La présente invention concerne la détection de la
présence et de la concentration d'une espèce de composés non
liés., par exemple des hormones. dans un échantillon liquide
comme du sérum. Plus particulièrement, l'invention concerne
un mode opératoire convenant bien à la détection d'une espèce
libre de composés du type capable de se lier de façon réversible
à une protéine dans des échantillons contenant l'espèce libre,
la protéine de liaison et une certaine concentration d'un
complexe espèce-protéine.
La technique "du dosage par compétition" pour mesu-
rer, à des fins de diagnostic, la concentration de diverses
substances douées d'une activité biologique est maintenant bien
connue et admise. La technique implique un système de réaction
dans lequel on fait incuber de l'anticorps spécifique de
l'espèce à déterminer avec l'échantillon d'essai et une partie
aliquote d'un analogue de l'échantillon pouvant être distingué. L'analogue et l'espèce naturelle entrent en compétition pour
les sites de fixation sur l'anticorps et, après séparation de l'anticorps et du reste du système de réaction, on peut doser
l'analogue dans l'anticorps ou le liquide surnageant. La quantité d'analogue associée à l'anticorps est une fonction inverse
de la concentration de l'espèce que l'on souhaite déterminer
dans l'échantillon.
Deux procédés courants pour effectuer de telles déterminations impliquant une compétition sont connus sous le
nom de "dosage radio-immunologique en phase liquide" et "dosage radio-immunologique en phase solide". Dans chaque système, la
substance immunogène liée à un anticorps doit être enlevée de
la substance immunogène non liée afin de permettre une mesure
de la quantité d'analogue marqué fixé à l'anticorps. A partir
de cette mesure, on détermine la quantité de substance immunogène existant dans l'échantillon.
Dans. les dosages radio-immunologiques "en phase
liquide", on fait incuber en solution l'anticorps, l'analogue
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nombre de sites de liaison de l'anticorps sont disponibles et
la réaction s'effectue rapidement. Pour séparer la substance immunogène complexée avec .1'anticorps, d'une part, de la substance immunogène non complexée, d'autre part, on précipite le complexe
<EMI ID=2.1>
le liquide surnageant.
Les dosages radio-immunologiques "en phase solide" évitent l'étape de la précipitation. L'anticorps est lié à un
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fugation des morceaux de verre ou une décantation des tubes revêtus sépare la substance immunogène complexée avec l'anticorps, d'une part, de la substance immunogène non complexée,
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un certain nombre de sites actifs disponibles sur l'anticorps sont bloqués par le morceau de verre ou par le tube.
Des hormones comme celles excrétées par la thyroïde, les testicules, les ovaires, le cortex surrénal, et d'autres glandes de mammifères, sont souvent transportées dans le
système circulatoire en association avec des protéines ou globulines capables de fixer ces hormones. Souvent, il est important pour le diagnostic de pouvoir déterminer la présence et la concentration d'une hormone libre par opposition à de l'hormone liée à une protéine ou à l'hormone totale. Par exemple, la thyroxine (T4) existe dans le courant sanguin en équilibre dynamique sous forme d'une espèce liée à une protéine de transport (globuline de liaison de la thyroxine, albumine ou pré-albumine) et, en une faible fraction (potentiellement 0,1 %
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du système des hormones thyroïdiennes. Malheureusement, la méthodologie des dosages de T. libre est pénible, compliquée, onéreuse et sujette à des erreurs en raison de la difficulté de normalisation des matières et de mesure de très faible quantité d'une hormone non liée en présence de quantités surabondantes d'une hormone liée de façon relativement lâche à une protéine. Le mode opératoire de dosage par compétition, indiqué ci-dessus, n'est pas: capable de déterminer les concentrations des composés ou espèces libres.
Parmi les procédés pour mesurer T. libre et d'autres hormones existant"in vivo" sous forme de complexes protéiniques, le procédé utilisant une membrane de dialyse assure un degré élevé de précision. On met un sac de dialyse, contenant des quantités connues, du sérum' à. vérifier et d'une hormone marquée, en suspension dans un tampon. L'hormone marquée se répartit entre les états libre et lié dans les mêmes proportions que l'hormone du sérum. La masse d'hormone marquée que l'on ajoute doit être extrêmement faible afin d'éviter de perturber gravement le système mais le taux de comptage doit être élevé pour permettre la détection de faible quantité. Dans le cas
des marques radio-actives, cela exige d'utiliser une hormone marquée ayant une très grande activité spécifique. Au bout d'une période convenable (environ 24 heures) l'hormone marquée et l'hormone naturelle non liée à une protéine diffusent à travers le sac semi-perméable de dialyse cependant que l'hormone liée
à une protéine (poids moléculaire supérieur à 20 000) demeure dans le sac de dialyse. Pour déterminer la quantité d'hormone libre présente dans le sérum, on dose l'hormone marquée dans une partie aliquote du tampon. A la suite de ce dosage, on peut calculer la fraction d'hormone marquée ayant pénétré dans le tampon et en déduire la fraction d'hormone totale existant à l'état libre. Pour transformer cette fraction en unités massiques
(par exemple ng/dl) d'hormone libre, il faut également effectuer sur l'échantillon un dosage d'hormone totale.
Ce système et ce procédé peuvent donner des résultats
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hormones libres mais cela ne convient que médiocrement pour une application de routine à des dosages en série. Il faut effectuer deux dosages, et la précision du résultat final peut être compromise par l'un ou l'autre mode opératoire. Il faut utiliser des quantités relativement grandes de radio-activité par dosage. Des impuretés gênantes présentes dans l'hormone marquée peuvent soulever des problèmes spéciaux et il faut de longues durées d'incub ation. On ne peut utiliser que du sérum, et il doit être extrêmement frais. En outre, la collecte et la normalisation de toutes les matières nécessaires pour le dosage ne peuvent s'effectuer que de façon routinière ou courante. Ainsi, l'application
du mode opératoire est limitée en raison du prix de revient
élevé et de la quantité de travail que ce procédé exige, ainsi que de l'obligation de faire appel à un personnel expérimenté.
Un autre procédé de dosage d'une hormone libre met en jeu la cinétique de la réaction et exige deux dosages séparés. Chaque dosage mesure une courbe cinétique liée à la rapidité avec laquelle un anticorps capture une hormone, par
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primaire de liaison comme une globuline de liaison de la thyroxine-
Dans un tel système de dosage, des imprécisions proviennent d'états pathologiques graves. S'il y a plus de sites de liaison à la protéine que le nombre habituel, l'attraction effective de la globuline pour l'hormone sera supérieure et la vitesse de liaison à un anticorps diminuera. Dans le cas de l'analyse de la thyroxine, cela risque d'apparaître comme si l'échantillon comportait peu de T4 alors qu'en fait il risque de
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liée.
En somme, la présente invention propose un procédé, un corps pouvant réagir et un nécessaire d'essai pour le dosage direct des hormones non liées et d'autres espèces analogues. Le dosage peut être effectué en présence des protéines du sérum et de l'hormone liée.
Selon l'invention, on fait incuber des micro-capsules semi-perméables, contenant de l'anticorps complémentaire de l'hormone ou d'une autre espèce à déceler, avec à la fois un analogue de l'hormone pouvant s'en distinguer et avec l'échantillon d'essai. L'analogue peut, avant l'incubation, être introduit dans les microcapsules en des quantités telles que l'anticorps soit saturé en site de liaison de l'hormone. Les parois des micro-capsules constituent des membranes séparant l'échantillon d'essai de l'anticorps et elles ont une perméabilité suffisante pour permettre le passage de l'espèce libre et de son analogue mais insuffisante pour permettre le passage de l'anticorps, des protéines naturelles ou d'une hormone liée à une protéine.
Lorsqu'on ajoute un échantillon d'essai à une quantité déterminée ou partie aliquote des micro-capsules, de l'hormone libre diffuse à travers les membranes et entre en compétition avec son analogue pour se fixer sur les sites de l'anticorps. Ainsi, la distribution de l'analogue entre l'anticorps et le reste du système de réaction devient une indication de la quantité de l'hormone libre présente à l'origine dans l'échantillon. Ce mode opératoire combine la précision inhérente à un dosage radioimmunologique classique en phase liquide et la simplicité et
la commodité d'un dosage en phase solide.
On sépare ensuite l'anticorps avec l'hormone qui
lui est liée (et l'analogue lié) de l'espèce libre, et l'on dose l'analogue dans l'anticorps ou dans le reste du système
de réaction. On peut effectuer la séparation en provoquant une modification osmotique entraînant l'affaissement des capsules
et la migration hors de celle-ci des hormones non liées. On
peut y parvenir, par exemple, en ajoutant de la sérum-albumine
ou de la polyéthylène-imine au système, ce qui favorise la
sortie du liquide intra-capsulaire. En variante, on peut tout simplement enlever l'espèce libre par lavage des microcapsules. On interprète les résultats en comparant le dosage
de teneur en analogue à un témoin, comme une courbe de la concentration de l'hormone libre en fonction du comptage de radio-activité, de l'intensité d'une fluorescence ou d'une
autre caractéristique du marqueur servant à indiquer la présence de l'analogue.
Le dosage peut servir à déceler la présence et/ou
la concentration de la thyroxine libre, de la tri-iodo-thyronine, de la thyroxine nêonatale, de la testostérone, du cortisol, d'autres hormones stéroïdes, et d'autres substances se liant de façon réversible à une protéine. Le dosage peut également servir à déceler des espèces qui ne se lient pas à un degré important
à une protéine, par exemple des produits ou drogues comme la digoxine. On peut déterminer pratiquement n'importe quelle matière pourvu que l'on dispose d'une substance complémentaire
de liaison et d'un analogue de la matière pouvant s'en distinguer, ou pourvu qu'on puisse produire une telle substance ou un tel analogue.
Le dosage peut être effectué en série lorsqu'on utilise un nécessaire d'essai comprenant de l'analogue, des micro-capsules contenant des quantités témoins d'anticorps et
des témoins à blanc contenant des concentrations prédéterminées de l'espèce en cause, ainsi qu'un corps pouvant réagir pour enlever des capsules, après achèvement de l'incubation, l'espèce non liée et l'analogue. Pour permettre un contrôle de la qualité, la solution présente dans la. micro-capsule peut être colorée. L'existence d'un liquide surnageant coloré, après dépôt ou sédimentation des capsules par centrifugation, risque ainsi d'indiquer une rupture des micro-capsules et une perte éventuelle d'anticorps. Contrairement à. des dosages classiques, le dosage de l'invention évite une perte de corrélation clinique avec des états diagnostiqués dans une large plage de concentrations
de la protéine, de l'hormone et des substances gênantes.
L'invention vise à proposer un procédé rapide, simple et reproductible de détection de la présence et de la concentration d'une espèce non liée à une protéine dans un échantillon liquide, un corps pouvant réagir et qui est utile pour de tels dosages, et un nécessaire d'essai convenant pour conduire rapidement et commodément de tels dosages. L'invention vise
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dans des échantillons extraits du sang humain et contenant T4 liée à une protéine.
L'invention vise également à proposer un procédé faisant appel à une compétition pour la détermination d'une substance immunogène. Ce procédé combine les avantages d'un système pour dosage radio-immunologique en phase solide et les avantages d'un système pour dosage radio-immunologique en
phase liquide. L'invention vise également à proposer un procédé hautement fiable pour la détermination de la quantité de digoxine présente dans du sérum.
Ces objets, caractéristiques et avantages de l'invention, ainsi que d'autres encores, apparaîtront à l'examen de la description détaillée suivante faite, à titre nullement limitatif, en regard des dessins annexés sur lesquels :
la figure 1 illustre une courbe de référence réalisée selon le mode opératoire de l'invention. Cette courbe indique <EMI ID=10.1>
de l'axe des ordonnées (axe des y) en fonction de la concentration de T4 libre, en ng/dl, sur une échelle logarithmique de l'axe des abscisses (axe des x) ; (voir les données correspondantes au tableau I) ; la figure 2 illustre une seconde courbe de référence pour un dosage de T 4 libre selon l'invention en coups par minute (échelle linéaire sur l'axe des ordonnées) en fonction de T4 libre, en ng/dl (échelle logarithmique sur l'axe des abscisses). Les données correspondant à. cette figure se <EMI ID=11.1> la figure 3 est un graphique présentant, en fonction du temps (en heures, en abscisses) le taux de comptage (en coups par minute, cpm, en ordonnées) dans le cas de T4 (125I) <EMI ID=12.1>
semi-perméables immergées dans des solutions type ou titrées
de T4 libre. A mesure que T4 du sérum remplace T4 ( 125 I) aux sites de liaison de T. sur l'anticorps, le taux de comptage caractérisant l'hormone restant en association avec l'anticorps diminue. On note que le taux de remplacement est largement linéaire jusqu'à 2 heures d'incubation à 37[deg.]C ; la figure 4 est un graphique illustrant la corrélation des résultats (dosage de T4 libre, en ng %) entre la technique de dosage par dialyse (en ordonnées ; ng % D) et le système de dosage radio-immunologique avec micro-encapsulation
(en abscisses; ng % R) ; la figure 5 est un graphique illustrant la plage <EMI ID=13.1>
micro-encapsulation (ordonnées : nombre d'échantillons ; abscisses : T4 libre en ng %) ; la figure 6 est un graphique illustrant la corréla- <EMI ID=14.1>
que l'on obtient par dosage radio-immunologique cinétique et
par le système de dosage avec micro-encapsulation selon l'invention ; la figure 7 montre, à partir des résultats apparaissant au tableau V, une courbe de référence pour la digoxine ; l'échelle linéaire des ordonnées indique le nombre de coups par minute (cpm) x 1Q<3> dans le cas de la digoxine liée ou fixée à de l'anticorps, et l'échelle logarithmique des abscisses indique
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semi-logarithmique ; la figure 8 montre le pourcentage de digoxine liée (pourcentage relatif), en ordonnées, linéaires, en fonction
de la concentration de la digoxine (en abscisses logarithmiques, ng/ml). Le pourcentage de digoxine liée (pourcentage relatif)
est calculé, (à partir des résultats du tableau VIII) par la formule suivante :
Pourcentage relatif de substance liée = nombre moyen de coups
par minute (cpm) de la substance liée/nombre moyen de cpm de la substance liée correspondant
à 0 ng/dl de digoxine sur la courbe de référence X
100 ; et la figure 9 est un schéma montrant la rétention de l'anticorps spécifique de la digoxine (9) et le libre passage de la digoxine (16) et/ou de la substance immunogène (18) dans des microcapsules formées selon la présente invention.
Le procédé de l'invention exige l'incubation de l'échantillon, contenant l'espèce ou composé à déceler, avec un anticorps complémentaire de cette espèce (ou une autre substance capable de se lier réversiblement avec l'espèce) et un analogue
de l'espèce pouvant être distingué, et la séparation de l'échantillon et de l'anticorps par une ou des membranes semiperméables empêchant le passage de protéines à poids moléculaire élevé..
Des anticorps de l'espèce choisie peuvent être produits selon des techniques bien connues impliquant l'injection de l'hormone, éventuellement avec un adjuvant, à des
animaux de laboratoire puis l'extraction et la purification des anticorps produits. De nombreux anticorps de ce genre sont disponibles dans le commerce. De nombreux analogues de l'espèce décelable par le procédé de l'invention, et que l'on peut distinguer, sont également disponibles dans le commerce ou peuvent être obtenus à l'aide de techniques. connues.. Telles qu'on les utilise ici, les expressions "analogue que l'on peut distinguer" ou "analogue distingable" désignent une molécule ayant des propriétés de fixation à un anticorps semblables à et de préférence identiques à celles de l'espèce que l'on cherche à déceler, et qui se caractérise par une propriété permettant d'obtenir facilement une .mesure de sa concentration.
Des analogues préférés comprennent un échantillon de l'espèce à déceler marqué avec un atome radio-actif : par exemple des hormones thyroïdiennes peuvent commodément être marquées par
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du rayonnement gamma. Cependant, en envisage la possibilité d'utiliser d'autres types d'analogues, tant que l'analogue présente un poids moléculaire et les dimensions résultantes se situant bien au-dessous de ceux des protéines naturelles et de l'anticorps que l'on utilise. Ainsi, on peut produire des analogues en marquant un échantillon de l'espèce à déceler à l'aide d'une enzyme à poids moléculaire relativement bas, d'un fragment fluorescent ou d'un autre fragment permettant une mesure quantitative, par des moyens physiques ou chimiques,
de la concentration de l'analogue.
Pour la mise en pratique du dosage, l'anticorps et l'analogue doivent être séparés de l'échantillon par une ou plusieurs membranes dont la perméabilité suffit à empêcher le passage des anticorps et des protéines naturelles (qui ont uniformément un poids moléculaire excédant 20 000) mais peut permettre le libre passage de l'espèce à déceler et de son analogue. Dans une forme préférée de réalisation de l'invention, les membranes prennent la forme de microcapsules semi-perméables contenant l'anticorps et de l'analogue.
Il est intéressant de noter que les microcapsules semi-perméables que l'on utilise ont une perméabilité semblable à celle des membranes de dialyse décrites ci-dessus. Cependant, la paroi des microcapsules semi-perméables est des centaines de fois plus mince que des membranes classiques de dialyse, et sa surface spécifique de contact par unité de poids est supérieure d'un certain nombre d'ordre de grandeur. T4 libre ou d'autres
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déplacent, en proportion de leur concentration, T4 marquée de T4 fixée sur l'anticorps- Ainsi, on se rapproche, au cours de la période d'incubation d'un équilibre entre T4 libre et T4 marquée dans la capsule.
Des procédés convenables pour encapsuler des
.matières biologiques dans.des membranes ayant les propriétés précitées de perméabilité sont décrits en détail dans les demandes de brevets des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 606 166, <EMI ID=18.1>
et n[deg.] 30 847 déposée le 17 avril 1979, ainsi que dans la
demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 24 600 déposée
par F.Lim le 28 mars 1979. Le procédé actuellement préféré
pour produire de telles microcapsules obtient, par une technique de polycondensation interfaciale, des membranes de polyamide semi-perméables. On choisit des solvants ou des systèmes de solvants mutuellement non miscibles les uns dans les autres,
par exemple de l'eau et un solvant à base de cyclohexane, et
l'on dissout dans l'eau, avec la matière à encapsuler, un monomëre capable de former, avec un second monomère complémentaire,
un polymère. On émulsifie ensuite au sein de l'autre solvant, le solvant aqueux contenant la matière à encapsuler, afin de
former plusieurs gouttelettes séparées. On ajoute ensuite à la phase continue de l'émulsion le second monomère complémentaire pour amorcer la polymérisation autour des gouttelettes à la limite des phases. On règle la perméabilité de la membrane et l'uniformité des dépôts de polymère en faisant varier l'affinité de la phase continue de l'émulsion pour le monomère encapsulé
au cours de la polymérisation et en réglant la concentration des monomères soumis 3 la réaction et la durée de la polymérisation.
Dans une approche, la phase continue est au début
un solvant ou un système de solvants présentant une affinité relativement grande pour le monomère encapsulé de sorte que,
dans un premier stade de la polymérisation, il se produit autour des gouttelettes un réseau de polymère relativement épais. Puis, la phase continue est modifiée de façon à diminuer son affinité pour le premier monomère, par exemple en diluant la phase continue avec un second.solvant ou bien en remplaçant la phase continue par un solvant frais . Lors de l'addition du second monomère, une polymérisation supplémentaire se produit de préférence au sein du réseau de polymère initialement déposé, en recouvrant des défauts de macroporosité et en aboutissant à des membranes de capsules uniformes permettant la diffusion des solutés au-dessous d'un certain poids moléculaire.
Dans une autre approche, la phase continue est choisie, au début, de façon. à présenter une faible affinité
pour le monomère encapsulé. de manière 5 former des membranes minces et relativement denses dans un premier stade de la polymérisation. Puis l'affinité de la phase continue pour le monomère encapsulé est accrue afin de faire passer des quantités supplémentaires du monomère à travers la membrane et de provoquer le dépôt d'une seconde couche externe de polymère insoluble.
Lorsque la phase discontinue des gouttelettes aqueuses est tamponnée de façon à assurer un environnement compatible à des matières biologiques labiles comme un anticorps, on peut conduire l'encapsulation de façon à conserver un large pourcentage de l'activité biologique de la matière labile. On conserve également la capacité de fonctionnement de la matière encapsulée en ajoutant en de petites quantités le second monomère
à la phase continue pendant toute la durée de la polymérisation de façon que sa concentration soit relativement faible à n'importe quel moment donné et que l'anticorps ne soit pas exposé à des concentrations élevées de substances potentiellement destructrices.
Dans un système préféré de réaction, des gouttelettes aqueuses contenant une diamine, une matière de charge à poids moléculaire élevé et l'anticorps sont produites dans une phase continue de cyclohexane dont l'affinité pour le monomère dissous dans la phase des gouttelettes est modifiée par l'addition de chloroforme comme diluant. L'addition d'un halogénure de diacide au système aboutit à la formation de microcapsules en polyamide semi-perméables. Cette approche par mtcro-encapsulation peut efficacement produire des membranes
dont la limite supérieure de perméabilité correspond à une
gamme de poids moléculaire se situant entre 2000 et 30 000. Ainsi, les capsules peuvent facilement être modifiées de façon à permettre la diffusion de nombreuses hormones.
Pour conduire le dosage, l'échantillon d'essai est mélangé aux microcapsules du type décrit et mis à incuber, de préférence à 37[deg.]C environ. Avant l'incubation, les capsules peuvent être mises en suspension dans une solution contenant
une concentration de l'analogue de l'espèce suffisante pour charger l'anticorps d'une quantité décelable de cet analogue. Cependant, le dosage peut être conduit par addi.tion de l'analogue au système de réaction pendant ou après incubation avec du sérum. Les protéines de l'échantillon et les complexes protéine-espèces ou composés ne peuvent traverser la paroi des microcapsules.
L'anticorps est ensuite séparé du reste du système de réaction (éventuellement à l'exclusion des membranes des microcapsules) et l'on dose l'analogue dans l'anticorps ou
dans le reste du système. Dans un procédé préféré de réalisation de la séparation, on ajoute une matière hydrophile à poids moléculaire élevé, comme une solution de polyéthylène-imine
ou de la sérum albumine au volume extra-capsulaire. Cela provoque une augmentation de l'osmolarité aboutissant à un affaissement des microcapsules et à la migration de l'hormone intra-capsulaire non liée et de son analogue passant dans le liquide surnageant. Il en résulte une pastille affaissée d'anticorps encapsulé qui, après un traitement facultatif de centrifugation, peut être isolé par aspiration ou décantation du liquide surnageant. En variante, on peut effectuer la séparation en extrayant par lavage l'espèce libre et l'analogue de la capsule.
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correspondantes, présentent les résultats de dosage destinés selon l'invention à déceler la présence de T4 libre, lorsqu'on
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1251 comme analogue, et des solutions contenant une concentration connue de T4 libre. Des essais effectués sur des échantillons inconnus en opérant de façon parallèle au mode opératoire utilisé pour assembler ces données peuvent être interprétés
par référence aux courbes étalon.
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Courbe de référence pour le dosage
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Décompte total
pour T4 (125I) ajoutée 86403
Durée d'incubation : 2 heures à 37[deg.]C
TABLEAU II
Courbe de référence pour le dosage
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Décompte total
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Durée d'incubation : 2 heures à 37[deg.]C L'invention se comprendra mieux à l'examen de
la descripti.on détaillée suivante d'au moins un exemple présenté à titre non limitatif.
Préparation des microcapsules
On prépare une solution de carbonate d'hexanediamine (pH = 8,5 + 0,1) en mélangeant 17,7 ml de 1,6-hexane-
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la solution durant une heure environ ou jusqu'à atteindre le niveau de pH voulu. On prépare une solution de chlorure de têrephtaloyle (TC1) en ajoutant 20 g de TC1 à 200 ml d'un solvant organique constitué par 4 parties de cyclohexane et une partie de chloroforme. On dissout TC1 en agitant vigoureusement
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par minute. On jette tout précipité éventuel.
On mélange 750 ml de cyclohexane avec 125 ml de "SPAN-85" (émulsifiant ester d'acide gras de sorbitane)
dans un mélangeur de 2 litres de capacité muni d'un barreau d'agitation magnétique. Tout en agitant, on ajoute au cyclohexane une solution mélangée obtenue à partir d'un millilitre d'antisêrum de thyroxine (à 4 % dans une solution saline tamponnée par du phosphate ; R.F. Laboratories, Houston, Texas, Etats-Unis d'Amérique, ou Radioassay Systems Laboratories, Carson, California, Etats-Unis d'Amérique) , 25 ml de polyvinylpyrrolidone à 4 % de sérum albumine de bovin et 30 ml d'une solution de carbonate d'hexanediamine. Lorsque les gouttelettes de la dimension voulue ont été produites, on ajoute 70 ml de solution de TC1. Trente secondes plus tard, on ajoute 37,5 ml de TC1. Soixante secondes plus tard, on ajoute 25 ml de chloroforme. On ajoute, à des intervalles de 30 secondes,
trois parties aliquotes supplémentaires de 25 ml chacune de chloroforme.
On recueille les microcapsules en centrifugeant le système de réaction en deux phases, en décantant le liquide surnageant et en mélangeant les capsules avec du "TWEEN 20"
(dérivé polyoxyéthylénique d'un ester partiel d'acide gras
<EMI ID=29.1>
avec une solution saline tamponnée par des phosphates. Les capsules retiennent la polyvinylpyrrolidone, la sérum-albumine de bovin et les matières de charge, ainsi que l'anticorps de thyroxine.
Saturation de l'anticorps par de -1 ' analogue Des microcapsules obtenues selon le mode opératoire ci-dessus peuvent être chargées par de la thyroxine marquée par
125 1 (Cambridge Nuclear Corporation, Billerica, Massachusetts, Etats-Unis d'Amérique) selon les étapes suivantes :
1) On prend 100 tubes normalisés et l'on introduit dans chacun 0,5 ml de suspension des microcapsùles et 1,0 micro-
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microCurie par microgramme)- On laisse incuber à 37[deg.]C durant au moins 30 minutes.
2) On lave les microcapsules avec deux fois leur volume de solution saline tamponnée par des phosphates (0,15 M
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3) On centrifuge à 2000 g durant 15 minutes et l'on élimine par décantation le liquide surnageant.
4) On répète deux fois les étapes 2 et 3.
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fois son volume de la solution saline tamponnée par du phosphate, décrite ci-dessus. Le volume total est de 80 ml. On utilise 0,8 ml de la suspension des microcapsules par essai. Ainsi, les capsules permettent d'effectuer 100 essais.
Mode opératoire pour un essai
1) On place des échantillons d'essai (25 microlitres)
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libre dans des tubes séparés. Sur la courbe de référence provenant du tableau I, on utilise les concentrations de 0,5
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On peut incorporer à la série un tube témoin contenant 25 microlitres de solution saline pour qu'il permette encore de vérifier la précision du dosage.
2) On introduit à la pipette 800 microlitres de
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de présaturation) dans chaque tube.
3) On soumet chaque tube à du tourbillonnement et
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4) Après l'incubation, on introduit dans chaque tube 1,0 ml de solution saline tamponnée par des phosphates
et contenant 2,0 % de polyéthylène-imine (poids moléculaire :
40000-50000).
5) On fait incuber durant 20 minutes supplémentaires.
6) On élimine par décantation le liquide surnageant.
7) Pour chaque tube, on compte durant une minute le nombre de coups dans un ensemble de mesure pour un rayonnement gamma.
Calcul des résultats
1) Chaque fois où l'on effectue un dosage pour déterminer la concentration inconnue de T4 libre dans un ou
des échantillons, il convient de soumettre au même dosage des étalons afin de préparer une courbe de référence.
2) Après achèvement du dosage, on prépare une courbe de référence, comme représentée sur les figures 2 ou 3, en utilisant les valeurs obtenues à l'aide des étalons qui ont été dosés en même temps que les échantillons inconnus.
3) Pour chaque valeur, on peut tracer une courbe
du nombre de coups par minute (cpm), sur l'échelle linéaire d'un papier semi-logarithmique, en fonction de la concentration en . T4 libre, en nanogrammes pour cent, sur l'échelle logarithmique.
Au lieu de tracer la courbe du nombre de coups par minute (cpm) en fonction de la concentration de T4 libre, on peut tracer celles du pourcentage de substance liée (pourcen-
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Pour cela, on calcule le pourcentage de substance liée (pourcentage relatif) pour chaque échantillon étalon, pour un témoin ou pour un échantillon inconnu et l'on reporte les valeurs sur un papier serai- logarithmique, de façon semblable à celle décrite précédemment pour le nombre de coups par minute. On calcule comme suit le pourcentage de substance liée (ou pourcentage relatif) :
Pourcentage de substance liée cpm de la substance liée/nombre
(pourcentage relatif) moyen de cpm de la substance liée
pour l'échantillon étalon présentant la plus faible concentration en T4 libre.
La figure 4 est un graphique montrant la concentra- <EMI ID=38.1>
d'essai dont chacun a été dosé par le procédé de la présente invention et par le procédé de dialyse. On voit qu'il existe un degré élevé de corrélation entre les deux procédés de dosage.
La figure 5 est un graphique indiquant la fréquence d'une concentration en T4 libre donnée (ordonnée nombre d'échantillons présentant une concentration donnée ; abscisse :
T4 en ng %), le graphique se fondant sur environ 200 échantil- <EMI ID=39.1>
ci-dessus La figure 6 est un graphique de la concentration en T4 libre, en ng %, pour environ 100 échantillons d'essai dont chacun a été dosé par le procédé de la présente invention et par la technique de dosage radio-immunologique cinétique. On voit qu'il existe un degré élevé de corrélation entre les deux procédés de dosage.
Le tableau III montre le degré d'accord entre les résultats obtenus pour un même dosage.
TABLEAU III
Variation à l'intérieur d'un .même dosage
(valeurs en ng/dl)
<EMI ID=40.1>
<EMI ID=41.1>
<EMI ID=42.1>
résultats d'un dosage à l'autre.
. TABLEAU IV
Variations d'un dosage à l'autre
(valeurs en ng/dl)
<EMI ID=43.1>
Voici un mode opératoire de dosage de la digoxine.
<EMI ID=44.1>
un anticorps spécifique de la digoxine.
Voici les réactifs utilisés, et l'indication de leur
fournisseur :
Bicarbonate de sodium
Cyclohexane
Chloroforme
Chlorure de sodium Fisher Chemical Phosphate de sodium,monobasique
Phosphate de sodium,dibasique
<EMI ID=45.1>
Antiséruin anti-digoxine de lapin Arnel Products,Brooklyn
New York
Sérum-albumine de bovin
Bleu brillant Comassie R Sigma Chemical Polyvinylpyrrolidone-40 Aldrich Chemical Chlorure de térephtaloyle Eastman Kodak
Voici la quantité utilisée pour chaque ingrédient :
<EMI ID=46.1>
Voici les différentes étapes du mode opératoire.
Avant utilisation, on rince toute la verrerie à l'eau distillée.
1) On place sous la hotte un mélangeur en verre, de 2 litrea, sur un agitateur magnétique.
2) Sur une paillasse voisine de la hotte, on met le microscope en état de fonctionnement.
3) Dans. une éprouvette graduée, en verre, de 250 ml, on mesure soigneusement 125 ml de "Span-85".
4) On verse la quantité mesurée de "Span-85" dans
le mélangeur en verre dans la hotte.
5) On mesure 750 ml de cyclohexane dans une éprouvette graduée en verre de 1000 ml. On verse dans le mélangeur en verre dans la hotte.
6) On place un couvercle sur le mélangeur.
7) On met en marche l'agitateur magnétique.
8) On mesure 30 ml de carbonate d'hexanediamine ;
30 ml de solution saline tamponnée par des phosphates ; 25 ml de polyvinylpyrrolidone à 15 %, bleu de Comassie et 4 % de sérum-albumine de bovin ; 5 ml d'anticorps ; on mélange les 40 ml de solution saline tamponnée avec les 5 ml d'anticorps dans une éprouvette graduée de 50 ml.
9) On place un barreau d'agitation de 5 cm avec une rondelle de rotation dans un bécher de 400 ml. On place sur l'agitateur magnétique.
<EMI ID=47.1>
On démarre le fonctionnement de l'agitateur magnétique.
il} A l'hexanediamine dans le bécher, on ajoute dans l'ordre spécifié ci-après : 25 ml à 15 % de polyvinylpyrrolidone/ bleu de Comassie/4 % de sérum albumine de bovin ; 35 ml de solution saline tamponnée/anticorps. On laisse mélanger durant
2 minutes puis on soumet les solutions à 3 minutes de mélange.
12) Pendant que la solution est soumise à l'action
de mélange, on mesure dans des éprouvettes cylindriques graduées séparées, en verre, de 100 ml de capacité, une portion de 70 ml et une portion de 37,5 ml de TC1 (chlorure de téréphtaloyle) .
On recouvre d'un verre de montre et l'on place dans la hotte.
-On mesure quatre portions de 25 ml de chloroforme dans des éprouvettes cylindriques graduées séparées en verre, de 25 ml. On recouvre d'un verre de montre et l'on place dans la hotte.
13) Par la tubulure latérale d'une fiole, on ajoute
<EMI ID=48.1>
trouvant dans la hotte.
14) Aussi rapidement que possible, on prélève avec une pipette de verre de 1 ml, à jeter après emploi, un échantillon de la solution se trouvant dans le mélangeur que l'on place sur la lamelle de microscope. On détermine la dimension des gouttelettes pour vérifier qu'elles sont bien acceptables
(diamètre de 10 à 80 microns).
15) Lorsque les gouttelettes ont une dimension acceptable, au temps T = 0, on ajoute par la tubulure latérale du mélangeur, la portion mesurée de 70 ml de TC1. A T = 30
(exactement 30 secondes plus tard) , on ajoute la seconde portion de 37,5 ml de TC1 dans le mélangeur par le bras latéral. On mélange durant 60 secondes exactement.
16) Au bout de ces 60 secondes (T = 90) , on ajoute une première portion de 25 ml de chloroforme. On mélange durant
30 secondes (T=120), on ajoute une seconde portion mesurée de
<EMI ID=49.1>
On ajoute une troisième portion mesurée de 25 ml de chloroforme et l'on mélange durant 30 secondes (T=180) . On ajoute une quatrième portion mesurée de 25 ml de chloroforme. On mélange durant exactement 30 secondes (T=210 secondes) . On arrête le mélangeur.
17) On verse le contenu du mélangeur dans deux bouteilles d'un litre, en matière plastique, pour centrifugeuse, qui ont été rincées 3 fois dans de l'eau distillée. On centrifuge durant 3 minutes à 500 tours par minute.
18) On décante soigneusement le liquide surnageant.
19) A chaque bouteille, on ajoute environ 50 ml de solution de "Tween-20" (c'est-à-dire environ le même volume de "Tween-20" que de capsules). On mélange bien avec le dispositif
à barreau d'agitation durant 5 minutes environ.
20) On ajoute environ 10 à 15 ml de solution saline tamponnée dans chaque houteille. On agite bien.
21) On répète 4 à 5 fois l'étape 20.
22) On ajoute 400 ml de solution tamponnée. On mélange bien.
23) On pèse puis,l'on centrifuge les bouteilles
<EMI ID=50.1>
surnageant. On ajoute environ 800 ml de solution saline tamponnée dans chaque bouteille. On agite bien et capsule.
24) On répète 10 fois l'opération de l'étape 23.
Après une aspiration finale, on introduit dans chaque bouteille
100 ml de solution tamponnée et l'on réunit le contenu des deux bouteilles. On secoue bien. On verse dans une éprouvette graduée en verre, de 500 ml, et l'on complète à 500 ml avec de la solution saline tamponnée.
25) On conserve dans une bouteille en verre, d'un litre, pour réactif à 4[deg.]C.
On prépare comme suit la solution de "Tween-20" de lavage. Le mode opératoire peut être appliqué le jour précédent l'utilisation de la solution.
1) On pèse 6,06 g de bicarbonate de sodium sur une balance de précision.
2) On verse soigneusement les 6,06 g de bicarbonate de sodium dans un ballon volumétrique de 250 ml contenant un barreau d'agitation.
3) On ajoute environ 200 ml d'eau purifiée, on place sur l'agitateur magnétique et l'on agite jusqu'à dissolution
du bicarbonate de sodium.
4) On enlève le barreau d'agitation et l'on ajoute de l'eau purifiée pour compléter à 250 ml.
5) On verse soigneusement dans un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml contenant un barreau d'agitation.
6) On mesure soigneusement 250 ml de "Tween-20" dans
<EMI ID=51.1>
7) On introduit le "Tween-20" dans le flacon d'Erlenmeyer contenant la solution de bicarbonate de sodium.
8) On place sur un agitateur magnétique et l'on agite jusqu'à mélange complet (environ 1 heure).
9) On conserve à 25[deg.]C environ dans une bouteille de un litre, en polyéthylène, fermée de façon étanche à l'aide d'une capsule vissée.
On prépare de la façon suivante la solution de chlorure de téréphtaloyle. Cette solution doit être préparée le jour de son utilisation et ne pas être réfrigérée.
1) On note sur la bouteille contenant le chlorure
<EMI ID=52.1>
poids de TC1, en grammes, par dix pour calculer le volume,
en millilitres, de solution de cyclohexane/chloroforme à ajouter à TC1. On s'assure que le volume total est suffisant pour le mode opératoire appliqué.
2) La solution de cyclohexane/chloroforme est constituée par quatre parties de cyclohexane avec une partie
de chloroforme. On divise par cinq le volume total de la solution
<EMI ID=53.1>
calculer le volume de chloroforme. On multiplie ce volume de chloroforme par quatre pour déterminer le volume de cyclohexane.
Donc :
(a) n millilitres de volume total de cyclohexane/ chloroforme : 5 = ni millilitres de chloroforme ;
(b) n' millilitres de chloroforme x 4 = n" millilitres de cyclohexane.
3) On mesure soigneusement dans des éprouvettes graduées les volumes calculés de cycicnexane et de chloroforme. On mélange dans un flacon d'Erlenmeyer. On fait doucement tourbillonner pour mélanger. On recouvre d'un verre de montre. On place dans
la hotte .
4) On place un agitateur magnétique dans la hotte.
5) On met la bouteille contenant TC1 sur l'agitateur magnétique. On ouvre cette bouteille et l'on y introduit aussi rapidement que possible un barreau d'agitation magnétique et
la solution de cyclohexane/chloroforme. On replace la capsule
(ou le bouchon) sur la bouteille.
6) On agite sur l'agitateur magnétique jusqu'à dissolution de tout le TC1. Il peut s'avérer nécessaire d'incliner ou Même de retourner la bouteille pour dissoudre le TC1 se
trouvant éventuellement autour du sommet de cette bouteille.
7) Aussi rapidement que possible, on verse une même quantité de solution de TC1 dans le nombre nécessaire de bouteilles de verre pour centrifugeuse, de 200 ml de capacité, et l'on ferme. On centrifuge durant 10 minutes à. 2 600 tours par minute à la température ambiante.
8) On verse le liquide surnageant dans des bouteilles de 500 ml, de couleur ambre, que l'on ferme bien.
9) On conserve les bouteilles bien fermées à
<EMI ID=54.1>
de sérum-albumine :
On applique le mode opératoire le jour de l'utilisation de la solution. Il ne faut pas réfrigérer celle-ci.
<EMI ID=55.1>
7,5 g de polyvinylpyrrolidone 40 ; 2 g de sérum-albumine de
bovin et 0,1 g de bleu Comassie.
2) On verse la polyvinylpyrrolidone 40 dans un bêcher de 50 ml en verre, comportant un barreau d'agitation.
3) On ajoute environ 20 ml de solution tamponnée par des phosphates. On place sur le bêcher une plaque de verre formant couvercle.
4) On agite sur un agitateur magnétique jusqu'à dissolution .
5) On verse 0,1 g de bleu Comassie et 2 g de sérumalbumine de bovin dans un autre bécher en verre de 50 ml.
6) On ajoute environ 20 ml de solution tamponnée par des phosphates. On place sur le bécher une plaque de verre de couverture.
7) On agite et chauffe légèrement en utilisant un agitateur magnétique n[deg.] 10 avec plaque chauffante, l'appareil
de chauffage étant réglé à la graduation 2. On laisse sous agitation jusqu'à dissolution (il faut environ 10 minutes) .
8) On introduit soigneusement un barreau d'agitation
et le contenu complet des bëchers contenant la solution de polyvinylpyxrolidone 40 et la solution de bleu Comassie dans un
<EMI ID=56.1>
9) On mélange sur un agitateur magnétique durant
10 minutes les solutions ainsi combinées. On enlève le barreau d'agitation.
<EMI ID=57.1>
par des phosphates.
11) A l'aide d'une solution 1 N d'hydroxyde de sodium,
<EMI ID=58.1>
d'origine, du pH final et de la quantité de NaOH 1 N que l'on utilise).
12) On filtre la solution avec un dispositif de filtration sur membrane "Nalgêne" à jeter après emploi (0,45 micron) .
<EMI ID=59.1>
polyéthylène, de 60 ml, fermée de façon étanche par un bouchon ou une capsule vissée.
Voici le mode opératoire pour préparer la solution saline tamponnée par des phosphates.
Ce mode opératoire peut être appliqué le jour précédent l'utilisation.
1) Dans une éprouvette cylindrique graduée en verre, de 1000 ml, on mesure soigneusement 1000 ml de la solution saline de réserve tamponnée par des phosphates.
2) On verse dans une bonbonne de polyéthylène de
20 litres.
3) A l'aide d'une éprouvette cylindrique graduée en
<EMI ID=60.1>
introduit dans la bonbonne contenant la solution saline tamponnée.
4) On agite à l'aide d'un agitateur à barreau magnétique.
5) On vérifie le pH que l'on ajuste, si nécessaire, à
<EMI ID=61.1>
6) On conserve la solution saline tamponnée par des phosphates dans la bonbonne de 20 litres, en polyéthylène, fermée de façon étanche. On conserve à 25[deg.]C environ jusqu' à utilisation.
Voici le mode opératoire pour préparer du carbonate de 1,6-hexanediamine.
Ce mode opératoire peut être appliqué le jour précédant l'utilisation.
1) On place une bouteille de 1,6-hexanediamine dans un bêcher de 3 litres. On introduit dans ce bêcher suffisamment d'eau du robinet pour atteindre le niveau de l'hexanediamine dans la bouteille.
2) On soulève le bouchon ou la capsule de la bouteille
<EMI ID=62.1>
3) On place le bêcher sur un agitateur magnétique à plaque chaude, dont le dispositif de chauffage est réglé à
la graduation 2, jusqu'à fusion complète de l'hexanediamine.
4) Dans une éprouvette cylindrique graduée en verre, de 25 ml, on mesure de façon précise 17,7 ml d'hexanediamine. On verse soigneusement dans une bouteille de 500 ml, de couleur ambre.
5) On mesure précisément 32 ml d'eau purifiée dans une éprouvette cylindrique graduée en verre, de 50 ml. On ajoute cette eau à l'hexanediamine dans la bouteille de couleur ambre.
6. On fait barboter dans la solution du C02 durant une heure environ jusqu'à ce que le pH soit égal à 8,5 + 0,1. On note le pH finalement obtenu.
7) On ferme bien la bouteille de couleur ambre qu'on conserve à 25[deg.]C environ.
La figure 9 montre schématiquement la microcapsule et le principe de son fonctionnemen t. On voit sur cette figure 9 de l'anticorps 9, spécifique de la digoxine, qui est enfermé au sein de la paroi 10 de la microcapsule 12. Cependant, la paroi 10 de la microcapsule 12 présente des ouvertures 14 assez petites pour permettre le libre passage de la digoxine. Ainsi, de la digoxine 16 provenant de l'échantillon et de la digoxine marquée 18 peuvent librement traverser les parois des microcapsules et entrer en compétition l'une avec l'autre pour les sites de l'anticorps 9. Une fois l'incubation achevée, la digoxine
16 ou 18 éventuellement non liée peut être éliminée par lavage de l'intérieur de la microcapsule.
Comme indiqué ci-dessus, une partie de la digoxine est marquée, et cette digoxine marquée entre en compétition avec de la digoxine non marquée provenant de l'échantillon pour les sites de l'anticorps spécifique de la digoxine. La digoxine marquée préférée est (125I)-digoxine que l'on peut obtenir
par exemple chez New England Nuclear Corporation, Billerica, Massachusetts, Etats-Unis d'Amérique.
Voici le mode opératoire de l'essai de. dosage.
1) On obtient par un mode opératoire hien connu en pratique un ou des échantillons: du sérum à essayer. Dans le présent exemple, on utilise des témoins.
2) A l'aide d'une pipette, on introduit 0,1 ml
<EMI ID=63.1>
ou de sérum d'un patient inconnu, dans des tubes marqués de façon correspondante et contenant 0,5 ml de suspension des microcapsules d'anticorps de digoxine qu'on obtient comme décrit ci-dessus.
3) A l'aide d'une pipette, on introduit dans chaque
<EMI ID=64.1>
solution saline tamponnée par des phosphates). On fait tourbillonner durant 3 à 4 secondes au moins.
4) On fait incuber tous les tubes de réaction dans un bain-marie à 37[deg.]C durant au moins 15 minutes. /En variante, on fait incuber tous les tubes de réaction à la température ambiante (20[deg.]-25[deg.]C) durant au moins 30 minutes?.
<EMI ID=65.1>
dans chaque tube. On fait tourbillonner durant 3 à 4 secondes au moins.
6) On fait incuber tous les tubes de réaction à la
<EMI ID=66.1>
7). On centrifuge tous les tubes à 1600 g au moins durant 10 minutes à la température ambiante (20[deg.]-25[deg.]C) et l'on décante le liquide surnageant dans un récipient approprié, destiné à recevoir les rebuts ; on recueille la dernière goutte sur du papier buvard ou un autre papier absorbant.
8) Dans un ensemble de comptage pour rayonnement
gamma, réglé pour 125 I, on soumet tous les tubes à une minute
de comptage pour chaque tube.
9) On trace une courbe de référence montrant la relation entre des quantités connues de digoxine et le nombre
de coups mar minute, et on lit sur cette courbe les quantités inconnues de digoxine.
Voici des détails sur les réactifs utilisés :
L'anticorps de digoxine est encapsulé dans des microcapsules semi-perméables en "nylon" en suspension dans une solution saline tamponnée par des phosphates, telle que préparée ci-dessus.. Pour un contrôle de qualité, les microcapsules contiennent en plus de l'anticorps. un colorant bleu
<EMI ID=67.1>
couleur bleue, après dépôt ou sédimentation des microcapsules par centrifugation, indiquerait une rupture des microcapsules et la possibilité d'une fuite de l'anticorps.
Chaque millilitre de solution de digoxine marquée
<EMI ID=68.1>
à moins de 4,2 microCurie.
La solution tampon est un tampon de phosphates
0,015 M à pH 7,5, contenant du chlorure de sodium 0,15 M, 0,5 % de sérum-albumine de bovin et 0,1 % d'azoture de sodium.
La solution de lavage est une solution à 20 % de
<EMI ID=69.1>
pH 8,9, contenant du chlorure de sodium 0,15 M.
Les résultats. d'un essai typique de cette expérience sont présentés au tableau V et, graphiquement, sur les figures 7 et 8.
Sur la figure 7, le nombre de coups par minute
(x 10<3>) est reporté sur l'échelle linéaire des ordonnées d'un papier semi-logarithmique en fonction de la concentration de
la digoxine, en ng/ml (nanogrammes/millilitre) sur l'échelle logarithmique des abscisses. Au lieu de tracer la courbe des coups par minute en fonction de la concentration de la digoxine, on peut tracer la courbe du pourcentage de substance liée
(pourcentage relatif), sur l'échelle linéaire des ordonnées,
en fonction de la concentration de la digoxine (sur l'échelle logarithmique des abscisses : voir figure 8). On peut y parvenir en calculant le pourcentage de substance liée
(pourcentage relatif) pour chacun des échantillons titré, témoin, ou inconnu et en reportant ces valeurs sur du papier semi-logarithmique, d'une façon semblable à celle décrite cidessus dans le cas des coups par minute. Le pourcentage de substance (pourcentage relatif) se calcule comme suit :
Pourcentage de substance liée (nombre moyen de coups par
(ou pourcentage relatif) minute de la substance liée, dans
le cas de la solution titrée ou étalon à 0 ng/ml de digoxine)
X 100.
TABLEAU V
<EMI ID=70.1>
Nombre total de CPM : 26780
<EMI ID=71.1>
* = nombre de coups. par .minute de la substance liée dans le
cas d'une teneur nulle (0 ng/ml) de digoxine.
Le procédé de l'invention propose un dosage qui s'est
<EMI ID=72.1>
inférieure à 7 % et la variation d'un dosage à l'autre est inférieure à. 9 %.
Voici les coefficients de variation. (CV) pour deux échantillons témoins, dont chacun a été soumis 25 fois à des opérations de dosage groupées en une même expérience :
<EMI ID=73.1>
Voici les coefficients de variation, d'un dosage à l'autre, pour deux échantillons témoins ayant subi chacun trois essais au cours de dix huit expériences séparées :
<EMI ID=74.1>
Le tableau VImontre que le dosage de l'invention présente pour la digoxine une spécificité extrêmement élevée et exclut d'autres substances risquant éventuellement de gêner le dosage. Ce tableau montre le pourcentage de réactivité croisée de divers composés biochimiques en présence d'antisêrum antidigoxine dans des microcapsules.
TABLEAU VI
<EMI ID=75.1>
Le présent procédé s'est avéré être hautement quantitatif en permettant de récupérer au moins 96 % de la digoxine ajoutée dans les échantillons.
: TABLEAU VII
<EMI ID=76.1>
Il est particulièrement important de noter le degré élevé de corrélation entre les résultats obtenus à l'aide du procédé de l'invention et les déterminations de la digoxine effectuées par d'autres procédés de dosage-
Le tableau VIII montre des résultats d'essais comparatifs que l'on obtient avec le procédé de la présente invention et avec d'autres procédés de dosage.
Les systèmes A et C représentent des systèmes ou réactifs pour dosage en milieu liquide avec séparation des réactifs par précipitation, cependant que le système B utilise une séparation de la phase solide. On voit que le coefficient
<EMI ID=77.1>
lons dosés à l'aide du réactif ou système A, du réactif ou système B, du réactif ou système C et du réactif ou système de la présente invention.
TABLEAU VIII
ACCORD ENTRE DIVERS MODES OPERATOIRES DE DOSAGE
<EMI ID=78.1>
Il ressort de ce qui précède que la technique de dosage décrite ici peut servir à déterminer la présence et la concentration de n'importe quelle espèce libre, pourvu que l'on dispose d'une substance complémentaire capable de se lier spé-cifiquement à cette espèce et que l'on dispose d'un analogue de l'espèce pouvant s'en distinguer. Il faut aussi que le poids moléculaire de l'espèce ou du composé et de son analogue
soit suffisamment faible pour que l'on puisse utiliser des membranes de microcapsules permettant une diffusion sélective de ces substances tout en empêchant le passage de matières à poids moléculaire élevé comme les protéines naturelles. Heureusement, des hormones stêroldes, des hormones thyroïdiennes,
de nombreux produits pharmaceutiques, de nombreuses drogues et d'autres classes de substances présentant de l'importance
dans le domaine clinique se caractérisent par des dimensions moléculaires bien inférieures à celles des protéines naturelles.
Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé et au nécessaire de dosage décrits et représentés.