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Produits pharmaceutiques anti-inflammatoires.
1 La présente invention concerne des produits pharmaceuti- 'ques anti-inflammatoires et des procédés de traitement de certaines inflammations à 1-laide de ces produits.
Les produits suivant linventjon se sont révèles effica- ces contre des doses létales de substances inflammatoires telles que l'histamine, la bradykinine, la sérotonine et l'acétylcholine.
On se réfère par un chiffre aux publications suivantes; 1. B.A. Kovacs et L. Szabadi, Arch Intern Pharmacody@
276 (1950).
2. J.Kovacs, B.A. Kovacs, L.Szabadi., D. Varsanyi, ibid. 90,
93 (1952).
3. W. Feldberg et B.A.Kovacs, J.Physiol, 154, 461 ,(1960).
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4. P.A.Berry, J. A. Holgate, I.M. Lockhart, Nature. 196,
382, (1962) 5. J.Broome, R.K. Callow, W. Feldberg, B.A.Kovacs, Brit. J.
EMI2.1
Pharmacol. 18, 87 (1962) 6. C.H.W. Hirs, S. Moore,W.H.Stein,'J.Biol. Chem. 219,
623 (1956) 7. B.A.Kovacs, G. Pelletier, B. Rose,Brit. J.Pharmacol.
EMI2.2
21,.19 (1963) 21,419 (1963) Sbornik Dnepropetr. Gos. Med. B.A. Tukalo, Sbornik Nauch. Tr. Dnepropetr. Gos. Mede Inst. 1, 351 (1956) Paper Chromatograpty and Paper Blectiophoresis, R.J.
Block, E.L. Durrum, G.Zweig, Eds. (Aerdenic Press, .,,) New Yorke 1958) J'¯.
10. J.M. Bobbitt "Thin Layer Ch omatographyn,Reinhold Pub- lishing Co.1963. il. The Merck Index '1?rck & Co., Ine. 1960'
On a signalé pour la première fois en 1950 que certains, ! extraits de tumeurs de plantes (galle du chêne, tumeur du collet)) injectés à des cobayes protègent ces animaux contre les effets dunt
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aérosol d'histanilne (1,2). Les expériences à l'aide de la galle du chêne ont été confirmées par Feldberg et Kovacs (3) et Berry et collaborateurs (4).
Des tumeurs du collet sont induites surdes tiges de plants de tomate et extraites par des procédés déjà décrits (5).
Au début, Inactivité biologique des , divers extraits est déterminée à chaque stade par le procédé à l'aérosol d'histamine (5). Toutefois au cours de la purification, cette technique constitue un obstacle majeur pour l'étude, en raison des quantités importantes de cha- que fraction qui sont nécessaires pour les expériences. On est arrivé à une purification poussée et enfin à l'isolement du prin-
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cipe actif en ds*::..z:.t 3,'activ3.té des extraits purifiés sur
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des préparations d'organes isolés.
Il est apparu que la substance cristalline,isolée à partir des tumeurs du collet, inhibe les contractions de l'iléon de cobaye isolé préparé induites par l'histamine, la bradykinine, la sérotonine et l'acétylcholine..
Le procédé et l'appareil utilisés pour préparer l'iléon de cobaye sont ceux décrits dans la littérature (7). Pour,le dosage, les di .verses fractions sont dissoutes dans de l'eau acidifiée à pH 3,2.
On fait varier entre 0,1 et 0,3 cm3 la quantité de solution ajoutée; au bain , parce qu'il est apparu que l'addition de telles quantités; d'eau ayant le même pH n'influence pas la contraction induite par ! l'histamine.
La Demanderesse a découvert que l'extrait de tumeur du collet a des propriétés exceptionnelles, étant donné qu'il inhibe longtemps la contraction de la musculature lisse par les quatre . agents principaux mentionnés ci-dessus. Cette action prolongée se manifeste tent in vitro que in vivo. La Demanderesse a trouvé, en outre, que cette action in vivo prolongée ne s'accompagne d'au- cun effet secondaire indésirable.
La Demanderesse est portée à croire que le mécanisme de cet effet anti-inflammatoire est différent du mécanisme "compéti- tif" typique des substances anti-histaminiques connues. Il semble en être ainsi parce que le produit suivant l'invention exerce un effet inhibiteur sur l'acétylcholine que ne manifeste pas les autre anti-histaminiques. Les anti-histaminiques connus apparaissent par compétition avec l'histamine.dont ils suppriment ainsi ?'effet inflammatoire. Il semble en être autrement dans le cas de la présente invention.
L'invention est davantage illustrée, sans être limitée, par les exemples suivants.
EXEMPLE 1
On broie 350 g de tumeur du collet dans un mélangeur
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Waring et on les extraits trois fois à l'aide d'aliquotes de 350cm3 d'un mélange (3: 1) en volume d'éthanol-éther. On.filtre la pulpe et! on évapore en atmosphère d'argon sous pression réduite à 45 - 50 C le liquide surnageant limpide comprenant l'éthanol et l'éther.
On extrait le résidu à l'aide d'eau à pH 5,6 (25 cm3/100 g de tissus de départ) et on filtre l'extrait aqueux. On ajuste le filtrat limpide à pH 8 à l'aide de NaOH dilué par obtenir un précipité pesant 175 mg. Le principe actif est contenu dans le précipité.
On procède à une nc.uvelle purification en dissolvant 10 mg du précipité dans 1 cm@ de HCl dilué (pH 3,2) et en passant la solution brune sur une colonne (0,9 x 30 cm) de Sephadex G-25.
Le gel a été équilibré au préalable à l'aide de HCl dilué (pH 3,2) et le même solvant sert pour développer le chromatogramme.
Certains constituants de couleur claire sont fortement retenus par le gel de dextrane. L'effluent s'obtient en aliquotes de 2 cm3 dans un collecteur @e fractions.. et est essayé par colorimétrie à la ninhydrine de Hirs et collaborateurs (6). Cha- que fraction est essayée pour en établir l'activité anti-hista- minique sur l'iléon isolé de cobaye. L'activité coïncide largement, avec la fraction donnant la seule réaction positive avec la ninhy- drine. On estime, sur la base de ces essais, que la filtration sur gel a augmenté de 10 à 15 fois l'activité spécifique.
Les fractions actires sont*réunies . ajustées à pH 8 à l'aide de NaOH dilué et extraites trois fois par des aliquotes de 10 cm3 d'un mélange (4:1 en volume) de chloro- forme et d'éthanol., Les extraits dans le chloroforme et l'étha- nol sont séchés sous vide à 35 C pour donner un produit cristallin blanc.
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Le procédé décret dans l'exemple 1 donne principalement un composa connu sous le nom de tomatine (11).
Il apparaît qu'une quantité relativement faible du principe actif a été séparée .de l'extrait de tumeur du collet par l'éthanol'- éther. Dans d'autres exemples, le mélange éthanol-chloroforme ' apparaît beaucoup plus sélectif' pour séparer la tomatine des .extraits de tumeur du collet plus actifs suivant l'invention.
EXEMPLES -
On broie 600 g de tumeur du collet de plants de tomates dans un mélangeur Waring en présence,comme solvant,d'un mélange
3:1 en volume de chloroforme et d'éthanol. Le mélange est ef- fectué pendant 2 à 3 minutes à la vitesse maximum de l'appareil.
On ajoute du mélange chlcroforme-éthanol pour porter le volume à 18 litre ce qui représente 300 cm3 pour 100 g de tissu. On chauffe la suspension, sous agitai.ion,pendant 5 minutes à 70 C et on la filtre surBuchner. On rejette 'le résidu et on sépare les, solvants du soluté par évaporation sous pression réduite,dans un évaporateur rotatif, puis on sèche encore le résidu à l'ai- de d'une pompe à vide.
L'extrait sec est ajouté à 90 cm3 d'eau distillée, ce qui représente 15 cm3 d'eau pour 100 g de tissu. Le mélange est bien homogénéisé et ajusté alors à pH 2. Le mélange est alors chauffé à 37 C pendant 5 minutes, puis filtré. Le résidu est alors rejeté.
Le filtrat est ajusté à pH 8 et extrait à l'aide d'un mélange
6:1 envolume de chloroforme et d'éthanol. Cette extraction est répétée trois à cinq fois en utilisant chaque fois 90 cm3 de liquide d'extraction, soit 15 cm3 pour 100 g de tissu. On rejette finalement la phase aqueuse pour obtenir 45 g d'un résidu appelé fraction "A". Cette fraction A,qui est constituée par tous les résidus solides des extractions précédentes,est amenée à siccité à l'aide d'un évaporateur rotatif, puis à l'aide d'une -trompe.
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EXEMPLE 3
L'extrait sec, c'est-à-dire la fraction A ci-dessus,est dissous dans 90 cm3 d'un mélange 6:1 en volume de chloroforme et d'éthanol et la solution est extraite trois à cinq fois à l'aide . de 900 cm3 d'une solution aqueuse à 10% d'acide acétique. Les extraits. aqueux sont réunis, évaporés à siccité d'abord à l'aide d'un évapo- rateur rotatif, puis à l'aide d'une pompe à vide et enfin pesés.
On obtient un résidu solide,appelé fraction "B".
La phase organique résultant de l'extraction ci-dessus est évaporée à siccité, d'abord à l'aide d'un évaporateur rotatif, puis à l'aide d'une pompe à vide et enfin pesée. On obtient un résidu solide appelé fraction "C".
Dans les dessins annexés:
Fig.l est le spectre infrarouge de l'extrait de tumeur du collet ; obtenu dans l'exemple'1,donnant la transmission en %.
. en ordonnées en fonction de la longueur'd'onde en microns ' en abscisses (au-dessus) ou'de la fréquence en cm-1 en abscisses (en dessous)
Fig.2 montre l'inhibition in vitro de l'histamine par l'extrait de tumeur du collet.
Fig.3 est un diagramme montrant certaines caractéristiques de l'ex- trait des tumeurs-du collet obtenu dans l'exemple 3.
La Fig. 3 montre les réponses d'une préparation d'iléon de cobaye à l'histamine,ajoutée aux moments indiqués par les points noirs,avant et après l'addition.indiquée par la flèche,de l'extrait de, tumeur du collet en une concentration de 3 x 10-6 poids/volume.'
Des intervalles de 3 minutes s'écoulent entre les additions d'hista- mine.Dans chaque cas,le cylindre est arrêté après lavage de l'organe et remis en marche 20 secondes avant l'addition de la dose suivante
Les temps de contact sont de 20 secondes pour l'histamine,et de 2 minutes pour l'extrait cristallin da tumeur du collet.
La Fig.2 montre que l'addition de la substance suivant l'in- ventLon enune concentration, de 3x10-6 au bainmême provoque une contrac- tion initiale,analogue à celle de l'histamine. Toutefois,les réponses
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aux doses suivantes de 0,1 g d'histamine,dont les additions sont séparées par des lavages.deviennent de plus en plus faibles.
La sensibilité de -l'iléon reste fort réduite pendant plus d'une heure . L'excitation initiale et l'effet dépresseur très durable qui se manifestantpar la. suite sont des caractéristiques de la substance cristalline impure in vitro et les deux effets indiquent Inexistence d'une corrélation directe avec les quantités ajoutées.
En d'autres termes, la contraction initiale et la dépression ultérieure sont d'autant plus marquées que la dose est plus élevée.
Les contractions initiales peuvent avoir été provoquées par les impuretés. '.' . '
Le tableau 1 ci-après présente les caractéristiques des fractions A, B et C. Ce tableau Indique lè nombre de grammes de chaque fraction qui est nécessaire pour protéger des cobayes pesant environ 250 g contre une exposition létale de
20 minutes à un aérosol d'histamine. Il ressort de ce tableau que la différence entre les activités anti-histaminiques des trois fractions est faible ou nulle. On est porté à croire,pour cette raison .que la nouvelle extraction décrite dans l'exemple 3 n'aug- mente pas sensiblement l'activité de l'extrait de tumeur du col- let suivant l'invention.
EXEMPLE 4 -
Chromatographie sur colonne de la fraction B
On dissout 1 g de la fraction soluble dans l'acide acé- tique dans 2 cm3 d'eau et on ajuste la solution à pH 3 à l'aide d'acide acétique . La solution obtenue est passée sur une colonne de Sephadex G-25 "fin" (pharmacie) de 2,5x 100 cm. La colonne est alors éluée à l'aide d'acide acétique dilué (pH3) à raison de 60 cm3 par heure. L'éluant est recueilli en 130 fractions de
2 cm3 chacune. Les fractions sont soumises à des analyses spectro photométriques par trois procédés.Les résultats de ces essais,les den- sités optiques étant en ordonnées,sont montrés sur la Fig.3 pour les tubes n s 50-130,groupés en classes I à VIII (abscisses), les classes actives étant indiquées par un signe particulier.
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a.
Le produit de la réaction avec la ninhydrine qui est un réactif spécifique des composas à groupes amino primaire est bleu..
L'absorption est mesurée à la longueur d'onde de 575 m . b. Absorption dans le visible à la longueur d'onde de 440 m au spectrophotomètre Junior Coleman. c. Absorption dans l'ultraviolet à al longueur d'onde de 280 m mesurée au spectrophotomètre Beckman DU.
Les tubes N s 50 à. 130 sont groupés en plusieurs classes ;
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portant le N 1 à VIII. Les classes n II et V présentent une act:; vite biologique prononcée.
EXEMPLE 5.
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Chro'natograph1e sur 'oo.ùoho mince de la coupe NO-11.
La fraction active (classe n II) qui accuse une activité in vivo est passée sur gel de silice G,en se conformant au procédé décrit par Bobbitt (10). On procède alors au développement à l'aide d'un mélange 1:1 en volume de méthanol et de chloroforme.Le chroma- togramme est ensuite coloré à l'aide de 3 réactifs:
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a. Acide phosphomolybdiaue
On constate trois taches sur le papier aux points sui- vants : Rf=0,0 (trace seulement ) Rf=0,5 (tache relativement grande) Rf=O,l (tache petitejaune pâle)
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b. Acide phosohor1Que
Ce composé colore généralement les stéroïdes.
Rf=0,5 (une tache) c. Ninhvdrine
Il s'agit d'un réactif spécifique des groupes amino.
On n'observe pas de réaction positive.
Le Rf désigne le rapport.entre le déplacement des taches' et le déplacement du front da solvant. La tache qui apparaît pour
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Rf=0,5 dans les essais et b devient fluorescente sous irradia- tion ultraviolette, ce qui indique également la présence d'un stérolde.
Activité biologique de la fraction active (classe n II de la Fig.3)
L'activité biologique de la classe n II est estimée en injectant la substance par voie intrapéritonéale dans le flanc gauche ou droit de cobayes pesant chacun environ 250 g. Ces doses se révèlent inhiber de façon significative la réaction des animaux contre l'effet létal d'un aérosol à 0,15% d'histamine. On con- stte avec surprise que la protection qu'assure une seule injec- tion dure 2 à 3 semaines ou davantage.
Dans le tableau 2,qui présente les données concernant le traitement d'un 'cobaye choisi au hasard, la lettre D indique le temps en minutes et en secondesqui s'écoule jusqu'à la première' manifestation de dyspnée (diarrhée et miction ). La lettre F indique le temps qui s'écoule jusqu'à ce que l'animal tombe la , .-première fois. La lettre L indique le temps qui s'écoule jusqu'à ce que l'animal reste couché et la lettre X indique le temps qui s'écoule jusqu'à la mort de l'animal.
Le tableau 3 montre que seule la classe n II accuse une activité in vivo significative.
Le tableau 4 montre la très longue persistance de l'effet anti-inflammatoire des extraits suivant l'invention.
L'identification de l'extrait suivant l'invention est encore en cours. On trouvera ci-après certaines caractéristiques de solubilité du produit.
Le produit est soluble dans: l'eau à pH 3,2 et moins le méthanol l'éthanol unmélange 3:1 en volume d'éthanol et,de chloroforme
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il est insoluble dans : le chloroforme le tétrachlorure de carbone le sulfure de carbone La chromatographie sur Sephadex G-25 semble indiquer que le principe actif a un poids moléculaire de 2.000 à 4.000.
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TABLEAU 1
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<tb> Echantillon <SEP> Poids <SEP> sec <SEP> moyen <SEP> de <SEP> la <SEP> Dose <SEP> moyenne <SEP> pour
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> fraction <SEP> mg/100 <SEP> g <SEP> de <SEP> , <SEP> une <SEP> protection <SEP> de
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<tb>
<tb>
<tb> tissu <SEP> de <SEP> tumeur <SEP> 20 <SEP> minutes <SEP> du <SEP> co-
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<tb> baye.¯¯¯¯¯¯--
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<tb> Fraction <SEP> A <SEP> 45,0 <SEP> 5,0-12,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fraction <SEP> B <SEP> 36,9' <SEP> 7,5-10,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fraction <SEP> C <SEP> 6,7 <SEP> 3,4-10,0
<tb>
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############zip TABLEAU 2
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<tb> Classe <SEP> II <SEP> Classe <SEP> II <SEP> Témoin
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Dosemg/kg <SEP> 20 <SEP> 40
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D <SEP> 2 <SEP> :
<SEP> 20 <SEP> >20 <SEP> 0:40
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> F <SEP> 4:30 <SEP> > <SEP> 20 <SEP> 1:00
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> L <SEP> 7:00 <SEP> >20 <SEP> 3 <SEP> :20
<tb>
<tb>
<tb> X <SEP> 9 <SEP> :04 <SEP> >20 <SEP> 4:00
<tb>
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TABLEAU 3
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<tb> Classe <SEP> I <SEP> Classe <SEP> II <SEP> Classe <SEP> III <SEP> Classe <SEP> IV <SEP> Classa <SEP> V <SEP> Classe <SEP> VI <SEP> Classe <SEP> VII <SEP> Classe <SEP> VIII <SEP> Té@
<tb> Dose
<tb> mg/kg <SEP> 7,5 <SEP> 15 <SEP> 7,5 <SEP> 15 <SEP> 7,5 <SEP> 15 <SEP> 7,5 <SEP> 15 <SEP> 7,5 <SEP> 15 <SEP> 7,5 <SEP> 15 <SEP> 7,5 <SEP> 15 <SEP> 7,5 <SEP> 15
<tb> D <SEP> 1:15 <SEP> 2:15 <SEP> 1:30 <SEP> '5:00 <SEP> 1:40 <SEP> 2:30 <SEP> 1:35 <SEP> 2:20 <SEP> 1:20 <SEP> 0 <SEP> :50 <SEP> 0:30 <SEP> 0:301:00 <SEP> 1:10 <SEP> 1:00 <SEP> 1:00
<tb>
<tb> F <SEP> 1:45 <SEP> 3 <SEP> :
10 <SEP> 5:000 <SEP> 2:15 <SEP> 2 <SEP> :50 <SEP> 2:45 <SEP> 2:55 <SEP> 1:45 <SEP> 2 <SEP> :00 <SEP> 2:30 <SEP> :40 <SEP> 2:30 <SEP> 2:30 <SEP> 3 <SEP> :00 <SEP> 3:35 <SEP> . <SEP>
<tb>
L <SEP> 4 <SEP> :20 <SEP> 5:20 <SEP> 7:30>20 <SEP> 3:45 <SEP> 4:00 <SEP> 5 <SEP> :25 <SEP> 4:25 <SEP> 3:15 <SEP> 3:15 <SEP> 3 <SEP> :30 <SEP> 3:30 <SEP> 4:00 <SEP> 4:00 <SEP> 4:20 <SEP> 4:30
<tb> X <SEP> 6:25 <SEP> 9:00 <SEP> 10:00>20 <SEP> 5:15 <SEP> 6:45 <SEP> 7:00 <SEP> 7:00 <SEP> 4 <SEP> :50 <SEP> 6:20 <SEP> 7 <SEP> :05 <SEP> 5:00 <SEP> 6:00 <SEP> 5:15, <SEP> 6:05 <SEP> 6 <SEP> :20
<tb>
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TABLEAU 4
EMI13.1
<tb> Classe <SEP> II <SEP> Témoins
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> heures <SEP> après <SEP> le
<tb>
<tb> traitement <SEP> >20 <SEP> 5:20
<tb>
<tb>
<tb> 16 <SEP> jours <SEP> ' <SEP> >20 <SEP> 5 <SEP> :30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 31 <SEP> jours <SEP> 11:15 <SEP> 5 <SEP> :15
<tb>
REVENDICATIONS. ;
1'- Procédé pour éviter ou atténuer les états inflamma- ; toires d'un être vivant,caractérisé en ce qu'on le traite à l'aide de l'extrait de tumeur du collet décrit ci-dessus.
2. - Procédé pour éviter ou atténuer les états inflamma- toires d'un être vivante caractérisé en ce qu'on le traite par une substance stéroïde présentant les particularités décrites ci-dessus.
3.- Procédé pour éviter ou atténuer les états inflamma- toires d'un tissu vivante caractérisé en ce qu'on traite le tissu pai l'extrait stéroïde présentant les particularités décrites plus haut, avec référence spéciale à la classe n II de la Fig.3.
4.- Produit pharmaceutique anti-inflammatoire, en substan- ce comme décrit ci-dessus.
5.- Produit pharmaceutique anti-inflammatoire, en substance comme décrit ci-dessus avec référence spéciale à la classe n II -de la Fig.3.