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"Perfectionnements relatifs à la préparation à-acide 6-aminopénicillanique"
La présente invention traite d'un procédé amélioré d'isolement de l'acide 6-aminopénicillanique par hydrolyse enzymatique de benzylpénicilline.
L'acide 6-aminopénicillanique est un composé de départ pour la synthèse de nouvelles pénicillines qui fut d'abord rapporté en 1950 par Sakaguchi, K. et. Murao, S. (J. Agri.Chem.Soc., Japan 23, 411, (1950)). Ils observèrent que le mycélium de
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:5J.-J...;,1'f! ,.:
...- f¯=±¯"' P:.soqenuPt et ¯g¯g, s¯n%¯yt contient un enzyme capable de ' :;- "',,'"' ... -+{. ...'" "".... ..... - "1'-' ,... diviser la pénicilline G en acide 6-aminopénicillanique et en acide phénylacétique.. Ils appelèrent le premier composé "pênici- ne Batchelor et consort (Nature 183, 257, (1959)), tout en tentant d'obtenir des pénicillines avec un groupe amino dans la
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cha,2ne latérale par l'addition d'un précurseur de chaîne laté-
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ra .,approprié au bouillon de fermentation de P.Chrysogenum ont les premiers relaté l'isolement de l'acide 6-aminopénicilla- nique à partir de la fermentation de pénicilline réalisée en l'absence de tout précurseur de chaîne @atérale .Plus tard,
ils purent isoler le produit par hydrolyse zytigue des pénicilli- nes s et V. (Robinson G.N. et consort, Nature 187 236, 1960).
Il est bien connu que l'enzyme pénicilline acylase capable d'hydrolyser les pénicillines en précurseur de chaîne latérale et en acide 6-aminopénicillanique est largement répandu parmi les micro-organismes.Hais les conditions de fermentation sous lesquelles les micro-organisme doivent croître pour donner un rendement optimum d'acide 6-aminopénicillanique ne sont. pas encore établies. Ces conditions varient pour différents micro-organismes et sont à établir pour chaque souche particulière de sorte qu'un procédé peut être utilisé pour la préparation de l'a-
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cide 6-ami.nopénxcilanâqxze¯ Les micro-organismes utilisés dans la présente invention consistent en une souche de Escherichia Coli portant la culture n HA61.
Le milieu de culture utilisé pour faire croître les micro-organismes est un milieu choisi parmi les milieux contenant de ..;la liqueur de macération de mais ou de l'extrait de levure, la / de l'extrait de boeuf et de/peptone comme source d'azote. Les mileux contiennent des sels inorganiques, tels que Fe, Zn, Mg sous la forme de sulfates, de chlorures et de phosphates de sodium ou
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de votassîum. L'acide phénylacétique ou ses dérivés sont ajoutés aux milieux comme inducteur de l'enzyme dans le micro-organisme
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Le procédé convenable de fermentation pour obtenir une croissance microbienne consiste en une culture immergée sous des @ conditions hautement aérobies.
Les conditions de fermentation
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';:,. -*..,. ----:"'--- - ¯. peuvent varier suivant de larges limites mais les résultats les plus satisfaisants ont été obtenus avec une température de 22 C-
30 C La fermentation est ordinairement réalisée en deux stades,
Dans le processus à petite échelle de l'exemple cité, la fermenta- tion est secouée, des flacons de culture donnant aussi les ré- sultats désirés..
A la fin de la période de fermentation, les cellules
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microbiennes contenant du bouillon gont i::1c'.J'bées avec de la pénicillJLne G pendant 8 à 12 heures à 22-50GC. Le pH du bouillon est maintenu à 7,2-7,5 au cours de la période d'incubation. Le bouillon est ensuite filtré pour enlever les cellules bactériennes et on le fait passer par des colonnes de résines d'échange ioni-
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que. L'acide 6-aminopénicillanique est absorbé dans la résine ou passe inadsorbé.. Le composé absorbé sur la colonne e.,;t. él"aé par un éluant convenable. Le pH de l'effluent ou des fractions éltées est ajusté à 7-7,2 par l'addition d'alcalis ou d'acide organique ou inorganique.
La solution contenant l'acide 6-amino-
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pénicillanique est évaporée sous pression réduite en un petit volume.. La solution concentrée est ensuite refroidie et ajustée à pH 4,3 avec de l'acide acétique ou de l'acide minéral concentré
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pour donner des cristaux d'acide 6-aminopénicillanique . Les cristaux sont séparés par filtration.
Les cellules microbiennes obtenues par centrifugation
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du bouillon après la première conversion de pénicilline G en acide 6-aminopénicillanigue peuvent être utilisées plus de huit m - fois pour la conversion enzymatique àe la ben3-pénicilline en acide 6-aminopénicillanique.
L'avantage du procédé réside dans le fait que l'acide
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6-aminôpénicillanîqçe passe dans l'effluent non adsorbé tandis que les impuretés sont retenues dans les colonnes de résine .
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,- ce çp4e,emet ainsi d'isoler le composé pur. i'llJ F<-.< '-t.<-''''. ""';i'''-4''''r'..Ur''\.,'4.'''........... ".. ., ... , , L'invention<est illustrée mais n'est en aucun cas limitée par 1 exemples auivants.
EXEMPLE 1
On prépare une solution nutritive ayant la composition suivante :0,5 gr de peptone, 1,5 gr d'extrait de levuxes, 1,5 gr d'extrait de boeuf, 3,58 gr de NaCl , 1,0 gr de glucose, 3,68 gr
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K2 HPO4 1,32 gr de KH2PO 4# 1,0 gr d'acide phénylacétique et de l'eaud:istille pour faire 1 litre.
La stérilisation est réalisée dans un autoclave pendant 30 à 40 minutes à une pression de 15 livres. Le pH du milieu avant la stérilisation est ajusté à 7,0-7,4 avec de l'alcali. Pour la préparation d'un inoculum de germes, une suspension de cellules bactériennes qu'on a fait crottre pendant une nuit dans une cul- ture couchée nutritive sur agar est inoculée dans 100 ml du mi- lieu ci-dessus contenant 0,5% d'acide phénylacétique, le tout étant disposé dans un flacon d'Erlenmeyer et maintenu sur une secoueuse pendant 18-20 heures à 22-30 C. 5% de ces germes sont inoculés dans 100 ml du milieu ci-dessus dans un flacon d'Erlen- meyer de 500 ml.
Les flacons de fermentation sont maintenus sur
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une sedoueuse pendant 18-30 heures à 22*-30*C. A la fin de la fermentation, le pH du bouillon est ajusté à 7,2-7,5 par addition d'acide organique ou minéral et de la benzylpénicilline est ajoutée de manière à contenir 20.000 u/ml de bouillon. Le mélange est incubé pendant 6-16 heures à 24 -42 C. La formation d'acide 6-
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amirnopénicillanique est mesurée pendant la marche de la réaction par la méthode colorimétrique décrite par Homstain J. et William G.E. (Analytical Chem. 37, 576, 1965).
A la fin de la période d'incubation, les cellules bactériennes sont enlevées soit par centrifugation soit par filtration. Le filtrat clair contenant l'acide 6-aminopénicillanique est ajusté à un pH 7-7,5 et on le fait successivement passer par des colonnes contenant du
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" 1)-..;!r-.. of
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ÏRC 50 ?) et<'du IRA (CI) 'Après avoir fait passer complètement µµ ' "ù "1.ii@'#fNEk ...- '-''A:.-.<.-.--?-<'-'--.'"- -" , ' " , le bouillon, les colonnes sont lavées avec de 1seau distillée.
'Pendant le passage du bouillon par les colonnes d'échange ionique, les impuretés sont enlevées et l'effluent jaune paie sortant de
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la colonne de IRA 400 (col) contient environ 80 à 90% d'acide fl6Laminopénicillanique. Le pH de l'effluent à ce stade est de 3,5 à 4,0 Le pH de la solution est élevé à 6,8-7,0 par l'addition d'alcali L'effluent est ensuite évaporé sous pression réduite à 22 -45 C en un petit volume . La solution concentrée est ensui-
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te refroidie et l'acide 6-eminopénicillanique est précipité par ,4'acldition d'acides minéraux ou d'acides organiques. La suspension est ensuite laissée au repos à 0 C pendant 6 à 8 heures.
On sépare ensuite les cristaux en les filtrant à la trompe,on les lave ,avec de l'eau froide, de l'acétone froid et finalement avec de l'éther. les cristaux sont sèches sous vide à la température ambiante. L'activité de l'acide 6-aminopénicillanique est de
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500 à 2600 <t/tagr.
MPLE 2 . , ' .
La fermentation des bactéries peut être réalisée en utilisant
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a 1< liq"ui*,d* macération de mats à la place d'un extrait de levures, un extrait de viande de boeuf et une peptone. La com- ., position du milieu est constituée de la façon suivante :30 gr de Liqueur de macération de mais, 2,72 gr de KH2PO4 3, 68 gr de
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H8O4, 0,1 gr d'acide phénylacdtique et de l'eau pour faire 1 Eitre. Le IQ du milieu est ajusté à 7-7,5. La fermentation et L'isolement de l'acide 6-aminoflénicillanique sont réalisés 3[Bse décrit dans l'exemple bzz '- .
A la place de l'acide phénylacétique des milieux des exem--. hes 1 et , on peut utiliser de la phdnylactanàlide-{0,15%j' rans le ieu comme inducteur pour la formation de pénicilline - cylase dans le micro-organisme. L'acide ¯6-amânopénicillanique, - -
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liit ExàµEe X <¯1 ' '.'-' '' ' :,'.'G'e4;r ., ¯ s .. .. , , m".,? j . ,."c "¯i i ? J..i ' ""' "--',-''. :-4S)iM<.'. > à: . 9 é; " F 1 F -" ± 1 ;;" ' j " jµ( ¯,¯..
A la place de l'aaide phénylacétique dans le milieu tels. que aécrit dans les exemples 1 et 2, les phénylacétyl àmino acides comme par exemple le phénylacétyl tryptophane (0.2%), ira phénylacétyl alamine , etc, et l'acide phénylacétyl-4-aminobenzot-que¯¯peuvent être utilisés comme inducteur de l'enzyme capable qui 2.,,àe scinder la pénicilline G en acide 6-amicDpênicillanique/est isolé commed écrit dans l'exemple 1
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EXEMPLE 5 '¯j. >...
Du bouillon fermenté d'Escherichia Coli RA61 obtenu comme décrit dans les exemples 1 à 4 est incubé à 22-40 c avec de la pénicilline G de potassium ou de sodium (20.000 u/ml) pendant 6-16 heures. Les cellules sont séparées et le bouillon clair est successivement passé par des colonnes de IRC 50(H)+ et de
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IR 45(Cl)-. L'acide 6-aminopênicilianiqLv provenant de l'effluent - ' est isolé commececrit dans l'exemple 1.
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MCEWIZ 6 - Les cellules microbiennes provenant du bouillon après la conversion de la benzylpénicilline en acide 6-aminopéàiéàla= nique, comme décrit dans les exemples 1 à 4, sont séparées par centrifugation. Les cellules sont ensuite remises en suspension dans un tampon phosphate 0,01M pH 7,5 dans un volume égal à 3/4 de*celui du bouillor. initial. On ajoute de la pénicilline G de manière à contenir 20.000 unités/ml. La suspension est incubée : pendant 6-16 heures à 22-40 C La solution résultante après la séparation des cellules bactériennes , est traitée pour l'isole- ment de l'acide 6-aminopénicillanique suivant le processus décrit dans l'exemple 1.
Les cellules microbiennes séparées après la conversion peuvent être utilisées plus de huit fois pour scinder
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;la,,pénicilline Gon acide phênylacétique et en acide 6-àmino- pénicillanique. .'-'..'-.'''.'-.--" in . . - Î/, " )::l,1; /;,
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0 1-11, "'''''''''''IÍ\' .: EXEMPEE:"7. '!' -x- 4 c:. Iif.'l"t"'
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Le bouillon contenant l'acide 6-amkicpénicillaniquè ob- tenu , comme décrit dans les exemples 1 à 4 après l'enlèvement des cellules bactériennes, est passé par une colonne de Duolite C25 (H) + La colonne, après le complet passage du bouillon, est la- vée avec de l'eau distillée.
L'acide 6-aminopénicillanique qui est adsorbé sur la colonne est élue avec de l'ammoniaque dilué jusqu'à ce que le pH de l'éluat monte à 9-la. Le pH de l'éluat est immédiatement descendu à 6,8 -7,0 avec de l'acide minéral ou de l'acide acétique. La solution éluée contenant l'acide 6-
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aminopênicillanique est évaporée en un petit volume sous pres- sion réduite et le composé est isolé tel que décrit dans l'exemple 1. L'activité des cristaux est de 2500 à 2600 u/mgr.
EXEMPLE 8
A la place de l'échangeur cationique utilisé dans
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l'exemple 7, c'est-à--dire la Duolite C25, pour l'isolement de l'acide 6-autnopénicillanique à partir du bouillon obtenu comme décrit dans 3ss'exemples 1 - 4 . on utilise le Permutit Zeokarb 215(H)+ et le composé est isolé comme décrit dans l'exemple 1. pour l'exemple 1 Note/: Le Permutit 225(H)+ est utilisé à la place de la Duolite C25 qu'on utilise dans l'exemple 7 pour l'isolement de l'acide
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6-aminpé,nicillanique du bouillon obtenu,tel que décrit dans les exemples 1 â6.
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3d3CITIQNS
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1.
Un procédé pour la fabrication d'acide 6-amînôpéni- , cillanique ayant la structure de la 13 lactam-thiazolidine, e procédé consistant à mettre en contact de la pénicilline G vec les cellules de micro-organisme Escherichia Coli auant la :ulture
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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"Improvements relating to the preparation of 6-aminopenicillanic acid"
The present invention relates to an improved process for the isolation of 6-aminopenicillanic acid by enzymatic hydrolysis of benzylpenicillin.
6-Aminopenicillanic acid is a starting compound for the synthesis of new penicillins which was first reported in 1950 by Sakaguchi, K. et. Murao, S. (J. Agri.Chem.Soc., Japan 23, 411, (1950)). They observed that the mycelium of
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: 5J.-J ...;, 1'f! ,.:
...- f¯ = ± ¯ "'P: .soqenuPt and ¯g¯g, s¯n% ¯yt contains an enzyme capable of':; -" ',,' "'... - + {. ... '"" ".... ..... -" 1'-', ... divide penicillin G into 6-aminopenicillanic acid and phenylacetic acid. They called the first compound "penicillin Batchelor et al. (Nature 183, 257, (1959)), while attempting to obtain penicillins with an amino group in the
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chain, 2nd side by the addition of a side chain precursor
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ra., suitable for the fermentation broth of P. Chrysogenum were the first to report the isolation of 6-aminopenicillinic acid from the fermentation of penicillin carried out in the absence of any ateral chain precursor. ,
they were able to isolate the product by zytic hydrolysis of the s and V penicillins (Robinson G.N. et al., Nature 187 236, 1960).
It is well known that the enzyme penicillin acylase capable of hydrolyzing penicillins to side chain precursor and 6-aminopenicillanic acid is widely found among microorganisms, but the fermentation conditions under which microorganisms must grow to give optimum yield of 6-aminopenicillanic acid do. not yet established. These conditions vary for different microorganisms and are to be established for each particular strain so that a method can be used for the preparation of a-
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cide 6-ami.nopénxcilanâqxzē The microorganisms used in the present invention consist of a strain of Escherichia Coli carrying culture n HA61.
The culture medium used to grow the microorganisms is a medium chosen from media containing ..; corn maceration liquor or yeast extract, beef extract and / peptone as a source of nitrogen. The media contain inorganic salts, such as Fe, Zn, Mg in the form of sulfates, chlorides and sodium phosphates or
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of votassîum. Phenylacetic acid or its derivatives are added to the media as an inducer of the enzyme in the microorganism
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The suitable fermentation process for obtaining microbial growth is by submerged culture under highly aerobic conditions.
Fermentation conditions
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';:,. - * ..,. ----: "'--- - ¯. Can vary over wide limits but the most satisfactory results have been obtained with a temperature of 22 C-
30 C Fermentation is usually carried out in two stages,
In the small-scale process of the example cited, the fermentation is shaken, with culture flasks also giving the desired results.
At the end of the fermentation period, the cells
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Microbial containing gont broth i :: 1c '. I born with penicillJLne G for 8 to 12 hours at 22-50GC. The pH of the broth is maintained at 7.2-7.5 during the incubation period. The broth is then filtered to remove bacterial cells and passed through columns of ion exchange resins.
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than. The 6-aminopenicillanic acid is absorbed into the resin or passes unsorbed. The compound absorbed on the e.,; T column. El "aé" with a suitable eluent. The pH of the effluent or of the eluted fractions is adjusted to 7-7.2 by the addition of alkalis or organic or inorganic acid.
The solution containing the 6-amino acid
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penicillanic acid is evaporated under reduced pressure to a small volume. The concentrated solution is then cooled and adjusted to pH 4.3 with acetic acid or concentrated mineral acid.
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to give crystals of 6-aminopenicillanic acid. The crystals are separated by filtration.
Microbial cells obtained by centrifugation
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broth after the first conversion of penicillin G to 6-aminopenicillanic acid can be used more than eight m-fold for the enzymatic conversion of ben3-penicillin to 6-aminopenicillanic acid.
The advantage of the process lies in the fact that the acid
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6-aminopenicillanîqe passes into the unadsorbed effluent while the impurities are retained in the resin columns.
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, - this çp4e, emet thus isolate the pure compound. i'llJ F <-. <'-t. <-' '' '. "" '; i' '' - 4 '' '' r '.. Ur' '\.,' 4. '''........... "..., ..., The invention <is illustrated but is in no way limited by 1 following examples.
EXAMPLE 1
A nutrient solution is prepared having the following composition: 0.5 gr of peptone, 1.5 gr of levuxes extract, 1.5 gr of beef extract, 3.58 gr of NaCl, 1.0 gr of glucose , 3.68 gr
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K2 HPO4 1.32 gr of KH2PO 4 # 1.0 gr of phenylacetic acid and water: istille to make 1 liter.
Sterilization is carried out in an autoclave for 30 to 40 minutes at a pressure of 15 pounds. The pH of the medium before sterilization is adjusted to 7.0-7.4 with alkali. For the preparation of a germ inoculum, a suspension of bacterial cells which has been grown overnight in a nutrient lying culture on agar is inoculated into 100 ml of the above medium containing 0.5%. of phenylacetic acid, the whole being placed in an Erlenmeyer flask and kept on a shaker for 18-20 hours at 22-30 C. 5% of these germs are inoculated in 100 ml of the above medium in a flask of 'Erlenmeyer of 500 ml.
The fermentation flasks are kept on
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a sedoueuse for 18-30 hours at 22 * -30 * C. At the end of the fermentation, the pH of the broth is adjusted to 7.2-7.5 by adding organic or mineral acid and benzylpenicillin is added so as to contain 20,000 u / ml of broth. The mixture is incubated for 6-16 hours at 24 -42 C. The formation of acid 6-
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amirnopenicillanic acid is measured during the course of the reaction by the colorimetric method described by Homstain J. and William G.E. (Analytical Chem. 37, 576, 1965).
At the end of the incubation period, the bacterial cells are removed either by centrifugation or by filtration. The clear filtrate containing 6-aminopenicillanic acid is adjusted to a pH 7-7.5 and is successively passed through columns containing
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"1) - ..;! R- .. of
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ÏRC 50?) And <'of the IRA (CI)' After having passed completely µµ '"ù" 1.ii@'#fNEk ...-' - '' A: .-. <.-.--? - <'-'--.' "- -", '", the broth, the columns are washed with distilled water.
'During the passage of the broth through the ion exchange columns, the impurities are removed and the yellow effluent pays out of
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IRA 400 column (col) contains approximately 80-90% fl6Laminopenicillanic acid. The pH of the effluent at this stage is 3.5 to 4.0 The pH of the solution is raised to 6.8-7.0 by the addition of alkali The effluent is then evaporated under reduced pressure at 22 -45 C in a small volume. The concentrated solution is then
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Te cooled and 6-eminopenicillanic acid is precipitated by the acldition of mineral acids or organic acids. The suspension is then left to stand at 0 C for 6 to 8 hours.
The crystals are then separated by suction filtering, washed with cold water, cold acetone and finally with ether. the crystals are dried in vacuo at room temperature. The activity of 6-aminopenicillanic acid is
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500 to 2600 <t / tagr.
MPLE 2. , '.
Fermentation of bacteria can be carried out using
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a 1 <liq "ui *, maceration of mats in place of a yeast extract, an extract of beef and a peptone. The composition, middle position is made as follows: 30 gr of Corn maceration liquor, 2.72 gr of KH2PO4 3, 68 gr of
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H8O4, 0.1 gr of phenylacdtic acid and water to make 1 liter. The middle IQ is adjusted to 7-7.5. The fermentation and the isolation of 6-aminoflenicillanic acid are carried out 3 [Bse described in the example bzz '-.
In place of phenylacetic acid in the media of the examples. hes 1 and, 0.15% phdnylactanalide can be used in the medium as an inducer for the formation of penicillin cylase in the microorganism. ¯6-Amanopenicillanic acid, - -
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liit ExàµEe X <¯1 '' .'- '' '':, '.' G'e4; r., ¯ s .. ..,, m ".,? j.,." c "¯ii? J..i '""' "- ', -' '. : -4S) iM <. '. > to:. 9 th; "F 1 F -" ± 1 ;; "'j" jµ (¯, ¯ ..
Instead of the phenylacetic aid in the medium such. as described in Examples 1 and 2, phenylacetyl amino acids such as, for example, phenylacetyl tryptophan (0.2%), phenylacetyl alamine, etc., and phenylacetyl-4-aminobenzot-quē¯ acid can be used as an inducer of l The enzyme capable of splitting penicillin G into 6-amicDpenicillanic acid / is isolated as written in Example 1
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EXAMPLE 5 '¯j. > ...
Fermented Escherichia Coli RA61 broth obtained as described in Examples 1 to 4 is incubated at 22-40 c with potassium or sodium penicillin G (20,000 u / ml) for 6-16 hours. The cells are separated and the clear broth is successively passed through columns of IRC 50 (H) + and
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IR 45 (Cl) -. The 6-aminopênicilianiqLv acid from the effluent - 'is isolated as described in Example 1.
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MCEWIZ 6 - The microbial cells from the broth after the conversion of the benzylpenicillin to 6-amino acid ala = nic acid, as described in Examples 1 to 4, are separated by centrifugation. The cells are then resuspended in 0.01M phosphate buffer pH 7.5 in a volume equal to 3/4 that of the bouillor. initial. Penicillin G is added so as to contain 20,000 units / ml. The suspension is incubated: for 6-16 hours at 22-40 ° C. The resulting solution, after separation of the bacterial cells, is treated for the isolation of 6-aminopenicillanic acid following the procedure described in Example 1.
Microbial cells separated after conversion can be used more than eight times to split
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; penicillin Gon phenylacetic acid and 6-amino-penicillanic acid. .'-'..'-.'''.'-.-- "in. - Î /,") :: l, 1; / ;,
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0 1-11, "'' '' '' '' '' 'IÍ \'.: EXEMPEE:" 7. '!' -x- 4 c :. Iif.'l "t" '
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The broth containing the 6-amkicpenicillanic acid obtained, as described in Examples 1 to 4 after the removal of the bacterial cells, is passed through a column of Duolite C25 (H) + The column, after the complete passage of the broth. , is washed with distilled water.
The 6-aminopenicillanic acid which is adsorbed on the column is eluted with dilute ammonia until the pH of the eluate rises to 9-1. The pH of the eluate immediately dropped to 6.8 -7.0 with mineral acid or acetic acid. The eluted solution containing the acid 6-
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Aminopenicillanic acid is evaporated to a small volume under reduced pressure and the compound is isolated as described in Example 1. The activity of the crystals is 2500-2600 µ / mgr.
EXAMPLE 8
Instead of the cation exchanger used in
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Example 7, that is to say Duolite C25, for the isolation of 6-autnopenicillanic acid from the broth obtained as described in 3s'examples 1 - 4. Permutit Zeokarb 215 (H) + is used and the compound is isolated as described in example 1. for example 1 Note /: Permutit 225 (H) + is used instead of Duolite C25 which is used in Example 7 for the isolation of the acid
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6-amino, nicillanic broth obtained, as described in Examples 1-6.
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3d3CITIQNS
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1.
A process for the manufacture of 6-aminopeni-, cillanic acid having the structure of 13-lactam-thiazolidine, the process comprising contacting penicillin G with cells of the microorganism Escherichia Coli by ulturing it.
** ATTENTION ** end of DESC field can contain start of CLMS **.