<EMI ID=1.1>
mede werkwijze ter bereiding van dergeli jke enzymen en de met deze werkwijze verkregen enzympreparaten.
De uitvinding heeft betrekking op de omzetting van
<EMI ID=2.1>
len met geïnduceerde methylotrofe microorganismen of daarvan afgeleide enzympreparaten.
Methaan is een van de goedkoopste koolstofbronnen
<EMI ID=3.1>
echter deze goede groei-eigenschappen gemeen. Het is tevens bekend dat methaan-gegroeide microorganismen gebruikt kunnen worden voor het omzetten van methaan in methanol onder aerobe omstandigheden.
Deze methaan-verbruikende microörganismen staan in het algemeen bekend als "methylotrofen". Het classificatiesysteem voor methylotrofen voorgesteld door R. Whittenbury et al. (J. of Gen.
<EMI ID=4.1>
vaard. In dit systeem worden de morfologische eigenschappen van methaaioxyderende bacteriën verdeeld in vijf groepen: Methylosinus, Methylocyctis, Methylomonas, Methylobacter en Methylococcus .
Onlangs hebben Patt, Cole en Hanson (International J.
<EMI ID=5.1>
otrofe bacteriën bacteriën zijn die niet-autotrofisch. kunnen groeien onder gebruik van koolstofverbindingen die een of meer koolstofatomen maar geen koolstof-koolstofbindingen bevatten. Patt et al. hebben voorgesteld methylotrofen als "obligaat" te beschouwen indien zij alleen in staat zi jn koolstofverbindingen die geen koolstof-koolstof-bindingen bevatten, (b.v. methaan, methanol, dimethylether, methylaminen enz.) als de enige koolstof- en energiebron te gebruiken terwijl daarentegen "facultatieve" methylotrofen organismen zijn die beide ver-
<EMI ID=6.1>
met koolstof-koolstofbindingen, als koolstof- en energiebron kunnen
<EMI ID=7.1>
rend bacterie, die is geidentificeerd als Kethylobacterium organophilum sp. nov (ATCC 27,886). Deze bacterie verschilt blijkbaar van alle eerder beschreven genera en species van methaan-oxyderende bacteriën vanwege zijn capaciteit een verscheidenheid van organische substraten met koolstof-koolstofbindingen als koolstof- en energiebron te benutten.
Het is nu algemeen aanvaard, dat er twee typen methyl-
<EMI ID=8.1>
tende substraten te groeien. Een type wordt aangeduid als methaanverbruiker en het andere als methanolverbruiker. De methanolverbruikers zijn niet in staat te groeien in aanwezigheid van methaan als enige koolstof- en energiebron, maar zij groeien in aanwezigheid van methanol, methylamine enz. De methaanverbruikers zijn in staat op
<EMI ID=9.1>
thanol, dimethylether enz. te groeien. Binnen de groep van methaanverbruikende methylotrofen en methanolverbruikende methylotrofen
<EMI ID=10.1>
zullen niet alleen groeien op de bovengenoemde C1-type verbindingen maar zullen tevens op andere organische verbindingen, zoals glucose. De obligate methanolverbruikende typen methylotrofe microorganismen
<EMI ID=11.1>
niet op methaan of organische verbindingen, zoals glucose. De facultatieve methanolverbruikende typen methylotrofe microorganismen zullen groeien op de C.-type verbindingen als boven vermeld (maar niet op methaan) en verschillende andere organische verbindingen, zoals glucose.
Leadbetter en Foster (Arch.. Microbiology, 30, 81-
<EMI ID=12.1>
tot de overeenkomstige alcoholen, ketonen en carbonzuren wanneer deze gelijktijdig aanwezig zijn in een kweek die methaan als groeisubstraat bevat. Leadbetter et al. vermelden op blz. 103: "propaan of n-butaan werden niet door gewassen cellen geoxydeerd. Zi j werden echter indien gelijktijdig aanwezig in een kweek met methaan als groeisubstraat geoxydeerd". Op blz. 102 speculeert Leadbetter et al. dat de secundaire alcohol een tussenprodukt in de omzetting van pro-
<EMI ID=13.1>
substraat dienende koolwaterstoffen, indien aanwezig,. als co-substraat in een medium, waarin een of meer verschillende koolwaterstoffen voor de groei worden geleverd, worden geoxydeerd. Als boven beschreven gebruikten Leadbetter et al. deze techniek waarbij Pseudo-
<EMI ID=14.1>
butaan n-butanol, n-boterzuur en 2-butanon.
Verschillende andere artikelen hebben verwezen naar het artikel van Leadbetter et al. wat betreft de produktie van ketonen uit alkanen bij verschillende pogingen het mechanisme van deze omzetting te begrijpen (d.w.z. of te omzetting via een secundair
<EMI ID=15.1>
Door deze auteurs is geen werkwijze beschreven vaarin "rustende" microbiële cellen of de daarvan afgeleide enzym-
<EMI ID=16.1>
alkanen of C3-C6-secundaire alcoholen zullen omzetten in de overeenkomstige methylketonen. Zoals bekend zijn "rustende" microbiële cel-len te onderscheiden van groeiende microbiéle cellen doordat de eerste niet in een groeimedium worden gehandhaafd, d.v.z. een koolstof- en stikstof-bron bevattend, terwijl daarentegen de laatste
in een groeimedium worden gehandhaafd waarin zij actief kunnen groeien en zich vermenigvuldigen.
<EMI ID=17.1>
Methylobacteria") hebben vermeld dat aceton werd waargenomen gedurende het metabolisme van ethaan en produkten van ethaanoxydatie
<EMI ID=18.1>
Hutchinson, Whittenbury en Dalton (J. Theor. Biol.,
<EMI ID=19.1>
Methane Mono-Oxygenase Fr om Methylococcus capsulatus Strain Bath") vermeldden dat etheen wordt geoxydeerd door het oplosbare methaan mono-oxygenase uit Methylococcus capsulatus stam Bath. De laatste onderzoekers vermeldden dat de "fijnverdeelde membraanpreparaten" uit Methylococcus capsulatus stam Bath geen methaan-oxygenase-activi-
<EMI ID=20.1>
Carniglia, Blevins en Perry (Applied and Environmental Microbiology, 32 (6) 764 - 768 (1976) "Microbial Oxidation and Assimilation of Propylene") beschreven de oxydatie van propeen
<EMI ID=21.1>
Oxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath) "Its Ability to Oxygenate n-Alkanes, n-Alkenes, Ethers, and Alicyclic Aromatic and Heterocyclic Compounds") vermeld dat de oplosbare fractie van Methylococcus capsulatus stam Bath een niet zeer specifiek oxygenase is omdat het alkanen tot alcoholen, alkenen tot 1,2-epoxyden, dimethylether tot ethanol en ethanal, styreen tot styreenepoxyde en pyridine tot pyri-dine-N-oxyde oxydeert.
<EMI ID=22.1>
Oxygen in Bacterial Cells Utilizing Hydrocarbons For Growth") dat in de beginoxydatieve aantasting van methaan een oxygenase is betrokken. Higgins en Quayle (J. Biochem., 118: 201 - 208 (1970) "Oxygenation of Methane by Methane-Grown Pseudcmonas methanic a en
<EMI ID=23.1>
Cell-Free Extract s of Methylococcus capsulatus or Methylomonas methanica Ferenci (FEBS Lett. 41: 94 - 98 (1974) "Carbon Monoxide-Stimulated Respiration in Methane-Utilizing Bacteria") suggereerden dat
het enzym dat voor deze oxygenering verantwoordelijk is een monooxygenase is. Deze auteurs steunden op indirecte enzymanalyses, waar-
<EMI ID=24.1>
van Methylosimis trichosporum AB3b (Tonge, Harrison en Higgins, J.
<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
299 (197.5) "Properties and Partial Purification of the Methane-
<EMI ID=27.1>
MethyJ.ococcus capsulatus (Bath) Into Three Components" en Colby, <EMI ID=28.1>
Methane Mono-Oxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath), "lts Ability to Oxygenate n-Alkanes, n-Alkenes, Ethers and Alicyclic Aromatic
<EMI ID=29.1>
De microbiële vorming van methylketonen in warmbloedigen,- bacteriën en schimmels is bekend. Het keton wordt echter gevormd door decarboxylatie van een 6-ketozuur en het heeft derhalve
<EMI ID=30.1>
stelt een unieke a-oxydatie voor, zonder verandering in de koolstofketen. In het laatste artikel wordt echter gesteld, dat de ketonvorming ontstond door co-oxydatie in aanwezigheid van het groeisubstraat en werd aangegeven dat geen activiteit werd aangetroffen voor de rustende cellen.
<EMI ID=31.1>
aceetaldehyde, maar hebben geen activiteit voor methanol. De alcoholdehydrogenases uit gist en lever oxyderen tevens ook enige secundaire alcoholen bij zeer lage opbrengst (kleiner dan 1% van hun ethanol-
<EMI ID=32.1>
aangetoond in Pseudomonas, E. coli en Leuconostoc. Deze enzymen varen echter alleen actief ten opzichte van primaire alcoholen of hy-
<EMI ID=33.1>
396 (1970)) als eersten de assimilatie van methanol door een gist hebben vermeld, zijn vele methanol-verbruikende stammen uit natuur-lijke bronnen geïsoleerd of aangetroffen in voorraadcultuurcollecties. Het interesse in het kweken van micro-organismen op goedkope en overvloedig beschikbare verbindingen zoals methanol, is sterk toe-
<EMI ID=34.1>
len besproken. Er is aangetoond dat oxydatie van methanol en andere primaire alcoholen in gisten gekatalyseerd wordt door een alcoholoxydase. Alcoholoxydase bevatte flavine adenine dinucleotide (FAD) als een prosthetische groep. Secundaire alcoholen werden door dit alcoholoxydase niet geoxydeerd.
<EMI ID=35.1>
niet-voedingsmiddelmedium dat rustende microbiële cellen bevat afgeleid van obligate of facultatieve methylotrofe micro-organismen of uit deze cellen afgeleide enzymprepaxaten in aanraking te brengen,
<EMI ID=36.1>
een mineraal voedingsmiddelmedium zijn gekweekt dat een oxygenase en/of dehydrogenase-enzym-inductor als de groei- en energiebron bevatte. Voorbeelden van dergelijke inductors omvatten methaan (in het geval van methaan-verbruikende methylotrofe micro-organismen), me-
<EMI ID=37.1>
ethanol, propanol, butanol, enz.
De microbiële cellen of de enzympreparaten afgeleid
<EMI ID=38.1>
secundaire alcoholen in de overeenkomstige ketonen kunnen worden afgeleid van hetzij de obligate of f acultatieve methaan- of methanolverbruikende typen methylotrofe micro-organismen.
Er is tevens gevonden dat methylotrofe giststam-men aëroob kunnen werden gegroeid op een veelvoud van methylradi-
<EMI ID=39.1>
methylamine, methylformiaat, methylcarbonaat, dimethylether enz., ter vorming van microbiële cellen of daarvan afgeleide enzympreparaten, die in staat zijn C3-C6 lineaire secundaire alcoholen aeroob om te zetten in de overeenkomstige methylketonen.
Verder is een nicotinamide adenine dinucleotide
(NAD )-afhankelijk secundair alcoholdehydrogenase in celvrije extracten van verschillende koolwaterstof-verbruikende microben, met inbegrip van b acterién en gisten, gevonden. Dit enzym is tevens aangetroffen in cellen gegroeid op methanol. Dit oxydeert specifiek
<EMI ID=40.1>
methylketonen. Dit enzym is 2600-voudig gezuiverd en toont een enkele protelneband bij acrylamide gelelektroforese. Het heeft een mole-
<EMI ID=41.1>
uit twee subeenheden van 48.000 dalton en twee zinkatomen per molecuul enzym. Het oxydeert secundaire alcoholen, in het bijzonder 2propanol en 2-butanol. Primaire alcoholen worden door SADH niet geoxydeerd.
Als boven beschreven zijn de obligate methaan-verbruikende methylotrofe micro-organismen in staat te groeien op methaan, methanol en een veelvoud van methylradicalen afgevende verbindingeh, b.v. dimethylether, methylformiaat, methylcarbonaat enz. De facultatieve methaan-verbruikende methylotrofe micro-organismen groeien niet alleen op methaan, methanol en de verschillende methylradicaal afgevende verbindingen als boven vermeld, maar zij zijn tevens in staat te groeien op verschillende andere organische verbindingen, zoals glucose.
De obligate methanol-verbruikende methylotrofe microorganismen zijn niet in staat te groeien op methaan, maar zij zijn in staat te groeien op methanol en andere methylradicalen afgevende type verbindingen, zoals methylamine, methylformiaat, methylcarbonaat enz. De facultatieve methanol-verbruikende methylotrofe micro-organismen, zoals de obligate methanol-verbruikende methylotrofe microorganismen zijn niet in staat op methaan te groeien, maar zij zijn wel in staat op methanol, de bovenvermelde methyl-bevattende en an-
<EMI ID=42.1>
groeien. Voor de doeleinden van de uitvinding worden echter de obligate of facultatieve metnanol-verbruikende micro-organismen gegroeid op het alcoholdehydrogenase-inducerende substraat, d.w.z. methanol, ethanol, p'ropanol, butanol, methylamine en methylformiaat enz.
De uitdrukking "micro-organisme" wordt hierin toegepast in zijn breedste betekenis en omvat niet alleen bacteriën
<EMI ID=43.1>
de meeste voorkeur bacteriën die in staat zijn methaan en methylradicaal afgevende koolstofhoudende verbindingen te oxyderen.
De uitdrukking "enzympreparaat" heeft betrekking op elke stof die de gewenste oxygenase- of dehydrogenase enzymatische activiteit vertoont. De uitdrukking heeft b.v. betrekking op levende hele cellen, gedroogde cellen, celextracten en geraffineerde en geconcentreerde preparaten afgeleid uit deze cellen, in het bijzonder
<EMI ID=44.1>
metaalbehoefte daarvan. Enzympreparaten kunnen hetzij in droge of vloeibare vorm zijn. De uitdrukking omvat tevens de onbeweeglijk ge-
<EMI ID=45.1>
methyl-radicaal-gegroeide micro-organismen of enzymextracten onbeweeglijk gemaakt of gebonden aan een onoplosbare matrix door covalente chemische bindingen, absorptie of ingangen van het enzym binnen een gel-rooster met poriën die groot genoeg zijn om de moleculen van het substraat en van het produkt vrij te laten passeren, maar klein genoeg om het enzym vast te houden. De uitdrukking "enzympreparaat" omvat tevens enzymen die vastgehouden zijn b innen holle vezelmembranen zoals b.v. beschreven door Rony, Biotechnology and Bioengineering
(1971).
De uitdrukking "fijnverdeelde fractie" heeft betrekking op de enzymactiviteit in het neergeslagen of gesedimenteerde materiaal wanneer de bovenvloeistoflaag na het centrifugeren van gebroken cellen met 10.000 g gedurende 30 minuten gedurende 1 uur
<EMI ID=46.1>
Het klassificatiesysteem van metaanoxyderende bacteriën voorgesteld door R. Whittenbury, K.C. Phillips en J.F. Wilkinson
<EMI ID=47.1>
is het momenteel meest toegepaste systeem. In dit klassificatiesysteem gebaseerd op morfologische eigenschappen worden de methaanverbruikende bacteriën in vijf groepen verdeeld. Deze zijn Methylosi-
<EMI ID=48.1>
Bacteriën van deze vijf groepen als vermeld door Whittenbury et al., verbruiken methaan, dimetbylether en methanol voor hun groei-energie en zij zijn alle vermeld als strikt aeroob en gram-negatief.
<EMI ID=49.1>
omstandigheden in aanraking te brengen met rustende microbiële cellen afgeleid van obligate of facultatieve methylotrofe micro-organismen of uit deze cellen afgeleide enzympreparaten, waarbij de microorganismen van te voren zijn gegroeid onder aerobe omstandigheden
<EMI ID=50.1>
Als andere specifieke uitvoeringsvorm van de uitvinding is gevonden, dat C3-C6 methylketonen kunnen worden geproduceerd door de overeenkomstige C3-C6 secundaire alcoholen onder aerobe omstandigheden met microbiële cellen (bij voorkeur rustende micro-
<EMI ID=51.1>
<EMI ID=52.1>
raking te brengen, waarbij de micro-organismen van te voren zijn
<EMI ID=53.1>
dingsmiddelmedium.
Er is onverwacht gevonden, dat de microbiële cellen of de enzympreparaten daarvan, waarin de cellen van te voren
zijn gekweekt op methanol als de hoofdkoolstof- en energiebron, in staat zijn C3-C6 secundaire alcoholen om te zetten in- de overeenkomstige methylketonen, maar dat zij niet in staat zijn de C--Cg alka-
<EMI ID=54.1>
gegroeide microbiële cellen of de enzympreparaten daarvan zijn in staat zowel C3-C6 alkanen als C3-C6 secundaire alcoholen in de over-
<EMI ID=55.1>
<EMI ID=56.1>
C3-C6 alkanen zijn bij voorkeur lineaire n-alkanen, b.v. propaan, n-butaan, n-pentaan en n-hexaan, met de meeste voorkeur propaan of
<EMI ID=57.1>
butanol .
Een andere bijzondere uitvoeringsvorm van de uit-
<EMI ID=58.1>
gezuiverde vorm of onbeweeglijk gemaakte vorm) in combinatie met nicotinamide adenine dinucleotide (NAD ).
De uitvinding omvat verder de volgende bijzonderheden: <EMI ID=59.1> komstige methylketonen. De produktmethylketonen hopen zich extracellulair op. Onder de secundaire alcoholen werd 2-butanol het snelst geoxydeerd.
- Succinaat-gegroeide cellen van de nieuwe facultatieve geisoleer- <EMI ID=60.1>
om.
- Er werd enige enzymatische ontleding van 2-butanon waargenomen. Het produkt 2-butanon remde de omzetting van 2-butanol in het overeenkomstige 2-butanon niet. De snelheid van de 2-butanonproduktie <EMI ID=61.1>
kweken .
- Een gistkweek had de hoogste produktiesnelheid en had een hoger <EMI ID=62.1>
ratuur van ongeveer 35[deg.]C).
- Metaalchelaatvormende middelen remmen de produktie van 2-butanon hetgeen suggereert dat hierbij een metaal (of metalen) is (zijn) betrokken.
- Secundaire alcohol-dehydrogenase-activiteit werd aangetroffen in het celvrije oplosbare extract van de sonisch gebroken cellen van de C.-gegroeide geïsoleerde kweken. Het celvrije. systeem vereist <EMI ID=63.1>
nieuwe secundaire alcohol-dehydrogenase oxydeert specifiek en stoechiometrisch C3-C6 secundaire alcoholen tot hun overeenkomstige methylketonen. Het enzym is 2.600-voudig gezuiverd en toont een enkele protelneband bij acrylamide gelelektroforese. Het heeft een molecuulgewicht van 95.000 dalton. Het bacteriële SADH bestaat uit twee subeenheden van 38.000 dalton en twee zinkatomen per molecuul enzymprotelne. Primaire alcoholen worden door het SADH niet in
<EMI ID=64.1>
en 30 - 35[deg.]C. De berekende activeringsenergie is 19,8 Kcal. Acrylamide gelelektroforese van de gezuiverde SADH-fractie gekleurd met coomassie briljant blauw en activiteitskleurpigment, alsmede de ruwe oplosbare celvrije extracten van'onderscheiden typen methanol-
<EMI ID=65.1>
ring van het gezuiverde SADH vertoonden een enkele proteineband.
De mobiliteiten bij de gelelektroforese van SADH uit de onderscheiden typen methanol-gegroeide bacteriële cellen waren identiek. Gist SADH had een snellere mobiliteit naar de anode bij de gelelektroforese. De toevoeging van substraten in de SADH-reactie vereist geen voorgeschreven volgorde. De SADH-activiteit wordt geremd door metaalchelaatvormende middelen, door sterke thio-reactanten en door het produkt 2-butanon.
- Celsuspensies van gisten gegroeid op methylradicaal afgevende verbindingen (b.v. methanol, methylamine, methylformiaat enz.) katalyseren de omzetting van secundaire alcoholen in de overeenkomstige methylketonen.
- Celsuspensies van gisten van de uitvinding gegroeid op methylr adicaal afgevende verbindingen (b.v. methanol, methylamine, methyl-formiaat enz.) katalyseren de omzetting van secundaire alcoholen in de overeenkomstige methylketonen.
- Celvrije extracten afgeleid van methyl-radicaal (b.v. methanol) - <EMI ID=66.1>
is homogeen zoals beoordeeld door polyacrylamide gelelektroforese.
<EMI ID=67.1>
zuiverde enzym niet geoxydeerd. De optimale pH voor de omzetting van secundaire alcoholen door het gezuiverde gist-afgeleide enzym is 8. Het molecuulgewicht van het gezuiverde gist-afgeleide SADE bepaald door gelfiltratie is 98.000 + 3.000 en de subeenheidsaf-
<EMI ID=68.1> <EMI ID=69.1>
verbindingen zullen de C3-C6 n-alkanen oxyderen tot de overeenkomstige secundaire alcoholen.
<EMI ID=70.1> celvrije fijnverdeelde fracties, afgeleid van de methylotrofe organismen van de uitvinding. De reactie vereist zuurstof en gereduceerde nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) als elektrondonor.
De omzetting van de n-alkanen in de secundaire alcoholen wordt geremd door thio-bevattende verbindingen en metaalbindende middelen zoals a.a-bipyridyl,. thiosemicarbazide, thioureum, 1,10-fenan-
<EMI ID=71.1>
secundaire alcoholen wordt geremd in aanwezigheid van propyleen.
Dit suggereert dat de propeen en n-alkanen (b.v. propaan) concurreren voor hetzelfde enzymsysteem. Ascorbaat en gereduceerde nicotinamide adenine dinucleotidefosfaat (NADPH) konden tevens als elektrondonor worden gebruikt in plaats van NADE voor het hydroxyleren van n-alkanen tot de overeenkomstige secundaire alcoholen.
Een voorkeursgroep van methaan-verbruikende methylo-
<EMI ID=72.1>
Methylococcus en Methylobacterium.
Een voorkeursgroep van methanol-verbruikende methylotrofe micro-organismen omvatten die micro-organismen afgeleid
<EMI ID=73.1>
bacteriën voorgesteld door R. Whittenbury, K.C. Phillips en J.F.
<EMI ID=74.1>
In dit klassificatiesysteem worden de methaan-verbruikende bacteriën op basis van de morfologische eigenschappen in vijf groepen verdeeld.
<EMI ID=75.1>
dat zij strikt aeroob en gram-negatief zijn. Zij worden tevens gekenmerkt doordat zij niet-endospoorvormend zijn, d.w.z. de capaciteit cysten en exosporen te vormen met een complexe fijnstructuur
en een complexe inwendige structuur.
De methylotrofe micro-organismen vermeld door Whittenbury et al., worden in de werkwijze van de uitvinding toegepast.
<EMI ID=76.1>
Methylomonas methanica, Methylomonas albus, Methylomonas streptobac- <EMI ID=77.1>
rosaceus, Methylobacter chrooccum, Methylobacter bovis, Methylobacter capsulatus, Methylobacter vinelandii, Methylococcus capsulatus
(met inbegrip van Methylococcus capsulatus stam Bath vermeld door
<EMI ID=78.1>
coccus capsulatus stam Texas, vermeld door D.W. Ribbons, J. Bacteriol.
122, 1351 - 1363 (1975)), en Methylococeus minimus. Deze methylotrofe
<EMI ID=79.1>
cellen, enzymextracten daarvan of onbeweeglijk gemaakte preparaten van die gehele cellen of enzymextracten, zoals door toepassing van DEAE-cellulose of ionenuitvisselharsen of poreuze alumina-dragers. In die gevallen dat het oxydatieve enzymsysteem zich ophoopt of
<EMI ID=80.1>
de voorkeur het enzym in zijn celgebonden vorm te gebruiken.
Subcultures van sommige methylotrofe micro-organis-
<EMI ID=81.1>
depot van subcultures van elk daarvan, die de individuele NRRL-stam aanduidingen als hierna aangegeven, hebben verkregen. Deze subcultures zijn gedeponeerd volgens de procedures van het Department of Agriculture zonder enige beperking zodat nageslacht van deze stammen voor het publiek beschikbaar is.. Stammen van gedeponeerde methylotrofe micro-organismen zijn de volgende:
<EMI ID=82.1>
Nageslacht van deze stammen is voor iedereen die deze opvraagt zonder beperking beschikbaar. Subcultures van de voor-noemde stammen werden oorspronkelijk. verkregen van R. Whittenbury, Department of Biological Science, University of Warwick, Warwickshire, Coventry, Engeland.
De morfologische en taxonome eigenschappen van de voornoemde methylotrofe stammen zijn als volgt:
<EMI ID=83.1>
Produceert witte kolonies op zoutagarplaten in aanwezigheid van methaan of methanol. De organismen zijn beweeglijk, staafvormig, gram-negatief en aëroob. Er worden veelvuldig rosetten gevormd. Het heeft een type II membraanstructuur.
<EMI ID=84.1>
Produceert witte kolonies op zoutagarplaten in aanwezigheid van methaan of methanol. De organismen zijn beweeglijk, staafvormig, gram-negatief en aeroob. Er worden veelvuldig rosetten gevormd. De organismen vormen exosporen die warmtebestendig zijn;
<EMI ID=85.1>
namen een vibriovorm aan. Organische verbindingen anders dan methaan en methanol onderhouden de groei niet. Heeft type II-membraanstructuur.
<EMI ID=86.1>
Produceert slijmachtig witte kolonies op zoutagarplaten in aanwezigheid van methaan of methanol. De organismen zijn niet-beweeglijk, hebben de vorm van coccenbacillen, zijn gram-negatief en aeroob. De organismen vormen cysten die tegen uitdroging bestendig maar niet tegen verhitting bestendig zijn. Groei ten koste
<EMI ID=87.1>
methanol onderhouden de groei niet. Het heeft een type II membreanstructuur.
<EMI ID=88.1>
Produceert rose kolonies op zoutagarplaten in aanwezigheid van methaan of methanol. De organismen zijn beweeglijk, staafvormig, gram-negatief en aeroob. Produceert slijmachtige capsules. Zij groeien ten koste van methaan en methanol. Organische verbindingen anders dan methaan en methanol onderhouden de groei niet. Heeft een type I membraan-structuur.
<EMI ID=89.1>
Produceert witte kqlonies op zoutagarplaten in aanwezigheid van methaan of methanol. De organismen zijn beweeglijk, staafvormig, gram-negatief en aëroob. Produceert slijmachtige capsule. Groeit ten koste van methaan en methanol. Organische verbindingen
<EMI ID=90.1>
Produceert witte tot bruine kolonies op zoutagarplaten in aanwezigheid van methaan of methanol. De organismen, zijn beweeglijk, staafvormig, gram-negatief,en aeroob. Produceert een slijmachtige capsule. Groeit ten koste van methaan en methanol. Organische verbindingen anders dan methaan en methanol onderhouden de groei niet . Heeft een type I membraanstructuur.
Onlangs hebben Patt, Cole en Hanson (International
<EMI ID=91.1>
trofe bacteriën die bacteriën zijn, die niet-autotrofisch kunnen
<EMI ID=92.1>
stcfatomen, maar geen koolstof-koolstofbindingen bevatten. Patt et al. hebben voorgesteld dat methylotrofen beschouwd moeten worden als obligaat indien zij in staat zijn alleen koolstofverbindingen die geen koolstof-koolstofbindingen bevatten (b.v. methaan, methanol, dimethylether, methylamine enz.) als de enige bron van koolstofenergie
te benutten, terwijl daarentegen facultatieve methylotrofen die organismen zijn die verbindingen die geen koolstof-koolstofbindingen en complexe verbindingen die koolstof-koolstofbindingen bevatten kunnen gebruiken als de enige koolstof en energie-bron. In hun artikel hebben Patt et al. al een methaan-oxyderende bacterie vermeld, die zij
<EMI ID=93.1>
27.886). Deze bacterie verschilt klaarblijkelijk van alle eerder beschreven genera en speciës van methaan-verbruikende bacteriën vanwege zijn capaciteit een verscheidenheid van organische substraten met koolstof-koolstofbindingen als koolstof- en energie-bron te benutten.
In een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding is <EMI ID=94.1>
nov. ATCC 27.886) en andere methaan- of methanol-gegroeide faculta-
<EMI ID=95.1>
en C3-C6 secundaire alcoholen te oxyderen. Zij bezitten met andere woorden oxydatieve (en alcoholdehydrogenase) enzymactiviteit indien gekweekt in aanwezigheid van methaan of methanol (in het geval van de alcoholdehydrogenering) . Als boven besproken met betrekking tot de Whittenbury et al. methaan-verbruikende methylotrofe micro-organismen kunnen de facultatieve methylotrofen in de vorm van hun oplosbare
<EMI ID=96.1>
gebracht of worden toegepast in celgebonden vorm bij toepassing in de werkwijze van de uitvinding.
Andere bekende methaan-verbruikende methylotrofe stammen kunnen in de werkwijze van de uitvinding worden toegepast,
<EMI ID=97.1>
rikaanse octrooischrift 3.930.9�7, vrij beschikbaar van het Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
<EMI ID=98.1>
met NCIB toegangsno. 11083 alsmede Methylomonas SM3 met NCIB toegangsno. 11084 (dat beschreven is in de Nederlandse oetrooiaanvrage
<EMI ID=99.1>
Er zijn reeds verschillende obligate en facultatieve methanol-verbruikende methylotrofe micro-organismen beschreven (d.w.z. die methylotrofen die niet op methaan kunnen groeien). Microbiële cellen, afgeleid van deze eerder beschreven micro-organismen en enzympreparaten daarvan, waarin de micro-organismen zijn gegroeid op methanol, zijn in staat C3-C6 secundaire alcoholen in de overeenkomstige methylketonen om te zetten. Specifieke methanolverbruikende methylotrofe micro-organismen als eerder beschreven die bruikbaar zijn voor de uitvoering van de uitvinding, worden hieronder aangegeven.
Obligate methanol-verbruikende methylotrofe micro-organismen:
Methanomonas methylovora, ATCC 21,852 (k. Kouno et
<EMI ID=100.1>
gram-negatief, beweeglijk, niet sporenvormend. De organismen groeien alleen op methanol en methylamine. Methaan onderhoudt de groei niet.
Pseudomonas sp., ATCC 21,439. De organismen zijn vit, gram-negatief en beweeglijk. Zij groeien op methanol en methylamine maar niet op methaan.
<EMI ID=101.1>
916 (1972)). D e organismen zijn gram-negatief, beweeglijk, niet-sporenvormend. De organismen groeien alleen op methanol en methylamine. Methaan onderhoudt de groei niet.
<EMI ID=102.1>
132, 101 (1973)). De organismen zijn gram-negatief. De organismen groeien alleen op methanol en methylamine. Methaan onderhoudt de groei niet.
<EMI ID=103.1>
132, 101 (1973)). De organismen zijn gram-negatief en beweeglijk. De organismen groeien alleen op methylamine. Methaan, methanol en andere organische verbindingen onderhouden de groei niet.
<EMI ID=104.1>
Soc. for Ferment. Tech., p. 72 (1973)). De organismen zijn kleurloze, steelvormige bacteriën die groeien door knopvorming aan de einden van de hyfen. De organismen groeien op methanol en methylamine. Methaan onderhoudt de groei niet.
Achrcmobacter sp. (S. Kubasawa et al., Proc. Japan
<EMI ID=105.1>
negatief, niet sporenvormend en beweeglijk. De organismen groeien alleen op methanol. Methaan onderhoudt de groei niet.
<EMI ID=106.1>
rose, gram-negatief en beweeglijk. Zij groeien op methanol, methylamine en andere organische verbindingen, maar niet op methaan.
<EMI ID=107.1>
niet-sporenvormend. De organismen groeien op methanol, methylamine, <EMI ID=108.1>
biol. 62, 289 (1968)). De organismen zijn kleurloze, steelvormige
<EMI ID=109.1>
De organismen groeien op methanol, methylamine, methylformiaat en andere organische verbindingen, maar niet op methaan.
Protaminobacter ruber (Stocks en McCleskey, J.
<EMI ID=110.1>
beweeglijk, de organismen groeien op methanol, methylamine, methylformiaat en organische verbindingen maar niet op methaan.
<EMI ID=111.1>
(1913". De organismen zijn rood, beweeglijk, gram-negatief. De organismen groeien op methanol, methylformiaat en andere organische verbindingen, maar niet op methaan.
<EMI ID=112.1>
Gen. Microbiol. �, 313 (1976)). De organismen zijn gram-negatief. De organismen groeien anaëroob in aanwezigheid van licht op methanol en andere organische verbindingen, maar niet op methaan.
<EMI ID=113.1>
Biochem. J., 116, 357 (1970)). De organismen zijn gram-negatief, beweeglijk en niet-sporenvormend. De organismen groeien op methanol, methylamine en andere organische verbindingen, maar niet óp methaan.
Achromobacter rufeseens (T. Akiba et al., J. Fermen-
<EMI ID=114.1>
beweeglijk. De organismen groeien op methanol en andere organische verbindingen, maar niet op methaan.
<EMI ID=115.1>
48-77083 van Fukimbara et al. (1973)]. De organismen zijn gram-negatief en niet-sporenvormend. De organismen groeien op methanol en andere organische verbindingen, maar niet op methaan.
<EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
lijk en niet-sporenvormend. De organismen groeien op methanol, methylamine, methylformiaat en andere organische verbindingen, maar niet op methaan.
<EMI ID=118.1>
Microbiol. 23, 135 (1972)). De organismen zijn gram-negatief, beweeglijk en niet-sporenvormend. De organismen groeien op methanol, me-
<EMI ID=119.1>
in staat zijn op methaan te groeien). Microbiële cellen afgeleid van deze eerder beschreven gisten en enzympreparaten daarvan (in het bijzonder de celvrije extracten die SADH-enzymactiviteit en NAD+ bevat-
<EMI ID=120.1>
verbinding) zijn in staat onder aerobe omstandigheden C3-C6 secundaire alcoholen in de overeenkomstige methylketonen om te zetten.
<EMI ID=121.1>
gisten, als eerder beschreven, die bruikbaar zijn voor de uitvinding zijn: Candida utilis ATCC 26387; Candida utilis NRRL Y-660; Hansenula
<EMI ID=122.1>
polymorpha NRRL Y-2267; Hansenula anomala NRRL Y-336; Pichia pastoris NRRL Y-55; Pichia pastoris NRRL Y-7556.
Verder kunnen de volgende onlangs geïsoleerde gisten in de uitvinding worden toegepast:
<EMI ID=123.1>
Deze nieuwe geisoleerde gisten hebben de volgende taxonome eigenschappen:
Pichia sp. CRL-72 (NRRL Y-11,328). Produceert slijm-
<EMI ID=124.1> cellen hebben knoppen. Zij reproduceren door knopvorming en groeien
<EMI ID=125.1>
amine en voedingsagar.. Groeien niet op methaan. Cellen zijn groot ovaalvormig en tonen een veelzijdige knopvorming onder microscopisch onderzoek.
<EMI ID=126.1>
en op methanol, methylformiaat, methylamine, ethanol, propylamine en voedingsagar. Groeien niet op methaan. Cellen zijn groot ovaalvormig en tonen een bipolaire knopvorming bij microscopisch onderzoek.
Naast de recent geïsoleerde gisten zoals boven be-
<EMI ID=127.1>
<EMI ID=128.1>
toegepast.
Daarin beschreven kenmerkende bacteriestammen zijn de volgende:
<EMI ID=129.1>
De voornoemde nieuwe stammen zijn gedeponeerd bij de United States Department of Agriculture, Agriculture Research
<EMI ID=130.1>
gen als boven beschreven verkregen.
Uiteraard kunnen tevens mutanten van deze bacteriën en gisten worden toegepast voor de produktie van microbiéle cellen en van deze cellen afgeleide enzympreparaten.
Het onderhoud van de kweken van deze onlangs ontdekte geïsoleerde stammen moet zorgvuldig worden geregeld. De voorkeursmethode voor het handhaven van de kweken wordt hierna beschreven.
In stand houden van de kweek
Van de organismen worden bij voorkeur iedere 2 weken op minerale zoutagarplaten subkweken gemaakt die het medium beschreven in voorbeeld I bevatten. In het geval van gistcellen wordt de giststikstofbase aan het voornoemde medium toegevoegd.
Deze platen dienen in glasdrogers te worden gelneubeer d die met deksels luchtdicht worden afgesloten en uitwendige hulzen hebben met een ingeperste slangaansluiting. Drogers moeten worden geëvacueerd en gevuld met een gasmengsel van methaan en lucht (1:1 v/v). De incubering dient plaats te vinden bij 30[deg.]C. Kweken zullen
<EMI ID=131.1>
zijn. Een zorgvuldige overbrenging van kweken heeft echter de voorkeur.
Bij commerciële methoden voor het voortplanten van microorganismen is het in het algemeen noodzakelijk in trappen te werken. Hiervan kunnen er enkele of vele van zijn afhankelijk van de aard van de werkwijze en de eigenschappen van de microorganismen. Gewoonlijk wordt de voortplanting gestart door cellen uit een schuine kweek te enten in een voorgesteriliseerd voedingsmiddelmedium dat gewoonlijk in een kolf aanwezig is. In de kolf wordt de groei van het microorganisme aangemoedigd door verschillende middelen, b.v. door schudden voor grondige beluchting en het handhaven van een geschikte temperatuur. Deze trap of dit stadium wordt een- of meerdere malen in kolven of vaten, die grotere of geli jke volumes voedingsmiddelmedium bevatten herhaald. Deze stadia kunnen geschikt worden aan-
<EMI ID=132.1>
zonder begeleidend kweekmedium worden uit het laatste ontwikkelingsstadium geintroduceerd of geënt in een gistingstank van grote afme-
<EMI ID=133.1>
men of enzymen daarvan.
De redenen voor het laten groeien van de micro-organismen in stadia zi jn veelvuldig, maar zi j hangen voornameli jk
af van de omstandigheden die noodzakelijk zijn voor de groei van de microorganismen en/of produktie van enzymen daarvan. Deze omvatten
de stabiliteit van de microorganismen, de juiste voedingsmiddelen,
de pH, osmotische verhoudingen, de beluchtingsgraad, de temperatuur en het handhaven van zuivere kweekomstandigheden gedurende het vergisten. Ter verkrijging van maximale opbrengsten van de microbiéle cellen moeten b.v. de omstandigheden van de fermentatie in het eind-
<EMI ID=134.1>
voor het verkrijgen van groei van de microorganismen in de kweekontwikkelingsstadia. Het handhaven van de zuiverheid van het medium is tevens een bijzonder belangrijk punt, in het bijzonder wanneer de fermentatie wordt uitgevoerd onder aerobe omstandigheden, zoals het geval is met de methylotrofe microorganismen. Indien de fermentatie
<EMI ID=135.1>
kelijk lange tijdsperiode nodig zijn om een aanzienlijke opbrengst aan microorganismen en/of oxydatieve en dehydrogenase-enzymen daarvan te bereiken. Dit verhoogt uiteraard de mogelijkheid van verontrei-
<EMI ID=136.1>
ingest eld te worden op een pH van 4 - 9 , bi j voorkeur 5,5 - 8,5, met de meeste voorkeur 6,0 - 7,5. De fermentatie kan worden uitgevoerd bij atmosferische druk hoewel hogere drukken tot 5 atmosfeer en nog hoger toegepast kunnen worden.
Voor het laten groeien van de methylotrofe microorganismen en voor het induceren van de oxygenase en dehydrogenase-
<EMI ID=137.1>
enzym-inducerende groei- en energiesubstraat bevat (b.v. methaan, methanol, methylamine enz.) en zuurstof. Indien methaan het inducerende groeisubstraat is, kan dit worden toegevoerd in de vorm van aardgas.
Voor een continue stroomkweek kan men de micro-organismen laten groeien in elk geschikt aangepast fermentatievat, b.v. een geroerde fermentator voorzien van schotten of een torenfermentator met luchtdoorblazing, die hetzij met inwendige koeling of een uitwendige recirculaatkoelkringloop voorzien is. Vers medium kan continu in de kweek worden ingepompt met snelheden die equivalent zijn aan 0,02 -
1 kweekvolume per uur terwijl de kweek met een zodanige snelheid kan worden verwijderd, dat het volume van de kweek constant blijft. Het inductor-groeisubstraat-zuurstofmengsel en eventueel kooldioxyde of andere gassen worden bij voorkeur met het medium in aanraking gebracht door deze continu door een blaasinrichting in de bodem van het
<EMI ID=138.1>
stof of met zuurstof verrijkte lucht zijn. Verbruikt gas kan uit de top van het vat worden verwijderd. Het verbruikt e gas kan hetzij
<EMI ID=139.1>
inductorroerder worden teruggevoerd. De gasstromen en recirculaties dienen zodanig te zijn aangepast, dat een maximale groei van microorganismen en een maximale benutting van het inducerende groeisubstraat wordt verkregen. Wanneer methaan of methanol het inducerendegroeisubstraat is, varieert de hoeveelheid methaan of methanol van 0,2 tot 2% v/v. In het geval dat andere inducerende groeisubstraten
<EMI ID=140.1>
v/v zijn.
De mie rob iele cellen kunnen met elk van de gewoonlijk toegepaste standaardtechnieken, b.v. uitvlokken, sedimenteren en/of precipiteren of neerslaan, gevolgd door centrifugeren en/of filtreren uit het groeimedium worden geoogst. De biologische massa
kan tevens worden gedroogd, b.v. door vriesdrogen of sproeidrogen
en in deze vorm voor verdere toepassing in de oxydatieve en/of alcoholdehydrogenaseomzettingsmethode worden toegepast. Bij het verkrijgen van een oxydatief enzymsysteem (d.w.z. methaan-geinduceerde cellen)
is het enzym meestal nauw verbonden met de celmembranen en kan het wenselijk zijn de microbiële cellen als de enzymbron te gebruiken.
Bij alcohol-dehydrogenase-enzymsystemen kan men geschikt het enzym
in de vorm van het oplosbare extract gebruiken (dat naar keuze in de <EMI ID=141.1>
Op andere wijze gesteld kan men bi j het verkri j gen van het cxygenase-enzymsysteem dat uit de methaan-geillduceerde cellen (niet methanol, methylamine enz.) voor toepassing bij het aëroob anzetten van lagere alkanen in secundaire alcoholen en methylketo-
<EMI ID=142.1>
de fractie van de cellen gebruiken. De laatste celvrije fijnverdeelde fractie is het. materiaal dat zich afzet wanneer de bovenlaag na het centrifugeren van gebroken cellen met 10.000 g gedurende 30 minuten gedurende 1 uur met 10.000 g of meer wordt gecentrifugeerd. Wanneer het daarentegen gewenst is de secundaire alcoholdehydrogenase (SADH) enzymfractie te verkri jgen worden eerst de cellen gebroken, b.v. door geluidsgolven enz., en daarna het celvormige afval verwijderd, b.v. door centrifugeren met 10.000 g gedurende 20 minuten, waarna
<EMI ID=143.1>
hierna volgende voorbeelden beschreven. Het SADH enzym bevindt zich in de bovenstaande fractie van de gecentrifugeerde gebroken cellen terwijl het oxygenase-enzym (d.v.z. de cellen geïnduceerd door methaan) aanwezig is in de fijnverdeelde fractie als boven beschreven.
Voor het ten uitvoer leggen van de uitvinding wordt
<EMI ID=144.1>
kregen op de wijze als boven beschreven, waarbij de microbiële
c ellen worden afgeleid van de methylotrofe microorganismen die aeroob zijn gekweekt in een voedingsmiddelmedium dat het inducerende groeisubstraat bevat of daarvan afgeleide enzympreparaten. De enzymbron
is niet kritisch, maar het heeft de voorkeur dat men een dergelijk preparaat verkrijgt uit een van de geinduceerde obligate of facultatieve methylotrofe microorganismen als boven beschreven. Het voedings-
<EMI ID=145.1>
het medium zijn als beschreven door Whittenbury et al., of met de meeste voorkeur het kweekmedium beschreven door Foster en Davis, J.
<EMI ID=146.1>
voorkeur geoogst en gewassen en kunnen de verkregen rustende micro-biële cellen of de verkregen enzympreparaten als zodanig worden toegepast voor het omzetten van C--Cg alkanen in de overeenkomstige
<EMI ID=147.1>
secundaire alcoholen in de overeenkomstige methylketonen- onder aerobe omstandigheden (in aanwezigheid van zuurstof) in een gebufferde oplossing. 'Het mengsel van het substraatmateriaal en geïnduceerde, rus-
<EMI ID=148.1>
wordt geïnduceerd tot de gewenste omzettingsgraad is verkregen. Daarna wordt het ketonprodukt door gebruikelijke middelen, zoals destillatie gewonnen.
Ter vergemakkelijking van het noodzakelijk effectieve contact van de zuurstof en het enzymsysteem (hetzij een enzymprepa-
<EMI ID=149.1>
methylotrofe micro-organismen) heeft het voor de beste resultaten de voorkeur een sterke fijnverdeelde luchtstroom te richten in een krach-
<EMI ID=150.1>
daire alcohol) in het oxydatiemedium dat gewoonlijk water en een buffer bevat, en waarin het enzympreparaat of het geinduceerde microbiële celsysteem is gesuspendeerd. Het enzympreparaat of geïnduceerde
<EMI ID=151.1>
keur door filtratie of centrifugering, worden afgescheiden. Het resulterende keton kan dan in het algemeen worden verkregen.
.De werkwijze van de uitvinding kan ladingsgewijze, half-continu, continu, in gelijk- of tegenstroom worden uitgevoerd. Naar keuze wordt de suspensie die het enzympreparaat of de methylotro- <EMI ID=152.1>
ren in benedenwaartse richting in tegenstroom geleid met een luchtstroom die in de buisreactor opstijgt. De toplaag wordt verwijderd uit de naar beneden stromende suspensie terwijl kweek en achterblijvende bufferoplossingsbestanddelen tenminste ten dele worden gerecirculeerd met naar behoefte meer oxydatief substraat en toegevoegd, vers enzympreparaat of geïnduceerd microbieel celsysteem.
<EMI ID=153.1>
oxydatiemethode kunnen geschikt worden gekoppeld door hen gelijktijdig, maar gescheiden en onder toepassing van een veel hogere beluchting in <EMI ID=154.1>
ste tweemaal de overmaat vereist voor de groei, bij voorkeur tenminste vijfmaal zoveel beluchting). Zowel de groeimethode, de oxydatieve of dehydrogenerende methoden kunnen in dezelfde reactor stapsgewijze
<EMI ID=155.1>
een normale en sterke beluchting.
De uitvinding wordt verder geïllustreerd, door de volgende voorbeelden die niet als beperkend zijn bedoeld. Alle delen en percentages tenzij anders vermeld, zijn in gewicht.
Voorbeeld I
Een voedingsmiddelmedium als beschreven door Foster
<EMI ID=156.1>
stelling per dm<3>, werd bereid:
<EMI ID=157.1>
<EMI ID=158.1>
op 7,0 door toevoeging van zuur of base waarbij 50 cm<3> monsters van
<EMI ID=159.1>
schudkolven werden geënt met een entlus van cellen uit een agarplaat die homogene kolonies van de microorganismen op de plaat bevatten
(de zuiverheid van de geisoleerde microorganismen werd door microsco-
<EMI ID=160.1>
van methaan en lucht met een 1 : 1 v/v gasverhouding die elke 2 weken werd verwisseld, gehandhaafd. Voor de groei op methanol werd aan het
<EMI ID=161.1>
vormige fase van de geënte kolven vervangen door een gasmengsel bestaande uit methaan en lucht in een verhouding van 1 : 1 op een v/v-
<EMI ID=162.1>
De cellen werden door centrifugeren met 10.000 g bij 40C gedurende 30 minuten geoogst. De celpellet werd tweemaal gewassen met een 0,05 M fosfaatbuffer bij een pH van 7,0 (die 0,02 M MgCl2 bevatte). De gewassen cellen werden daarna gesuspendeerd in een 0,05 M fosfaatbuffer bij pH 7,0.
<EMI ID=163.1>
gesloten met een rubber dop. De gasvormige fase van de flesjes werd onder vacuum verwijderd en daarna vervangen door een gasmengsel van de substraatreactanten (d.v.z. alkaan of secundaire alcohol) en zuurstof in een 1 : 1 v/v-verhouding (in het geval van een vloeibaar substraat, d.w.z. secundaire alcohol, werd 10 microliter van het substraat in de
<EMI ID=164.1>
cubeerd in een roterende schudinrichting met 300 toeren/minuut. Monsters van het produkt (1 - 3 microliter) werden periodiek met een microspuit afgevoerd en de produkten werden door gaschromatografie
(ionisatie vlam-detector-kolom) geanalyseerd.
Tabel A toont de omzettingssnelheden voor de omzetting van n-propaan , n-butaan, n-pentaan en n-hexaan in aceton, 2butanon, 2-pentanon en 2-hexanon door geïnduceerde, rustende (gewas-
<EMI ID=165.1>
van stammen zijn gekweekt op methaan volgens de voornoemde experimentele procedure. Men kan uit deze gegevens afleiden dat de rustende
<EMI ID=166.1>
<EMI ID=167.1>
<EMI ID=168.1>
<EMI ID=169.1>
Voorbeeld II
Microbiologische omzetting van secundaire alcoholen in ketonen
De procedure van voorbeeld I werd herhaald waarbij een veelvoud van de methaan-verbruikende methylotr ofe micro-organismen 5 elk aeroob werden gekweekt in een voedingsmiddelmedium dat methaan als
<EMI ID=170.1>
energiebron voor de groei bevatte. De cellen werden geoogst en gewassen als beschreven in voorbeeld I. De rustende microbiële cellen van de geinduceerde methaan-gegroeide methaan-verbruikende methylo-
<EMI ID=171.1>
geven in tabel B.
<EMI ID=172.1>
<EMI ID=173.1>
<EMI ID=174.1>
.Voorbeeld III
Microbiologische omzetting van secundaire alcoholen in ketonen
In dit voorbeeld werd de procedure van voorbeeld I herhaald met uitzondering dat een veelvoud van methaan-verbruikende
<EMI ID=175.1>
thanol-bevattend voedingsmedium in plaats van een methaan-bevattend voedingsmedium. De voedingsmiddelen in het medium waren dezelfde als aangeduid in voorbeeld I met uitzondering dat 0,4% v/v methanol werd toegepast als de alcoholdehydrogenase-inducent en als hoofdbron van
10 koolstof en energie voor de groei. Na de groei werden de cellen geoogst en gewassen als beschreven in voorbeeld I. De rustende cellen van de geïnduceerde methanol-gegroeide methylotrofe microorganismen werden daarna in aanraking gebracht met decundaire alcoholen in een
<EMI ID=176.1>
15 De resultaten van deze reeks proeven worden weergegeven in tabel C.
<EMI ID=177.1>
<EMI ID=178.1>
<EMI ID=179.1>
Voorbeeld IV
Microbiologische omzetting van secundaire alcoholen in ketonen
<EMI ID=180.1>
5 men toegepast voor het omzetten van secundaire alcoholen in methylketonen.
De procedure volgens voorbeeld I werd herhaald met uitzondering dat een veelvoud van methanol-verbruikende methylotrofe . microorganismen elk aëroob werden gekweekt in een methancl-bevattend
10 voedingsmedium in plaats van een methaan-bevattend medium. De voedingsmiddelen in het medium waren dezelfde als aangeduid in voorbeeld
<EMI ID=181.1>
inducent en als de hoofdkoolstof- en energiebron voor de groei werd toegepast. De cellen werden geoogst en gewassen als beschreven in voor-
<EMI ID=182.1>
gebufferde oplossing volgens de procedure van voorbeeld I. De reactieprodukten werden door gaschromatografie geanalyseerd en bleken 2-
20 ketonen te bevatten als aangeduid in tabel D.
De resultaten van deze reeks proeven worden tevens in tabel D weergegeven.
<EMI ID=183.1>
<EMI ID=184.1>
<EMI ID=185.1>
Voorbeeld V
Microbiologische omzetting van secundaire alcoholen in ketonen
In dit voorbeeld werden microbiële cellen van methaan en methanol-verbruikende metbylotrofe microorganismen (zowel obligate als facultatieve typen) toegepast voor het omzetten van secundaire alcoholen in methylketonen.
De procedure van voorbeeld I werd herhaald met uit-
<EMI ID=186.1>
thylamine of methylformiaat als de alcoholdehydrogenase-enzymindu-
<EMI ID=187.1>
<EMI ID=188.1>
De cellen werden geoogst en gewassen als beschreven in voorbeeld I.
<EMI ID=189.1>
coholen in een gebufferde oplossing volgens de omzettingsprocedure van voorbeeld I in aanraking gebracht. Tabel E toont de omzettingssnelheden van de secundaire alcoholen in de ketonen voor de methyl-
<EMI ID=190.1>
tingssnelheden voor de secundaire alcoholen in de ketonen voor de methylformiaat-gegroeide microbiële celsuspensies.
<EMI ID=191.1>
<EMI ID=192.1>
<EMI ID=193.1>
01 i
cd <EMI ID=194.1>
H
<EMI ID=195.1>
.
-ë a
a
m
<EMI ID=196.1> <EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1>
& �
<EMI ID=199.1>
<EMI ID=200.1>
<EMI ID=201.1>
Cl) h
<EMI ID=202.1>
<EMI ID=203.1>
<EMI ID=204.1>
u y
<EMI ID=205.1>
eo c <EMI ID=206.1> <EMI ID=207.1>
<EMI ID=208.1>
<EMI ID=209.1>
<EMI ID=210.1>
<EMI ID=211.1>
<EMI ID=212.1>
<EMI ID=213.1>
<EMI ID=214.1>
<EMI ID=215.1>
�H
�p
<EMI ID=216.1>
0)
<EMI ID=217.1>
V 3
<EMI ID=218.1>
<EMI ID=219.1>
<EMI ID=220.1>
<EMI ID=221.1> Als boven aangegeven is een werkwijze gevonden waar-
<EMI ID=222.1>
lineaire secundaire alcoholen in aanraking te brengen met rustende microbiële cellen (of daarvan afgeleide enzympreparaten) die zijn gekweekt in aanwezigheid van een oxygenase- en/of alcoholdehydrogenaseenzyminducent als de hoofdkoolstof- en energiebron. De methylotrofe microorganismen kunnen hetzij obligaat of facultatief zijn. In beide gevallen zijn wanneer de methylotrofe microorganismen aeroob wor den gegroeid in een voedingsmiddelmedium dat de enzyminducent, methaan, bevat, de verkregen rustende microbiële cellen of enzympreparaten
<EMI ID=223.1>
len in de overeenkomstige methylketonen om te zetten. In het geval van hetzij de obligate of facultatieve methylotrofe micro5rganismen die aeroob zijn gegroeid in een voedingsmiddelmedium dat methanol,
<EMI ID=224.1>
paraten daarvan slechts in staat C3-C6 secundaire alcoholen in de overeenkomstige methylketonen om te zetten. Deze geïnduceerde enzymen zijn niet in staat de C3-C6 alkanen in de overeenkomstige methylketonen om te zetten. In beide gevallen werd geen verdere reactie
van het ketonprodukt gedetecteerd. Bij ladingsgewijze proeven onder toepassing van rustende methaan-, methanol-, methylamine- of methylformiaat-gegroeide cellen verliep de omzettingsreactie gedurende tenminste 4 uren lineair.
Het oxydatieve en/of alcoholdehydrogenase-enzymsysteem van de aeroob geinduceerde methylotrofe microorganismen is induceerbaar en het ketonprodukt hoopt zich extracellulair op (d.w.z. nadat de reactie plaats vindt en het reactiemengsel wordt gecentrifugeerd wordt het ketonprodukt aangetroffen in de bovenlaagfractie en niet in de celpellet).
<EMI ID=225.1>
micro-organismen cellen of enzympreparaten produceren met een groter
<EMI ID=226.1>
Microbiële cellen afgeleid van Methylosinus trichosporium OB3b produceerden b.v. de grootste hoeveelheid methylketonen uit secundaire alcoholen (b.v. 15 micromol/2 mg proteine na 2 uren).
Zoals zal worden aangetoond door de nu volgende voorbeelden bezitten de methaan-gegroeide microbiële cellen en de enzympreparaten daarvan (met ingebrip van celvrije extracten) zowel oxygenase- als alcoholdehydrogenase-enzymactiviteit. Aangenomen wordt, dat het methaan zelf de oxygenase-enzymactiviteit induceert en het methanol dat gedurende de groei ontstaat bij de oxydatie van methaan door
<EMI ID=227.1>
daire alcohol, terwijl daarentegen het geïnduceerde alcoholdehydrogenase-enzym de secundaire alcohol tot de overeenkomstige methylketon dehydrogeneert.
Zoals aangetoond in de volgende voorbeelden kunnen naast de methylotrofe bacteriën andere microórganismen worden toege-
<EMI ID=228.1>
zetting van de C3-C6 secundaire alcoholen in de overeenkomstige methylketonen. Deze omvatten bacteriën, schimmel en gisten die op korte alkanen, b.v. methaan of alcoholen zoals methanol enz. groeien. Alcoholoxydatiesystemen:
Als weergegeven en boven beschreven (tabellen B en C) oxydeerden rustende eelsuspensies van methaan- en methanol-gegroeide <EMI ID=229.1>
hun overeenkomstige methylketonen. De methylketonprodukten hoopten zich extracellulair op zoals vastgesteld door analyse van de bovenlaag van het gecentrifugeerde reactiemengsel. Blanco experimenten met door verhitting gedode cellen hebben uitgewezen dat de methylketonen enzy-
<EMI ID=230.1>
aangetoond. Verdere proeven hebben aangetoond, dat de SADH-activiteit werd aangetroffen in celsuspensies van methanol-gegroeide of methylamine-gegroeide micro-organismen. Het SADH blijkt echter niet een samenstellend enzym te zijn aangezien de SADH-enzymactiviteit niet werd
<EMI ID=231.1>
Ter bereiding van het celvrije secundaire alcohol-dehydrogenase (SADH)-systeem werden de gewassen cellen gebroken met een ultrasone oscillator, Model W201 (Wave Energy System, Inc., Newton, Pa) en gedurende 30 minuten met 20.000 g gecentrifugeerd. De' heldere bovenlaag bevatte de SADH-activiteit. De enzymactiviteit werd
<EMI ID=232.1>
een gegeven hoeveelheid enzympreparaat; en secundaire alcohol 10 micromol. De reactie werd gestart door de toevoeging van substraat. Een eenheid enzym-activiteit stelt de reductie van 1 micromol NAD per minuut voor. Proteïne-concentraties werden bepaald volgens de Lowry-
<EMI ID=233.1>
Hierna wordt een samenvatting gegeven van proeven uitgevoerd bij optimale omst andigheden voor de produktie van methyl-
<EMI ID=234.1>
den optimale omstandigheden waartoe de uitvinding niet is beperkt. Omzettingen kunnen eveneens worden verkregen door. af te wijken van
<EMI ID=235.1>
tingen.
Tijdsverloop:
De produktie van 2-butanon uit 2-butanol bereikte
<EMI ID=236.1>
binnen dit interval gemeten steeds wanneer het effect van een variabele werd onderzocht.
pH:
Het effect van de pH op de produktie van 2-butanon
<EMI ID=237.1>
M) voor pH-waarden van 8,0 - 10,0, en 0,05 M kaliumfosfaatbuffer voor waarden van 5,0 - 8,0. Een pH bij ongeveer 8,0 bleek voor de 2-butaan-
<EMI ID=238.1> de nieuwe stammen, toonde Methylobacterium organophilum CRL 26
<EMI ID=239.1>
ïnvloed.
Temperatuur:
Het temperatuuroptimum voor de produktie van 2-butanon door celsuspensie was ongeveer 35[deg.]C met uitzondering voor de
<EMI ID=240.1>
Substraat-concentratie:
Verschillende concentraties van 2-butanol werden
<EMI ID=241.1>
toegevoegd. De produktie van 2-butanon werd na 35 minuten incubatie onderzocht. De hoeveelheid geproduceerd 2-butanon was afhankelijk van de hoeveelheid aanvankelijk toegevoegd substraat. Een 2-butanolcon-
<EMI ID=242.1>
produkt ie .
Celconcentratie:
De celconcentratie heeft tevens invloed op de snelheid van de 2-butanon-produktie. De hoeveelheid 2-butanon verzameld na 2 uren incubatie nam lineair toe naarmate de celconcentratie verder
<EMI ID=243.1>
<EMI ID=244.1>
Produkt remming en verdere oxydatie:
Onderzoek van het tijdsverloop van de 2-butanonpro-
<EMI ID=245.1>
nam, hetgeen onder andere mogelijkheden produktremming of verdere oxydatie van 2-butanon suggereerde. Voor het onderzoek van deze mogelijkheden werden 8 micromol 2-butanon toegevoegd aan levensvatbare of door verhitting gedode eelsuspensies en onder de bovenbeschreven omstandigheden voor de produktie van 2-butanon geincubeerd. Er werd geen daling in de 2-butanonconcentraties in alle door verhitting gedode celsuspensies waargenomen, maar 2-butanon verdween langzaam in aanwezigheid van levensvatbare cellen van alle beproefde stamnen. Bij toevoeging van 2-butanol (5 microliter/0,5 cm<3> reactiemengsel) aan levensvatbare celsuspensies samen met het exogeen toegevoerde 2-butanon, werd een netto toename in de 2-butanonproduktie waargenomen. De reactiesnelheden waren identiek aan die waarin de secundaire alcohol in het begin werd omgezet in het methylketon en zij werden niet be-
<EMI ID=246.1>
gegevens duiden aan dat er geen produktrenming in de produktie van 2butanon is. Een kleine mate verdere oxydatie van 2-butanon door levensvatbare celsuspensies werd waargenomen. De afname in de 2-butanon-
<EMI ID=247.1>
putting van de andere factoren, zoals een cofactor.
Remmingsstudies:
De produktie van 2-butanon uit 2-butanol door celsuspensies van de beproefde stammen werd geremd door metaal-chelaatvormende middelen zoals 1.10-fenantroline en a.a-dipyridyl. De activiteit werd echter niet geremd door natriumcyanide of thioureum hetgeen suggereert dat bij het enzym een metaal betrokken is. De resultaten van de remmingsproeven worden weergegeven in tabel G.
T A B E L G
Effect van metaal-chelaatvormende middelen en andere remmers op de produktie van 2-butanon door celsuspensies van methanol-gegroeide
<EMI ID=248.1>
<EMI ID=249.1>
Substraatspecificiteit:
<EMI ID=250.1>
Onder de secundaire alcoholen werden 2-propanol en 2-butanol met hogere snelheden geoxydeerd; 2-pentanol, 2-hexanol en 2-heptanol werden veel langzamer geoxydeerd. De oxydatieprodukten van deze secundaire alcoholen waren de overeenkomstige methylketonen, zoals bepaald door GC-retentietijdvergelijkingen met authentieke standaarden.
Celvrije systemen:
Celvrije oplosbare extracten uit sonisch gebroken
<EMI ID=251.1>
butanol tot, 2-butanon. Deze resultaten vorden weergegeven in tabel Q, Bij alle onderzochte. celvrije systemen was echter de toevoeging van
<EMI ID=252.1>
nase.
De experimentele procedure voor de in tabel H ge-
<EMI ID=253.1>
toegevoegd, waarna het flesje werd afgesloten met een rubber stop om verdamping tegen te gaan. Het reactiemengsel werd bij 30[deg.]C op een
<EMI ID=254.1>
ten incubatie met een spuit verwijderd en onderzocht met g.l.c. De katalytische activiteit verd tevens geanalyseerd door fluorescentie-
<EMI ID=255.1>
kregen als blijkt uit tabel E. Tabel Ha. toont eveneens omzettingen van 2-propanol, 2-butanol en 2-pentanol in de methylketonen met de cel-
<EMI ID=256.1>
<EMI ID=257.1>
<EMI ID=258.1>
<EMI ID=259.1>
<EMI ID=260.1>
<EMI ID=261.1>
<EMI ID=262.1>
<EMI ID=263.1>
<EMI ID=264.1>
<EMI ID=265.1>
<EMI ID=266.1>
<EMI ID=267.1>
<EMI ID=268.1>
Zuivering en eigenschappen van secundaire alcoholdehydrogenase:
Secundaire alcoholdehydrogenase (SADH) uit een obligate methanolverbruiker, Pseudomonas sp. ATCC 21�39 werd als
<EMI ID=269.1>
stofbron als beschreven in de voorgaande voorbeelden werden gesuspen-
<EMI ID=270.1>
dithiothretol (buffer A) en met geluidsenergie (5 x 1 minuut) gebroken. Het ruwe extract werd geisoleerd door centrifugeren. Het ruwe extract werd gedurende 10 minuten op 50[deg.]C verhit in een waterbad.
Het verkregen neerslag werd door centrifugeren verwijderd. Aan de bovenstaande oplossing werd 25 cm<3> protaminesulfaatoplossing (2% oplossing in 0,1 M tris-base) druppelsgewijze onder continu roeren toe- ' gevoegd. Na gedurende 30 minuten staan werd het extract gecentrifugeerd. De bovenstaande oplossing werd gefractioneerd met vast ammoniumsulfaat. Het materiaal dat tussen 30 en 60% verzadiging neersloeg
werd verzameld en gedurende de nacht gedialyseerd tegen buffer A.
Het gedialyseerde materiaal werd aangebracht in een DEAE-cellulosekolom (3 x 35 cm) die in evenwicht was gebracht met buffer A. De secundaire alcoholdehydrogenase-activiteit werd geëlueerd in het lege
<EMI ID=271.1>
verzadiging neersloeg werd door centrifugeren verzameld en gedurende de nacht tegen A gedialyseerd. Deze fractie werd verder gewassen en gefiltreerd via een Amicon-eenheid met XM 50-membraan . De geconcen-
<EMI ID=272.1>
een Affi-gel blauwe-kolom (0,8 x 18 cm) die in evenwicht was gebracht met buffer A voor affiniteitschromatografie. De kolom werd gedurende
<EMI ID=273.1>
ting van de zuiveringstrappen wordt weergegeven in tabel J.
<EMI ID=274.1>
<EMI ID=275.1>
Het gezuiverde secundaire alcoholdehydrogenase-
<EMI ID=276.1>
secundaire alcoholen in de overeenkomstige methylketonen door de bovenbeschreven procedures; een bron van NAD + moet echter aan het reactiemedium worden toegevoegd. Men kan de NAD-gekoppelde secun-
<EMI ID=277.1>
1,0 micromol; een gegeven hoeveelheid enzympreparaat en 20 micromol secundaire alcohol. De reactie wordt gestart door toevoeging van
<EMI ID=278.1>
De zuiveringsprocedure als weergegeven. in tabel J
<EMI ID=279.1>
een- hogere specifieke activiteit verkrijgen door de warmtebehande-
<EMI ID=280.1>
<EMI ID=281.1>
heid van een reductiemiddel �oals dithrothretol in de dialyserende buffer bleek gedurende de dialyse van het materiaal neergeslagen
<EMI ID=282.1>
proef werd de Affi-gel blauw-kolom opgeschaald tot een afmeting van 2,5 x 25 cm. Uit 10 dm ruw extract dat 200 g proteïne bevatte, werd een 45 mg zuivere SADE-fractie met een specifieke activiteit van
65.600 SADH-eenheden/mg proteïne (33% terugwinning) verkregen.
Metaalanalyse van de gezuiverde SADH-enzymen werd
<EMI ID=283.1>
1220C semi-automatische vacuumspectrograaf. Bij het uitvoeren van de metaalanalyse werd het gezuiverde SADH eerst grondig gewassen met gedeioniseerd gedestilleerd water en daarna gelijkmatig gedroogd met een Amicron XM 50-ultrafiltratiemembraan. Dit membraan werd daarna ge-
<EMI ID=284.1>
veelheid metaal dat kwalitatief en kwantitatief met deze methode detecteerbaar is, is resp. groter dan 0,02 en groter dan 0,5 micro-gram/cm<2>. Metaalanalyse volgens deze techniek aan de van gezuiverde
<EMI ID=285.1>
het ultrafiltratiemembraan. Dit is equivalent aan 2 mol zink per mol SADH-enzym of 1 mol zink per subeenheid. Er werd geen ander metaal gedetecteerd.
Het molecuulgewicht van het gezuiverde SADH werd
<EMI ID=286.1>
forese in een 10% gelsysteem en de dissociatie van enzymproteine werden uitgevoerd met SDS-PAGE-standaarden. Zowel het protelnekleurpigment als het enzymactiviteitskleurpigment van de gezuiverde SADH-enzymen als beproefd, toonden een enkele proteineband. De mobiliteiten op de gelelektrotorese van SADH ten opzichte van de onder-
<EMI ID=287.1>
Van gist afgeleid SADH had een snellere mobiliteit naar de anode bij de gelelektroforese. De molecuulgewichten van verschillende van bacteriën en gisten afgeleide en gezuiverde �ADH-enzymen waren elk
95,000 dalton, zoals bepaald door bio-gel-agarose A-1,5 kolom. SDS-gelelektroforese van de gezuiverde enzymen toonde twee identieke subeenheden met �8.000 dalton.
De optimale pH en temperaturen voor de activiteit van het gezuiverde SADE varen resp. 8 - 9 en 30 - 35[deg.]C, hoewel ruimere gebieden van pH en temperaturen de enzymactiviteit niet signi-
<EMI ID=288.1>
uit Arrhenius-grafieken van snelheid versus de omgekeerde waarde van absolute temperatuur, is 19,8 Kcal. Het absorptiespectrum. van de gezuiverde SADH-fractie toonde geen pieken in het zichtbare gebied.
<EMI ID=289.1>
reactiesnelheden werden verkregen vanneer SADH van tevoren gedurende
10 minuten werd geincubeerd met hetzij NAD of 2-butanol. Dit geeft aan, dat toevoeging van substraten in de SADH-reactie niet een nood-
<EMI ID=290.1>
stelt. Er werd geen verbruik van opgeloste zuurstof gedurende de reac-tie waargenomen.
Het effect van metaal-chelaatvormende middelen en thioreactanten op de activiteit van de gezuiverde SADH-enzymen werd bestudeerd. De SADH-activiteit werd als volgt geremd (% remming, activiteit spectrofluorametrisch gemeten en elke remmer toegevoegd
<EMI ID=291.1> tegenstaande het feit dat SADH 2 mol zink per mol enzym bevat stimuleerde de toevoeging van exogeen zink de activiteit niet. De mogelijkheid ethanol of n-propanol als remmer te gebruiken werd bestudeerd. Ongeacht hun st ructuurgelijkheid bij de concurrentie met 2-butanol voor de alkylbindingsplaatsen remde geen van beide de SADH-activiteit.
De substraatspecificiteit van gezuiverd SADH was het hoogst voor 2-propanol en 2-butanol. Het oxydeerde tevens bij lagere snelheid 2-pentanol, 2-hexanol, aceetaldehyde, propanol, cyclo-
<EMI ID=292.1>
ren geen substraten van gezuiverd SADH. Het blijkt dat voor enzymactiviteit een hydrofobe koo�stofeenheid aan de secundaire alcohol vereist is.
Het gezuiverde SADH-enzym werd met een Beekman Model 120 B aminozuuranalysator na de zuurhydrolyse van het enzym geanalyseerd op aminozuur. De resultaten van de aminozuuranalyse worden samengevat in tabel K. De waarden worden uitgedrukt als gemiddeld aantal resten per molecuul verkregen na 24, 48 en 72 uren zuurhydrolyse, hetgeen een molecuulgewicht van 95.000 veronderstelt. Slechts twee resten cysteine werden gedetecteerd.
T A B E L K
<EMI ID=293.1>
(a) Het secundaire alcoholdehydrogenase-enzym verd gezuiverd uit <EMI ID=294.1>
op methanol.
Van gist afgeleid SADH:
<EMI ID=295.1>
ding gegroeide gisten enzymatisch omgezet in de corresponderende overeenkomstige methylketonen. Verder is in het bijzonder gevonden dat celsuspensies van de gisten: Candida utilis ATCC 26387; Hansenula
<EMI ID=296.1> <EMI ID=297.1>
De cellen werden gedurende de exponentiële groei door centrifugeren bij 12.000 g gedurende 15 minuten geoogst. De
<EMI ID=298.1>
energiebron.
<EMI ID=299.1>
sie van gisten gegroeid op verschillende koolstofbronnen, werd in
<EMI ID=300.1>
bi j 200 tpm. Het oxydatieprodukt van de secundaire alcohol werd gedetecteerd door gaschromatografische retentietijdvergelijking en cochromatografie met een authentieke standaard. Als weergegeven in tabel L katalyseren de celsuspensies van gisten de omzetting van isopropanol, 2-butanol, 2-pentanol en 2-hexanol in de overeenkomstige methylketonen. De oxydatieprodukten van secundaire alcoholen hoopten zich extracellulair op terwijl geen verdere oxydatie van produkten
(methylketonen) door gaschromatografische analyse aan het licht werd gebracht. Soortgelijke omzettingen van 2-butanol in 2-butanon werden uit gevoerd met celsuspensies van de gisten: Candida boidinii NRRL
<EMI ID=301.1>
ketonen.
Celvrije extracten van deze gisten katalyseerden
<EMI ID=302.1>
de overeenkomstige methylketonen. De aanwezigheid van NAD + als elek-
<EMI ID=303.1>
deze van gist afgeleide enzymen. Primaire alcoholen werden door dit gezuiverde enzym niet geoxydeerd. Het molecuulgewicht van het van ge- <EMI ID=304.1>
door gelfiltratie en de subeenheidafmeting, zoals bepaald door natriumdodecylsulfaat gelekejtroforese, was �8.000.
Er valt op te merken dat het molecuulgewicht van
<EMI ID=305.1>
variëren afhankelijk van de zuiveringsprocedures en de experimentele fout.
De activiteit van van gezuiverde gist afgeleid SADH
<EMI ID=306.1>
optimale pH van het gezuiverde enzym werd op ongeveer 8 bepaald.
Een typerend van gist afgeleid SADH-enzym werd als volgt bereid:
De gisten werden bij 30[deg.]C gegroeid in 2,8 dm" kol-
<EMI ID=307.1>
<EMI ID=308.1>
<EMI ID=309.1>
<EMI ID=310.1>
<EMI ID=311.1>
<EMI ID=312.1>
<EMI ID=313.1>
<EMI ID=314.1>
Celsuspensies (2 g nat gewicht) van gepakte cellen
<EMI ID=315.1>
door geluidsgolven met een Megason-ultrasone desintegrator. De aldus met geluidsenergie behandelde celsuspensies werden gedurende 15 minuten bij 30.000 g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistoflaag werd het ruwe extract genoemd,
<EMI ID=316.1>
<EMI ID=317.1>
Brunswick fermentator in een mineraalzoutmedium dat methanol als enige koolstofbron bevatte (0,4% v/v). De cellen (200 g, nat gewicht) wer-
<EMI ID=318.1>
eerder beschreven werden bereid. Aan de ruwe extracten werd 18 cm van een protaminesulfaatoplossing [2% oplossing in 0,1 M tris(hydroxy-
<EMI ID=319.1>
toegevoegd. Na staan gedurende 30 minuten werden de extracten gecentrifugeerd met 20.000 g gedurende 60 minuten. De bovenstaande oplos-
<EMI ID=320.1>
werden door centrifugeren verwijderd en 137 g ammoniumsulfaat werd per liter van de bovenstaande vloeistoflaag toegevoegd om deze op 70%
<EMI ID=321.1>
verzadiging werd door centrifugeren verzameld en opgelost in buffer A. Dit preparaat werd gedurende de nacht gedialyseerd ten opzichte van buffer A en het gedialyseerde materiaal werd aangebracht in een DEAE-
<EMI ID=322.1>
<EMI ID=323.1>
1 buffer A die NAC1 in een lineaire gradiënt lopende van een concentratie van 0 tot 0,5 M bevatte. Fracties van 15 cm<3> werden verzameld.
<EMI ID=324.1>
Materiaal dat neersloeg tussen 50 en 70% anmoniumsulfaatverzadiging <EMI ID=325.1>
buffer A. Fracties die een constante specifieke enzym-activiteit bevatten, werden samengevoegd en door Amicon-ultrafiltratie met een
<EMI ID=326.1>
<EMI ID=327.1>
heid van methylketonen (aceton, 2-butanon, 2-pentanon, 2-hexanon) werd door gaschromatografie gemeten.
Het ketonprodujct verkregen uit de oxydatie van secundaire alcoholen door celextracten van organismen werd geschat door
<EMI ID=328.1>
stalen kolom (3,6 m x 0,3 cm) gepakt met 10% Carbowax 2CM op 80/100 chromosorb w kolom (Perkin Elmer Corp., Norwalk, Conn.). De kolom-
<EMI ID=329.1>
butanon, 2-pentanon, 2-hexanon) werden geidentificeerd door retentietijdvergelijkingen en door cochromatografie met een authentiek stan-
<EMI ID=330.1>
tratie werd bepaald volgens de methode van Lowry et al.
Celvrije extracten verkregen uit gisten, Candida uti-
<EMI ID=331.1> lijke oxydatie van secundaire alcoholen (isopropanol, 2-butanol, 2pentanol, 2-hexanol) tot de overeenkomstige methylketonen (aceton, 2butanon, 2-pentanon, 2-hexanon). De produktiesnelheid van de methylketonen uit secundaire alcoholen wordt weergegeven in tabel M. Oxydatie van secundaire alcoholen werd tevens spectrofotometrisch ge-
<EMI ID=332.1>
ten (nmol NAD+ gereduceerd per minuut met mg proteine) van 78, 85,
105, 62 en 90 werden verkregen met extracten afgeleid van Candida uti-
<EMI ID=333.1>
<EMI ID=334.1>
<EMI ID=335.1>
<EMI ID=336.1>
<EMI ID=337.1>
tie uit een DEAE-cellulosekolom geëlueerd. De totale 60-voudige zuivering werd bereikt uitgaande van ruwe extracten. De zuiverheid van
<EMI ID=338.1>
neband indien onderworpen aan elektroforese op polyacrylamidegel. Tabel N illustreert een samenvatting van de zuiveringstrappen en een analyse van de produkten bi j het einde van elke trap.
<EMI ID=339.1>
de verschillende beproefde secundaire alcoholen katalyseerde het enzym de oxydatie van isopropanol, 2-butanol, 2-pentanol en 2-hexanol.
2-Heptsnol, 2-octancl, methanol, ethanol, propaan-
<EMI ID=340.1>
als elektrondrager werken.
Verschillende primaire alcoholen die niet door secundaire alcoholdehydrogenase werden geoxydeerd werden onderzocht
<EMI ID=341.1>
zool en 1.10-fenantroline een sterke renming van secundaire alcoholdehydrogenaseactiviteit. De enzymactiviteit werd tevens geremd door
<EMI ID=342.1>
faat.
<EMI ID=343.1>
<EMI ID=344.1>
<EMI ID=345.1>
Aceton en 2-butanon werden gedetecteerd als het oxydatieprodukt van resp. isopropanol en 2-butanol door het gezuiver-
<EMI ID=346.1>
overeenstemming met de kwantitatieve oxydatie van beide substraten. Deze resultaten worden weergegeven in tabel 0.
TABEL 0
Stoechiometrie van isopropanol en sec-butanol-oxydatie door gezuiver-
<EMI ID=347.1>
<EMI ID=348.1>
<EMI ID=349.1> ten bij 340 nm.
(b) De schatting van produkten werd gedetecteerd door gaschromatografie als beschreven in de methoden.
<EMI ID=350.1>
Zowel de celsuspensies (fijnverdeelde fractie)
als de celvrije fijnverdeelde fractie van methaan-gegroeide methylotro-
<EMI ID=351.1>
te katalyseren. De omstandigheden ter bereiding van de celsuspensies of de celvrije fijnverdeelde fracties uit methaan gekweekte methylotrofe micro-organismen zijn dezelfde als boven beschreven. De celvrije fijnverdeelde fractie vereist de aanwezigheid van zuurstof en NADH als elektronen-donor. De omzetting in de alcoholen werd geremd door
<EMI ID=352.1>
de omzetting van alkanen tot secundaire alcoholen suggereert. Tevens bleek propeen de omzetting te remmen hetgeen suggereert, dat propeen en n-alkaan (b.v. propaan) concurreren voor dezelfde enzymsystemen,
<EMI ID=353.1> <EMI ID=354.1>
van celsuspensies en celvrije fijnverdeelde fracties van methaan-gegroeide methylotrofe micro-organismen. Tabel R toont dat celsuspensies
<EMI ID=355.1>
maire en secundaire alcoholen, methylketonen en aldehyden.
<EMI ID=356.1>
<EMI ID=357.1>
<EMI ID=358.1>
<EMI ID=359.1>
<EMI ID=360.1>
ii
34
<EMI ID=361.1>
TABEL R
<EMI ID=362.1>
<EMI ID=363.1>
(a) Celsuspensies van methaan-gegroeide methylotrofe micro-organismen aangegeven in 0,15 M fosfaatbuffer, pH 7,0, geïncubeerd in <EMI ID=364.1>
<EMI ID=365.1>
nica propaan en butaan gelijk oxydeerden tot hun overeenkomstige methylketonen. Zij stelden dat rustende cel-suspensies van methaangegroeide cellen propaan of butaan echter niet oxydeerden. Later hebben Lukins en Foster (J. Bacteriol. 85: 1074 - 1086 (1963)) vermeld
<EMI ID=366.1>
overeenkomstige methylketonen oxydeerden. Gevonden en gedemonstreerd is dat rustende celsuspensies van methaan-gegroeide cellen C3-C6
<EMI ID=367.1>
thylketonen in afwezigheid van groeisubstraten. Tevens is voor de eer-ste keer de omzetting van C3-C6 secundaire alcoholen in hun overeenkomstige methylketonen gedemonstreerd door rustende celsuspensies (fijnverdeelde fractie) van hetzij alkaan-gegroeide of alcohol-gegroeide cellen. Succinaat-gegroeide cellen hebben geen SADH-activiteit het- geen suggereert dat hetzi j alkaan of alcohol voor het induceren van
het enzym nodig is.
Als boven weergegeven oxydeerden celsuspensies van deze
<EMI ID=368.1>
thaan of methanol, secundaire alcoholen tot hun overeenkomstige methylketonen. De beproefde kweken werden gekozen uit een duidelijk genus
en zij werden vergeleken wat betreft hun optimale omstandigheden bij
de produktie van 2-butanon. Deze kweken varen Methylosinus trichospo-
<EMI ID=369.1>
ve methaan-verbruiker); Hansenula polymorpha ATCC 26012; en Pseudomonas
<EMI ID=370.1>
2-butanonproduktie was gedurende de eerste 4 uren incubatie voor alle vijf beproefde kweken lineair. De gist-kweek had de hoogste produktiesnelheid. De optimale temperatuur voor de produktie van 2-butanon was
<EMI ID=371.1>
produktie van 2-butanon werd beïnvloed door substraatconcentratie
en celconcentratie� Remming door metaal-chelaatvormende middelen
van de vorming van 2-butanon suggereert het betrokken zijn van metalen.
<EMI ID=372.1>
celsuspensies bij elk van de vijf beproefde kweken.
Gevonden is dat celvrije oplosbare extracten uit door geluidsgolven gebroken cellen tevens 2-butanol tot 2-butanon oxyderen. Het celvrije systeem vereist de toevoeging van een cofactor, in het bijzonder NAD, voor de activiteit daarvan. Een van de verklarin-
<EMI ID=373.1>
tie kan derhalve de uitputting van NAD in de celsuspensie zijn.
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) bleek vereist te zijn voor de oxydatie van C3-C6 secundaire alcoholen in het cel-vrije S�.DH-systeem. Andere beproefde cofactoren (met inbegrip van PMS, GSH, EAD, kaliumferricyanide, dichloorfenolindofenol en NADP) waren niet effectief.
Het molecuulgewicht van het zuivere SADH als geschat door een biogel-agarose A-1,5-kolom is 95.000 dalton. Acrylamide gelelektroforese van de gezuiverde SADH-fractie uit de affiniteitschro-
<EMI ID=374.1>
gende relatieve percentages: 2-propanol 85%; 2-butanol 100%; 2-pen-
<EMI ID=375.1>
<EMI ID=376.1>
verbindingen werden niet door SADH geoxydeerd: 2-heptanol tot 2decanol, formaldehyde, butanal tot decanal, benzaldehyde, methanol tot
<EMI ID=377.1>
een eventuele metaalbetrokkenheid. De activiteit werd echter door natriumcyanide of thioureum niet geremd. De enzymactiviteit verd
<EMI ID=378.1>
(100%), 5.5'-dithiobis(2-nitrobenzoëzuur) en werd niet geremd door minder krachtige thioremmers zoals joodazi jnzuur of N-ethyl-maleimide. De fysiologische betekenis van dit SADH in.methylotrofen. alsmede andere gasvormige koolwaterstofverbruikers is niet bekend. Het bezit van dit enzym is echter van groot voordeel voor het organisme aangezien de groei-opbrengst daarvan, bij groeien op gasvormige alkanen
<EMI ID=379.1>
oxygenase uit Methylococcus eapsulatus (Bath) oxydeert tevens n-alka- <EMI ID=380.1>
tevens in de methanol gegroeide cellen aanwezig ia is een aanwijzing dat het enzym niet wordt geïnduceerd door n-alkanen.
Het metabolisme van de obligate methylotrofen is uniek
<EMI ID=381.1>
van deze dehydrogenases hebben een brede specificiteit ten opzichte van primaire alcoholen. Onlangs vermeldde Metha (J. Bacteriol. 124:
1165 - 1167 (1975)) een NAD-gekoppelde alcoholdehydrogenase uit een gist-gegroeid op methanol. Dit primaire alcohol dehydrogenase oxydeert tevens 2-propanol. Tevens vermeldt het artikel dat dit alcoholdehydrogenase zeer instabiel was, dat het zijn enzymactiviteit binnen
24 uren na viervoudige zuivering verloor. Resultaten van eerdere onderzoekingen hebb en echter aangetoond, dat de secundaire alcoholdehydrogenase van de uitvinding een secundair alcohol-specifiek enzym is, met de grootste activiteit ten opzichte van 2-propanol en 2butanol en zonder activiteit ten opzichte van primaire alcoholen.
<EMI ID=382.1>
1. Werkwijze voor het enzymatisch omzetten van een organisch substraat, met het kenmerk, dat een organisch substraat geko-
<EMI ID=383.1>
omstandigheden in aanraking wordt gebracht met rustende microbiële cellen afgeleid van een methylotroof microorganisme dat oxygenase of dehydrogenase enzymactiviteit bevat of een uit deze cellen afge-
<EMI ID=384.1>
onder aerobe omstandigheden in een een C.-verbinding bevattend voe- dingsmiddelmedium dat in staat is de koolstof- en energiebron te leveren voor de groei van de cellen en in staat is oxygenase-enzymactiviteit in de cellen te induceren voor de oxydatie van de genoemde al-
<EMI ID=385.1>
datie van de genoemde alcoholen.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de
<EMI ID=386.1>