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Procédé de transfert de l'oxygène à partir d'un gaz contenant de l'oxygène à destination de la solution nutritive, dans la fabrica- tion de la levure, notamment de la levure de boulangerie, ou dans la fabrication d'autres microorganismes.
A la teneur en alcool d'un bain de fermentation consti- tue un critère excellent pour déterminer si l'on a un équilibre correct entre la concentration en levure et l'apport de sucre et d'oxygène. Même si une foule d'autres facteurs, par exemple la quantité de biotine et l'état physiologique de la levure jouent un certain rôle, ces facteurs n'ont que peu d'intérêt à ce point de vue. Dans la préparation industrielle courante de la levure, l'apport de mélasse est très souvent déterminé en fonction d'un programme préétabli. Dans le cas où l'on dissout simultanément dans le bain de fermentation une quantité suffisante d'oxygène ou d'air, la croissance de la levure est directement proportion- nelle à l'apport de mélasse, autrement dit la croissance suit le
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même programme que l'apport de mélasse.
Si la quantité d'oxygène qui est dissoute par unité de temps, lors de Inexécution d'un tel programme de fermentation, est insuffisante, on a une accumulation d'alcool et la concentration en levure est inférieure à la valeur calculée. Dans les conditions de ce genre avec un apport initial de levure correspondant à 15 à 20% de la quantité finale obtenue et un taux d'accroissement de 0,05 à 0,20, la concentration en alcool ; est essentiellement fonction de la quantité d'oxygène qui est ap- portée à la solution nutritive; autrement dit, si une.quantité suf- fisante d'oxygène est incorporée au moment de la fermentation à la solution nutritive, aucun alcool n'est accumulé au cours de la croissance de la levure.
Dans certaines conditions, par exemple lorsque la concentration en levure est trop faible pour que la quantité de mélasse qui est apportée puisse être transformée en levure, il peut se produire une accmulation d'alcool, même si l'on ' a un excès d'oxygène dans la solution nutritive. Dans ce cas, le facteur limitatif est constitué par l'équipement enzymatique oxy- datif de la levure. Une telle situation est toutefois exclue lors- que la fermentation est programmée correctement.
Le transfert de l'oxygène entre les bulles de gaz qui sont introduites dans la solution nutritive et les cellules de la levure peut être influencé par une ou plusieurs des mesures ci- après: 1) Par modification de l'apport d'air dans la solution nutritive.
2) Par réglage du travail mécanique de brassage qui est dépensé dans la solution nutritive, cela dans le cas où l'on a effecti- vement un brassage mécanique en dehors de l'insufflation de l'air, 3) Par modification de la dimension des bulles de gaz, par exemple en abaissant la tension superficielle de la solution nutritive ou bien en utilisant tout système mécanique de fragmentation des bulles.
4) Par modification de la teneur en oxygène dù gaz admis dans le bain.
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Eorsque l'on agit sur l'un de ces facteurs, la teneur en alcool du bain se modifie; autrement dit on a une modification de la vitesse de transfert de l'oxygène. L'invention est basée sur le principe suivant: on mesure la teneut en alcool de la solution nu- tritive et l'on règle la vitesse de transfert del'oxygne vers la solution, en fonction de la teneur en alcool mesurée, de telle sorte que cette vitesse reste essentiellement inchangée.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, on.utilise de pré- férence certaines méthodes permettant de réaliser le dosage auto- matique et exact de l'alcool, autrement dit lmesure de la teneur en alcool, par, exemple selon.une variante du procédé de 1.ADH de Theorell. Les teneurs en alcool mesurées et enregistrées'sont uti- lisées ensuite pour le réglage automatique de la vitesse de transfert de l'oxygène à destination de la solution nutritive, par exemple selon l'un des programmes de réglage diqué ci-dessous.
La détermination de l'alcool par le procédé dit à l'ADH est accomplie selon le principe ci-après: l'alcool éthylique est oxydé par l'enzyme spécifique de cette réaction, à savoir l'alcool- deshydrogénase (ADH) en présence du coenzyme 1 (plus précisément le 'diphosphopyridine-nucléotide ou DPN) le DPN étant simultanément transformé dans sa forme réduite DPNH2.
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Alcool + DPN ### aoétalàéhydo + DPN H2 #--.
ADH
La réaction est opérée au pH de 8,78, La quantité de DPN H2 ainsi formée est directement proportionnelle à la concentra - tion d'alcool et elle est calculée à partir de son absorption spé- cifique à la longueur d'onde de 340 /u .
Succinctement, l'exécution de l'analyse est conforme à l'exemple ci-après: On prend 3 ml d'un mélange constitué par une partie de solution de DPN et 30 parties de solution tampon, et l'on y ajoute 5 microlitres de la solution alcoolique. On ajoute ensuite
30 microlitres de la solution de l'ADH et la réaction se déroule
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pendant dix minutes. Ensuite on lit la valeur d'extinction à 340/u dans un spectrophotomètre. On utilise comme échantillon-témoin les mêmes agents de réaction sans addition d'alcool.
En fonctionnement automatique, il est rationnel d'utili- ser un instrument à faisceaux assurant automatiquement la correc- tion en fonction de l'absorption d'un échantillon-témoin.
' La valeur mesurée est par conséquent constituée par une différence entre les taux d'absorption de la lumière.
Un'doseur de l'alcool pour la détermination de la teneur en alcool peut être par exemple conçu de telle sorte que la solu- tion tampon contenant le DPN s'écoule dans un récipient de mesure jusqu'à obtention d'un volume donne, ce après quoi cet apport est automatiquement interrompu alors que simultanément on fait inter- venir l'arrivée de la solution d'enz,me. Ce faisant, la solution d'enzyme s'écoule vers le bas dans le récipient de mesure, au travers d'un ajutage, et forme une goutte entre cet ajutage et une électrode a goutte pour le dosage de la solution d'enzyme,
ladite goutte étant ensuite repoussée dans le récipient de mesure*.La liqueur à doser s'écoule sans arrêt dans une canalisation de dériva- tion au travers d'une vanne qui peut être actionnée en rotation. par un moteur de commande. Lors d'une détermination, de la teneur en alcool, 'cette vanne est tournée de telle sorte que la circulation soit interrompue et qu'une certaine quantité représentant l'échan- tillon d'épreuve, par 'exemple ,microlitress,est enfermée entre les parois de la vanne pour s'écouler ensuite, en même temps que la solution d'enzyme, de tampon et de DPN (précédemment dosée), dans un bac où tous les composants sont mélangés.
A l'instant où le moteur de commande de la vanne d'arrête de telle sorte que ladi- te vanne se trouve dans la position prescrite, on enclenche un relais différé qui remet par exemple le moteur en route, cela dans un délai qui peut être d'une minute afin de ramener la vanne dans la position pour laquelle,la dérivation est ouverte.
Apres écoule- ment d'un certain temps, par exemple dix minutes, pendant lesquelles
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se poursuit la réaction dans le bac, on met en action un spectro- photomètre qui mesure la quantité de DPN H2 qui s'est formée et 'duquel part une tension photoélectrique amplifiée à destination de l'enregistreur-régulateur, la valeur des impulsions de réglage qui sont envoyées à l'appareillage en vue de commander le transfert de l'oxygène à destination du bain de fermentation étant réglable'
Une fois que la mesure a été effectuée, une canalisation s'ouvre pour opérer le levage du bac de mesure et le processus décrit ci-dessus peut recommencer-
En dehors du doseur d'alcool décrit ci-dessus,
il est possible d'utiliser d'autres appareils de dosage pour la détermi- nation de la teneur en alcool en conjonction avec le système selon l'invention. C'est ainsi que l'analyse par le procédé 4 l'ADH peut être effectuée par exemple avec l'auto-analyseur de la firme Technicon Instruments Corp. Certains appareils de chromatographie en phase gazeuse peuvent aussi être utilisés pour l'analyse auto- matique et l'¯mission des impulsions, par exemple l'appareil de Beckaan et' Parkin-Elmer ,avec utilisation de la technique d'analyse qui est usuelle dans le cas de ces appareils.
Le réglage du transfert d'oxygène vers le bain peut être effectué en se basant sur la teneur en alcool de diverses manières dans le cadra de l'invention. Par exemple on peut agir soit sur la quantité d'air introduite dans le bain soit sur l'effet d'agitation et/ou la tension superficielle du bain toujours en fonction de la teneur en alcool dudit bain laquelle constitue une mesure de l'ac- tivité de l'oxygène ou de la teneur en oxygène du bain. Le réglage peut être effectué automatiquement et sans interruption.
Quelques modes d'exécution seront décrits en se référant aux dessins ci-après, dans lesquels la figure 1 est un dispositif pour le dosage de l'air, la figure 2 étant une variante d'exécution du dispositif selon la,figure 1.
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La figure 3 représente un dispositif pour le réglage de la vitesse angulaire du brasseur;
La figure 4 étant un dispositif pour le réglage de la tension superficielle du ,bain; La figure 5 montrant des courbes qui mettent en éviden- ce le rapport entre la teneur en alcool et l'apport d'air dans l'un des étages de fermentation;
La figure ,6 montrant la relation qui existe entre la vitesse angulaire du dispositif'de brassage et la teneur en al- cool ; et enfin
La figure 7 mettant en évidence la relation entre la te- neur en alcool et l'adjonction d'agents tensio-actifs superficiels, EXEMPLE 1.-
Réglage du transfert d'oxygène à destination du bain par modification de la quantité d'air insufflée ou de la vitesse de l'air.
Dans l'industrie des levures de boulangerie, c'est ce type de réglage du transfert d'oxygène qui est.le plus usuel. En augmentant le débit de l'air, ou la vitesse de l'air, on obtient une augmentation de la surface des bulles de gaz et une forte tur- bulence. La surface de contact entre le gaz et le liquide est donc augmentée, et l'on a un accroissement proportionnel de la vitesse de transfert de l'oxygène. Ce procédé de réglage rencontre certaines limitations lorsqu'il s'agit du transfert de grandes quantités d'oxy- gène.
Au delà d'une certaine valeur de la vitesse de l'air, on a généralement un abaissement de l'efficacité, étant donné que des canaux s'ouvrent dans le liquide, de sorte qu'un apport supplémen- taire d'air ne conduit pas au résultat attendu. Dans les autres exemples qui sont décrits ci-aprés et qui concernent également le réglage du transfert de l'oxygène, les impulsions fournies par le doseur d'alcool agissent sur le réglage de l'air comme ci- après:
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Lorsque la teneur en alcool dépasse vers le haut ou vers le bas une valeur limite déterminée à l'avance, on a une modifica- tion du débit d'air insufflé qui correspond à une quantité donnée par unité de temps, à savoir une augmentation ou une réduction de 50 litres par seconde.
Des exemples de circuit de réglage sont don- ces par les figures 1 et 2, dans lesquels on a en 1 un récipient contenant la solution de réaction dont il convient de déterminer la teneur en alcool. En 2 se trouve un spectrophotomètre qui déter- mine cette teneur et qui envoie les impulsions à un amplificateur, lequel émet à son tour des impulsions amplifiées à destination d'un régulateur enregistreur 4,, Ce dernier agit sur un système de com- mande 5 qui est muni d'un relais temporisé, ledit système de com- mande agissant à son tour sur le moteur 8 de réglage d'une pompe pneumatique 9 (voir la figure 1) qui refoule de l'air à destina- tion du bac de fermentation.
Le réglage peut aussi être effectué, Comme le montre la figure 2, en faisant agir le dispositif de com- mande 5 non plus sur le acteur 8 de réglage de la rampe mais sur des moteurs 8 qui agissent sur des vannes 7 montées dans lesdéri- vations 6 qui admettent l'air 1 destination du récipient de fermen- tation. Aussi longtemps que les impulsions en provenance du doseur d'alcool 2 sont incluses dans le domaine autorisé, le débit d'air admis, dans le fermentateur n'est pas modifié. Au contraire, si le doseur d'alcool 2 émet une impulsion qui dénote un renforcement de la teneur en alcool, ou au contraire une réduction, le débit d'air admis à destination de chaque fermentateur est augmenté ou réduit d'une fraction représentant par exemple 50 litres à l'heure.
L'exemple de fermentation décrit ci-dessus correspond à une étape dans la culture continue de la levure. Les essais sont exécutés 'dans un récipient inoxydable de 15 litres qui est muni d'un agita- teur, de bafles, d'un système automatique de prévention de la mous - se, d'un réglage automatique du pH, d'une alimentation automatique en solution nutritive ainsi que d'un prélèvement automatique de la solution. La température est maintenue à la valeur de 30 C et le
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volume du bain de fermentation représente 7 litres au départ* On ajoute 1 litre de solution nutritive par heure.
La solution nutri- tive a la composition suivante, pour 100 litres;
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8,42 de M614sse pol,. 45,6' ! 1 0,650 kg de (NH 4)2 sa 4 0,12 kg de K.f.J2 P0 0,02, kg de Mg SO 4 250 ml d'antimousse à 5% 250 ml de solution de biotine à 10,00 / ml 8,0 ml de solution de pyridine à 10 mg/ml 4,0 ml de pantothénate de calcium à 1%
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40 ml d'inos1tol à 1% .
Le rendement en levure (calculé sur la base d'une levure à 25%) a atteint en moyenne 107,5% et la teneur en protéine de la levure ,valait en moyenne 53%. La figure 5 montre la relation qui existe entre la teneur en alcool et rapport d'air.
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XEMPL.2,¯- Réglage de la vitesse de .,rpnstert de l'oxygène par réglage de la vitesse angulaire du brasseur mécanique en fonction de la teneur en alcool.
S'il s'agit d'introduire des quantités importantes d'oxy- gêne dans la solution, il est souvent nécessaire de combiner l'in- sufflation de l'air avec un système mécanique de brassage, Un tel système présente un intérêt incontestable lorsque l'on souhaite par exemple augmenter la production d'une batterie donnée de fer- mentateur. Ce système peut être, également précieux lorsque l'on souhaite réduire la quantité de liqueur effluente;, en outre cela permet d'obtenir certains avantages relativement à la source de carbone utilisé dans la solution nutritive.
Il s'est avéré que notamment les brasseurs rotatifs à pales planes permettaient d'obtenir une augmentation du coeffi- cient de l'absorption d'oxygène selon une fonction exponentielle
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de la vitesse angulaire. Le travail de brassage augmente comme le cube de la vitesse angulaire et le rapport entre le travail de brassage p et le coefficient de transfert de l'oxygène ks peut être exprimé par la formule ci-après p0,73 = ks
Si l'on a cette relation entre le travail de brassage et la vitesse de transfert de l'oxygène, cela tient.au fait qu'une augmentation du brassage procure une turbulence accrue dans la solution et permet d'obtenir de ce fait, une augmentation du nom- bre des bulles, un abaissement de résistance à la mise en solution dans la couche limite entre les bulles et le liquide,
une augmen- tation de la vitesse de diffusionde l'oxygène dans la solution, ainsi qu'une répartition plus uniforme des composants de réaction dans la solution nutritive.
La figure 3 montre un exemple d'un circuit de réglage convenant dans ce cas. La fréquence des analyses est de deux par heure. Les éléments repères par les chiffres 1,2,3,4,5 et 8 cor- respondent à peu près aux éléments que l'on a déjà vus précédemment.
Toutefois le moteur de réglage 8 commande ici un réducteur variable ou un variateur, qui est intercalé entre un moteur 11 tournant à vitesse angulaire constante et un renvoi d'angle 12 destiné à transmettre la force motrice à un brasseur 13, lequel est par exem- ple du type rotatif. Il est clair que la vitesse angulaire du brasseur oscille en fonction de la teneur en alcool mesurée par l'analyseur 2.
La fermentation est exécutée par exemple sous la forme d'une fermentation à alimentation continue du type habituel, mais avec apport croissant de matière nutritive selon le schéma indiqué plus loin. On recourt de ce fait à un programme qui détermine l'augmentation de la vitesse angulaire de l'agitateur au fur et à mesure de l'évolution de la fermentation. Une action en provenance
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du doseur d'alcool 2 peut,augmenter ou abaisser la vitesse angu- laire de 6% par rapport au programme prescrit. Lorsque le doseur d'alcool 2 indique une teneur normale, la vitesse angulaire est ramenée automatiquement à la valeur de base prescrite.
Pendant la dernière heure du processus de fermentation, au cours de laquelle on n'ajoute pas d'hydrocarbone, on na' pas de modification de la vitesse angulaire et le brassage continue conformément au programme de base.
L'apport de substance nutritive est effectué selon le programme ci-après:
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La solution nutritive contient 60% de mêlasse ayant une teneur en sucre de 48%, et 44 grammes de sulfate d'ammonium par litre. La liqueur de base comprenait en outre 20,7 grammes de sulfate d'ammonium, 10,65 grammes de Kh2PO4, 2 grammes de MgSo4, ainsi que 50 grammes de biotine. La levure d'ensemencement repré- sentait 169 grammes, le volume de'départ étant de 6,055 ml et le volume d'arrivée de 10 1. La culture s'est poursuivie pendant . 12 heures à température de #0 C. La valeur du pH était maintenue pendant ce temps à 4,5.
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Réglage de la vitesse,de transfert de l'oxygène en fonc- tion de la teneur en alcool, par adjonction d'agents tensio-actifs.
Les essais ont,montré que l'adjonction de certains agents tensio-actifs permettait de réduire le volume moyen des bulles lors de l'insufflation d'air dans la solution nutritive. Dans ces con- ditions, on obtient; pour une quantité donnée d'air, une surface plus importante d'échange avec la solution, autrement dit une augmen tation de la vitesse de transfert de l'oxygène. Il est ainsi posi- sible d'augmenter la'vitesse de transfert de l'oxygène dans des pro- portions pouvant atteindre 30%, par adjonction d'une très faible quantité seulement d'agents tensb-actifs.
Etant donné qu'avec cer- tains de ces agents on peut obtenir une destruction de la mousse et que ces agents ont une action détersive,'de qui permet d'éviter à la fois le dépôt sur les parois du fermentateur et une croissance des organismes sur lesdites parois, (ce qui se produit aisément lors d'une culture continu(se poursuivant pendant de longues pério- des) l'utilisation de tels agents tensio-actifs est précieuse- La figure 4 montre le principe d'un tel système de réglage. En 5 se trouve un relais à seuil et en 8 un moteur de réglage qui actionne une vanne 14 réglant l'admission des agents tensio-actifs à partir d'un récipient doseur 15 à destination du fermentnteur 10.
Le récipient doseur 15 peut avoir, par exemple, une capacité de 2 ml qui est déversée chaque fois que la vanne s'ouvre. Lorsque la te- neur en alcool dépasse une certaine valeur limite supérieure, la doseur d'alcool 2 fournit une impulsion et le réservoir doseur 15 déverse 2 ml dégagent tensio-actif dans le bain qui est contenu dans le fermentateur 10,
Bans l'exemple cité ici il est fait appel à un'système de culture en'continu. Etant donné quela tension superficielle de la solution nutritive est notablement plus élevée que celle de l'agent tensio-actif, la tension superficielle augmente si l'agent tensio-actif n'est pas introduit.
Il en résulte un abaissement de
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la vitesse de transfert de l'oxygéne pour une vitesse donnée d'in- troduction de 7.'air et la teneur en alcool a à nouveau tendance t augmenter au delà de la valeur limite pour laquelle une nouvelle . impulsion de dosage est .émise.
Les conditions de culture sont les suivantes: le volume initial de la solution est de 71; on ajoute 925 ml de solution nutri. tive additionnelle par heure. La température est de 20 C ; le pH est maintenu à 4,5 La vitesse de rotation du brasseur est de 450 tours par minute et le débit d'air est de 300 litres à l'heure- On utilise une solution nutritive ayant la même composition que celle de l'exemple 1. La concentration init iale en levure est de 8%. Le rendement exprimé en levure à 25% est d'environ 108,8%. En tant qu'agent tensio-ac.tif on utilise une addition d'oxyde d'éthylène couplé avec du nonylphénol. Dautres agents tensio-actifs possibles sont constitués par d'autres corps sans activité ionique ainsi que par l'huile rouge de Tunquie.
La figure 7 montre le détail de la courbe de régulation. On a opéré deux dosages de l'alcool par heure* RESUMA.
1.- Ce procédé pour le transfert de l'oxygène entre un gaz contenant de l'oxygène, par exemple de l'air, et une solution nutritive, en vue de la préparation de micro-organismes, par exem- ple de levures, notamment de levure de boulangerie, est caractérisé en ce que l'on mesure la teneur en alcool de la solution nutritive et en ce que la vitesse du transfert de l'agent à destination de ladite solution est réglée en fonction de la teneur en alcool ainsi Mesurée.
2.- La mesure de la concentration d'alcool dans la solu- tion nutritive est obtenue par oxydation de l'alcool présent dans des enzymes et absorption ainsi que par détermination des produits ainsi formés.
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