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Produits dérivant du lait pour 2'alimentation et la médecine.
Il y a plus de soixante ans, METCHNIKOFF, entrevoyant le rôle de la flore intestinale et de ses perturbations dans certains troubles digestifs, préconisait l'ingestion de yaourts dont les ferments lactiques étaient censés s'opposer au développement anormal des germes indésirables..-.Si cette théorie fat longuement discutée et battue en brèche il a, en revanche été démontré, notamment chez le poulet, le rat et le porc, qu'une flore intestinale indésirable pouvait nuire à la croissance de ces animaux et engendrer des substances toxiques, parmi lesquelles l'ammeniac:
veir les travaux de HANKE et autres (1924), MEINYKOWYCZ et autres (1955), COATDS et autres (1951) et (1952), SIEBURTH et autres (1952), ANDBRSON et autres (1956), LEV et autres (1959), FRANCOIS et MICHEL (1961).
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FRANCOIS (1961), MICHEL et SACQUET (1 964), MICHEL et col. (1965).
Ces derniers auteurs ont, en particulier, observé que l'excrétion fécale des bases azotées (cadavérine, putrescine et ammoniac principalement), pratiquement nulle chez le porcelet allaité, s'accroissait très rapidement après le sevrage et atteignait une valeur élevée pendant les diarrhées. La vogue du-yaourt,-en--¯¯ tant qu'agent favorable àla flore lactobacillaire intestinale n'a cessé de croître d'année en année et il est actuellement préconisé par les médecins et les diététiciens pour corriger les dysmicrobismes .intestinaux.
Cependant, tous s'accordent à penser qu'il est illusoire de voir dans les heureux effets du yaourt sur l'intestin la conséquence d'une implantation intes- tinale des bactéries lactiques qué le yaourt-renferme régle- mentairment (Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermo- philus). C'est ainsi que F. CASSER (Annales de l'Institut
Pasteur, 1964, 5, 7&8/796) étudiant les Lactobacilles isolés par coproculture chez l'homme, a montré que le Lactobacillus bulgaricus, l'un des ferments lactiques spécifiques du yaourt, n'était jamais retrouvé dans le contenu fécal, -bien que son apport alimentaire puisse être important.
En revanche, il est admis que la flore lactobacillaire intestinale, contenant notamment les Lactobacillus acidophibus; L. plantarum, L. casei et apparentés telsque les Bifidobacterium bifidum (Orla Jensen) nommés aussi Lactobacillus bifidus, est le témoin d'un bon état nutritionnel.
Cette flore existe chez l'homme à tous les âges de la vie et l'on sait qu'elle est prédominante, sinon exclusive, chez le nourrisson élevé au sein, R. DUBOS de l'Institut Rockfeller de New-York, étudiant un élevage de souris exemptes de germes pathogènes a montré, qu'il existait une bonne corrélation entre,
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d'une part, la présence chez ces souris d'une flore intestinale lactobacillaire dominante et, d'autre part, leur développement, leur fécondité, leur état nutritionnel et leur résistance aux radiations, aux corticostéroides et aux endotoxines microbiennes.
Cependant R.DUBOS a également démontré que., à l'opposé de ce que pensati METCHNIKOFF, il n'est pas nécessaire d' administrer des @ lactobacilles vivants pour obtenir leur prolifération intesti- nale. En effet, la flore lactobacillaire intes-tinale varie -essentiellement en fonction de facteurs externes et, notamment de l'alimentation, celle-ci devant apporter les facteurs de croissance indispensables à sa prolifération. Certains de-ces facteurs de croissance sont bien connus ; ce sont les facteurs
Bifidus pour les bifidobactéries et les strépogénines pour les lactobacilles aérobies.
La présente invention concerne, à titre de produits industriels nouveaux, des produits alimentaires laitiers-, en particulier des produits de fermentation du lait, spécialement du yaourt, qui se caractérisent en ce qu'ils contiennent un supplément de facteurs de croissance pour lactobacilles ou' pour bifidobactéries ou pour les uns et les autres, ce qui leur confère un grand intérêt diététique.-
Ces facteurs¯ de croissance sont des polypeptides ayant par eux-mêmes valeur d'aliment.
On peut obtenir des produits riches en de tels facteurs en soumettant diverses matières protéiques à une protéolyse ménagée que l'on suit par dosage des facteurs engendrés. On peut déterminer la teneur en ces facteurs de croissance en étudiant leur action sur le développement de souches de lactobacilles appartenant à la flore¯intestinale normale de l'homme, par exemple, B. bifidum souche TISSIER pour les bifido- bactéries et L. acidophilus pour les lactobacilles aérobies.
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En tant que source de facteurs de croissance on peut utiliser différents substrats protidiques dorigine végétale ou animale tels que le soya, les levures de bière ou de brasserie, le lait ou ses protéines (la caséine notamment), le foie, le pancréas et la rate de mammifères, l'hépato- pancréas, le foie, la laitance, les oeufs ou l'ensemble des viscères de poisson, les protéines de l'oeuf des oiseaux, la pancréatine et l'insuline. Les enzymes protéolytiques utili- sés peuvent également être d'origine végétale ou animale ; citera notamment la papaine, la broméline, la ficine, la pepsine et les enzymes protéolytiques pancréatiques ou intestinales. On peut aussi se servir de protéases d'origine bactérienne ou fungiquc: notamment celles qui sont propres aux levures.
La proportion de ces enzymes comptée en extrait sec, par rapport au substrat, peut être de 0,2 à 3%.
La protéolyse doit être conduite de façon ménagée et l'on peut en déterminer les modalités suivant les substrats choisis et les enzymes utilisés, en se basant sur le dosage des Facteurs de croissance libérés (facteurs de croissance de Lactobacillus acidophilus et de Bifidobacterium bifidum par exemple). Lorsque la quantité produite de ces f acteurs de croissance passe par un maximum ou avoisine le maximum, il y a avantage à inactiver les enzymes par chauffage. Ensuite, le cas échéant,, après séparation des matières indigérées, par exemple par filtration, et délipidation éventuelle (par exemple par centrifugation et filtration au filtre-presse, le liquide renfermant les produits de la protéolyse peut être- desséché en vue de son incorporation à des produits alimentaires.
Selon un mode d'exécution de l'invention, on peut
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partir de lait entier, partiellement ou totalement écrémé et stérilisé.
L'enzyme à mettre en oeuvre peut être une pepsine, en particulier la pepsine 600 du Codex ou la pepsine 1/6.000 du "National Formulary". c'est-à-dire une pepsine capable de digérer 6.000 fois son poids de blanc d'oeuf coagulé. La quantité est, de préférence, de l'ordre de 3%.par rapport au lait, la pepsine étant comptée en extrait sec. Il convient de conduire la protéolyse en milieu acide, plus spécialement à un pH de la gamme 1,5-4. Le réglage du pH à une telle valeur peut être effectué au moyen d'un acidc admissible du point de vue ali- mentaire. par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique ou l'acide citrique.
La protéolyse est conduite à environ 45 pendant une durée de l'ordre de trois heures. On inactive ensuite l'enzyme en portant la masse à . l'ébullition pendant un quart d'heure. Après refroidissement à la température ordinaire, le cas échéant par un courant d'eau froide, on filtre et le liquide obtenu peut être desséché, ato- misé ou lyophilisé.
On peut ainsi obtenir des produits dont la- teneur en facteurs de croissance, titrés selon la méthode de RAYNAUD est la suivante : - Facteur Bifidus II : 1-.000 unités/g - Facteur de croissance de
Lactobacillus acidophilus 300 à 500 unités/g
Le dosage du facteur Bifidus II s'effectue selon la méthode décrite par RAYNAUD dans les Annales de pédiatrie, N 4/1 du 24janvier 1-959, pages 240/P 8 à 255/P 23 et celui du facteur de croissance de L. acidophilus selon une méthode semblable : on ajoute le produit contenant de ce facteur à une suspension de L. acidophilus, on met la suspension en incubation
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à 37 pendant 48 heures puis on dose l'acidité au moyen de soude décinormale ;
on convîent de prendre pour unité la plus petite quantité du produit qui exige l'emploi d'un ml de soude décinormale.
L'exemple suivant, non limitatif, illustre un mode d'obtention de produits riches en facteurs de croissance.
EXEMPLE :
Dans une cuve d'autolyseur où l'on a placé 11 litres de lait écrémé et stérilisé- (donc contenant environ 1100g de matières sèches), on ajoute lentement et en-agitant énergiquement, 68,7 ml d'HC1 à 36%. Le pH est alors-compris entre 3 et 3,5. On ajoute ensuite 35,86 g de pepsine 600 du Codex et on agite fortement. On a ainsi réalise, à la tempé- rature près, des conditions semblables celles dans lesquelles s'opère la digestion gastrique du lait chez le nourrisson du premier âge. On porte la masse à 45 et on maintient cette températurependant 3 heures - le pH final ne dépasse pas 3.5.
La protéolyse étant suffisante au bout de ce temps, ainsi qu'il a été établi par l'expérience, on chauffe alos à 100 pendant un quart d'heure pour inactiver l'enzyme. On refroidit à 25 , puis on ìltre : on obtient ainsi 7,560 litres de jus filtré qui, atomisé, donne 720 g de poudre -{la différence 1100-720 g représente le poids de matières sèches éliminées lors de la filtration).
Le produit obtenu comme il a été décrit ci-dessus et comme l'illustre l'exemple précédent a été soumis -à une expérimentation pharmacologique chez la souris et chez le poulet.
Chez la souris, le produit incorporé à l'alimentation s'avère capable de multiplier par 10 le poids de la flore
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lactobacillaire et plus spécialement la flore à Bifidus, comme le montrent-les numérations de germés effectuées sur- des prélèvements de selles.
De même, chez le poulet, le produit incorporé à raison de 1 à 3 % dans la ration alimentaire-de base, permet l'implantation de Lactobacillus bifidus et exalte le dévelop- pement des Lactobacilles aérobies.
Chez l'homme il s'est confirmé que ce produit permettait aussi bien le maintien que la régénération de la flore lactobacillaire qui représente l'essentiel de la flore Gram positive aérobie (Lactobacillus acidophilus et apparentés), et anaérobie (Bifidobacterium bifidum). Cette flore lactoba- cillaire se retrouve, en effet, à tous'les âges de la vie ; -même le Bifidobacterium bifidum, représentant exclusif de la flore intestinale du nourrisson au sein, peut être dénombré dans la flore fécale de l'adulte, à des concentrations-voisines de celles- des- Lactobacilles aérobies, soit de10 millions à 1 milliard de germes revivifiables-par gramme de fèces.
Cette flore lactobacillaire, essentiellement acidifiante, s'oppose au développement des germes putréfiants générteur d'ammoniaque et d'amines. nocives pour l'organisme.
L'administration de ferments lactiques ne peut réaliser, à elle seule, une implantation suffisante de lacto= - bacilles. Au contraire, du fait que la flore lactobacillaire est directement influencée par les facteurs de croissance que lui apportent les produits de la digestion protidique, l'administration de polypeptides contenant lesdits facteurs peut être avantageusement substituée à celle des flores dites de remplacement dans le traitement du dysmicrobisme intestinal.
Le nouveau médicament peut être utilisé, en
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thérapeutique, -dans tous les cas de dysmicrobisme intestinal avec élévation anomale des putréfactions (le titrage de NH3 nécessite plus de 2,5 ml de NaOH normale par 100 g de selles
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fraîches),"en particulier dans-les cas s1 '=.';nts - Constipation. diarrhées de putréfactions..
-.Gastro-entérites et entérecolites.
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Intoxications alijsentaires.
- Colites, colopathies fonctionnelles ou- residuel:tt:s; ¯ mgacolon et dolichocolon.
- Prévention et trait-c--ner4t des troubles liés à lWantihiothérap2e.- la sulfamidothérapie ou la chimiothérapie intestinales.
- Chez le nourrisson, plus pwr tica3i: r^^=nt - prévention et trait entent de la dyspepsie du lait de vache ou des laits- industriels, - création de régimes bifidigènes.
Le produit peut être présenté en vue de l'administra- tion orale.
Ainsi, par exemple. dans le cas du produit contenant
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1000 unités/g-de facteur de croi qsar.4,-e des lactobacilles anaérobies (facteur Bifidus II) et
300 à 500 unités/g de facteur de croissance des lacto- bacilles aérobies (facteur de croissance de Lacto- bacillus acidophilus), le nouveau médicament peut être présenté
1 ) en flacons ou sachets à 0,250 g de produit actif en poudre,
2 ) en capsules ou gélules contenant 0,100 ou 0,200 g de principe actif en poudra
3 ) en comprimés, éventuellement enrobés, à 0,125 g de principe actif en poudre,
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4 ) en ampoules contenant une dilution aqueuse à 10% de principe-actif, la dilution pouvant, le cas échéant,
être utilisée-comme -véhicule de cultures de ferments lactiques.¯
Une posologie utile est de l'ordre de 0,50 à 1 g par jour, soit par exemple : - chez le nourrisson - 2 à 4 sachets ou 2 à 4 ampoules par jour (à incorporer éventuellement dans les biberons), - chez l'enfant et l'adulte : 4 à 8 comprimés ou gélules-par jour.
Cette poudre de lait peptonisé qui convient particu- lièrement à la fabrication des yaourts infantiles peut être incorporée avec brassage, soit à du lait, avant sa coagulation, au moment de son ensemencement pour sa transformation en yaourt, soit après coagulation. La proportion de poudre à incorporer est de 0,3 à 3 g par pot de yaourt de 125 ml. Lorsque l'incorporation est réalisée au moment de l'ensemencement, la coagulation se fait très rapidement en raison de l'action des facteurs de croissance des lactobacilles qui entraînent une prolifération très abondante de ces derniers :cela implique, d'ailleurs, la nécessité de jouer sur la température d'incubation pour arriver à l'équilibre recherché entre Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus.
A titre indicatif, les pots de yaourt du commerce (125 ni) renferment, en moyenne, 250 à 375 unités Raynaud de facteur bifidus 2 et 15 à 20 unités de facteur de croissance de Lactobacillus acidophilus. 'En incorporant à ces pots de yaourt un gramme de poudre de lait peptonisé dans les conditions ci- dessus on y apporte environ 1.000 unités Raynaud de facteur bifidus 2 et 400 à 450 unités de facteur de croissance de Lactobacillus acidophilus.