contient 1 à 2 en poids de matières solides sèches.

   55.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 48 à 54, caractérisé en ce que l'élution o 'effectue h l'aide d'hydroxyde- de aodiun, de potassium ou d'foaoniunt en solution diluée ou 3 l'aide de carbonate de pota3si u nu d'an- noniust on. solution a :7.We.

   56.- l'roc.5d.( suivant l'une ou l'nutru (loti r(%vtcn(!Icn- tiono 48 à 5., .r: t¯c ::r ict en ce ;uu l'01uti(m c''*ft'octuo ii l'aide d'un phosphate tampon l'nido d'un pli da 7,5 ou h l'aide d'un hilogru.-o do 1:L't.,Ü alcalin.

   57.- Procéd,' suivant la revendication 17, caracté- rie6 en ce qu'on x<5cuto plus J'un deo traitensento de purifi- cation zpdcifiés dar.3 les reveiidic;ttionc la a 59.

   58.- Procd9 de production d'une matière rolypopti- dique sensiblement non ryrone et non antijenc, en subatance, tel que décrit plu.3 haut.

   59.- Procédé de production d'une natibre polypeptidi- que sensiblement non pyrone ez non w1tinp., en substance, tel que décrit donu les exemple... <Desc/Clms Page number 22>

   60. - Mâture polypeptidique possédant une action EMI22.1 inaunisjuite non spécifique, préparée par le procédé suivant l'une ou l'autre ces revendications précédentes.

   61.- ratière polypeptidique possédant une action im- munisante non spécifique et dépourvue d'action pyrogène ou anti- EMI22.2 gène substantielle, cette natière provenant d'une a-.re de parois de cellules de nycètes, tout en étant stable à chaleur jusqu'à au moins 100 C. soluble dans le phénol liquide dans l'eau et dans les bases aqueuses, précipitable en sol ion aqueuse par l'acide ph03photun.;rt1que et présentant un, fluores- cence vorte en solution aqueuso.

   62.- Wat1rc polypeptidique possédant une acx --i immunisante non 9pÓcil1quc, Srt."1S action pyrocènd ou ant :e substantielle, provenant d'une matière extraite des paro¯3 de cellules de r.1.Y0tCU :JCl1Di 1Jlc;:ent exemple d polypeptides c.'un poida moléculaire inférieur à 1000, stable ù. la chaleur, jus- qu'à au moins 100 C, soluble dans le phénol liquide, dans l'eu ' et dans les bases aqueuses, précipitable en solution aqueuse EMI22.3 par l'acide pbo splio -cunE;%3-i que et l'acide 3ulfosalycili-:e, pr- sentant une xluorescenco jaune-veraàtre et contenant les ,U:1110- acides suivants sous l'orme peptiaique: acides slutaaique et asparzique, arginine, lysine, alanine, serine, valine, leucine, isoleucine, glycine, phénylalanine, hiatidine, proline, tyrosi- ni):

   et tlireonine, cette aaxiere polypeptidique étant sjeu3lbl - ment exempte da phouphorc \.:0::loin6, prs;uontunt uno réaction po- sitive au biuret et 1'ttnthrone et exerçant un orfot. antimixo- .tLque vis-à-vis aes cellules de Hela et Chang. EMI22.4

   63.- Hatiere polypepuidique possédant une aovion im- munisante non spécifique, aan3 action aw idne ou pyrogène ub3tani11c, provenant d'une matière uxtraitu des parois de ollulQD ue ayeexos sensiblement exuanto da polypeptidcs c'un <Desc/Clms Page number 23> poids moléculaire inferieur a 1000, stable à la ehaleur, jus- qu'à, au moins 100 C, soluble dons le nénol liquide, cons l'eau et dans les bases aqueuses, préeipitables en uolution aqueuse par l'acide tique et l'acide sulfosalycilique, présentent une flueresscence vure et contenant les aminoacides suivants sous forme polypeptidique;

   acides glutamique et aspartique, argiaine, lysine, alanine, serine, valine, leucine, isoleucine, glycine, phénylalanine, histidine, proline, tyrosi- ne et thréonine, sensiblement exeppte de phosphate coabin, possédant une réaction positive au biuret et à l'anthrone et possédant un effet antimitosique vis-à-vis des cellules de Hela et Chag.

   64. - Matière suivant l'une ou l'autre dos revendica- tions 61 à 63, caractérisée en ce qu'Ile est exempte de matière polypoptidique d'un poidc moléculaire inférieur à BOUC.

   65. - Matière polypoptidique, en substance, telle que décrite plus haut.

   66.- Matière polypeptidique, en substance, telle que décrite dans les exemples.

   67. - Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent une matière polypeptidique suivant l'une ou l'autre des revendications 61 à 66, ainsi qu'un ou plusieurs véhicules ou excipiente pharmaceutiques.

   68.- Compositions suivant la revendication 67 sous forme de doses unitaires.

   69. - Compositions suivant la revendication 68, oarao- térisées en ce que chaque dose unitaire contient 5 à 20 mg de matière polypepzidique.

   70. - Compositions suivant l'une ou l'autre aes reven- dications 68 et 69,sous forme de comprimés, de capsules, de dragées ou de suppositoires. <Desc/Clms Page number 24> EMI24.1

   71- Uompoitiono suivant Ici rovondiontion 67. ':'H- tindon 4 Otru lnj dt 5oo onrt4otertnJqii on rio (itiqa J,u vdhaaulo ont un liul' rift 1,11 ttt"i 1-t-iltifilint anouititble, 72.- Compoaitiono suivant la revendication 71, EMI24.2 caractérie4ec en ce que ledit liquide est do l'eau apyrogène stérile. EMI24.3

   73.- Compositions suivant la revendication. 67t administrât)]. par la voie buccale, caractérisées en 3 que les vÓhicuee ou excipients comprennent un ou pluaio a véhi- cules ou excipients pour la fabrication ne comprimés.

   74.- Compositions suivant la revendication . caractérisées en ce que le véhicule ou excipient composa une ou plusiours bauos pour suppositoires.

   75. - Compositions suivant la revendication 6@, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de si- EMI24.4 rops, do pastilles à sucer d'élixirs ou d'éaulsions.

   76. - Compositions suivant la revendication 67, caractérisées en ce qu'elles se présentent soua forme de solu- tions à pulvériser.

   77. - Compositions suivant la revendication 76, caractérisées en ce que la solution à pulvériser contient EMI24.5 0,01 à 10 en poids de matière polypoptidique.

   78.- Compositions pharmaceutiques, en substance, 'colles que décrites plus haut, 79. - Matière polypeptidique, compositions pharma- ceutiques en contenant et procédas pour leur obtention, en substance, tels que décrits plus haut.