"Agents antimicrobiens et leur application" De nombreux genres de substances ont un effet nuisible sur les microorganismes. Les substances antimicrobiennes ont deux genres d'activités, l'une bactéricide, germicide ou destructrice de virus et qui concerne la destruction des microorganismes ; et l'autre est une action bactériostatique ou d'inhibition de la croissance. Une activité antimicrobiennes
est une propriété de substances minérales comme de substances organiques, et l'exploitation d'une telle activité a une importance pratique considérable dans le développement et la mise au point d'antiseptiques, de germicides, de bactéricides,
de sporicides, de produits pour détruire les virus et de toutes sortes de désinfectants.
Un certain nombre de substances minérales ont une activité antibactérienne en raison de la toxicité, pour les microorganismes, des ions provenant de leur dissociation ou en raison de leur activité comme agents oxydants provoquant
un certain degré d'oxydation de la substance cellulaire. Parmi les substances minérales jouant le rôle d'agents antimicrobiens, il y a des sels. Les degrés auxquels des sels peuvent efficacement jouer le rôle d'agents toxiques dépendent principalement du degré de dissociation du sel en cause, de la natu-
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l'ion métallique. En général, les cations bivalents sont plus toxiques que les cations monovalents, et les sels des métaux lourds sont plus toxiques que ceux des métaux légers. L'activité antimicrobienne des sels de métaux lourds est attribuée à l'affinité des cations pour les matières protéiques. Lorsque les protéines faisant partie de la cellule bactérienne sont précipitées sous forme d'un protéinate insoluble, la cellule meurt. Cependant, d'autres facteurs peuvent également être impliqués.
Diverses influences peuvent jouer sur les processus d'inhibition de la croissance bactérienne ou de destruction des bactéries par la mort. La plus importante de ces influences est la concentration des substances devant réagir, c'està-dire la concentration de la substance biocide et le nombre des bactéries présentes. La concentration efficace d'une substance biocide dépend à son tour principalement de deux autres facteurs : en premier lieu, la présence d'humidité, qui rend possible une ionisation de la substance pour former l'agent biocide et joue le rôle d'un milieu de maintien en suspension dans lequel il peut y avoir un contact intime entre l'agent biocide et le microorganisme. En second lieu, la présence d'une matière organique étrangère et/ou d'une autre matière qui réagira avec l'agent avant son contact avec un organisme en rendant cet agent inefficace.
Des sels de métaux ou des complexes de métaux ont servi d'agents antimicrobiens. Parmi les brevets représentatifs de l'art antérieur et qui visent l'utilisation de sels de métaux ou de chélates de métaux dérivant-de composés minéraux ou organiques comme agents microbicides, il y a les brevets des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 871 392, n[deg.] 991 261, n[deg.] 1 679 919, n[deg.] 1 785 472, n[deg.] 2 208 253, n[deg.] 2 269 891, n[deg.] 2 456 727, n[deg.]
2 494 941, n[deg.] 2 878 155, n[deg.] 2 900 303, n[deg.] 2 901 393, n[deg.]
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n[deg.] 3 262 846, n[deg.] 3 266 913, n[deg.] 3 681 492 et n[deg.] 3 782 471.
Il a été établi pour des activités antimicrobiennes que des sels de métaux lourds sont rapidement précipités par une matière organique étrangère ou par une autre matière et, par conséquent, si de tels sels peuvent détruire initialement des cellules à une concentration efficace initiale, la concentration efficace est assez rapidement réduite par combinaison du métal avec cette matière étrangère ce qui épuise la quantité de métal toxique disponible pour une activité biocide.
Donc, si des sels minéraux présentent dans certains cas la propriété d'une solubilité en milieu aqueux et, par conséquent, d'une dissociation les rendant disponibles à titre d'agents métalliques toxiques, ils peuvent être rendus assez rapidement inefficaces de sorte qu'il n'y a plus de destruction ou d'inhibition prolongée ou réglée de l'action bactérienne. Par ailleurs, les sels métalliques ou les complexes de fragments organiques comme des acides organiques, etc., possèdent un degré de dissociation qui n'est normalement pas aussi grand, par exemple, que celui de sels minéraux fortement solubles.
Donc, si les sels organiques de métaux ou les complexes de métaux peuvent avoir une plus grande stabilité ou une plus grande inertie cinétique à l'égard d'une matière organique étrangère présente dans l'environnement des cellules vivantes, il y a généralement aussi une perte de l'effet toxique en raison de leur plus grande stabilité..
A ce bref exposé général sur l'activité microbienne, vient s'ajouter la relation entre la croissance des bactéries et l'acidité ou l'alcalinité des milieux conduisant à une telle croissance. Les concentrations en ions hydrogène compatibles avec la croissance sont.très basses, généralement de l'ordre
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lité des bactéries croîtra à un pH d'environ 7,0 (1 x 10 7-mole de l'ion hydrogène par litre), mais le meilleur développement s'effectuera à un pH optimal qui varie d'une espèce'à l'autre. Les limites de minimum et de maximum entre lesquelles une telle viabilité est possible varient de même largement drune espèce
à l'autre. Donc, l'activité d'un agent antimicrobien dans l'intervalle de pH de la viabilité microbienne est une considération très importante,car l'activité détermine l'efficacité biocide.
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dans l'art antérieur deux extrêmes présentées par des compositions métalliques antimicrobiennes. D'une part, des composés métalliques connus ont un degré élevé de dissociation.de sorte que des ions métalliques toxiques sont rendus rapidement et abondamment disponibles en raison d'une dissociation rapide avec formation de l'espèce ionisée. Ces espèces réagissent de façon à saturer tous lés ligands disponibles et-elles deviennent ainsi inactivées, en ce qui concerne leur potentiel destructeur, en une très courte période de temps en éliminant un pouvoir destructeur résiduel, ce qui les rend relativement inefficaces comme agents biocides sur des périodes prolongées de temps.
D'autres composés métalliques connus sont- relativement stables et fournissent des quantités minimales d'une espèce ionisée dans l'intervalle de pH physiologique normal en assurant donc le minimum de pouvoir d'inhibition de croissance ou de potentiel toxique,en raison du degré très minimal de dissociation caractérisant de façon inhérente ces composés.
. La présente invention repose en partie sur la dé- <EMI ID=5.1> . priété de dissociation provoquée par des protons qui rend ce complexe particulièrement remarquable et efficace à des concentrations en ions hydrogène compatibles avec la viabilité des microorganismes. L'ingrédient actif de l'activité antimicrobienne selon la présente invention est un complexe d'un ion métallique et d'un ligand organique polyfonctionnel. On a également trouvé que ces complexes de métaux ont une propriété très inattendue de dissociation à peu près dans l'intervalle normal de pH physiologique.
La propriété de dissociation est représentée par une courbe en forme sigmoïdale, c'est-à-dire une courbe partant dans deux directions différentes comme la lettre "S", dans un diagramme à coordonnées cartésienne du logarithme négatif (c'est-à-dire changé- de signe) de la concentration de l'ion de métal par rapport au logarithme négatif
(changé. de signe) de la concentration de l'ion hydrogène (ce qu'on connaît par ailleurs sous le nom de diagramme pM-pH). Cette propriété de dissociation remarquable des complexes métalliques antimicrobiens les rend ainsi extrêmement efficaces dans la libération réglée de l'ion de métal toxique, à partir <EMI ID=6.1>
ries. Les agents antimicrobiens sont des microbicides et bactériostatiques très efficaces sur des microorganismes comme des bactéries, des champignons et des virus.
Dans un autre aspect remarquable de la présente invention, celle-ci propose des complexes de métaux antimicrobiens qui sont très stables à des pH fortement alcalins de l'ordre d'environ 9 à environ 12. Par conséquent, de tels complexes servent très avantageusement dans des milieux alcalins en assurant une libération réglée, à la demande, de leur activité antimicrobienne. Comme on pourra pleinement le comprendre grâce à la description détaillée de la présente invention et grâce aux exemples qui suivent, les agents antimicrobiens de la présente invention sont actifs contre de larges spectres de microorganismes.
En outre, dans une autre de ses caractéristiques,
la présente invention répond d'une façon inconnue jusqu'à présent à un besoin dans le- domaine des agents antimicrobiens en utilisant un complexe de métal d'un ligand organique polyfon-
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que dans l'intervalle normal de pH physiologique, c'est-à-dire entre environ 4 et environ 9. En particulier, les agents microbiens de la présente invention libèrent de grandes quantités
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coordination à un pH compris entre environ 7 et 9 et ils sont effectivement instables au voisinage de pH 7 où la quasi-totalité des microorganismes est viable. Ces agents antimicrobiens sont très stables et relativement inertes à l'égard de fragments organiques, contrairement à des sels solubles multivalents de l'art antérieur. dont on provoque habituellement ainsi la précipitation. De tels agents sont extrêmement stables même à des pH fortement alcalins. Cependant, à la demande et en raison de leur propriété remarquable de dissociation (montrée par la forme sigmoïdale ou en "S" sur un diagramme pM-pH), ces agents offrent une libération réglée des ions de métal à un pH où l'on pense que la quasi-totalité des bactéries se développent. Une telle structure, qui offre une dissociation à la demande
au pH pouvant le mieux correspondre à la viabilité des bactéries et qui est facilement acceptée dans la structure cellulaire interne des bactéries, constitue une découverte remarquable. En raison de la nature du ligand organique servant à leur formation, les complexes d'un métal de la présente invention sont particulièrement stables à l'égard de fragments organiques étrangers présents dans les cellules bactériennes ou.dans le milieu environnant.
<EMI ID=9.1> doivent donc être différenciés d'autres complexes de métaux dans lesquels les cations du métal ont été complexés à l'aide de ligands organiques représentés par l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriaminepentaacétique
(DTPA), d'autres amino-acides, etc., qui ont une stabilité ou une inertie chimique relativement grande et qui n'offrent pas une libération réglée de l'ion de métal toxique ou une propriété de dissociation représentée par une courbe en S dans
un diagramme pM-pH. Au contraire, les complexes connus de métaux, en raison de leur stabilité et de leur inertie chimique, tendront à se dissocier à un degré moindre de façon plutôt linéaire dans l'intervalle des pH physiologiques normaux.
En outre, la présente invention propose un complexe de métal antimicrobien qui peut se dissoudre en une concentration élevée en milieu aqueux, en raison de son caractère ionique, et qui cependant reste sous forme stable. Cette propriété de la solubilité dans de l'eau de milieux/neutres, acides ou alcalins, permet de produire des concentrés capables de produire à la demande l'ion de métal toxique dans un environnement à pH physiologique.
Une telle propriété de solubilité permet la distinction avec les composés de métaux plutôt insolubles de l'art antérieur(qui utilisent un cation de métal et un constituant anionique et qui sont virtuellement insolubles dans des milieux aqueux)ou avec les complexes de métaux qui, bien qu'ils soient solubles, fixent l'ion de métal en un tel état de complexe que cet ion n'est que légèrement dissocié et, par conséquent, �, peine disponible pour une action toxique.
Dans une forme actuellement préférée, l'agent de la présente invention comprend un complexe monométallique d'un métal multivalent et d'un ligand organique polyfonctionnel, selon un rapport de 1:1 1 entre le métal et le ligand, le complexe ayant une propriété de dissociation représentée par une
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métal est du monocuivre-(II)-citrate dialcalin représenté par du monocuivre(II)-citrate disodique, dipotassique ou de dilithium. Ces monocuivre (Il)-citrates dialcalins ont une propriété de dissociation représentée par une courbe en forme de
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environ 7 et environ 9. Il a été établi que ces complexes de monocuivre (II) sont très stables dans des milieux basiques, de l'ordre d'environ 9 à environ 12, c'est-à-dire qu'ils ont une constante de stabilité effective, Keff , de l'ordre d'en-
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blement inférieure (inférieure d'un millier à plusieurs centaines de milliers de fois),et une concentration importante
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dans le complexe est à l'état ionisé à un pH égal à 7 ou voisin de cette valeur, cependant qu'environ 0,1 % du cuivre est ionisé à un pH égal à 9 ou voisin de cette valeur. Cela ne serait pas vrai pour un complexe de EDTA ou d'une polyamine d'un métal multivalent comme le cuivre, puisque sa constante
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lité, mais cela est représenté par une courbe lisse régulière atteignant un effet de limitation par une dissociation provoquée <EMI ID=15.1>
en ne donnant qu'environ 0,0001 % d'une espèce ionisée à un pH de 7 ou voisin de cette valeur jusqu'à une valeur aussi faible que 0,00001 % de l'espèce ionisée à un pH égal à 9 ou voisin de cette valeur.-On doit comprendre que les complexes
à action de stabilisation ou à action antimicrobienne fonctionneront dans un intervalle du pH compris entre environ 3 et environ 12. Au-dessus de ph 12 environ, les complexes tendront à être détruits par les milieux alcalins,en précipitant de ces milieux sous forme d'oxydes métalliques hydratés. Au-dessous d'une valeur de pH 6 environ, c'est-à-dire à environ 3 à environ 6, l'instabilité du complexe de métal aboutit à une grande concentration du Ou libre en solution, ce qui créera de la biostabilité et exercera d'autres rôles de stabilisation comme mentionné ci-dessus. Dans l'intervalle moyen compris entre environ 7 et environ 9, la libération réglée est très efficace. Ainsi, ces complexes assurent une libération réglée de l'ion
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dans l'intervalle du pH compris entre environ 7 et 9 ; cet ion de métal est alors disponible pour des rôles de coordination, d'action antimicrobienne et de stabilisation.
Selon cette description et la forme de réalisation actuellement préférée, il apparaîtra que d'autres complexes de métaux et de ligands organiques polyfonctionnels répondent au modèle de la présente invention lorsqu'ils montrent la propriété de dissociation caractérisée par une courbe sigmoldale ou en forme de S dans un diagramme normal pM-pH. Par exemple, en
se fondant sur le complexe monométallique d'un ligand organique polyfonctionnel de la présente invention, on peut utiliser d'autres ions de métaux de nature monovalente ou multivalente, en particulier des cations divalents et polyvalents et notamment du zinc, du nickel, du chrome, du bismuth, du mercure, de l'argent, du cobalt, et d'autres cations métalliques ou de métaux lourds semblables. Les complexes de métaux lourds sont considérés comme plus toxiques que ceux des métaux légers. On peut remplacer par d'autres ligands organiques polyfonctionnels l'acide citrique cité comme exemple spécifique par la forme préférée de réalisation de la présente invention.
Cependant, le citrate offre une action de tampon préférée à un pH d'environ 8,5, ce qui constitue un avantage supplémentaire pour les fluides pour le travail des métaux qui sont stabilisés par un tel complexe de métal. Parmi d'autres ligands polyfonctionnels, il y a la classe plus large des acides alpha- ou bêtahydroxypolycarboxyliques-dans laquelle l'acide citrique figure. De même, on peut introduire dans le modèle moléculaire des complexes de métal de la présente invention, à la place de l'acide citrique, d'autres acides comportant comme substituants des groupes fonctionnels tels que des groupes alpha-,.ou bêtaamino, sulfhydro, phosphinol, etc., et l'on peut obtenir des résultats semblables.
En général, du point de vue de la formule d'un complexe de métal, le complexe monométallique du cuivre et de l'acide citrique correspond à une formule de complexe représentée par l'une ou l'autre des formules développées ou de structure (A) et (B) qui suivent :
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On pense que la forme (A) est la forme préférée lorsqu'on applique des considérations tenant à l'énergie li-bre. Un seul proton introduit dans la structure du complexe représenté par la forme (A) ou (B) empêche la formation de noyaux coordonnas stables à cinq ou six chaînons. Avec l'introduction d'un proton, seuls des noyaux à sept chaînons peuvent être formés par la coordination des groupes acétates donneurs d'électrons, et de telles structures de noyaux à sept chaînons
(heptagonaux) sont instables. Par conséquent, la molécule du complexe se dissocie et elle présente l'ion métal qui peut exercer ses effets toxiques ou de stabilisation. En comparaison, des complexes de métaux et de l'EDTA ou d'autres polyamines exigent quatre protons ou davantage, et donc une plus
grande acidité, pour dissocier le complexe. Cela explique le faible effet-du pH sur de tels complexes dans un diagramme pM-pH.
Les formes (A) et (B) de structure peuvent être plus généralement représentées par les modèles suivants :
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Dans les modèles ci-dessus, les segments formés d'un trait plein représentent une liaison chimique entre des éléments de la structure de la charpente de la molécule ; X, Y et Z représentent des donneurs de paires d'électrons ; (R) représente n'importe quel élément ou molécule ou groupe, M représente un métal ; l'affinité de X pour des protons est supé- <EMI ID=19.1>
remplacer par d'autres paires de protons de base de Lewis et
par d'autres ions de métaux, l'oxygène, le cuivre divalent ou, dans ce cas, les atomes de carbone de ces modèles de structures pour obtenir un modèle moléculaire qui se dissociera de façon semblable lorsqu'on introduit'un proton ou une espèce dont le compor-' tement est semblable au comportement représenté par la courbe
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les moléculaires constituent donc une autre forme d'expression des agents de stabilisation de la présente invention.
L'invention et ses diverses formes de réalisation et avantages se comprendront mieux lorsqu'on se réfère aux exemples suivants, aux descriptions détaillées qui suivent et à la figure illustrant la préparation des complexes et leur activité. PREPARATION DES COMPLEXES
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On dissout 10 millimoles de citrate de lithium dans
10 ml d'eau. A cette solution, on ajoute progressivement tout
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Il se forme une solution bleu foncé. On la neutralise jusqu'à un pH_d'environ 7 avec 10 millimoles d'hydroxyde de lithium
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ne un solide semi-cristallin bleu foncé. On broie ce solide pour obtenir une fine poudre et l'on extrait le chlorure de lithium avec 50 ml de méthanol anhydre, cinq fois, à 35[deg.]C. On maintient sous vide le solide bleu qui reste comme résidu pour en enlever le méthanol et le sécher. On a essayé de faire cristalliser le sel dans des systèmes eau/solvant organique mais,
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et à la grande charge négative de la molécule ionisée, le solide obtenu a été microcristallin à amorphe. La formule suivante
est proposée pour le complexe 1:1 de cuivre et de citrate, en se fondant sur l'élucidation de la structure et les analyses décrites ci-après : . - - .
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Selon le degré d'hydratation, on propose les masses <EMI ID=26.1>
les pourcentages correspondants de teneur en cuivre :
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La teneur en cuivre qu'on observe pour des échantillons diversement séchés du complexe solide se situe entre 20 % et 23 %. Le composé (complexe solide 1:1) est extrêmement soluble dans l'eau. On peut produire assez facilement une solution aussi concentrée qu'une solution deux molaire. Jusqu'à un
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dans l'eau. Au-delà de ce pH, le complexe se décompose en donnant un précipité brun verdâtre, qui est probablement constitué par des oxydes hydratés du cuivre. On peut utiliser le complexe solide 1:1 comme agent de stabilisation avec ou sans l'enlèvement du chlorure de lithium formé au cours de sa préparation.
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re de cuivre et de citrate de sodium à de l'eau comme en (A) ci-dessus pour obtenir une solution bleu foncé ayant un pH d'environ 5. On place dans une ampoule à décanter une partie aliquote (50 ml) de cette solution. On ajoute un égal volume d'acétone anhydre et l'on secoue l'ampoule de façon à effectuer un mélange. Après repos, on.obtient un système à deux phases. Une phase liquide bleue repose au bas de l'ampoule en un volume réduit d'environ 25 ml, cependant que la couche supérieure
(environ 75 ml) est légèrement trouble et incolore alors qu'elle .avait-la limpidité du cristal avant le processus du mélange par secousses. On enlève de l'ampoule par le robinet le li- <EMI ID=30.1>
secondé ampoule à décanter. On place le liquide surnageant �rouble: dans un bêcher et on l'évaporé à siccité sur un bain
<EMI ID=31.1> 25 ml environ d'acétone anhydre,ce qui provoque la formation presque instantanée d'une masse analogue à de la matière plastique au bas de l'ampoule, par opposition au liquide huileux qui y était présent. On place dans un second bécher le liquide surnageant de la masse plastique et on l'appelle liquide surnageant 2. L'addition d'eau distillée à la masse analogue à de la matière plastique aboutit à la redissolution immédiate de la matière. On ajuste à 25 ml - le volume total de la substance redissoute, ce qui aboutit une fois encore à la formation d'un.liquide huileux et visqueux. Après l'évaporation à siccité de la liqueur surnageante 1, l'examen au microscope du résidu sec révèle la présence de.fortes quantités bien définies de cristaux de chlorure de sodium.
L'évaporation du liquide surnageant 2 donne un résidu pulvérulent très finement divisé qui contient un faible nombre de cristaux distincts de chlorure de sodium. L'analyse, pour déceler la teneur en cuivre, de la solution huileuse bleue ayant subi une double extraction révèle que la solution contient environ 125 mg de cuivre par millilitre, ce qui représente un concentré du complexe de métal qui contenait à l'origine environ 65 mg/ml. La grande diminution de la quantité du chlorure de sodium dans le liquide surnageant 2 indique que la majeure partie du sel, constituant du sous-produit à action d'impureté, a été enlevée. On a laissé s'évaporer une portion du concentré et l'on a noté l'existence d'une matière nettement cristalline.
(2) On a répété les modes opératoires du paragraphe précédent (1), sauf que l'on a ajusté le pH de la solution bleue initialement formée à une valeur d'environ 5 à environ
7 avec une solution de KOH peur neutraliser le HC1 formé. Après réalisation des opérations d'extraction et d'évaporation, on
a obtenu un concentré du complexe de métal qui, après évaporation, a donné de la matière nettement cristalline.
(3) On-a combiné des parties aliquotes équimolaires de sulfate de cuivre et de citrate de sodium comme au paragraphe (1) puis l'on a ajusté avec NaOH le pH à environ 7. Des opérations d'extraction et d'évaporation de la solution bleue résultante, comme décrit.ci-dessus, ont donné une poudre amor- phe ne possédant pas de structure cristalline discernable à la vue.
La formule suivante est proposée pour le monocuivre(II)citrate disodique préparé aux paragraphes (1) à (3) ci-dessus, en se fondant sur l'élucidation de la structure et sur les analyses décrites ci-après :
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C. Monozinc-citrate disodique
En utilisant les ingrédients suivants, on a préparé un complexe de zinc qui est un stabilisant analogue au-complexe de cuivre de (B) ci-dessus :
50 ml d'eau froide
29,4 g de citrate trisodique dihydraté
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HC1 concentré
pastilles de NaOH
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mortier (et un pilon) puis l'on a dissous dans de l'eau. On a ajusté le pH à une valeur comprise entre 0,5 et 1,0 avec HC1. On a ajouté lentement du citrate de sodium en ajoutant HC1 afin de maintenir le pH à une valeur inférieure à 1,0. Lorsque toute la matière a été dissoute, on a lentement neutralisé la solution avec des pastilles de NaOH. On a décanté la matière restant en solution à pH 7,2, on en a ajusté le pH à une va- leur de 8,5-9,0 puis l'on a effectué une extraction-avec un double volume d'une solution 50:50 d'éthanol-acétone. On a collecté la matière sur un entonnoir de Buchner en utilisant du papier filtre Whatman n[deg.] 42. En variante, on peut sécher la
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D. Mononickel-citrate disodique
On prépare un complexe de nickel stabilisant en utilisant les ingrédients suivants :
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<EMI ID=37.1>
et des paillettes de NaOH
On dissout l'acide citrique dans l'eau. On ajoute lentement le sel de nickel en suivant constamment le pH. Lorsque toute la matière est en solution, on ajoute des paillettes de NaOH lentement (pour réduire à son minimum le dégagement de chaleur) afin d'ajuster le pH à une valeur comprise entre' 4,0 et 5,0. On obtient environ 100 ml contenant environ 117 mg de Ni++ par millilitre.
B. Monomercure-citrate disodique
On prépare un complexe de mercure stabilisant en utilisant les ingrédients suivants :
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et des pastilles de NaOH
On dissout l'acide citrique dans l'eau et l'on réchauffe la solution jusqu'à une température non supérieure à
50 [deg.]C. On ajoute lentement HgO, en agitant vigoureusement, et on laisse réagir jusqu'à ce que la solution soit limpide. On ajuste avec des pastilles de NaOH le-pH à 8,5-9,0 en s'assurant que la température n'excède pas 50[deg.]C. On peut faire cristalliser la matière par l'une ou l'autre des méthodes décrites dans le cas du complexe de zinc en (C) ci-dessus.
DETERMINATION DE LA DISSOCIATION DU COMPLEXE DE METAL
On a déterminé sur un intervalle du pH compris entre 3 et 12 unités, en utilisant une électrode spécifique pour l'ion cuivre(Il) [(Orion Copper II) Spécifie Electrode]), la propriété de dissociation du complexe 1:1 de cuivre et de citrate préparé par les techniques ci-dessus. On a ajusté le pH d'échantillons de 50 ml de la solution 1:1 de citrate et de cuivre (0,0068 molaire) à des valeurs de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11 et 12, en déterminant par la suite, à l'aide de l'électrode spécifique pour l'ion cuivre, la concentration de l'ion cuivre libre. On a obtenu les valeurs suivantes pour la concentration de l'ion cuivre libre au pH indiqué, et l'on a déterminé les logarithmes négatifs de la concentration de l'ion cuivre.
TABLEAU
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A_partir de ces données, on a construit une courbe pM-pH pour indiquer la relation entre la concentration de l'ion
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Cette figure est un graphique en coordonnées cartésiennes (ligne noire pleine) du logarithme négatif (c'est-à-dire changé de signe) de la concentration de l'ion du métal (pM) en fonc- tion du logarithme négatif (c'est-à-dire changé de signe) de
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dans le tableau ci-dessus. Ce graphique est une courbe en forme de S (en forme sigmoïdale) représentant la propriété de dissociation (provoquée par des protons) du complexe du métal. Dans l'intervalle du pH compris entre environ 9 et 12, le com-
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basse. A un pH d'environ 7, le complexe est relativement instarble et la dissociation en Ou ++ libre est importante, ce qui permet le rôle de stabilisant. Dans l'intervalle compris en-
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libération réglée : il se produit environ 10 % à environ 0,1 % de dissociation de Cu du complexe. Ce comportement inattendu d'une dissociation en fonction du pH rend les complexes extrêmement efficaces comme agents .antimicrobiens ou de stabilisation pour des compositions pour le travail des métaux.
En comparaison, une courbe concernant le complexe de cuivre de EDTA est représentée à la figure annexée par la ligne brisée, selon les indications de A. Ringbom, "Complexation in Analytical Chemistry", J. Wiley & Sons, N.Y., 1963, page
360. Comme illustré, l'effet du pH sur le complexe de cuivre de EDTA est représenté par une courbe lisse et régulière atteignant un effet de limitation par dissociation provoquée par un proton à environ pH 7-9, ce qui ne donne, par exemple, qu'environ 0,001 % à 0,00001 % du produit ionisé.
L'existence dans des solutions diluées de complexes présentant le rapport de un métal pour un citrate a peut être été suggérée dans la publication de M. Bobtelsky et J. Jordan, J. Amer. Chem. Soc., volume 67 (1945), page 1824. Cependant, personne n'a cité.les remarquables activités antimicrobiennes ou de stabilisation d'une émulsion caractérisant ces dérivés
ni leurs capacités à former les structures de coordination avec des gouttelettes émulsifiées. En outre, la Demanderesse a également-découvert d'autres propriétés remarquables de ces complexes dans des fluides pour le travail des métaux, comme décrit ici en détail.
En outre, la Demanderesse a préparé des complexes de métaux solides du type des mono-cuivre(Il)-citrates dialcalins, et de telles formes solides sont de façon surprenante inattendues.La Demanderesse a pu également produire de fortes concentrations en solution de ces complexes de métaux. La nature de ces complexes a été nettement établie par l'utilisation de critères analytiques, à savoir : (1) la méthode du rapport entre
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A.L. Jones : Ind. Eng. Chem. Anal.- Edition, 16 ; 111, 1944) ;
(2) la méthode de variation continue attribuée à Job et modifiée par Vosburgh and Cooper (W.C. Vosburg et G.R. Cooper :
J. Am. Chem. Soc., 63; 437, 1941) ; (3) la dépendance de la formation du complexe à l'égard du pH ; et (4) la détermination de la constante de stabilité apparente du complexe. Des études de spectrophotométrie, comprenant la spectroscopie dans le spectre visible et dans l'ultraviolet, des déterminations de pH, ainsi que des mesures de spectroscopie dans l'infrarouge ont servi de moyens supplémentaires de confirmation des découvertes faites par la Demanderesse sur la formation et la composition moléculaire du complexe 1:1 de cuivre(II) et de citrate.
Les complexes 1:1 de cuivre que l'on utilise ici comme agents antimicrobiens ou .. agents stabilisants sont très fortement solubles, ce qui indique la nature ionique de ces complexes. Cela est encore confirmé par l'observation de la migration vers l'anode (électrode positive) de la bande colorée de solution du complexe dans des expériences d'électrophorèse. Les spectres dans le visible et dans l'ultraviolet montrent la formation d'un composé 1:1. La -Jaction globale de formation du complexe de la forme de structure (B) semble être :
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Ainsi, au lieu de complexer les groupes _COO seulement, le groupe hydroxyle -OH alcoolique s'ionise et il est
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cinq chaînons et probablement un noyau à six chaînons. Ainsi,
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tion se poursuit. Cela aboutit à la valeur très élevée de la <EMI ID=49.1>
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l'intervalle du pH d'environ 9 à 12. La valeur apparente de
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rieures à 7 environ, il y a une diminution supplémentaire indiquant que le complexe existe en des concentrations finies même à un pH de 3 à 7.
On pense qu'une autre caractéristique importante des complexes de la présente invention peut fonctionner en leur permettant de jouer le rôle de bactéricides très efficaces.
On peut prendre par exemple le cas où des bactéries se développent dans un milieu ayant un pH d'environ 9 à environ 11 par exemple et où l'on introduit un complexe de monocuivre(II)citrate dialcalin. Comme indiqué ci-dessus, un environnement
à pH alcalin rend le complexe de monocuivre(II)-citrate très stable. On suppose qu'en raison de sa fixation immédiate à la surface d'une cellule, on ne doit pas s'attendre à ce que l'ion cuivreux libre traverse du tout la membrane d'une cellule ou,
au mieux, il ne la-traversera pas aussi facilement que la forme complexe. Par ailleurs, le complexe traverse facilement la membrane: d'une cellule, peut être parce que (1) sa nature organique lui permettrait de servir de substrat métabolique dont dépendrait la croissance ou la prolifération des bactéries, ou
(2) la faible densité de charge dianonique du complexe en augmen-ferait la perméabilité pour la traversée de la paroi de la cellule microbienne. Après la traversée de la membrane de la cellule, on s'attend à ce que le complexe soit soumis à un environnement dont le pH est de l'ordre de 7 environ.. Donc, après cette traversée ou ce transport, le complexe particulier est très instable et labile ; l'ion cuivre est donc.abondamment et rapidement libéré pour la dénaturation des protéines cellulaires ou pour gêner autrement les réactions biochimiques du métabolisme intracellulaire de façon à provoquer la mort de la cellule.
Au contraire, lorsque d'autres complexes connus peuvent subir ce transport ou ce passage dans de telles circonstances, ces complexes connus sont assez stables et-cinétiquement inertes,et ils ne seront pas efficaces,car le cuivre est' trop étroitement lié, même au pH intracellulaire d'environ 7, pour qu'il soit excessivement toxique.
Les complexes de métaux de la présente invention ont des-propriétés antimicrobiennes très remarquables en comparaison des composés de l'art antérieur. Par exemple, la formation de sels de métaux.lourds d'acides carboxyliques est assez courante. Cependant, à l'exception des sels d'acides à faible masse moléculaire, ils sont habituellement insolubles dans l'eau. Cela est montré par le citrate dicuivrique(II) cité
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port de 2 atomes de cuivre pour un ion citrate) précipite de
la solution. Ce citrate dicuivrique a les propriétés suivantes :
(1) de l'insolubilité dans de l'eau (avec une charge nette
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la réaction est :
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du produit avec OH- en milieu basique ; (2) une couleur vert clair sous forme solide ; et (3) l'analyse élémentaire confirme le rapport de 2Cu pour un. citrate. L'insolubilité du..citrate dicuivrique a également limité l'efficacité de ce composé com-
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applications pharmaceutiques, son utilisation a été limitée.
ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
On a effectué les expériences suivantes pour illustrer l'efficacité biocide du monocuivre(II)-citrate disodique de la présente invention par rapport au citrate dicuivrique(Il) de l'art antérieur. On a utilisé les matières, l'appareil et les modes opératoires indiqués ci-après.
Matières
1. On a choisi pour l'essai trois organismes d'essai représentatifs :
a) Staphylococcus aureus, appelé "SA", n[deg.] ATCC 12600 b) Aerobacter aerogenes, appelé "AA", n[deg.] ATCC 13048 c) Pseudomonas aeruginosa, appelé "PA", n[deg.] ATCC 10145.
Le "n[deg.] ATCC" est le numéro de "the American Type Culture Collection".
2. Du bouillon "Trypticase soy" (Difco), préparé de la façon spécifiée par dissolution dans de l'eau chaude et traitement en autoclave, capable d'entretenir une croissance favorable des organismes d'essai.
3. Des étalons de trouble McLaglan pour l'estimation de la croissance bactérienne dans le bouillon.
4. Appareillage à filtre bactérien "Millipore" pour estimer la viabilité des bactéries et pour dénombrer les organismes viables.
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masse moléculaire 297 ; solide, préparé comme ci-dessus, appelé "MCC" .
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masse moléculaire 360 ; solide, préparé selon les spécifications du National Formulary ; appelé "DCC".
7. Un spectrophotomètre Coleman Jr. pour une déter- mination quantitative du trouble ; "DO" indique la densité op-
tique et "SO" signifie que l'instrument est sorti de son échel-
le par suite du trouble. ;
8. Des tubes de culture normaux, stériles, à capsule vissée.
vissée. 9. Un incubateur à bain d'air, 35 [deg.]C.
Méthode
On prépare trois tubes témoins contenant 5,0 ml de bouillon pour chaque organisme à essayer soit au total neuf tubes. A chaque groupe de trois tubes, on inocule, en provenance d'une culture de réserve, environ 106 organismes/ml. Le pH du milieu de culture est d'environ 7. En outre, on prépare deux témoins à blanc pour le spectrophotomètre. On ajoute MCC et DCC à un tube de chaque groupe pour obtenir un niveau de cuivre de 0,5 mg/ml. Schématiquement, le protocole d'essai est celui indiqué au tableau 1 suivant :
TABLEAU I
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Après un dénombrement immédiat et des essais de viabilité, on ferme de façon lâche tous les tubes qu'on fait incuber durant 48 heures à 35[deg.]C, après quoi on répète les essais. Les résultats obtenus sont présentés au tableau II.
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Les résultats des essais ci-dessus indiquent claire-
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les organismes d'essai. Il y a lieu de noter en particulier la diminution du nombre des organismes viables dans la phase "immédiate" 5 minutes environ après l'addition de MCC. Il est également évident que DCC présente peu, sinon pas, d'activité biocide, bien que l'on ait noté après 48 heures d'incubation un résultat marginal dans la lutte contre "Staphylococcus aureus".
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soluble dans les solutions aqueuses et, par conséquent, il se dissout facilement dans le bouillon. Au contraire, DCC est insoluble dans les milieux aqueux et forme une suspension trou-
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quent, avant d'effectuer des lectures de la densité optique
(DO), on laisse les tubes contenant DCC subir un dépôt de sédimentation jusqu'à obtention d'une lecture constante, ce qui indique que le trouble mesuré est dû en fait aux particules bactériennes. L'essai de trouble, s'il est assez précis du point de vue quantitatif, ne donne aucune indication sur la viabilité réelle des organismes. Donc, il est nécessaire d'utiliser une méthode d'essai biologique pour déterminer la viabilité aussi bien que pour confirmer les dénombrements réels des or-
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En plus de ce qui précède, l'activité antimicrobienne des monocuivre(II)-citrates dialcalins a été établie par leur action toxique et d'inhibition de la croissance s'exerçant contre les microbes suivants dans des milieux d'émulsion d'huile servant de milieu ou d'agent de refroidissement dans diverses opérations d'usinage, lorsque le pH des bains et liquides de refroidissement est de l'ordre d'environ 9 à environ
10. De telles compositions d'agents de refroidissement pour l'usinage industriel sont décrites dans le brevet des Etats-
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Engineers - Tool Engineer's Handbook" (Manuel de l'ingénieur d'outillage), première édition, 1953, aux pages 357 et suivantes; que l'on pourra consulter.
Aerobacter aerogenes
Aspergillus niger'
Bacteroides
Bacillus subtilis
Candida albicans
Citrobacter
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Enterobacter cloacae
Escherichia coli
Klebsiella-Aerobacter
Neisseria catarrhalis
Proteus Groupe Providence
Proteus mirabilis
Proteus morgani
Proteus rettgeri
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Salmonella species
Staphylococcus albus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus fecalis
Streptococcus viridano
On a établi l'efficacité ci-dessus de l'activité antimicrobienne dans des liquides de refroidissement industriel dans lesquels on a trouvé que les microbes énumérés prolifèrent. Il est important de noter que même aux valeurs élevées du pH qui sont nécessaires pour que le liquide de refroidissement joue bien son rôle, les monocuivre(II)-citrates dialcalins ont été remarquablement efficaces.
En se référant à la figure unique annexée, montrant la courbe de dissociation, on comprendra en outre qu'il y a environ cent fois plus de cuivre libre disponible à un pH de 8,5 par rapport à ce qui est disponible à un pH de 9,5. De même, lorsque le pH diminue au-dessous de 8,5, des quantités encore nettement plus grandes de l'ion cuivre toxique sont libérées. De tels essais montrent la possibilité d'application des agents antimicrobiens de la présente invention. De plus, on a suivi sur des périodes de plusieurs mois les bains de refroidissement industriel et il a été établi que l'agent antimicrobien de la présente invention est efficace sur un nombre considérable de semaines sans diminution de son activité attribuàble à la libération réglée de l'ion cuivre à la demande dans les bains de refroidissement.
Comme mentionné ci-dessus, les complexes du métal peuvent servir en solution aqueuse ou sous forme solide. On peut obtenir les activités antimicrobiennes grâce à l'addition d'une quantité efficace de l'une ou l'autre forint . En outre, il n'est pas nécessaire d'enlever des complexes ainsi préparés d'autres sels constituant des sous-produits pour obtenir l'activité voulue. Cependant, on peut de façon surprenante enlever l'eau et le sel constituant des sous-produits, comme décrit ci-dessus, pour former des solides complexes de concentrés.
Cela permet d'atteindre plusieurs buts et par exemple d'enlever une impureté pouvant nuire à l'utilisation du complexe dans les applications pratiques en donnant naissance à des concentrations excessives de sels ou à des problèmes de corrosion, et cela permet de préparer des solutions plus fortement concentrées de l'ingrédient actif permettant de diminuer le volume des produits à conserver en magasinage, ce qui constitue un net avantage pour les applications industrielles en diminuant les frais d'expédition et de magasinage. De même, pour d'autres utilisations du type antiseptique, germicide, bactéricide, sporicide, destruction des virus ou divers types de désinfection, il peut être souhaitable de disposer d'une préparation du complexe aussi pure que possible.
Il va de soi que l'invention n'a été décrite qu'à titre illustratif, mais non limitatif, et qu'elle est susceptible de recevoir diverses variantes entrant dans son cadre
et dans son esprit.