Préparation d'enzyme.
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d'enzyme et concerne plus particulièrement des préparations permettant d'effectuer des transformations chimiques, qui peuvent être récupérées à partir du milieu réactionnel en vue d'une réutilisation.'
les transformations ou conversions catalysées par des enzymes sont des stades importants dans un grand nombre de processus chimiques, par exemple dans la saponification des lipi-
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dation des protéines en utilisant un enzyme protéolytique tel que la trypsine ; la production de stéroïdes en utilisant une déhydrogénase ; la production de sirops de glucose à partir d'amidon en utilisant une hydrolase ; et la production d'acide 6-amino-pénicillanique à partir de pénicilline comme la benzylpénicilline ou la phénoxyméthylpénicilline en utilisant l'acylase de la pénicilline.
En général, les réactions enzymatiques sont effectuées alors que l'enzyme est en solution dans le milieu contenant le
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substance que l'enzyme transforme ou convertit pour donner le produit_7. Etant donné que l'enzyme est dissout dans le milieu réactionnel, il est fréquemment très difficile de séparer l'en-
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quand la réaction est complète. D'une façon générale, quand le produit est isolé du mélange réactionnel, le processus de séparation provoque la désactivation de l'enzyme. Ceci rend bien entendu l'enzyme irrécupérable.
Afin de remédier à cette difficulté de séparation, et pour fournir un système d'enzyme pouvant être réutilisé, il est connu de fixer l'enzyme sur un support solide insoluble par adsorption (voir par exemple le Brevet britannique n[deg.] 1.264.147) ou par des liaisons covalentes, directement ou indirectement par des groupes en pont (voir par exemple les Brevets britanniques Nos 1.349.498, 1.387.460 et 1.365.886.). Toutefois, de telles préparations insolubles présentent un certain nombre d'inconvénients. Tout d'abord, du fait qu'elles sont solides, elles sont soumises à une dégradation mécanique et éventuellement à une rupture ou dissociation. Par ailleurs, l'incorpora-
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troisièmement, l'accès du substrat au centre actif de l'enzyme est souvent inhibé.ou gêné. Les tentatives faites pour améliorer l'activité spécifique de telles préparations insolubles d'enzy- me et de polymère en augmentant la superficie extérieure du
solide exigent une diminution de la taille des particules de la préparation solide rendant la manutention et en particulier la séparation par filtration plus difficile, et celles augmentant la surface intérieure en rendant les particules beaucoup plus poreuses aboutissent à des particules ayant une moindre résistance mécanique.
En outre, certains complexes d'enzyme et de polymère solubles dans l'eau ont été décrits (voir par exemple le Brevet
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N[deg.] 53822/72 et ..44542/?3) ; dans ce cas l'enzyme est fixé directement ou indirectement par un groupe en pont sur un support polymère soluble dans l' eau. Ces complexes d'enzyme et de polymère sont récupérables à partir du milieu réactionnel aqueux par ultrafiltration.' Toutefois, l'ultrafiltration est une technique difficile et coûteuse, en particulier à grande échelle, et par suite indésirable pour des applications industrielles.
Les recherches qui ont abouti à l'invention ont montré que certains enzymes peuvent être fixés sur des groupes non polaires pour rendre la préparation séparable des milieux aqueux par'affinité pour les liquides non miscibles à l' eau.
L'invention est matérialisée en conséquence dans une préparation d'enzyme renfermant un enzyme fixé sur des groupes non polaires en nombre suffisant pour que, par mise en contact de la préparation en milieux aqueux avec un liquide inerte non miscible à l'eau, la préparation s'associe au liquide inerte non miscible à l'eau et puisse être par suite séparée du milieu aqueux.
On entend ici par l'expression "liquide inerte non miscible à l'eau" un liquide qui ne réagit pas avec la.préparation d'enzyme d'une manière capable de modifier sensiblement l'activité enzymatique.
L'expression "associé à" utilisée ci-avant concerne n'importe quelle forme d'interaction entre les groupes non polaires de la préparation d'enzyme et les molécules de liquide non miscible à l'eau,. suffisamment stable pour fournir un moyen <EMI ID=8.1> processus de production convient à une incorporation aux préparations suivant l'invention, et on peut citer, comme enzymes de ce type, l'Amylase, l'Asparaginase, la Protéase neutre ou alca-
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Trypsine.
De préférence, l'enzyme est de la Lipase, de l'Acylase de la Pénicilline ou de la Trypsine.
A titre de groupes non polaires convenables pouvant être fixés sur l'enzyme, on peut citer les groupes hydrocarbyle ayant au moins 6 atomes de carbone, et judicieusement les grou-
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heptyle, n-octyle, n-nonyle, n-décyle, n-dodécyle, n-octadécyle,
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aralcoyle, par exemple benzyle, 2-phényléthyle, 4-phénylbutyle, 2-tolyléthyle.
L'enzyme peut âtre fixé directement sur le groupe non polaire, ou bien indirectement par l'intermédiaire d'un groupe en pont.
Avec certains enzymes, la fixation d'un certain nombre de groupes non polaires directement sur une molécule d'enzyme produit une modification de conformation et une modification de l'activité de l'enzyme. A cause de ce fait et dans certains cas à cause de la structure de l'enzyme, il n'est pas possible parfois de fixer des groupes non polaires en nombre suffisant sur un enzyme pour que la préparation puisse être séparée des milieux aqueux, sans réduire de façon inadmissible l'activité de l'enzyme.
Pour remédier à cette difficulté, il est souvent préférable de produire une préparation d'enzyme dans laquelle l'enzyme est lié à un support polymère ou. adsorbé sur un tel support, qui peut alors porter des groupes non polaires au lieu
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les proportions relatives de groupes non polaires et d'enzyme dans la préparation.' Il est également possible, bien entendu, de fixer un enzyme portant suffisamment de groupes non polaires pour le rendre séparable des milieux aqueux sur un support polymère qui peut ou non porter d'autres groupes non polaires.
Selon un second aspect, l'invention concerne en conséquence une préparation d'enzyme telle que définie ci-avant dans laquelle l'enzyme est fixé sur un support polymère.
La fixation de l'enzyme sur un polymère tel qu'il est utilisé ici comprend à la fois la liaison covalente avec le support polymère et l'adsorption sur celui-ci, pour autant que l'adsorption soit suffisamment forte pour retenir l'enzyme sur le support quand la préparation est associée au liquide non
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Le support convenant à une utilisation dans les préparations précitées peut être soluble ou insoluble dans l'eau.
Quand on utilise une matière polymère insoluble dans l'eau dans les préparations suivant l'invention, elle est de préférence à l'état finement divisé, de façon à avoir une grande superficie pour la fixation de l'enzyme, et ainsi à communiquer une activité spécifique élevée à la préparation.
A titre de matières insolubles dans l'eau convenables, on peut citer la cellulose en poudre et les dérivés de cellulo-
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d'ions, le nylon, les polysaccharides à poids moléculaire élevé,
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des modifiés, avec des agents modifiants tels que l'épichlorhydrine, ou bien modifiés pour renfermer des groupes carboxyméthyle ou aminoéthyle ; les polyacrylates et les polyméthacryla-
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et les résines du type polyacrylate et polyméthacrylate réticulées à macroréticulation.
A titre de matières solubles dans l'eau convenables, on peut citer les polymères d'origine naturelle, par exemple
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long et les polymères d'origine, naturelle qui ont été modifiés, somme l'amidon partiellement dégradé ou la cellulose ; les
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Parmi les saccharides et les oligosaccharides mentionnés modifiés ci-avant, on a constaté que des copolymères d'épichlorhydrine et de lactose, de dextrose ou de saccharose
conviennent particulièrement bien. Un polymère préféré est le
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un poids moléculaire de l'ordre de 400.000. Le terme "Ficoll" est une dénomination commerciale.
De même que des polymères d'origine naturelle, il est également possible d'utiliser des polymères solubles dans l'eau synthétiques, par exemple des polymères d'alcool polyvinylique et des copolymères d'anhydride maléique ou acrylique avec de l'éthylène, du styrène, de l'éther méthyl-vinylique, de l'éther divinylique ou.de, l'acétate de vinyle. De tels polymères sont décrits par exemple dans les demandes de brevets allemands
n[deg.] 1.948.177 et 1.948.298, et dans les brevets britanniques
N[deg.] 1.290.701 et 1.223.28<1>.
Une classe convenable de copolymères solubles dans l'eau est formée par les copolymères d'éther néthyl-vinylique et d'anhydride maléique connus sous la dénomination "Gantrez".
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L'enzyme peut être fixé directement sur un polymère contenant le groupe non polaire, ou bien suivant une variante il peut être fixé sur les (croupes en pont du support polymère, sur lesquels l'enzyme peut être fixé lui-même. Judicieusement, le groupe en pont est une alpha, oméga-diamine aliphatique en
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fonction amino du groupe en pont est fixée sur le polymère et l'autre est libre en vue d'un couplage sur l'enzyme, par exemple par 1!intermédiaire d'un dialdéhyde soluble dans l'eau comme le glyoxal ou le glutaraldéhyde. L'utilisation de groupes en
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entre les unités d'enzyme et de polymère. Les groupes en pont peuvent être utilisés entre l'enzyme et le support ; l'enzyme et le groupe non polaire (avec ou sans présence additionnelle d'un support) ; ou le support et le groupe non polaire.
Le nombre des groupes non polaires incorporés aux pré- parations suivant l'invention dépend d'un certain nombre de factours. La fixation des groupes non polaires sur le polymère et <EMI ID=27.1>
me. Avec certains enzymes, un degré de caractère hydrophobe trop intense produit la désactivation de l'enzyme par suite d'une modification concomitante de conformation.
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nimum de groupes non polaires nécessaire afin de permettre la séparation par rapport aux milieux aqueux et celle du nombre maximum compatible avec la stabilité de l'enzyme. La détermination de cat équilibré doit, nécessairement, demeurer une question de détermination par expérience et d'erreur classique. Les critères par lesquels cet équilibre peut être déterminé sont les suivants :
1 - poids moléculaire du support polymère,
2 - poids moléculaire de l'unité de monomère,
3 - pourcentage d'unités de monomère dans le polymère substitué
par des groupes non polaires,
4 - taille des groupes non polaires,
5 - identité de l'enzyme,
6 - degré de substitution du polymère par l'enzyme.
Par exemple, quand le support est du Gantrez AN 119
(poids'moléculaire du polymère 230.000, poids moléculaire de l'unité de monomère 156) dans lequel une mole de Gantrez AN 119 est substituée par une mole d'acylase de la pénicilline, la substitution minimum nécessaire pour effectuer la séparation par
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unités de monomère sont substitués par des groupes n-décyle ; et la substitution maximum pour conserver l'activité enzymatique
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remplacés par des groupes n-octadécyle.
L'invention concerne également un procédé pour la production d.'une préparation d'enzyme telle que définie ci-avant, ce procédé consistant à amener en contact un composé de formu-
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R - X (I)
dans laquelle R est un groupe non polaire et X est un groupe fonctionnel avec un enzyme fixé sur un groupe actif capable de réagir avec le groupe X.
Le groupe. X peut être par exemple un groupe amino, carboxyle, aldéhyde, hydroxy, thiol ou azo ; ou bien des groupes de Liaison réactifs dérivés, par exemple, des dialdéhydes comme le..
glyoxal ou le glutaraldéhyde, et (ou) des comme la
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support polymère contenant un groupe fonctionnel quelconque de ce type. De préférence, X est un groupe amino ou bien une fraction molaire portant un groupe amino.
Le groupe actif fixé sur l'enzyme et capable de réagii avec le groupe X peut être un groupe présent sur l'enzyme de façon inhérente, ou bien par modification, par exemple un group
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sons anhydride ; ou encore une matière de support polymère contenant un tel groupe actif ; ou un groupe de liaison réactif tel que ceux indiqués pour le groupe X ci-dessus.
La réaction entre le composé de formule (I) et l'enzym est effectuée de la façon la plus avantageuse à un pH sensiblement neutre, judicieusement dans une gamme de pH allant de 4 à
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comprise entre 0 et 5[deg.]C.
Quand la préparation d'enzyme est formée essentiellement par l'enzyme et par les groupes non polaires seuls, il est préférable que le groupe X soit dérivé d'un dialdéhyde et (ou) d'une alpha, oméga-diamine, c'est-à-dire que les groupes non po laires soient fixés sur l'enzyme par de tels groupes en pont.
Lors de la production d'une préparation d'enzyme suivant l'invention renfermant également -un support polymère, il est préférable tout d'abord de modifier le support de façon à incorporer le groupe non polaire et, lorsque cela est nécessaire, le groupe de liaison en pont, avant la fixation sur l'enzy-
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sente une matière polymère qui est liée au groupe non polaire R et à un groupe fonctionnel.
Les préparations d'enzyme et de polymère modifié peuvent alors être obtenues par n'importe quelle méthode connue pour relier des enzymes à des polymères. De telles méthodes de liaison sont décrites, par exemple, dans le brevet britannique
<EMI ID=37.1> .le polymère par l'utilisation de réactifs tels que les halogénu. res de cyanogène, par exemple le bromure de cyanogène ; les <EMI ID=38.1>
les azothydrures d'acyle, les composés de diazonium, par exem-
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tes organiques comme le cyanate phénylique ; et les carbodiimides. Souvent, de tels agents de liaison sont utilisés d'abord en vue d'une réaction avec le polymère, et ils fournissent des groupes réactifs sur celui-ci, puis on provoque la réaction de ces groupes avec l'enzyme. Dans certains cas, les enzymes peuvent réagir directement avec le polymère, par exemple si celuici contient ou a été modifié de façon à contenir des groupes actifs comme des liaisons anhydrides ou des groupes azothydrures
On comprendra par suite que la méthode réactionnelle
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mères modifiés et pour les lier aux enzymes vont varier selon la nature de l'enzyme et celle de la matière polymère.
Pour la plupart des préparations d'enzyme et de polymère, un processus judicieux est représenté par le schéma opératoire I. Le premier stade consiste à fixer sur le polymère (a) les groupes non polaires, de préférence par l'intermédiaire
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groupes de liaison en pont tels que des alpha, oméga-diamines, en vue d'une fixation ultérieure sur l'enzyme par l'intermédiaire de groupes dialdéhydes. Ces réactions sont effectuées judicieusement dans une.solution ou suspension aqueuse à un pH
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te. L'enzyme portant des groupes dialdéhydes peut ensuite être couplé avec le polymère modifié dans des milieux aqueux à un pH sensiblement neutre.
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dans laquelle R est un groupe non polaire tel que désigné ci-avant :
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Il est souvent nécessaire d'activer les groupes portés par le polymère, de préférence avec du bromure de cyanogène, avant la fixation sur les groupes non polaires si cela est possible .
Par ailleurs, certains polymères comprennent des groupes qui peuvent être utilisés en vue du couplage avec des groupes non polaires et (ou) l'enzyme, si cela est désirable sans groupe en pont intermédiaire. Les préparations d'enzyme suivant l'invention préparées de cette manière ne présentent pas alors la réticulation associée à l'utilisation des groupes de liaison en pont et possèdent' souvent des propriétés avantageuses comme indiqué plus loin.
Par exemple, dans les polymères à base de monomère formé par de l'anhydride maléique, comme les matières du type "Gantrez", les groupes anhydrides situés le long du squelette dorsal peuvent être utilisés pour la fixation à la fois des
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est tout d'abord modifié par fixation des groupes non polaires, et les groupes anhydrides restants du polymère sont ensuite uti- <EMI ID=47.1>
est illustré par le schéma opératoire II.
SCHEMA OPERATOIRE II.
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' R représente le groupe non polaire mentionné ci-dessus ; ENZ-NH2 représente l'enzyme portant un groupe amino.
Les polymères de type Gantrez, par exemple le Gantrez AN 119 et. le Gantrez AN 149, ont encore 'un autre avantage en ce sens qu'ils se dissolvent sans réaction dans certains solvants
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R2NH. Un mélange réactionnel homogène est possible et par suite de tels solvants constituent des milieux de réaction avantageux pour la fixation des groupes non polaires sur ces polymères lors de la production des préparations d'enzyme suivant l'in.vention.
En conséquence, suivant un mode de mise en oeuvre pré- <EMI ID=51.1>
tion sont préparées par réaction d'une matière polymère compre-. nant des groupes anhydrides sur le squelette dorsal avec une
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que non aqueux dans lequel R est un groupe non polaire, et ensuite par fixation du polymère modifié sur un enzyme.
Il est préférable de faire réagir l'aminé avec le polymère en présence d'une base tertiaire, par exemple de pyridine.
L'expression "base tertiaire" utilisée ici désigne une amine tertiaire ou bien une amine aromatique hétérocyclique.
De préférence, le solvant aprotique non aqueux est du
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température à laquelle la réaction est effectuée dépend de l'identité du support polymère et de l'amine. Toutefois, en général, la réaction est effectuée à une température comprise entre
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Le support polymère modifié peut être isolé du milieu dans lequel il est préparé par précipitation avec un solvant moins polaire, le plus judicieusement avec de l'éther diéthylique, ou bien par addition de la solution à de l'eau quand il se produit un gonflement et une hydrolyse de l'anhydride, avec iso.lement du polymère modifié hydrolyse par rapport au milieu aqueux, en utilisant,un liquide non miscible à l'eau, ou par centrifugation.
L'enzyme est ensuite fixé sur le support modifié isolé précité par contact du support modifié avec l'enzyme en solution aqueuse, éventuellement avec un agent de couplage, par exemple avec un carbodiimide substitué. Suivant une variante, le mélange réactionnel non hydrolysé ou bien le polymère modifié non hydrolysé dissous dans un petit volume d'un solvant, non aqueux polaire peut être ajouté directement à une solution aqueuse de l' enzyme.
Suivant une variante, le couplage peut être assuré en adaptant tout d'abord le support non hydrolyse susmentionné par traitemont de celui-ci avec de l'hydrate d'hydrazine en solu- tion dans le diméthylformamide. Ce support adapté, qui est ensuite hydrolyse et'isolé du milieu aqueux par centrifugation, peut être couplé avec l'enzyme dans des milieux aqueux en utili-
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Suivant un autre aspect, l'invention concerne un procé- ' <EMI ID=56.1>
tant à amener en contact, dans un milieu aqueux, une préparation d'enzyme telle que définie ci-avant avec un substrat de l'enzyme, puis à séparer la préparation d'enzyme du mélange réactionnel aqueux par contact avec un liquide non miscible à l'eau, à récupérer le produit de la.réaction à partir de la phase aqueuse, et éventuellement à réutiliser la préparation d'enzyme séparée par contact de celle-ci avec un nouveau substrat.
On peut utiliser une grande diversité de liquides non miscibles à l'eau pour séparer la préparation d'enzyme du milieu aqueux. Des liquides convenables comprennent des alcanes comme l'heptane, l'octane,- le nonane, le décane, l'hexadécane, des hydrocarbures aromatiques, des esters aliphatiques supérieurs
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Lors d'un contact avec un tel liquide, la préparation d'enzyme forme une couche superficielle dans la zone de contact entre les deux. Afin de. rendre cette zone de contact maximale, le stade de mise en contact fait intervenir habituellement une agitation, par exemple par secouage ou agitation normale, pour dissocier le liquide non miscible à l'eau en petites gouttelettes. Chaque gouttelette est ensuite entourée par la préparation d'enzyme qui adhère à sa surface.
Ce contact de la préparation d'enzyme avec le liquide non miscible à l'eau peut être réalisé avant, pendant ou après la réaction enzymatique. De préférence, il est assuré avant la réaction enzymatique par dispersion, par agitation de la préparation d'enzyme avec un liquide non miscible à l'eau dans un milieu aqueux contenant le substrat. Ainsi, pendant la réaction enzymatique, la préparation est associée à des gouttelettes de liquide non miscible à l'eau, qui est présent sous forme d'une émulsion dans le milieu aqueux, et la dispersion est maintenue pendant la réaction par agitation. Quand une séparation de la préparation d'enzyme est requise, l'agitation est interrompue et les phases fusionnent.
Suivant une variante, la préparation d'enzyme peut être présente dans le mélange réactionnel aqueux sous forme d'une solution ou d'une suspension et peut être mise en contact avec
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zyme et le liquide non miscible à l'eau varie selon la matière polymère et (ou) les groupes non polaires incorporés à la préparation d'enzyme . Par exemple, quand les préparations d'enzyme et de polymère présentent une réticulation notable, des agrégats solides se forment et ces particules adhèrent sur les gouttelettes de liquide non miscible à l'eau. Toutefois, dans le cas de préparations non réticulées, parmi lesquelles on peut citer à titre d'exemples les matières fixées sur des supports du typa "Gantrez" comme indiqué précédemment (et les préparations ne contenant pas de polymère), il n'existe pas normalement d'adhérence importante du solide sur les gouttelettes, et une couche unique de préparation d'enzyme se forme sur ces gouttelettes.
Ceci est particulièrement avantageux quand la réaction enzymatique est effectuée après avoir d'abord amené la préparation d'enzyme en contact avec le liquide non miscible à l'eau pour produire un tel système.
Quelle que soit la nature de l'association, le contact entre la préparation d'enzyme et le liquide non miscible à l'eau
(habituellement sous la forme de gouttelettes) permet la sépara-
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ximativement la même densité que celle des liquides non miscible à l'eau. Lorsqu'on les laisse se reposer, les gouttelettes flottent à la surface du milieu aqueux (pour les liquides moins denses que l'eau) ou se déposent au fond (pour les liquides plus denses). Ainsi, une couche séparée est produite, qui renferme le liquide non miscible à l'eau associé à la préparation d'enzyme, laquelle est facilement récupérée à partir du milieu aqueux.
Pour les liquides qui ne flottent pas sur les milieux aqueux ou.qui ne se déposent pas à partir de ceux-ci de façon suffisamment rapide, d'autres moyens de séparation peuvent être utilisés, par exemple une centrifugation, ou bien on peut agir par passage du mélange à travers un filtre hydrofuge, de sorte que le milieu aqueux traverse ce filtra et que le liquide non miscible à l'eau (ainsi que la préparation d'enzyme) reste en arrière et est par suite séparé., Un procédé enzymatique préféré suivant l'invention est la préparation de l'acide 6-aminopéni:illanique à partir d'une'pénicilline en utilisant une prépara-
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telles que des souches d'Escherichia coli lors d'une utilisation pour dissocier la benzylpénicilline, ou bien de champignons du type des actinomycètes lors d'une utilisation pour la dissociation de la phénoxyméthylpénicilline. De tels enzymes sont en général bien connus. Ils sont utilisés pour la production de 6-APA dans une gamme de pH allant de 6,0 à 9,0 et de
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tion d'une pénicilline a pour conséquence la libération d'un acide libre à partir de la chaîne latérale de la pénicilline, 3 est nécessaire de maintenir la gamme de pH précitée pendant le processus de préparation de 6-APA par addition, en fonction des besoins, d'un alcalin tel qu'une solution de soude, d'hydroxyde d'ammonium, ou encore de triéthylamine.
Un avantage particulier résultant de l'utilisation de préparations d'enzyme suivant l'invention est la facilité d'application à une méthode continue de réaction enzymatique, qui peut être effectuée dans un appareil tel que celui représenté sur la Fig. 3 du dessin annexé, qui est une représentation schématique d'un réacteur convenable.
Si l'on se reporte à la Fig. 3, on voit qu'une cuve formant réacteur 1 est équipée de moyens d'agitation sous la forme d'un agitateur rotatif 2, d'admissions 3, 4 et 5 pour le substrat, l'alcalin et la phase formée par l'enzyme respectivement, et d'une .sortie 6. la cuve 1 renferme également une sonde 7 de détection du pH, qui commande une vanne 8 reliée à l'admission de l'alcalin 4. La sortie 6 de la cuve alimente à travers une pompe 9 un récipient séparateur 10, par l'intermédiaire d'une admission 11. Le séparateur présente une sortie supérieure 12 reliée à l'admission 5 de'la cuve formant réacteur, une sortie inférieure 13 pour évacuer le produit de la réaction par la pompe 14, et un filtre se présentant sous la forme de verre fritte 15 disposé au-dessus de la sortie inférieure 13.
L'admission 3 du substrat est alimentée à partir d'une pompe 16 et les pompes 14 et 16 sont reliées entre elles pour travailler selon les mêmes débits.
En service, la cuve formant réacteur 1 reçoit, par l'intermédiaire de l'admission 3, le substrat dans un milieu
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cuve 1 peut être maintenue à une température constante, par exemple au moyen d'un chemisage d'eau (non représenté) entourant cette cuve. L'alcalin est ajouté à l'émulsion qui se trouve dans la cuve, par l'intermédiaire de l'admission 4, et la vitesse d'addition est réglée par la vanne 8 commandée par la sonde 7, de sorte que le pH du mélange réactionnel est maintenu dans la fourchette requise en vue d'une réaction optimale. Au cours de la réaction, la pompe 9 travaille et le mélange est prélevé
à la sortie 6 et transféré au séparateur 10 par l'admission 11.
Dans le séparateur.10, le liquide non miscible à l'eau (dans ce cas ce liquide est moins dense que l'eau) forme une couche su-
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-zyme. La couche aqueuse inférieure 18 contenant le produit de la réaction est prélevée par le filtre 15 et par suite par la sortie 13 au moyen de la pompe 14. La couche supérieure 17 contenant la préparation d'enzyme associée au liquide non miscible à l'eau peut s'écouler. par la sortie 12 et est renvoyée à la cuve formant réacteur 1 par l'admission 5. Lorsque le produit est prélevé par la sortie 13, une nouvelle quantité de solution de substrat est ajoutée à la cuve 1 par l'admission 3, au moyen de la pompe 16. Les pompes 14 et 16 sont coordonnées de telle sorte que le débit d'admission du substrat soit égal au débit de sortie du. produit.
Les débits d'écoulement, le temps de séjour dans le réacteur et les autres paramètres de la réaction vont dépendre du système de préparation d'enzyme et de substrat particulier considéré. On peut noter à partir de résultats préliminaires qu'un réacteur d'une capacité de 10.000 litres, utilisant
1.000 kg d'une préparation d'enzyme à base d'acylase de pénicil <EMI ID=69.1>
viron 2.000 kg de pénicilline G par jour selon une concentration
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se être améliorée avec des préparations d'enzyme ayant une acti vité spécifique plus élevée.
Les exemples donnés ci-après à titre non limitatif illustrent la production et les propriétés de certains compleces de polymère et d'enzyme suivant l'invention.
Dans les exemples, les abréviations suivantes sont' itilisées pour désigner les polymères et les polymères modifiés, - <EMI ID=71.1> .et les agents de couplage.
Enzymes :
L : Lipase
PA : Acylase de la Pénicilline
T : Trypsine '
Supports :
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GAN : Gantrez
SR : Sepharose
T 2000 : Dextrane T.2000
Groupe de liaison Enzyme/Support :
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Groupes non polaires :
D : n-décylamino
DD : n-dodécylamino
OD : n-octadécylamino
Agents de liaison et d'activation et groupes activés :
CMC : Méthane-p-toluènesulfonate de 1-cyclohexyl-3-(2-
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A : Hydrazide..
Le nombre .entier qui suit la notation représente le numéro de la charge.:
Par exemple,la préparation d'enzyme de l'exemple 1 est
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hexaméthylène-diamine (HD) en vue d'une fixation sur l'enzyme, et également des groupes décyle (D) comme groupes non polaires.
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ène-diamipe et l'enzyme est effectué en utilisant du glutaraldéhyde (G).
Par ailleurs, GAN149HDOD est le support modifié préparé à partir de GANTREZ 149 modifié par du 1,6-diaminohexane et
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ci-dessus sur lequel est fixée de l'acylase de la pénicilline en présence de glutaraldéhyde.
EXEMPLE 1 <EMI ID=79.1>
On fait dissoudre du Ficoll (5 g) dans de l'eau <EMI ID=80.1>
gène (1 g) et on maintient le pH pendant la réaction avec
NaOH 2N. La réaction cesse après 20 minutes à la température ambiante et on ajoute de la n-décylamine (4 g) et du 1,6-diaminohexane (0,5 g) en solution dans le méthanol (10 ml). On ajuste
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<EMI ID=82.1>
g/heure, ce qui donne une boulette blanche (poids humide 35 g) qui est retenue, et une liqueur trouble qui surnage et qui est rejetée.
(b) Acylase de la pénicilline �n-décylamino, (6-aminohexylamino)-Ficoll_7(PAFHDDG - 1)
On mélange du FHDD -- 1 (poids humide 21,6 g) avec un
<EMI ID=83.1>
<EMI ID=84.1>
la pénicilline de E- coli (50 ml, 340 mg de protéine, partiel-
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
dant 30 minutes, on ajoute la suspension de FHDD-1. On agite le
<EMI ID=87.1>
on congèle (-20[deg.]C) pendant 16 heures. Après avoir dégelé, on
<EMI ID=88.1>
une boulette de coule=- brune analogue à un gel. On remet le
<EMI ID=89.1>
nutes. On réunit les liqueurs qui surnagent et on met la boulette brune (poids humide environ 6,3 g) en suspension dans un
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
n-décanol, la suspension renfermant *la boulette flotte avec le décanol à, la surface de solutions aqueuses, en laissant une masse sous-jacente ne contenant pas d'enzyme à l'état de particules. Les activités enzymatiques de la boulette, de la liqueur qui surnage et de l'enzyme de départ sont indiquées dans le ta-
<EMI ID=92.1>
l'enzyme, dont virtuellement la totalité se trouve dans le-complexe. L'activité du complexe peut être récupérée sensiblement à partir des solutions de pénicilline par flottation ou par centrifugation, de façon 'classique.
<EMI ID=93.1>
Activité de l'acylase de la pénicilline de PAFHDDG-1 Processus de titrage . On fait dissoudre de la pénicilline G (sel de sodium) à la concentration appropriée dans
<EMI ID=94.1>
<EMI ID=95.1>
primée sous forme de la vitesse initiale de production d'acide 6-aminopénicillanique (6-APA). Au cours du processus de titrage de confirmation 1, on ajoute 2 ml de n-décanol au mélange réactionnel agité et, après la détermination, on laisse la suspension se séparer en deux couches. On enlève la couche supérieure avec une seringue et on la réutilise. Au cours du processus 2, on centrifuge la suspension finale à 2.000 g pendant 15 minutes et on réutilise la boulette formée.
<EMI ID=96.1>
EXEMPLE 2
(a) n-Octadécylamirio; (6-aminohexylamino)-Ficoll (FODHD-1)
On fait dissoudre du Ficoll (5 g) dans l'eau (300 ml) et on traite la solution avec du bromure de cyanogène (1 g) à
<EMI ID=97.1>
<EMI ID=98.1> <EMI ID=99.1>
méthanol (20 ml). On réajuste le pH à 10,0 avec HC1 2N et on
<EMI ID=100.1>
te blanche non serrée (25 ml, retenue) et une liqueur surnageante claire, avec une mousse en surface (octadécylamine).
<EMI ID=101.1>
On ajuste de l'acylase de la pénicilline (25 ml,
<EMI ID=102.1>
<EMI ID=103.1>
à la température ambiante pendant 15 minutes, on ajoute du
<EMI ID=104.1>
Après agitation à 4[deg.]C pendant 3 heures, on effectue la centrifugation de la matière à 20.000 g/4[deg.]C/30 mn. On remet la boulette rose en suspension dans un tampon au phosphate de sodium
<EMI ID=105.1>
flottation effective sous l'effet du n-décanol, son activité étant indiquée dans..le Tableau 2. La récupération de l'activité
<EMI ID=106.1>
TABLEAU 2
Activité de PAFODHDG-1
Processus de titrage : comme pour le Tableau 1. On utilise pour l'ensemble de la pénicilline G à 5 % p/v.
<EMI ID=107.1>
EXEMPLE 3 <EMI ID=108.1> mure'de cyanogène (2,5 g) comme décrit précédemment. Après 20 <EMI ID=109.1>
â 4[deg.]C pendant 16 heures puis on effectue la centrifugation à <EMI ID=110.1> <EMI ID=111.1>
1 heure). On conserve la seconde boulette (poids humide 50 g environ).
<EMI ID=112.1>
On effectue l'homogénéisation de T2000HDD-1 (poids humide 10 g) dans une solution tampon au phosphate de sodium
<EMI ID=113.1>
l'acylase de la pénicilline (50 ml - 340 mg de protéine) à pH
<EMI ID=114.1>
conserve à -20[deg.]C pendant 16 heures. Après avoir fait dégeler, on agite la suspension à la température ambiante pendant 1 heu-
<EMI ID=115.1>
fraction qui surnage et on remet la boulette en suspension dans
<EMI ID=116.1>
effectue l'homogénéisation. On centrifuge comme précédemment puis on remet en suspension et on centrifuge à nouveau, ce qui donne une boulette brune (poids humide 8,0 g). Celle-ci subit une flottation effective avec le n-décanol et de façon moins effective avec le'n-heptane. L'activité de cette préparation
<EMI ID=117.1>
tiale de l'enzyme sont présents dans le complexe.
TABLEAU 3 ..
<EMI ID=118.1> . Processus de titrage : comme précédemment, on utilise <EMI ID=119.1>
<EMI ID=120.1>
EXEMPLE 4
(a) n-Décylamino, (6-aminohexylamino) Sepharose 4B (SRHDD-1)
On fait gonfler du Sepharose 4B (poids à sec 2 g) activé par le bromure de cyanogène dans 50 ml de HC1 10-3N.à
<EMI ID=121.1>
deux fois 100 ml de HC1 10-3N. On ajoute le gel à une solution
<EMI ID=122.1>
décylamine (0,5 g) et de 1,6-diaminohexane (0,1 g). On fait tourner lentement le mélange à 4[deg.]C pendant 16 heures, puis on filtré sur du verre, fritte. On lave le gel sous aspiration
<EMI ID=123.1>
fois 50 ml d'eau, puis on remet en suspension dans l'eau et on
<EMI ID=124.1> <EMI ID=125.1> <EMI ID=126.1>
On met du SRHDD-1 sous forme de gel séché par aspiration (1,5 g) en suspension dans une solution de phosphate de
<EMI ID=127.1>
(0,5 ml, 25 % p/v). On agite le mélange pendant 2 heures à la température ambiante et on sèche par aspiration sur du verre fritté. On ajoute alors le gel à un mélange d'acylase de la pé-
<EMI ID=128.1>
0,1M pH 6,0 (3 ml). On agite ce mélange pendant 24 heures à
<EMI ID=129.1>
avec 5 fois 20 ml d'une solution tampon au phosphate de sodium
<EMI ID=130.1>
Les billes résultantes flottent lors de l'addition de n-déca-
<EMI ID=131.1>
partir de suspensions aqueuses contenant du n-décanol. L'acti- <EMI ID=132.1>
environ de l'activité initiale sont présents dans le complexe.
<EMI ID=133.1>
<EMI ID=134.1>
Processus de titrage : comme précédemment, en utilisant constamment de la pénicilline G à 5 % p/v.
<EMI ID=135.1>
EXEMPLE 5
n-Décylaminoglutaraldéhyde-acylase de la pénicilline (PADDG-1)
On ajuste de l'acylase de la pénicilline (40 ml,
272 mg) à pH 6,2 et on ajoute du glutaraldéhyde (4 ml, 25 %
<EMI ID=136.1>
décanol (6 ml) et de la n-décylamine (0,6 ml) et on poursuit une
<EMI ID=137.1>
ambiante pendant 1 heure. On effectue la centrifugation du mé-
<EMI ID=138.1>
de couleur brune qui est enlevée et stockée en suspension dans
<EMI ID=139.1>
tière flotte spontanément à la surface des suspensions aqueuses, mais elle.ne peut être mise en dispersion que d'une manière un peu moins aisée que,les complexes de polymère, et elle a tendan ce à forcer des agrégats de grande taille. 1 ml de la suspension, titré comme dans l'exemple 1, présente une activité de
<EMI ID=140.1>
<EMI ID=141.1>
EXEMPLE 6
<EMI ID=142.1>
(TFODHDG-1)
On fait dissoudre de la trypsine (50 mg, sans sel) dans une solution tampon'au phosphate de sodium 0,1 M à pH 6,0
<EMI ID=143.1> <EMI ID=144.1>
<EMI ID=145.1>
on effectue la centrifugation à 20.000 g/4[deg.]C/30 mn. On remet la boulette en suspension dans 20 ml d'eau et on filtre en utilisant des papiers de séparation des phases Whatman IPS. On remet le résidu en suspension dans HC1 <1>0-<3>M (20 ml) et on filtre à nouveau. On effectue ensuite deux fois une remise en suspension (]ici 10-3M) et une centrifugation (10.000 g/14[deg.]C/20 mn), ce qui donne 2,65 g d'un gel brun. Cette matière peut être rendue
<EMI ID=146.1>
té du complexe est indiquée sur la Fig. 1, sur laquelle on a porté en abscisses les temps d'incubation en minutes et en ordonnées les activités. Le processus de titrage est le suivant :
<EMI ID=147.1>
ce qui donne une solution à 2 x 10-314 du substrat chromogène. Or
<EMI ID=148.1>
ge à 22[deg.]0. On ajoute l'échantillon d'enzyme et on prélève des parties aliquotes de mélange de 5 ml à certains intervalles. Lorsqu'on laisse reposer brièvement ou lorsqu'on soumet à une centrifugation douce., la couche d'heptane se sépare (en entraî-
<EMI ID=149.1>
<EMI ID=150.1>
ment de p-nitroanilide. Des gouttelettes d'heptane donnent une valeur d'absorption "nulle" significative. Dans certains cas,
<EMI ID=151.1>
sorption. Après lecture, on renvoie à la fois la couche d'hepta ne et la couche aqueuse au mélange réactionnel agité. L'activi-
<EMI ID=152.1>
l'activité amidolytique initiale.
EXEMPLE 7
<EMI ID=153.1>
On fait'dissoudre de la lipase de Candida Cylindracea
<EMI ID=154.1>
<EMI ID=155.1>
<EMI ID=156.1> <EMI ID=157.1>
fier à nouveau le précipité dans l'eau. On effectue l'homogénéisation de 10' g du'gel résultant dans du phosphate de sodium
<EMI ID=158.1>
glutaraldéhyde. On ajuste le pH à 6,2 et on agite le mélange à 4[deg.]C pendant 16 heures. On effectue la centrifugation de la sus-
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
met la boulette finale (poids humide 8,4 g) en suspension dans
<EMI ID=162.1>
être rendue flottante à la fois avec le n-décanol et le n-heptane. L'activité du complexe est indiquée sur la Fig. 2, sur laquelle on a porté ici encore les temps d'incubation en minute en abscisses et les activités en ordonnées. Le processus de titrage est le suivant :
On agite rapidement du laurat e de p-nitrophényle
(10-<2>M dans le n-heptane), 5 ml, avec du phosphate de sodium
<EMI ID=163.1>
tions, une hydrolyse d'ester non enzymatique ne peut pas être détectée en une heure ou plus'. Après addition de l'enzyme, on prélève des parties aliquotes de 5 ml à certains intervalles et
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
minutes après prélèvement de la première partie aliquote. On renvoie ensuite les couches aqueuse et l'heptane au mélange agité. (Etant donné que le substrat se trouve dans la phase non aqueuse au cours de cette expérience, la vitesse d'agitation, c'est-à-dire le degré de dispersion, doit être maintenue cons- tante pendant toute l'expérience). ' .1 % environ de l'activité initiale de la lipase est présent dans le -complexe.
EXEMPLE
<EMI ID=166.1>
nohexane (0,2 g) en suspension dans le méthanol (10 ml) et on
<EMI ID=167.1>
<EMI ID=168.1>
<EMI ID=169.1>
On agite le mélange pendant 16 heures à la température ambiante, .
1 <EMI ID=170.1>
la température ambiante. On rejette la mousse et la fraction qui surnage, et on remet la boulette en suspension dans une solution
<EMI ID=171.1>
centrifuge à nouveau comme précédemment. On conserve la boulette en forme de gel (80 g) à 4[deg.]C.
<EMI ID=172.1>
On ajuste une solution d'acylase de la pénicilline
<EMI ID=173.1>
<EMI ID=174.1>
l'eau). On agite le mélange à la température ambiante et on ajoute une suspension de GAN149HDOD-1 (10 g) dans un tampon au
<EMI ID=175.1>
à 6,2 et on poursuit-l'agitation à la température ambiante pendant 2 heures. On centrifuge la suspension pendant 1 heure à
20.000 g à 4[deg.]C et on conserve la boulette (14 g). On remet cette boulette en suspension dans un tampon au phosphate de sodium
<EMI ID=176.1>
ve la boulette finale à 4[deg.]C.
<EMI ID=177.1>
cilline G à 5 %, pH 7,8, 22[deg.]C)
<EMI ID=178.1>
le n-décane.
<EMI ID=179.1>
(a) GAN149HDOD-2
On fait dissoudre de la n-octadécylamine (5 g) dans l'éthanol (50 ml) et on ajoute à une solution tampon au phospha-
<EMI ID=180.1>
<EMI ID=181.1>
<EMI ID=182.1>
<EMI ID=183.1>
pendant 6 heures. On abaisse le pH à 3,0 avec HC1 concentré et on centrifuge la suspension à 12.000 g pendant 1 heure à la température ambiante. On rejette là fraction qui surnage et on remet la boulette en suspension dans l'eau (550 ml) et on centrifuge à nouveau, ce qui donne,une boulette blanche finale
<EMI ID=184.1> <EMI ID=185.1>
On mélange une solution d'acylase de la pénicilline
<EMI ID=186.1>
HDOD-2 (15 g), une solution tampon au phosphate de sodium à pH
<EMI ID=187.1>
<EMI ID=188.1>
<EMI ID=189.1>
trifuge à nouveau. On répète ensuite ces opérations, ce qui donne une boulette finale d'un poids de 11,2 g, qu'on conserve
<EMI ID=190.1> . Activité spécifique : 1,8 x 10-5 mole de 6-APA min
(Conditions comme précédemment).
<EMI ID=191.1>
décanol ou le n-decane.
EXEMPLE 10
Trypsine (n-décylamino-Gantrez AN119)(TGAN119D)
<EMI ID=192.1>
méthylformamide (DMF) (5 ml) et on agite vigoureusement. On ajoute de la n-décylamine (0,3 g) dans Le DMF (1 ml) et la solution devient plus visqueuse. Après agitation pendant 10 minu- tes, on ajoute la solution goutte à goutte à une solution de trypsine de bovin.(300 ml) dans une solution tampon au phosphate de sodium 0,1M à pH 8,0 (60 ml), à 22[deg.]C. On maintient le pH avec de la soude 2N et quand aucune autre variation ne se produit, on ajoute du chlorure de sodium (4 g). On verse la solu- tion résultante dans une solution tampon au phosphate de sodium
<EMI ID=193.1>
fate d'ammonium (50 g) et on agite le mélange à 4[deg.]C pendant
<EMI ID=194.1>
effectue une nouvelle homogénéisation de la boulette analogue à un gel dans une solution tampon au phosphate de sodium 0,1 M à
<EMI ID=195.1>
deux autres cycles d'homogénéisation/centrifugation, ce qui don ne un gel lâche final (7,5 g). On titre la préparation par
<EMI ID=196.1>
Nitroanilide (BANA), 2mM, dans un tampon au véronal 0,1M à pH
<EMI ID=197.1> .de 0,001 par minute à 400 nm. Etant donné que le gel provoque une dispersion appréciable de la lumière, il est nécessaire de <EMI ID=198.1>
tente...
Activité du gel : 168 unités/mg de poids à l'état humide, <EMI ID=199.1>
<EMI ID=200.1>
L'immobilisation du complexe d'enzyme sur les gouttelettes de solvant est illustrée par l'expérience suivante :
<EMI ID=201.1>
dans un petit broyeur à tissus avec du n-décane (2,5 ml) et une
<EMI ID=202.1>
4.000 tours/minute et 0[deg.]C, pendant 5 minutes. On sépare la suspension laiteuse pour former une couche supérieure comprenant des gouttelettes de décane étroitement serrées et une couche <EMI ID=203.1>
couches en utilisant, la même méthode spectrophotométrique. Dans ce cas encore, on secoue la cuvette à des intervalles réguliers quand la couche supérieure est titrée et on mesure la vitesse moyenne d'augmentation de la densité optique.
Activité de la phase, supérieure : 2.280 unités/ml
Activité de la phase inférieure : 57 unités/ml.
Etant donné que l'activité apparente de la phase supérieure est probablement nettement inférieure à l'activité réelle par suite de la méthode utilisée, ce résultat indique qu'au
<EMI ID=204.1>
tes de solvant.
<EMI ID=205.1>
Acylase de la pénicilline (n-octadécylamino Gantrez AN119)
(PAGAN1190D).
On fait dissoudre du Gantrez AN119 (0,5 g) dans le di-
<EMI ID=206.1>
fait dissoudre également de l'octadécylamine (0,28 g) dans le
<EMI ID=207.1>
solution de Gantrez alors qu'elle est encore chaude. On agite le mélange et on ajoute de la pyridine (0,1 ml). Après refroidissement à la température ambiante pendant 1 heure, on ajoute l'ensemble de la solution à l'acylase de la pénicilline (175 mg) dans l'eau (30 ml) à pH 7,0 et on effectue une brève homogénéi-
<EMI ID=208.1>
<EMI ID=209.1>
<EMI ID=210.1> <EMI ID=211.1>
<EMI ID=212.1>
tion tampon au phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,0 (20 ml).
<EMI ID=213.1>
<EMI ID=214.1>
<EMI ID=215.1>
<EMI ID=216.1>
dans le complexe. On mélange la suspension ci-dessus (4,0 ml) avec un tampon au phosphate de sodium 0,02M (20 ml) et du ndécanol (5 ml) et on effectue l'homogénéisation à 4.000 tours/
<EMI ID=217.1>
à 100 g à la température ambiante pendant 20 minutes et on sépare en une émulsion organique supérieure et une couche aqueuse inférieure. On rétient la couche inférieure et on remet la couche supérieure en suspension dans un tampon au phosphate de sodium 0,02M (20 ml) et on centrifuge à nouveau. La couche infé-
<EMI ID=218.1>
<EMI ID=219.1>
x 10-5 mole/minute. Le rapport entre les activités spécifiques
(sur une base volumétrique) est égal à 21,6 (supérieur/infé- rieur). Après détermination de l'activité par la méthode ci-dessus, on recycle la couche organique par centrifugation douce et élimination de la couche aqueuse comme indiqué dans le tableau
5.
TABLEAU 5
<EMI ID=220.1>
<EMI ID=221.1>
<EMI ID=222.1>
<EMI ID=223.1>
(0,25 g) dans le diméthylformamide (1 ml) et on ajoute à une <EMI ID=224.1>
<EMI ID=225.1>
suspension-pendant 16 heures à 4[deg.]C. On ajoute du sulfate d'am-
<EMI ID=226.1>
<EMI ID=227.1>
Après dissolution-dû sulfate d'ammonium, il se forme une suspen sion trouble. On centrifuge cette matière à 25.000 g/0[deg.]C/1 heure. On remet la boulette en suspension dans une solution de sul
<EMI ID=228.1>
centrifuge à nouveau. La boulette finale pèse 1,36 g et est dissoute à nouveau dans l'eau (10 ml), ce qui donne une solutio visqueuse. L'activité de la boulette (titrage comme précédem-
<EMI ID=229.1>
représente une récupération d'activité de 80 %. l'immobilisation) du complexe soluble dans l'eau sur les gouttelettes de n-décanol est illustrée par l'expérience ci-après :
On fait dissoudre 1 ml de la solution ci-dessus dans un tampon au phosphate de sodium 0,02M (20 ml) et on homogénéi-
<EMI ID=230.1>
<EMI ID=231.1>
lion à 300 g pendant 10 minutes. La couche supérieure a une ac-
<EMI ID=232.1>
de recyclages successifs est indiquée dans le tableau 6.
Au cours d'une seconde expérience, on effectue l'homogénéisation d'une solution de complexe d'enzyme dans les mêmes conditions avec du n-décanol (2,5 ml) et un tampon au phosphate de sodium 0,02M (10 ml). Après centrifugation et lavage avec
20 ml du même tampon, la couche supérieure a une activité de
<EMI ID=233.1>
<EMI ID=234.1>
spécifiques (supérieure/inférieure, base volumétrique) est 3'environ 7,5.
TABLEAU 6
activité initiale en pourcentage de la phase PAGAN119DD-n-déca-
<EMI ID=235.1>
<EMI ID=236.1>
EXEMPLE 13
Trypsine (n-octadécylamino-Gantrez AN 149 hydrolysé) TGAN
14-9DCMC.
<EMI ID=237.1>
<EMI ID=238.1>
<EMI ID=239.1>
On ajoute du métha-p-toluènesulfonate de 1-cyclohexyl-
<EMI ID=240.1>
<EMI ID=241.1>
biante, on ajoute de la trypsine de bovin (75 mg dans un tampon
<EMI ID=242.1>
mélange à 5,9 et on maintient ce pH pendant l'heure suivante avec de la soude 2N. Après 3 heures à la température ambiante, on centrifuge le gel 25.000 g/30 mn/4[deg.]C. On remet la boulette en suspension dans un tampon au phosphate de sodium 0,1M à pH
<EMI ID=243.1>
finale avec le tampon susmentionné (15 ml) et du n-décane
(10 ml) et on effectue une brève homogénéisation. Ce processus donne une dispersion incomplète et on traite le mélange à 20 KH par charges successives de 5 en 5 minutes, avec refroidissement intermittent dans la glace. On centrifuge l'émulsion finale à
100 g/15 mn. On lave trois fois la couche supérieure avec le tampon au phosphate (25 ml). Le volume final de la couche supérieure est de 11 ml et la couche a une activité (titrée comme
<EMI ID=244.1>
<EMI ID=245.1>
<EMI ID=246.1>
(a) n-Octadécylamino-Gantrez AN 119-hydrazide hydrolysé
(GAN1190DH) <EMI ID=247.1> ajoute une solution de n-octadécylamïne (2,8 g) dans le diméthylformamide (30 ml) chaud (80[deg.]C) et on maintient le mélange à
<EMI ID=248.1>
rature ambiante, on ajoute la solution à un mélange d'hydrate
<EMI ID=249.1>
rature ambiante. Il se forme un précipité légèrement brun et on
<EMI ID=250.1>
Il en résulta une solution verte savonneuse et, après agitation - <EMI ID=251.1> <EMI ID=252.1>
floculation et on centrifuge la suspension à 10.000 g/30 mn/
<EMI ID=253.1>
on agite pendant 16 heures à 4[deg.]C, puis on centrifuge comme précédemment, ce qui donne une boulette bleu-gris (poids humide
39 g).
(b) Acylase de la pénicilline (n-octadécylamino-Gantrez AN 119)- <EMI ID=254.1>
<EMI ID=255.1>
<EMI ID=256.1>
une solution de nitrite de sodium (0,5 g) dans l'eau (5 ml) et on agite le mélange à 0[deg.]C pendant 10 mn, puis on centrifuge à
25.000 g/30mn/0[deg.]C et on remet la boulette en suspension dans un
<EMI ID=257.1>
ajoute cette suspension à une solution d'acylase de la pénicilline (100 ml contenant 55 mg de protéine) et on ajuste à pH
<EMI ID=258.1>
<EMI ID=259.1>
<EMI ID=260.1>
<EMI ID=261.1>
que (titrage comme précédemment) : 5,2 x 10-5 mole/mn/g. Récupération d'activité : 32,5 %.
On mélange une suspension du complexe précité dans un tampon au phosphate de sodium 0,1M à pH 7,0 (0,29 g/ml, 2,5 ml) avec un tampon au phosphate de sodium 0,02M à pH ?,8 (20 ml) et
<EMI ID=262.1>
puis on centrifuge à 5.000 tours/minute (100 g, 10 mn), ce qui donne deux couches. La couche inférieure a une activité totale
<EMI ID=263.1>
<EMI ID=264.1>
le/mn. Le rapport entre les activités spécifiques (supérieure/ inférieure, base volumétrique) est de 30 environ. Les résultats d'un recyclage avec la phase supérieure.sont indiqués dans le tableau 7.
TABLEAU 7
<EMI ID=265.1>
iécanol lors de cycles successifs de flottation et réutilisa- tion.
<EMI ID=266.1>
EXEMPLE 15
Dissociation enzymatique de la benzyl-pénicilline pour produire de l'acide 6-aminopénicillanique.
On fait dissoudre 1,0 g de Gantrez AN119 dans 10 ml d diméthylformamide et on ajoute 0,56 g d'octadécylamine. On agit l'ensemble pendant une nuit à la température ambiante.
On ajuste 48 ml d'une préparation partiellement purifiée d'acylase de la pénicilline à pH 9,0 avec une solution 1M de carbonate de sodium. On ajoute ensuite la solution de résine Gantrez en deux parties aliquotes avec homogénéisation et ajustement du pH entre les* deux additions. On agite ensuite le mélange pendant 3 heures, le pH étant maintenu à 990 par l'addition d'une solution 1M de soude.
On récupère ensuite le complexe enzyme-résine par cen. trifugation, on remet en suspension dans 120 ml d'un tampon au
<EMI ID=267.1>
On récupère l'enzyme-résine par centrifugation et on ^répète le lavage.
On effectue l'homogénéisation de 20 g du gel d'enzyme avec 80 ml de n-décane et 20 ml de tampon au phosphate 0,02M à
<EMI ID=268.1>
250 ml d'eau distillée. On chauffe l'ensemble à 370C, on ajuste
<EMI ID=269.1>
(21,8 g). On agite le mélange pendant 5 heures et on maintient le pH à 7,8 par,l'addition d'une solution à 4 % (p/v) de soude. A la fin de la réaction, on verse le mélange dans un entonnoir
séparateur et on laisse l'enzyme se séparer de la phase aqueuse. Ceci demandé 30 minutes. On élimine ensuite la couche aqueuse
<EMI ID=270.1>
vante :
On concentre la liqueur au quart de son volume, on
<EMI ID=271.1>
cétone tout en agitant. On réduit le pH à 4,3 par addition d'acide nitrique concentré, après quoi on précipite l'acide 6-ami- <EMI ID=272.1> <EMI ID=273.1> <EMI ID=274.1>
Des modifications peuvent être apportées aux modes de
mise en oeuvre décrits, dans le domaine des équivalences tech- niques, sans s'écarter de l'invention.
<EMI ID=275.1>
1. - Préparation d'enzyme, caractérisée en ce qu'elle renferme un enzyme fixé sur des groupes non polaires en quantité suffisante pour que,.lors de la mise en contact de la préparation dans des milieux aqueux avec un liquide inerte non miscible à l'eau, ladite préparation s'associe au liquide inerte non miscible à l'eau et puisse se séparer alors du milieu aqueux.