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"Nouveaux antibiotiques d'Azalomycines B et F, de même que leur procède de préparation"., la présente invention a pour objet de nouvelles sub- stanoes utiles ayant des activités antimicrobiennes, de même que leurs procédés de préparation. Elle a plus particulière- ment pour objet de nouveaux antibiotiques utiles appelée aza- lomycines B et F, de même que le procédés de préparation des antibiotique..
Un objet de la présente invention est de prévoir de nouveaux antibiotiques utiles d'azalomycines B et F.
Un autre objet de la présente invention cet de prévoir des procédés de préparation de ces antibiotiques d'azalomycines
B et ? par des procédés miorobiologiques.
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Les propriété physiques et chimiques des asalo8lo1n,..
B et 1 sont indiquées ci-après ! 0 I" PHYSIQUES ET CHIMIQUES go I.ZALOMVQIHB B.
Zlazalomyoine Beat une substance cristalline neutre en aiguillée blanches et elle fond à 185-l.BTaC, avec décomposition.
Loe ohiffrea analytiques sont donnée oi-aprèst Calcule pour 014"24 ,' 0, 61,74! H, tàgbal 4H5 119401 poids moléculaires 272933,. Trouvés 0, 61#wu H, 8,t2i OOH 39 10#121 poids moléculaire! 284 (suivant méthode de Raat).
Bile ne contient pas d'azote, d'halogène ou de aoufre.
Par traitement avec de la pyridine et de l'anhydride acétique, elle donne un diaoétate soue forme de cristaux blancs en aiguil- les* L'analyse élémentaire du diaoétate donne lea résultats eu!- vantas
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Calculé pour O1,H2zOg(H500)2t 0, 60,66, H, 7992.
Trouvé! 0,60929; H, 'l,?5.
Le degré de rotation spécifique de l'atalonycine B ,si ,0()D25==48A (oo*l dans du méthanol). Le spectre d'absorption ultraviolet eat indiqué à la figure 1. Il a un maximum d'abaorp- tion caractéristique à:
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252,5 au (ica' 790) dans une solution méthanoliquet Le spectre d'absorption infra- rouge de l'azalcayoine B et de la d1aoétrl-azalomyoine B dans des pastilles de bromure de potassium vont indiquée dans les figures 3a et 3b respectivement.
Dans la région du spectre infra-rouge, l'azalomyoine B a des bandes d'absorption carac-
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térietiques, dans des pastilles de bromure de potassium, aux fréquences suivantes, exprimées en centimètres réciproques! 3450, 2970, 1695, 1640, 1565, 1460, 1420, 1380, 1345, 1300,
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1260, 1250, 1220, 1175, 1145, 1110o 1065, 1050, 10o30, 10150 95, zou 5, * p0, 8?fi, 8fui0, a15, 795, 743, 716, 705, z
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et 664.Dans la région infra-rouge du spectre, la diaoétyl- azaloayoine B a des bandes d'absorption caractéristiques, dans
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des pastilles de bromure de potassium,
aux fréquences suiTan- test exprimées en centimètres réciproques 3470, 2970, 1750, 1700, 1645, 1620, 1470, 1450, 1435v 1390, 1370e 1300, 1250, 1227, 1182, 1150, 1112, 1083, 1040, 1028, 1000, 965, 950, 905, 875, 820, 753 et 714.
L'azalomyoine B est soluble dans le méthanol, l'éthanol et le chloroforme, elle est modérément soluble dans l'acétone et l'acétate éthylique, tandis qu'elle n'est que peu soluble .dans l'éther et le benzène, mais elle est pratiquement insolu-
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ble dans l'eau et l'éther de pétrole. A l'essai de "Tollenallp elle donne une couleur noir orunâtre foncé ,mais elle ne forme aucun miroir argentique. A l'essai de Itlahl1ng", elle donne une oouleur verte et le permanganate de potassium se décolores
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Les testa de "Molicoh" d'anthrone et de ferriohlorure sont négatifs.
PROPRIRTES PHYSIQUES ET CHIMIQUES DE L'A ZALOMYOINË L'azalomyoine F est une substance cristalline neutre en aiguilles blanches* Elle fond à 125.1? ü, avec décomposition* Les chiffres analytiques sont les suivantes Calculé pour o,OH50010N2' O# 60,le, H, 6#421 N, 4#68g poids moléculaire! 598,72. Trouvés 0, 60,41, H, 8#571 kt, 4,33. Niant donné qu'elle est insoluble dans le camphre, on calcule un poids moléculaire approximatif suivant la méthode
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de tlBeré&er-Akiya" dans du méthanol, pour trouver que ce poids moléculaire est de 600. Le degré de rotation spécifique de l'azalomyoine t est de (COD 22 *+460 (oeul dans du méthanol).
Le spectre d'absorption ultraviolet est reprèsenté à la figure
2. On a des maxima d'absorption caractéristiques à
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240 mu <4*om.* 385) et
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266 mu (J 1 Olaf 255) . , | ...' ., ,l, .' ",' , et un minimum z : " 1 l, ,". , - 258 lu mu (31% 1 osé 2l6) la figure 4 représente le spectre d'absorption infra". rouge de l'azalomyoine f dans des pastilles.de bromure de potas- sium. Dans la région infra-rouge du spectre, l'azalomyoine f a des bandes d'absorption caractéristiques, dans des pastilles de bromure de potassium, aux fréquences suivantes, exprimées en centimètres réciproques. 5460, 2940, 1690, 1645, 1555, 1450,
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1360, 1265, 1240, 1150, 1085, 970, 915, 8'i5, E'0, bzz, 745, 690 et 662.
L'azalomyoine Y est soluble dans le méthanol et l'étha- nol, elle est modérément soluble dans de l'acétone aqueux z 20% et elle est peu soluble dans de l'eau acide, .nais elle est pratiquement insoluble dans de l'eau alcaline, dans de l'acétone, de l'acétate éthylique et du chloroforme.
A l'essai de "Tollens", elle donne une couleur noir
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brunâtre foncé, une couleur brune dans du H280 4 concentré et une oouleur vin dans du Hel concentré. Les tests de Molieoh", d'anthrone, de "Fehling", de ferrioblorure, de ninhydrine, de "Millon" et de biuret sont négatifs* Toutefois, elle réagit positivement au test de ninhydrine après une hydrolyse de 2 . minutes avec du H01 5 N.
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Les solutions aqueuses de l'asa1omyoine B et de l'asa- lomyoine f sont plus stables à un pH de 6,0 qu'à un pH alva- lin ou un pH plue acide.
Après ohauffage à 10000, pendant 5 minutes, . un pH de 6, l'aotivité de l'azalomyoine B ne diminue pas mais, à un
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pH de 2, 0 et 10,0, l'activité est réduite à 10 2t?96. L'aza- iomyolne B est plus instable en solution alcaline qu'en solu- tion acides Par contre, l'azalomyoine ? est plus stable à un pH alcalin, Après chauffage à 100 0, pendant 30 minutes, à
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un pH de 4-6, l'activité reste toujours inchangée, ait le potentiel et réduit à 0 lorsqu'on chauffe à 60*Cp pendant 30 minutes# à un pH de 2,0.
9ROoatst Les nouveaux antibiotique. décrits ci-destuag à aavoir les azalomyo1n.. B et 1# peuvent être obtenue en cultivant un atioroorganieme appelé 03treptouyote hygrosoopicun â 4" sur un milieu nutritif approprié. On décrire ci-après le procédé de préparation des alalomlo1ne. B et y par un procédé micro- biologique, Le "Streptomyces hygroncopicua K5-4" peut égale- ment être appelé Streptoayoee hY8roloop1au. vert a.aloMTol'1ou., qui indique que la aouohe K5-4 out une variété de Strepxamyoes hygroaoopious produisant de l'azalomyoine B et de l'atalonyoi- ne Po Le miorOOrant8G' pouvant être utilisé pour la prépara- tion des azaloayoinea B et 1..
savoir le Streptomyoes hygrorw oop1ous X5-4# *et une aouohe de Streptomyces découverte réons- ment et Isolée d'un échantillon de sol, obtenu à Shibuya, Tokyo# Japon, On peut obtenir dee cultures de oe m1oroorgan1.me en
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préparant une suspension d'un échantillon de eol en contenant
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dans de l'eau stérile, en laissant et déposer les plus grosses particules, en séparant la suspension surnageant* de sol en
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dilutions en série sur des plaques d'agar-agar nutritif, en
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incubant les plaques à 24-28009 pour obtenir des croissances
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du mioroorganisme et on transplantant, sur des plaques d'agar- agar nutritif frais, des oroissanoes choisies ressemblant au
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Streptomyces hygroncopicun K5-4.
En répétant la sélection et la transe-plantation des croissances non-.contaminées et caracté- ristiques sur des plaques d'agar-agar nutritif frais, on ob- tient les cultures constituantes pures du mioroorgan1... de*'
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aire.
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Une culture de l'organisme vivant a été déposés à
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l' "Amerioan Type Culture Collection", à la collection perma- nente de laquelle elle ont venue s'ajouter nous le nota de ATOG 13810.
Lee études taxonomiques ont permis de faire les découvertes suivante@*
Afin de déterminer lea caractéristiques de croissance du Streptomyoes hygroscopicus K5-4, on a fait croître la cul- ture sur une variété de milieux et on l'a incubée à 27-29 C, pendant un moins
Suivant l'examen microscopique, les hypes aériennes sont bien ramifiées, leur chaîne comporte des conides et elle$ forment parfois des spirales serrées, Les conidies mont sphé riquee et ont un diamètre de 1,5 à 1,7 u. Lee caractéristiques culturelles sont indiquées au tableau 1.
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1... 1. - Caracb1.t1.... C1I1t11r8U.- 8'trep'tolQ'C88 I17croacopJ.CQ8 IS-4
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1It1.1.. Croisaanes ¯¯¯¯¯ 7cl11- aérien rt solalls 6lnoowjaspassüaj Sonna incolore à Blanche Poudreux, abondant. taches blanc sénat # r-**ar genatre à rouge grisâtre. galate de c'c17C'- Bonne, plat.. 't4ID4-. 3acolo- Poudreux, mime*, blanc t blanc rol/qar-8&U' re à blanche gristtre avec na: marge blanche, 14.... lisr-sisr ejmthdtl- ]leu abondante, 1Dc81ore Poudreux. pou abondant, taches blatte Il qas blanche griattra à rougs-bznn gelait .
&a1.oa/llàer-aaar Doans, Incolora à blanc grtst- Poudreux, abondant, 6riv clair à idm. tre. couleur gris olive clair noir brunâtra, l' Glidol1 est hydre- ;Lavera* l.J8I fl7efrol/8gU'-8Ù' Béant, plate. janas pile. cou- Poudreux, abondant, gris branttre .1'- clair leur csaaois Inverse clair 1 rouge brun tritttr ?,Trwiasjtôar-aser 244111t.. blanc à jeun* pila, poudreux, peu abondant Hast brun rongattra pile laver l'ztndt de J.nurel Iom1tt. glissés, ocra 021ve à ]Poudreux, abondant, blanc à gris- Iàss. agar-agar jeune-orange foncé pourpre, devenant noir u.]:tlri8Ur4lcent à l'huaidita. l6trar nutritif ]Peu a1toD4anta.II1C01are"1iI8oche Peu abondant. blanc Id..., Bouillon de &1-8 1Ioa."14t. Incolore à blanche Toudraux, abondant, blanc Zdub.
8Car-tlCU' Solution .tbft1Q feu abondants, addlumt no- géant :14¯., .e0l1l18Q.X. aucuns croissance aupe..-ftc1en.
Bouillon nutritif h1'8Q "-lqtd. eolonfss apon- rem abondant. ble . idur- - af scssa blanches à la surface, sédiseat floconneux Bouillon de cimes* Peu abondante. colonisa sénat Zdeu.
.poag1--- .. la 88I'f'... itoudelles de pum tonne, levés, plus pllde, abondante blanc de de terre Incolore 4 java* clair rre prsaaaat # oniesr noir trs fta< 108IIe1188 de emo,&- goddrie" 3 ptls à Ms tee MFt* lait 107M de couleur artas, abondante blanc, ptptoalw*- ldw6 couleur ch ole ivoirs rapide sans coacastion Id" a hrom griattrs OO1I1.nr ort.e. ort OD4an"..1.., peptold-- .4ter de ggl*ttm rodir6es 1...lft8 . tma. abondant, blase, 21a*4*a - Xteaw bieuffl on np1t.
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Les résultats de ces études indiquent que le microorganisme donne habituellement une bonne croissance. Le mycélium végéta- . tif cet inoolore à jaune et l'inverse de la colonie cet brun rougeâtre.
Le mycélium aérien sur la plupart des milieux est abon- dant et devient rouge-brun grisâtre Il se forme un pigment soluble jaune olair dans le milieu de glyoérol/agar-agar, mais non dans les éthers. La caractéristique la plue remarquable de la eouohe réside dans 'hygroscopictié distincte, que l'on observe sur l'extrait de levure/agar-agar.
L'utilisation des sources de oarbone a été soumise aux essais,avec un milieu de base décrit par "Pridham and Gottlieb'l les résultats sont indiqués au tableau 2.
Tableau 2 - Utilisation des souroes de carbone
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<tb> Source <SEP> de <SEP> Croissance <SEP> Source <SEP> de <SEP> carbone <SEP> Croissance
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<tb> carbone
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<tb> Mannoae <SEP> ++ <SEP> Duloitol
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<tb> Lactose <SEP> ++ <SEP> Salioine
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<tb> Rhamnoae <SEP> ++ <SEP> Inuline
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<tb> Amidon <SEP> ++ <SEP> Arabinose
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<tb> Maltose <SEP> +,
<SEP> Fructose
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<tb> Raffinose <SEP> + <SEP> Sorbose
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<tb> Suoroae <SEP> + <SEP> Xyloae
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<tb> Mannitol <SEP> + <SEP> Citrate <SEP> de <SEP> Na
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<tb> Sorbitol <SEP> + <SEP> Suooinate <SEP> de <SEP> Na
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<tb> Inositol <SEP> + <SEP> Acétate <SEP> de <SEP> Na <SEP> -
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Remarque, Le signe "++a signifie une bonne oroiaeaaoe et une ,,",,'.... . modérée """"",,,, utilisation positive le signe ##+" désigne une bonne croissance/ et une utilisation positive) le signe "" signifie une faible croissance, probablement nana aucune utilisation) le signe "-"signifie qu'il n'y a ni croissance, ni utilisation.
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Parmi les espèces connues de Streptoayoes , le streptoupas h,itoloop1ouli,1lo14 par Jensen on 1931 (Waksauut, S.A., and A, T. genrioit Streptomyoee hygrosoopiques, "Manual ai' Doter- winative 7 otarioi.agr", Berger, 7. éd., pp. 796 -.797, 1957), .est analogue à la souche de la présente invention, . savoir le K-4, main une comparaison détaillée montre que l'on peut tou- jours les distinguer aisément.
Par exemple, la aouohe de la prdsonte invention, à $avoir X5-4, cet caractérisée par les pointe suivants! oaraotere hydrophobe sur le milieu de gluoose/ a8paragin./Bgar-aar. mycélium aérien rouge-brun grisâtre sur
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l'agar-agar synthétique) auoun pigment soluble dane le milieu
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. de aluoooo/auparagine ou le milieu d'agar-agar synthétique; bonne onienance avec mycélium aérien blano sur les rondelles
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de pomme. de terre et liquéfaction assez rapide de la gélatine.
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toutefois récemment Treener et Baoleus (Traener, H.D., and RtJf Backust "A broadened oonoept of the oharaaer1.'1c. of Streptomyoes hygroooopioueme Àpple Mierobiole 4s 243 - 250,
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1956), ont donné un large aperçu des caractéristique* du Strep-
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tomyceo hygroncopieus comme suit.
(1) Couleur gris Brunâtre
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(gris souris à brun benzo suivant Ridgway) des spores dans la
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massa; (2) spires serrées des hyphes comportant les spores j
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et (3) zones hygrosoopiques noires caractéristiques sur certaine
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milieux d'agar-agar. Suivant oette aonoeption, on peut conci-
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dérer que la souche de la présente invention à savoir le K5-4,
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appartient au groupe du Streptomyces hygroooopiquang mais que, pour certaines propriétés caractéristiques, il ce distingue de
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la souche authentique décrite dans la littérature. .Des lors, la aouohe de la présente invention peut être appelée "Strepto-
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myoes hYirosoop1oWl K5-4".
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On a également déorit plusieurs souches du groupe du Streptomyoes hygrosoopious, produisant certaine antibiotiques
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comme par exemple le Streptomyces hygrocoopîouo producteur de
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oarbomyoine (Pa6anos Je., Mois W.1nai.in and 0*M( t4elrots "An anti-rioketteial antibiotio trou 8tr<pt0t<yoet<, M-4209".
I. D101osioa1 oha.r1zation8. Antibiot, and Ohenoth, 3 (9)1 699 - 902, September 1953), le Streptoayoea hygroaoopious ' producteur d'hypromyoine (Pittenger, R 8>, 1. Wolfe, M. M.
Hoehn, p.N. Marks, W.A. Daisy and J.M. MoQuires "HyHroaryoiri I, Preliminary studios on the production and biologie activité of a new antibiotio". Antib1ot108 Annual 1953/5s 157 - 166, 1954), le Streptorayoea hygroeoopioua var. odoratge producteur
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d'hydroeoopine (Nakazawa, K.K. Ok1, I. Tadokoro, M. Honjo, H. Hitomi and J. Uoyanagit "Studios on StJ'OpQrâ10'" Hygroaoo- pin, an antibiotio substance active aga1n.. fuhgi and phyto, pathogena". J. Agr. Chem. Soo. Jap. 28 (4)t 296 - 299, 1954, Tatsuoka, S.A. Miyaké, M. Honjo, H. Hitomi, J. Ueyanagi, M. Miyamoto, Ki Nakazawa and K, Okit "Studies on antibîotions Purification of hygroeoop1n". J. Antibiotioa, Sort B7 (9)t 329 - bzz, Deoember 1956), de même que le Streptomyoea hygroa- oopious var. anguatmyoet1cuB produoteur d'angvaatayaina (Yuntiient Masui K. Ohkuma, Y. lah11 and H.
Yonoharas "Studles on anguet- myoin, III". J. Antibiotioa, Ser. A9 (6)# 195 - 201, Deoembor
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1956). D'après les différences morphologiques observées entre
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ces aouohee et la couche K5-4, de même que d'aprbe les diffa-' renoce entre lea propriétés chimiques et biologiques dea avala.. myoines B et J? et lea antibiotiques de la littérature précitée,
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on peut en oonolure que la aouohe de la présente invention, à
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savoir le K5--4, n'est identique à aucune des eouoheapréoitéea du groupe du Streptamyoee hygroecopiol.18.
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ANTIBIOTIQUES
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On effectue la préparation des al&1 mJc1ne.
B et Y lui-
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vant la présente invention en inoculant un milieu nutritif
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aqueux et stérile avec le Straptomyoer h1iJ4'" 15 4, puia en incubant le milieu inoculé, dans des O'04 adrobiquon le 4.'"
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"1 1< -....r II' -'r 1 e lumUiMt, à une température comprise entre 20 et 39"0t ensuit, on isole lea azalomyoines B et f désirées dt la oui. tiers aolide présente dans le mélange de culture 11 le liquide de culture aqueux,
Pour l'inoculation, on peut employer des sports ou des
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oon1diee de Streptomyoes hygrosoopîous K5-4.
De même, on peut employer des suspensions aqueuses oontenant une proportion mi- neure de savon ou d'un autre agent mouillant. Pour les grandes fermentations, il est préférable d'employer des cultures jeu-
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nes et vigoureuses du miaraorgan.tme.
Ion milieux nutritifs aqueux appropriée sont ceux ayant
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un pH compris entre 5 et 8, de préférence entre z, 5 et 7,5, tout en contenant une source de carbone assimilable et une nouer- oe d'azote et de minéraux. Comme sources de carbone assimila- blet on peut employer,les oarbohydrates pure ou Ion mélanges de oarbohydrates disponibles dans le commerce.
Parmi les matières appropriées à cet effets il y a, par exemple, le glucose, le
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#anno.., le lactose, le rhamnoae, le maltose, l'amidon, la gly- cérine, jeu mélasses et analogues. la quantité du oarboh1drat. présent dans le milieu nutritif n'est pas particulièrement ori. tique 1 elle peut i 4tr'ontrer environ a, 5 et 5't en poids, calculée sur le poids total du 'milieu.
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la source detgote du milieu nutritif peut être d'une nature organique, inorganique ou organique-inorganique mixte.
Parmi les nombreuses nuuetancea azotées pouvant être utilisées dans le milieu nutritif, il y a, par exemple, les amino-aoidee, lee peptones, les protéines hydrolysées et non-hydrolysées , la farine de poisson$ la farine de soja, la liqueur de macéra-
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tien du maïa, les extraits de viande, lea nitrates inorganiques, # l'urée, les sels d'ammonium et analogues. Par suite de la nature brute de la plupart des luuataoo.8 azotées pouvant être obtenues 1 aisément, la quantité à ajouter au milieu nutritif varie suivant
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la pureté.
Toutefois, pour des application! pratiques, on peut dire que les matière* azotées ne doivent pas dépasser 10% en poide, calculée sur le poids total du Milieu de fermentation!
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Pour obtenir les meilleurs rendements en aealoatyoinea .
B et I1, il est nécessaire de prévoir une certaine quantité de sels minéraux* ±n règle générale, de nombreuses matières brutes, oomme par exemple la liqueur de macération du mate, les prépa- rations de levures, la farine de soja, etc., contiennent des sels minéraux en quantités suffisantes* Toutefois, afin d'au- eurer la présence de quantités appropriées de composants :
mi- néraux du milieu, il est habituellement avantageux d'ajouter une petite quantité de sels inorganiques, comme par exemple du chlorure de sodium, du carbonate de calcium$ don phosphate.,
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des sella de métaux lourds et analogues. la concentration préfé- rée des sels minéraux est inférieure à 1,5% du milieu nutritifs
L'intervalle précité a été spécifié suivant la présente invention, étant donné que les rendements en antibiotiques, à
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savoir en azalomyoinea B et z', sont considérablement réduite lorsqu'on travaille en dehors d'un intervalle de pH compris entre 5 et b.
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La culture du streptomyces hygroscopique Bzz dans le ' milieu nutritif aqueux peut être effectuée de différentes ma-
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niére. Par exemple, on peut cultiver le mioroorganisme dane des conditions adrobiques à la surface du milieu ou en dessous de la surface de ce dernier, c'est-à-dire dans due condition@- submergées, ai l'on amène en même temps de l'oxygènet
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Le procédé préféré pour la préparation dje atalcoyainis B et f à l'échelle industrielle consiste à utiliser des oul- turea submergées ou profondes du Streptomyoes hgroBoop10ul K5-4, Suivant cette forme de réalisation de l'invention, on inocule un milieu nutritif aqueux et stérile avec le Strepto-
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myoes hygroscopioue Ka-4 et on l'incube,
tout en l'agitant et
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en aérant i à une température comprise entre environ 20 et 35*0, : de préférence voisine de 25 - 32009 Jusqu'à oe qu'on obtienne, due le liquide de culture, une concentration maximum des Ma" lomyoines B et x. La durée requise pour la production maximum des azaloayoinos fl et t varie avec les dimensions et le type de l'appareillage utilisée Par exemple, dans des fomentation
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à l'échelle industrielle oomme par exemple celles effectuées dans des cuves de fermentation du type à réservoirs, on atteint une production maximum des &lalomyo1ne. B et F en deux à six jours environ. la durée d'incubation varie avec la température d'incubation, le procédé d'inoculation et analogues.
De plus longues périodea d'incubation, de même qu'un déplacement du pH d'incubation vers le coté alcalin semblent entraîner une réduc-
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tion de la quantité de l'aaalomycine B présente dans le liquide de culture* Lorsqu'on utilise de ballons à agitateurs pour l'incubation, la durée de production maximum peut être légère*
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ment plue longue que celle requitte pour les ouveu de fermenta- tion industriellesDans les conditions de culture submergée,
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le mioroorganisme ne développe soue forme de particules plue ou moins minuscule , dispersées dans tout le milieu nutritif, oontrairement à la pellicule plus ou moine continue existant à la surface du milieu,
dans le procédé de culture superficiel- le. En raison de cette'répartition de l'organisme dans tout le milieu, on peut cultiver, en une fais, d'important. volumes du milieu nutritif inoculé dans le* grandes cuvée et les grande réservoirs habituellement utilisés dans l'industrie de la fer- mentation.
A cet effet, on a trouvé qu'il était particulière- ment utile d'employer des cuves de fermentation fixée, munie* de dispositifs appropriée d'agitation et d'aération, de même que des tambours rotatifs horizontaux de fomentation* Toutefois, pour la préparation de plus petite$ quantités
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de l'antibiotique ou des cultures du 1t1oNorgan1..., on peut
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effectuer le procédé à culture Submergés dans de petite ballons
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ou de petite bocaux.
que l'on agite par de* moyen* adoantques, approprient
L'agitation et l'aération du Mélange de obture peuvent
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être effectuées de diverses manières* y agitation peut être assurée par des turbines, des palettes, des Hélices ou autre$ dispositifs mécaniques d'agitation,
en faisant tourner ou en
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agitant la cuve de fermentation 43.i1.s#mex4 différente dis- positifs de raompage ou encore en faisant passer de l'air z travers le milieu* On peut effectuer l'aération en injectant de l'air dans le mélange de fermentation par des conduites ouver-
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te@@ de* conduites perforées* des milieux poit dt diffusion, ooame par exemple de@ bâtons de carbone# du darborundua, du verre fritte et analogueul de aime, on peut effectuer l'aéra- tion en pulvérisant,
en projetant ou en répandant la trempe dana ou à travers une atmosphère contenant de l'oxygène*
Afin d'isoler les substances efficaces présente@ dans le mélange de culture, après la phase de fermentation du pro- cédé, on peut avantageusement employer les moyen-@ habituelle- ment utilisée pour l'Isolation des composante effioaose conte- nus dans les différente mélanges de fermentation.
Lorsqu'on
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isole les azalomyoines B et ? dee source* deeritee oi-deaauet suivant les propriété des azalomyoinea B et ?p on emploie des moyens tels que la concentration des substances efficaces, l'élimination des impuretés et la transformation en une compo* aition pouvant être purifiée plua aisément* Les moyens utili- sés sont lee différences de solubilité dans différente solvant
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les coefficients de séparation un deux ootwboe liquides, les affinités d'absorption, les degrés de décomposition de l'ion hydrogène, les activités 'artiFi é d'r'qi afarrx,
ue les poids moléculaires don asalo"oînet 49#& tut don in
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puretés, Parmi lea opérations où lt' i 'an, il
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y a, par exemple, la dissolution.ou l'extraction aveo de solvants, la précipitation & partir de solutions et la dialyse.
Ces opérations peuvent être effectuées en présence de produite auxiliaires pour la dissolution des atalomyoines B et F ,de la transformation ultérieure des antibiotiques en leurs dérivés peu solubles ou facilement solubles ou autres. Ces moyens peuvent être appliquée à n'importe quelle durée nécessaire pour obtenir les produits désirée à partir des matières de départ, en une fois ou à plusieurs reprises, de même qu'isolément ou en combinai- . son,
80n. On décrira à présent, en détails, les prooédés d'isola tion des azalomyoinea B et ? en utilisant les moyens préoités.
Il est toutefois entendu que oes procédés détaillée sont donnée à tittre d'illustration, sans auoun caractère limitatif
Lors du traitement du mélange de culture liquide conte- nant le mycélium, il est préférable d'effectuer l'extraction en utilisant des solvants, qui dissolvent les azalomyoinee B et F, mais qui ne sont pas misoibles à l'eau, comme par exemple l'alcool n-butylique ou des solvants qui dissolvent l'azalomyoine B, maie qui ne sont pas misoibles à l'eau, comme par exemple l'acétate éthylique ou l'acétate butylique. Il est souhaitable d'effectuer l'extraction à un pH oompris entre 4,0 et 7,0, mais on peut appli- quer un pH inférieur ou supérieur a celui indiqué ci-dessus.
Lorsqu'on soumet la matière solide contenant le mycélium et le filtrat séparément à des procédés d'isolation, on peut séparer les azalomyoines B et ? en phase liquide don impureté., en utilisant la différence du coefficient de séparation entre la couche aqueuse et la couche de solvant organique de la même manière que celle déorite ci-dessus, tandis que les antibiotiques présents dans la matière solide, contenant le mycélium peuvent être extraite aveo des solvants appropriée capables de dissou- dre les antibiotiques, comme par exemple le méthanol, l'éthanol,
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l'acétone, le n-outanol, les esters décide acétique et ana- logues.
Lorsqu'on concentre ou solidifie le liquide de culture , contenant ou non le mycélium par distillation soue vide ou par séchage par pulvérisation, on peut isoler les azalomycines B et 1 de la môme manière que celle décrite ci-dessus pour le cas de la matière solide contenant le mycélium Si le degré de concentration est faible, le traitement est effectué de la même manière que celle décrite ci-dessus pour le cas du mélange de culture liquide. Les azalomycines B et F, dissoutes dans le solvant, peuvent être isolées en éliminant le solvant, par exemple par distillation nous vide.
Do même, on peut les isoler en les précipitant, puis en ajoutant, à la solution, un solvant, dans lequel elles sont pratiquement insolubles, comme par exem- ple l'éther de pétrole ou l'eau. De plus, on peut isoler les substances efficaces en éliminant les impuretés par lavage du résidu avec unsolvant, dans lequel elles sont pratiquement insolubles, après avoir éliminer le solvant, dans lequel elles sont dissoutes. L'isolation des azalomyoines B et ? du sirop ou des précipités, après élimination du solvant, est effectuée en utilisant la différence de solubilité dans les solvants, On peut employer l'acétone anhydre, l'acétate éthylique, l'éther,' , l'hexane et analogues, étant donné qu'ils dissolvent facilement l'azalomyoine B, mais qu'ils dissolvent peu l'azalomyoine F.
L'azalomyoine B ainsi obtenue est aisément cristallisée sous forme de cristaux bruts, lorsqu'on la laisse reposer, de pré- férenoe à de basses températures, après avoir éliminé le sol- vant à un dégré approprié. L'azalomyoine F est obtenue sous forme de cristaux jaune pâle ou. gris clair, en la précipitant du solvant précité, comme par exemple l'acétone anhydre ou l'acétate éthylique.
On peut purifier les azalomyoines brutes B et 1 en poudre en les traitant avec différents solvants orga-
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niques, un solvant ou un mélange de solvants, comme par exemple
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le méthanol, l'éthanolf l'acétate éthylique, le butanol et analogues, par exemple en le* concentrant en le* laissant re- poser et en les refroidissant* Dans ce cas, afin d'éliminer les impureté., il peut être avantageux d'ajouter du charbon ac-
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tif ou d'employerun agent adsorbant, comme par exemple l'alu- mine active, en une quantité appropriée.
Compte tenu des propriétés pr oitd.8 don asalowyoïnes
B et F, on peut dire que les substances obtenues suivant la présente invention sont nouvelles et qu'ellee peuvent être . isolées aisément.
On donnera ci-après des exemples de combinaisons de plu- sieurs procédés d'isolation. Toutefois, d'après la description
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ol-dessua, il est entendu que la présente invention peut éga- lement être mise en oeuvre par un seul procédé d'isolation@
D'après les propriétés des substances efficaces décrites 01-des. sus, l'homme de métier comprendra que l'on peut également at. teindre l'objet de l'invention par d'autres modifications, qui ne sont pas décrites concrètement dans la présente spécifioa- tion.
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' L3 Tit'; HI J)K3 AZAMMKlt<R3 1itL On a examiné les spectres tmt1mioobiene des azalomyoinea par un double procédé de dilution d'agar-agar pendant une pé- riode de 1 - 4 joura. On a dissous les antibiotiques dans une
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petite quantité de diméthyl-formuunide et on les a diluée avec ' de l'eau stérilisée, pour obtenir des milieux finale d'agar- agar contenant moins d'un pouroent du solvant, ce qui n'était pas une concentration nuisible pour l'organisme soumis à l'es-
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oui* Les études sur la plupart des bactéries ont été ettea- tuées dans un milieu de bouillon de glycérol (on a ajouté 11 de glyodrol), Le 0. diphtheriae a été testé dans un milieu de !Dattier, le M. tuberculoale M 37 Rv dans un milieu de Kiroh-
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ner, le C.
tetani dant un milieu de T.G.C. et les St. equi et D. pneumonies dans un bouillon additionné de 10% de sérum de lapin* Pour les levures et le milieu de Trichophyton astéroïdes Sabouraud, de même que pour les autres fongi, on a utilisé un milieu de pommes de terre/sucrose. Le Trichomonas vaginalis a été testé dans un milieu de Hamada. Ion résultat* sont re- prie au tableau 30 L'azalomyoine B est efficace contre les bactéries gram- positives. mais elle a une faible activité contre les mycobacté rias et aucune activité contre les levure* ou les fongi.
Par oontre,l'azalomycine F présente un spectre très large. Elle est efficace in vitro contre les levures, les fongi et le Trichomonas, de mime que contre les bactéries gram- positives, généralement à des concentrations intérieures à 10 meq/ml.
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' Tableau 3* - Spectre$ antimiorcoïene des atalompineo B et'
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Organisme d'oaaai Concentration inh.xitxi ##pe.nita (eq/.t.)..........
Azalomyoine Azalomyoine
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<tb> B
<tb>
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Dao111u8 eubtilie 0 219 0,76 3,12 Staphyloooooua aureua 209 P 0,78 6,25 Saroina lutea l,56 3,12 Oorynobaoterium diphteriae oe63 0,63 Streptoooous $qui 5 > 20 Diploooooua pneumonie.. . 5 > 20 clostridïum tetani 1,25 10
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<tb> Myoobaoterium <SEP> 607 <SEP> 100 <SEP> 50
<tb>
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Myoobaoteriuat phlei 100 25 Myoooaoterium tuberculocie H,7itv tuberaulvai 100 50 6ohsrioh!A ooli NIHJ >100 >100 Pseudontonns aeruginoaa >100 >100 Candida aloioana >100 z Saccharomyces oerevieiaie >100 ' 3 12 Zyosaooharonyoea aalaua >100 1:56 Torula utilis 7100 12 5 Tricophyton astoroides i100 3912 Aspergillus oryzae 100 12,5-25 AI:Jperg:
l.llu8 niger ,00 12 5"25 Pariioïllium ahryaoanum Q.176 >100 1,56-3,12 Urioularia oryzae >100 l,5ô-',12 Ophiobolua myiabeanuo >100 - 1 56-3,12
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<tb> Auertaria <SEP> Kikuohiana <SEP> - <SEP> 1,56-3,12
<tb>
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Solerotinia liuertiana - 0 zizi F'usxrium liooperaioi - 6,25-25 Fusarium Uni 6,25-12,5 ceratostomella fimbriata - 12 -25 corticium vagum M ,?8
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<tb> botrytis <SEP> oinerea <SEP> - <SEP> 1,56
<tb>
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Trichomonas vayinalia 6,25
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La LD60 de l'azalomyoine B chez le@ écurie cet de 281 mg/Kg# lorsqu'elle est administrée par voie intrapdritonales De la même manière, la LOGO de l'azaomo1ne , est de 25e9 mg/Kg.
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Les azalomyoines B et ? sont des substances de valeur
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pour empêcher des infections violentes avec des mioroorgan18m81
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pathogènes chez les Êtres humaine, les animaux et les plant..,
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L'azalomyoine a possède un large spectre d'aotivitee antîmîoro- biennes, principalement contre le8 bactéries gram-ponitivos et,
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en particulier, elle possède des propriétés inhibitrices remar-
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quables contre les pathogènes diphtdritiquest Ltazalom1c1ne ,
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possède des activité anti-fongus, anti-protozoaires et anti- oaotériennea et elle est très utile' pour le traitement des in- feotione par le Trichophyton,
le Trichomonas et analogue.. le@' azalomyoinea B et ? peuvent être utilisées sous de$ formes ap- propriées, par exemple nous forme d'un mélange' en poudre avec des diluants inaotifa, d'un onguent constitué d'azalomyoine et d'une base inactive ou éventuellement nous forme d'une sus- pension ou d'une solution diluée dans une solution saline phy- siologique ou dans de l'eau contenant, un agent tensio-actif compatible* Dans le cas d'une poudre ou d'un onguent, l'azalo- myoine B ou l'azalomyoine P peut être avantageusement utilisée dans des concentrations comprises entre 5 mg et 10 mg par gram- me de la préparation. On peut également employer une solution ou une suspension d'une concentration comprise entre 0,1 et 1%.
Les azalomyoines B et ? sont avantageuses en ce sono qu'elles ont des toxicités relativement faibles et qu'elles sont stables dans différentes conditions d'utilisation. Lorsqu'on utilise l'a- zalomyoine B ou 9 comme agent inhibiteur de croissance contre les bactéries, les fongi et les protozoaires, on l'applique directement à la région infectée et éventuellement, on répète périodiquement le traitement. On peut éventuellement employer l'azalomyoine B ou F en combinaison avec d'autres agents antimi- orobiens ou ohémothérapeutiques.
Les exemples suivants illustrent des procédés appropriée pour la préparation, la purification et le fractionnement des . azalomyoinea B et F.
Exemple
Dans oent et vingt bouteilles de fermentation à agita- tion de 500 cm3, on place et stérilise, de la manière habituelle, dans chaque bouteille, 100 cm3 d'un milieu contenant 1% de glycérine, 0,5% de glucose$ 1% de levure sèche, 0,5% de poudre de soja, 0,2% de phosphate de potassium dibasique et 0,3% de
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chlorure de sodium. On Inocule une oeae de mlo411.. de Strepto- oloos h²ro.Qop10U8 si5-4, cultive sur une culture inclinée d'a- sar-agar de Kraln8kf, puis on incube les bouteilles inoculées, tout en agitant, pendant une période de 5 jours. La production des exalomyoines B et 9 est alors de 160 y/om3 d'a.lo8101n.
B et 500 /Vo m 3 d'azalotayoine ? dans le mycélium #1 120 f/o 3 d'azalomyoine 8 et 400 '(/om' d'azalomyoine dans le bouillon*
On recueille les milieux de culture et on sépare le myoélium par filtration. Le mycélium humide pèse 1 kg et on le
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soumet à une extraction avec 5 kg. d'acétone. On soumet le sol- vant à une distillation noue vide, afin de précipiter les aza- lomycines 8'et 1 de la solution aqueuse résiduelle* On dissout
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, . les précipitée néchée dans 50 om3 de méthanol et on ajoute 200 om3 d'éther à lu solution, afin de séparer l'asalamyoine B, qui est soluble, de même que l'azalomyoine f, qui précipite.
On extrait le bouillon (volume! 10 litres) avec 1/3 de volume de butanol et on concentre l'extrait à un volume d'envi- ron 50 cm3. En ajoutant 5 foie plue d'hexane, on sépare l'azalo-
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aiyaine fi soluble et l'azalomyoine ? précipitée.
On concentre, nous vide, la solution d'éther et d'hexane de l'azalotnyoine B, On sèche le résidu et on le dissout dans environ 50 oa3 d'acétate éthylique. Afin d'éliminer les impurotin, on soumet la solution à des extractions luco8Ieiv..ent avec de@ quantités égales de solution de bicarbonate de sodium
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z à 2% et d'acide ohlorhydrique 00, 1, puis on lave aveo de l'eau distillée. Par refroidissement, on précipite environ 500 mg de cristaux bruts d'azalomyoine B.
On combine les précipitas précités et on lee dissout dans 40 cm3 de méthanol, puis on ajoute 200 on? d'acétone, afin de préoipiter l'azalomyoine F et d'éliminer les Impuretés so-
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lubies. On dissout l'azalomy01ne , dans 20 om3 de méthanol et on soumet la solution à une ohromatographie sur de l'alumine
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neutre,en utilisant le l'acétate éthylique comme phase fixe.
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On élue le produit avec du méthanol aqueux a 20% et on le ra- oriatalliee dane du méthanol, On obtient de l'acalomyoine part sous forme de cristaux en aiguilles pesant environ 1 g.
Exemple 2;
Dans une cuve de fermentation de 100 litres, on place 50 1. d'un milieu contenant 1% de glycérine,0,5% de glucose,
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3 de levure pressée, bzz de farine de soja, O,2 de phosphate de potassium dibasique et ou de chlorure de sodium. On sté- rilise le milieu aqueux sous pression par le procédé habituel et on l'inocule avec 500 on? d'une oulture agitée de Strepto-
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myoeu hyraecapioue bzz.
(oultivé à 12700 pendant 4 jours) On incube le milieu inocule à 28¯ 1 avec une aération de 40 1/minute et une agitation de 250 tours/minute. Après une inou- bation de 48 heure., on obtient 47 1. d'un liquide de culture
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(comprenant le mycélium) contenant lâ0 r'%am3 d'azalomyoine B, et 7O Y/om3 d'azalomyoine 1.
!'x19t)1, .
A 30 l.du liquide de culture d'azalocyoin'8 B et ? (contenant 3,5 g d'azalomyoine B et 22 g d'aealomyoine Bzz ob- tenu de la même manière qu'à l'exemple 2, on ajoute 20 1.d'al- cool n-butylique. On agite le mélange et, par oentrifugation, . on le sépare en 3 parti.., à savoir un bouillon résiduaire,
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un mycélium et une couche d'alcool n-butylique. On aonaantxa la couche d'alcool n-butylique nous vide, en un sirop, auquel on . ajoute 1 Ld'aoétate éthylique.
On sépare la matière insoluble' et la solution et, à la matière insolubles on ajoute 200 cm3 de méthanol, afin de la dissoudre* On filtre la solution et, au filtrat, on ajoute 1 1. d'acétone. On laisse reposer le mélange puis on recueille les précipités formée et on les sèche , pour
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ootenir 7 8.d'azalomycine , brute d'une pureté de 50%, On concentre la solution d'acétate éthylique ci-dessus
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soue ida, , ,. ¯.. y d'aaaloatyoine B.
'J- s..r 't. on ajoute 10 1 à'wborid, pure on ". ,k1tre le m61ange.
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On extrait davantage le mycélium de la môme Manière
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que celle 1ndi.1"eo 10 1 d'acétone aqueux à 20%. On concentre, nous vide, les extraite combinés d'acétone, afin de séparer I*ap4tcin par distillation. On recueille les
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précipitée formée dans le concentrât (couche aqueuse) et on les
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dissout dans 500 om3 de. méthanol. On sépare la matière inaolu- blé et on ajoute, a la solution, 3 1.d'acétone. On laisse reposer
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le mélange pendant une nuit, puis on recueille les précipitée
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ainsi obtenue par centrifugation et on les sèche# pour obtenir 1", g d'azulomyoiue 1 brute gris clair (puretés z). mBl&J: Avec de l'acide chiot-hydrique à 10y, on règle, à , 0, le pH de 250 L du liquida de culture (contenant 24 g.datalo myosine 8 et riz g.deazalomyoine P) , obtenu de la môme manière qu'à l'exemple 2.
Au ni,ane obtenu, on ajoute 200 l'd'acétate éthylique #t 6 k de "Hyfio Super-oell'Os qui est un produit auxiliaire filtrant aonstitué de terre d'infusoires ayant des particules d*uwe g3 a U3f moyenne de 8 à 10; ensuite, on agite vigoureusement se on filtre.
On extrait, 8U40eo81v.men 30 kg.du myoélium humide (contenant le "&1P8\0.00.l.l tt' on utilisant chaque foie 100 1. d'aotare à 90 va On oonoeAtre. noue vide, lori extraits oombinéa dluaëtone et on recueille les précipitée ainsi formée, puis on le aohe, pour obtenir 195 g. de poudre grise. On lave la poudre ave d6ft pôr'10o de 5OQtm3 d'acétate éthylique. Le résidu ae.a3 ont 4"lt*alQ1ne F brute, pelant 96 & (pureté.
74)* Par roo16t.111.a1 dane du méthanol aqueux à 90%, on obtient 40 g l9 poudre,4 gris clair d' azalomyo1ne , (pureté t 95<)t On \'.1IOUCeii\t"i'J,."mw,.. v4 i f à un volume d'environ 1/1.000.
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la solution aqueuse d'acétate éthyliques séparée du ayoélium par filtration.
On lave deux fois le concentrât avec une solu- tion de bicarbonate de sodium à 2% et une foie avec de l'aoide chlorhydrique à 0,1%, chaque foie à un volume de 1/10, afin d'éliminer les impuretés.On concentre davantage le concentrat obtenu et on le laisse reposer pendant une nuit dans un endroit froid, afin de précipiter des cristaux brute. On filtre les cristaux et on lea sèche, pour obtenir 8,4 g.de poudre d'aza- lomyoine B brute (purent 91%).
Exemple 5 Tout en chauffant à 40 C, on dissout, dans 1 1. de n-butanol, 7 g. d'azalomycine F brute, obtenue à l'exemple 3.
On filtre la matière insoluble et on concentre le filtrat sous vide, à sec. On dissout le résidu dans 50 cm3 de méthanol et on filtre la matière insoluble. On ajoute 600 m3 d'acétone au filtrat et on laisse reposer le mélange, afin de séparer une quantité suffisante de précipités. On recueille les précipitée ainsi formée et on les dissout dans 30 on? de méthanol. On traite la solution avec 0,5 g.de charbon de bois en poudre, en vue de la décoloration, puis on filtre. On ajoute 200 om3 d'acé- tone au filtrat, pour obtenir des précipitée que l'on filtre et lave avec 50 cm3 d'acétate éthylique.
On recristallise les cristaux obtenus dans du méthanol à 90% et on les sèche$ pour obtenir 2,5 g.d'azalomyoine F en aiguilles blanches d'un point de fusion de 125-127 0.
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