COMPOSITION PHARMACEUTIQUE AYANT UNE ACTIVITE ANTITUMORALE
La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique formée par une liaison amide entre un anticorps,extrêmement pur, aux anti-
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La présente invention se rapporte plus particulièrement à une composition pharmaceutique qui ne provoque aucun effet secondaire, tel que pyrexie et choc anaphylactique lorsqu'elle est administrée.
La présente invention a encore pour objet un anticorps extrêmement pur aux antigènes tumoraux, qui peut être utilisé pour la préparation des compositions pharmaceutiques précitées.
Jusqu'à très récemment, différents types de compositions pharmaceutiques
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tinaux. Aussi, pour le moment, leur utilisation est-elle relativement restreinte.
Plus récemment, l'utilisation d'une substance obtenue par liaison chimique d'un anticorps aux antigènes tumoraux (que l'on appelle dans la présente'anticorps antitumoraux) avec une substance antitumorale telle qu'un agent antitumoral, a été tentée. Cependant, comme les anticorps antitumoraux utilisés pour la préparation de cette substance ne sont pas suffisamment purs
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rer en tant qu'anticorps antitumoraux purs.Aussi, dans le cas où une substance obtenue par liaison d'un anticorps antitumoral avec une substance antitumorale est administrée en tant qu'agent antitumoral, l'apparition de pyrexie et de
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tumoral précité est inévitable.
Les inventeurs ont pris en considération les inconvénients précités et ont cherché à éliminer les effets secondaires résultant de l'emploi d'anticorps antitumoraux et leurs recherches ont permis de constater qu'un anticorps antitumoral extrêmement pur est obtenu par purification de la fraction immunoglobuline de l'antisérum par une technique de chromatographie par affinité, et qu'une composition pharmaceutique obtenue par liaison de l'anticorps puri-
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xyle ou un groupe amino, ne donne pas lieu aux effets secondaires précités.
La présente invention a, par conséquent, pour objet une composition pharmaceutique ayant une cytotoxicité faible et présentant par ailleurs une activité antitumorale excellente. Elle se rapporte également à un anticorps antitumoral présentant une pureté élevée, et se rapporte à la méthode de préparation de cet anticorps antitumoral.
D'autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des figures jointes, données à titre illustratif mais non limitatif.
La Figure 1 présente un spectre d'absorption infrararouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'une <EMI ID=6.1> La Figure 2 présente un spectre d'absorption infrarouge d'un anticorps purifié résultant de purification par chromatographie par affinité d'un antisérum d'un patient de sexe masculin ayant un cancer du rectum. La Figure 3 présente un spectre d'absorption ultra-violet de l'anticorps purifié précité. La Figure 4 présente un spectre d'absorption infrarouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'une souris à un chlorhydrate de doxorubicine, conformément à la présente invention. La Figure 5 présente un spectre d'absorption infrarouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'un rat au chlorambucil, conformément à la présente invention.
La Figure 6 présente un spectre d'absorption infrarouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'un rat à 1'uramustine, conformément à la présente invention. La Figure 7 présente un spectre d'absorption infrarouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'un lapin à la cytarabine, conformément à la présente invention. La Figure 8 présente un spectre d'absorption infrarouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'une souris <EMI ID=7.1>
La caractéristique principale de la présente invention réside dans ce que la composition pharmaceutique obtenue par liaison d'un anticorps antitumoral purifié, obtenu par purification par chromatographie par affinité d'une substance antitumorale ayant au moins un groupe amino carboxyle, peut être utilisée en tant que constituant actif de la composition pharmaceutique selon la présente invention.
L'anticorps antitumoral conforme à la présente invention est obtenu par
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meurs de types Sarcome-180, cancer des poumons de Sato, leucémie L-1210, leucémie P-388, cancer d'Ehrlich, sarcomie d'Yoshida, leucémie lymphatique aiguë, tumeur médullaire, ou autres cancers humains, par une technique de chromatographie par affinité.
La préparation de l'anticorps aux antigènes tumoraux précités lui-même peut être effectuée par les méthodes décrites dans "Proceedings of theVIthAnnual Meeting of Japan Society of Immunology", page 198 (1975), ou par la
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Dans la première méthode, on utilise l'adjuvant complet de Freund, et injecte par voie sous-cutanée les cellules tumorales à des animaux expérimentaux afin de les immuniser, et l'anticorps est obtenu à partir des animaux immunisés. Dans la deuxième méthode, un antigène tumoral est injecté,par voie intrapêritonéale,â 3 ou 4 reprises à un animal aux fins de l'immuniser, et l'anticorps est obtenu a partir de l'animal immunisé.
En outre, on peut utiliser conformément à la présente invention aussi bien les alloanticorps que les génoanticorps; cependant, l'emploi de l'alloanticorps est préférable.
Jusqu'à présent, aux fins de purifier un anticorps, la méthode a consisté
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chromatographie par échange ionique avec une colonne de cellulose DEAE, de façon à obtenir la fraction d'immunoglobuline G d'un antisérum.
Selon la présente invention, une procédure de purification spécifique est mise en oeuvre par emploi de la méthode de chromatographie par affinité aux fins d'obtenir par voie sélective uniquement l'anticorps spécifique des
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leur séparation.
La chromatographie par affinité utilisée dans la présente invention comprend:
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tumorales,sont liées par une liaison covalente à un support tel qu'un gel
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d'une colonne à l'aide du support, on fait passer une solution d'anticorps dans la colonne pour que l'anticorps soit lié à l'antigène et, enfin, on fait passer une quantité suffisante du solvant dans la colonne aux fins de le laver de toute trace d'anticorps non-lié, puis on y fait passer une solution tampon à un pH inférieur aux fins de défaire toute liaison entre l'anticorps et l'antigène et d'éluer l'anticorps qui se sépare;
(2) une méthode dans laquelle, sans que l'on emploie une colonne, l'anticorps
est amené à une .liaison'avec l'antigène par mélange du support auquel. l'antigène est lié, ainsi qu'il est décrit ci-dessus et d'une solution de l'anticorps puis, après lavage des particules de support aux fins d'éliminer les anticorps non-lies, l'anticorps est dissout; et
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sées au lieu d'employer le support auquel l'antigène est lié.
Ainsi, l'anticorps purifié obtenu selon la présente invention par la méthode de chromatographie par affinité est une immunoglobuline antitumorale ayant une pureté supérieure à celle des fractions d'immunoglobuline obtenues
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Les substances antitumorales qui sont amenées à être liées par une liaison amido avec les anticorps antitumoraux purifiés obtenus ainsi qu'il est décrit ci-dessus, consistent en les substances antibiotiques, telles,que mytocine C, chlorhydrate de doxorubicine, bléomycine, daunorubicine, actinomycine D et sarcomycine. Les substances antimétabolitiques telles que cytarabine, 8-azaguanine, 5-fluorouracile, méthotrexate et aminoptérine de sodium,
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et quoiqu'elles soient désignées par leur nom commun, leurs structures.sont bien connues et sont notamment décrites dans les articles suivants:
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Ed. par Y. Ueno et al.
Les substances antitumorales précitées sont liées aux anticorps antitumoraux précités par liaison du groupe amino ou du groupe carboxyle de la substance avec, soit le groupe carboxyle ou le groupe amino de l'anticorps, grâce à une mise en réaction de la substance avec l'anticorps dans des conditions douces.
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des groupes amino- ou carboxyles est de préférence misé en oeuvre par mise . en réaction de la substance antitumorale elle-même, ou de son sel de sodium,de potassium ou d'argent, avec un composé présentant la formule générale:
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10 et 40[deg.]C, durant 10 mn à 72 heures.
Par recristallisation du produit de la réaction ainsi obtenu �ans un solvant tel que eau, alcool, chloroforme et dioxane, un dérivé de la substance antitumorale auquel un ou plus groupes amino ou carboxyles sont fixés peut être
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l'acide chloroacétique.
La liaison de l'anticorps antitumoral purifié et de la substance antitumorale comportant au moins un groupe amino ou carboxyle est mise en oeuvre par dissolution des deux réactifs dans un solvant soluble dans l'eau et addition de carbodiimide agissant en tant que catalyseur, la réaction se déroulant à une température comprise entre 0 et 50[deg.]C, de préférence 10 et 40[deg.]C, durant
10 mn à 8 heures, de préférence 30 mn à 5 heures, la réaction étant ensuite arrêtée-par addition d'une solution tampon, telle qu'une solution d'acétate de sodium et d'acide acétique.
Ensuite, afin d'éliminer la substance antitumorale n'ayant pas réagi
le catalyseur et les constituants de la solution tampon et les sels du mélange réactionnel, le mélange réactionnel est soumis à un traitement de.dialyse, de filtration de gel, d'ultrafiltration ou de plusieurs de ces traitements.
Le carbodiimide utilisé dans la réaction précitée en tant que catalyseur
peut être l'un ou l'autre des produits consistant en:
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Dans la composition pharmaceutique obtenue par la réaction précitée, l'anticorps et la substance antitumorale sont liés par une liaison amidique;
le rapport moléculaire anticorps/substance antitumorale est de l'ordre de
1/2 à 5/1 dans le cas où la substance antitumorale est d'origine antibiotique et de 1/1 à 10/1 dans le cas où elle est d'origine antimétabolique ou alkylante.
On trouve ci-dessous des explications du caractère toxicologique, de l'action pharmacologique et de la préparation des substances de liaison, de la composition pharmaceutique du composé selon la présente invention ayant
une liaison amidique entre l'anticorps antitumoral et la substance antitumorale.
La toxicité aiguë est déterminée par l'administration intraveineuse de
300 mg d'une composition pharmaceutique par kg d'une souris à titre d'animaltest. Etant donné qu'aucun décès n'est observé dans le groupe de souris traitées une semaine après traitement, on peut en déduire que la composition pharmacologique peut être utilisée à titre de médicament.
La composition pharmacologique, ainsi que le montrent les Exemples qui suivent, est efficace vis-à-vis d'un grand nombre de cancers, tels que leucémie aiguë, lymphome malin, carcinome, sarcome, épithéliome cilié malin, leucémie myelogène aiguë, mélanome, leucémie lymphatique aiguë, myelome, etc.
Pour la préparation des composés pharmacologiques destinés à être utilisés en tant que médicaments antitumoraux et les méthodes de leur administration, les méthodes généralement utilisées peuvent être employées.
Ainsi, ces médicaments peuvent être administrés par voie orale, par injection ou par voie rectale, et leurs formes d'administration peuvent être quelconques,
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l'administration par injection est effectuée de préférence.
Pour la préparation d'une solution destinée à être injectée, les solvants solubles dans l'eau tels que des solutions de sérum physiologique, d'eau sté-
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des agents isotoniques, des agents analgésiques, des agents de stabilisation, des agents antiseptiques, des agents de suspension, des agents tampon, des agents. émulsifiants, etc., peuvent être utilisés le cas échéant.
Ainsi, par exemple 10 mg de la composition pharmaceutique, et 50 mg de mannitol sont dissouts dans de l'eau distillée-,on obtient 10 ml d'une solution aqueuse, et après stérilisation de la solution par une méthode classique,
la solution stérilisée est introduite dans un appareil pour injection, ou encore, elle est directement séchée par lyophilisation et, avant injection,est diluée à l'aide d'une solution aqueuse de sérum physiologique.
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Quoique la quantité de composition pharmaceutique administrée dépend de Tétât de la maladie, elle est généralement de l'ordre de 0,11 à 9g par jour
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En outre, conformément à la présente invention, comme l'activité antitumorale et tumortrope de l'anticorps et l'activité antitumoralc de la substance antitumorale qui est liée à l'anticorps sont conservées dans la com-
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lorsqu'elles sont administrées; elles arriva: aux sites cibles de la tumeur en donnant lieu à une activité antitumorale efficace.
Aussi, lorsque l'en considère la composition pharmaceutique en tant que base, l'administration de la composition pharmaceutique contenant une quantité
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de a même substance antitumorale donne lieu au même taux d'inhibition quant à la prolifération de la tumeur que l'administration de la substance tumorale elle-même, et le taux d'effets secondaires dus à la substance antitumorale contenue dans la composition pharmaceutique en tant que consti-
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ration comprenant cette substance antitumorale. Ces effets peuvent être considérés comme donnant lieu à une action synergique à propriétés favorables des deux constituants de la composition pharmacologique.
L'invention sera d'ailleurs mieux comprise à la lecture de la description des exemples suivants,et notamment des résultats des tests pharmacologiques de l'agent antitumoral selon la présente invention, donnés à titre illustratif mais non limitatif.
EXEMPLE 1
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méthode de chromatographie par affinité(3).
Après culture des cellules de sarcome-180 de type ascite, obtenues sur
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C à une concentration de 50 microgramme/ml durant 30 mn, à une température de l'ordre de 37[deg.]C, le liquide surnageant est éliminé par centrifugation, et les cellules qui prolifèrent sont lavées, à trois reprises, à l'aide d'une solution
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L'adjuvant complet de Freund (appelé FCA) est additionné aux cellules de sarcome-180 ainsi traitées auxquelles on a enlevé l'activité prolifératrice,' et le ange est injecté par voie sous-cutanée dans 'la voûte plantaire d'un
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Le lapin est immunisé par injection répétée des cellules 2 semaines après la première injection, puis le même nombre de cellules est injecté par voie intraveineuse au même lapin.
Une semaine après la dernière injection, l'ensemble du sang du lapin est recueilli par une canule insérée dans l'artère carotide et l'on prépare un antisérum a partir de ce sang, que l'on purifie alors de la façon suivante:
La fraction relarguée, formée par addition de sulfate d'ammonium, dans
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10 mM aqueuse (appelée dans la présente PBS), à un pH de 7,0, durant 72h.
à une température de l'ordre de 4[deg.]C. (Durant ce traitement, le liquide de dialyse externe a été changé toutes les 24 heures).
Une quantité égale de cellules de sang d'une souris ICR normale, lavée à 3 reprises à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure de sodium est mélangée à la solution dessalée, et le mélange est maintenu au repos, durant 30 mn,
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centrifugation aux fins d'obtenir un liquide surnageant.
Le processus précité est répété à 4 reprises, le nombre total d'absorptions étant de 5. L'anticorps ainsi obtenu est appelé l'anticorps de pré-purification (en général "IgG").
Ensuite, on poursuit la purification suivant les méthodes connues :
A la solution surnageante soumise à l'absorption, la même quantité de cellules de sarcome-180 est ajoutée, puis le mélange est amené au repos durant
30 mn, à une température de 4[deg.]C, pour que l'anticorps du sarcome-180 soit lié aux cellules de sarcome-180, et la solution surnageante est éliminée par centrifugation. Une solution aqueuse d'un tampon à base de chlorhydrate de glycine, ayant un pH de 3,0, est ajoutée au précipitât en vue de libérer l'anticorps. Le mélange est centrifugé aux fins de recueillir la solution surnageante contenant l'anticorps. Après ajustement du pH de la solution surnageante proche de son point de neutralité par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de
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PBS, à une température de l'ordre de 4[deg.]C, durant 24h (le liquide de dialyse externe étant échangé toutes les 8h).
La solution de dialyse ainsi obtenue est une solution aqueuse contenant l'anticorps d'anti-sarcome 180 du lapin.
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tumorales.
Les modifications dues aux anticorps anti-sarcome-180 du lapin obtenus ainsi qu'il est décrit ci-dessus vis-à-vis des cellules sont déterminées en présence d'un complément (sérum de cobaye) de la façon suivante:
Chaque 100 ml de la solution aqueuse de l'anticorps précité et des trois solutions de l'anticorps diluées 10 fois; 100 fois et 1000 fois, respectivemert, sont mélangés à 100 microlitres de la suspension aqueuse de cellules de
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15 mn à température ambiante. Ensuite, une partie aliquote de 100 microlitres d'un sérum dilué 2 fois de cobaye dans le milieu essentiel minimum de Eagle
(appelé ci-dessous MEM) (le sérum dilué étant considéré comme un complément) est ajoutée à chacun des mélanges précités, et les mélanges finaux sont maintenus à l'incubation durant 30 mn, à une température de l'ordre de 37[deg.]C. Apres incubation, le milieu incubé subit une centrifugation aux fins de recueillir les particules de cellules et, après lavage de ces particules,
à nouveau à l'aide de MEM, on ajoute une solution aqueuse de bleu-trypan
à ces particules et on les examine sous microscope aux fins de déterminer
le taux de mortalité des cellules.
Les résultats obtenus sont consignés dans le TabLeau I. ci-après. -
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et on constate très aisément que, quoique l'anticorps repris après purification de l'antisérum par la méthode précitée, présente une toxicité vis-àvis des cellules de sarcome-180 relativement peu différente de la toxicité de l'anticorps repris par purification de l'antisérum, la toxicité du premier vis-à-vis des cellules spléniques des souris normales est suffisamment faible pour que celles-ci ne soient pas tuées.
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la présente invention.
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11 faut remarquer que les' cellules splêniques des souris ICR normales. utilisées à titre représentatif des cellules normales sont obtenues tout d'abord, après extirpation de la rate, éminçage de la rate avec une paire de couteaux dans MEM de Eagle pour qu'elle passe dans ur. grillage en acier inoxydable de 200 mesh, lavage du filtrat une fois à l'aide de MEM, addition de
3 ml d'une solution de chlorure d'ammonium à 0,75% tamponnée par le tris-(hy-
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Comme dans la méthode (3) de chromatographie par affinité utilisée dans
le point 1-1 ci-dessus se sont produits des problèmes dans la séparation des anticorps purs qui montrent que la divergence est encore reconnue sur les cellules spléniques de souris, la méthode de purification ci-dessus de l'anticorps est mise en oeuvre sur une colonne dans laquelle l'antigène tumoral est lié. Tout d'abord, la purification est effectuée sur l'antigène lui-même.
Des cellules tumorales de sarcome-180 de type ascitess qui ont été obtenues sur des souricières sont séchées par lyophilisation et, après addition d'une solution tampon de phosphate de potassium 5 mM, ayant un pH de 7,4, l'antigène est extrait des cellules durant 20 heures.
On obtient ainsi une solution surnageante après centrifugation du mélange durant 10 mn à 65 OOOG. La solution surnageante subit une nouvelle centrifugation durant 30 mn à 180 OOOG et le surnageant ainsi obtenu est dialyse à l'encontre d'eau distillée, durant 70 heures, à une température de Tordre de 4[deg.]C. (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes 'les 24 heures). Le dialysat est à nouveau centrifugé à 65 OOOG pour éliminer le précipité et, après addition de sulfate d'ammonium dans la solution surnageante ainsi obtenue pour que la concentration atteigne 2M, la solution est centrifugée durant 10 mn
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distillée durant 72 heures (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
L'antigène de sarcome-180 ainsi obtenu est utilisé pour la préparation de
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Ltd), qu'on a laissé gonflerdans de l'eau jusqu'à atteindre 20 ml, on ajoute le même volume d'une solution aqueuse de bromocyane à 1 g/ml et, après réaction durant 8 mn, tout en maintenant le pH du mélange réactionnel à 11,0,
le mélange est filtre dans un filtre de verre; on recueille le précipité que 1'on lave sur le filtre à T'aide d'eau distillée refroidie par de la glace et une solution de carbonate acide de sodium 0,5M refroidie à l'aide de glace. Après lavage, le précipité est suspendu dans une solution de carbonate acide
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fasse. Le produit est filtré à l'aide d'un filtre de verre, puis lave avec, tout d'abord, une solution de carbonate acide de sodium 0,1m, puis à l'aide d'eau distillée et, enfin, l'aide d'un tampon phosphatique aqueux de chlorure de sodium (0,85%, "à pH 7,0). Le produit réactionnel ainsi lavé'est mis dans un tube de verre de 13 mm de diamètre interne et 15 cm de long, destiné à former la colonne de chromatographie par affinité.
3 ml de la solution d'anticorps (IgG) préparés par le procédé mentionné dans le point 1-1 précité, si ce n'est que l'on n'effectue pas l'étape de liaison avec les cellules de sarcome-180, sont versés dans la colonne, puis une solution aqueuse d'un tampon de phosphate 5 mM de chlorure de sodium (0,85%, à pH 7,0) est versée dans la colonne jusqu'à ce que, 1 .on ne constate plus la présence de protéines dans l'effluent, et on ajoute alors une solution de chlorure de sodium 0,5M et une solution tampon de chlorhydrate de glycine 50 mM dans la colonne aux fins de recueillir la fraction en tant qu'éluat.
L'éluat obtenu est rapidement neutralisé à l'aide de carbonate acide de sodium et le neutralisat est dialysé à nouveau à l'encontre d'une solution aqueuse
de tampon de phosphate de chlorure de sodium (0,85%, à pH 7,0) durant 72h
(le liquide externe étant échangé toutes les 24h).
Le dialysat ainsi obtenu est une solution aqueuse d'un anticorps purifié vis-à-vis du sarcome-180 par chromatographie par affinité sur colonne.
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tumorales.
La cytotoxicité due à l'anticorps antisarcome-180 du lapin obtenu. dans le point 1-3 est examinée par la méthode décrite dans le point 1-2 sur les cellules tumorales et les cellules normales.
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Les résultats du Tableau II montrent la réduction de toxicité des cellules spléniques et l'accentuation de l'activité des cellules de sarcome-?.80 de l'anticorps dues à la purification de l'anticorps par chromatographie par affinité (1). c'est-à-dire montrent l'excellente purification de 1'anticorps par chromatographie par affinité (1).
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points 1-1 et 1-3 mentionnés ci-dessus et purifié par chacune des méthodes de purification mentionnées ci-dessus, est amené à réagir avec chacune dès
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actinomycine D, sarcomycine et chlorhydrate de doxorubicine aux fins de produire chaque substance correspondante.
A titre d'exemple, la réaction de l'anticorps préparé dans le point 1-1 et
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aux fins d'effectuer la réaction pendant la période indiquée dans le Tableau III. ci-avant, puis on stoppe la réaction par addition de 2 ml d'une solution tampon d'acétate de sodium d'acide acétique en solution aqueuse, ayant un pH de 4,70.
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température de 4[deg.]C, durant 72 heures (durant la dialyse, le liquide externe est renouvelé à 3 reprises), le liquide de dialysat interne est condensé et envoyé dans une colonne de 1,5 cm de diamètre et 55 cm de haut, garnie de
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les substances de bas poids moléculaire du mélange réactionnel soient complèrement absorbées dans la colonne; ensuite, l'éluat est séché par lyophilisation à une température de -20[deg.]C aux fins d'obtenir le produit recherché..
La quantité de mitomycine C liée à l'anticorps est déterminée en fonction du temps par spectroscopie de l'absorption ultraviolette.
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L'une des compositions pharmaceutiques est une protéine modifiée d'un poids moléculaire d'environ 150 000, soluble dans l'eau et insoluble dans les solvants organiques, telle que benzène, acétone, méthanol, etc.
Ce composé présente un spectre d'absorption infrarouge ainsi que le montre la Figure 1. Dans un spectre d'absorption ultraviolet des pics d'absorption <EMI ID=61.1>
En opérant selon la méthode précitée, 1'antigène anti-sarcome-180 du lapin
(10 mg) purifié, est amené à réagir avec chacun des composés suivants:
chlorhydrate de doxorubicine, daunorubicine et actinomycine D aux fins d'obtenir les composés liés en un poids d'environ 7 mg. Les quantités de chlorhydrate de doxorubicine liées à 1 mg de protéines anticorps sont de 4,1 microgrammes et de 9,0 microgrammes, respectivement, pour des durées réactionnelles de 10 et 30 mn. Les mêmes résultats sont obtenus lorsque l'on emploi l'anti- corps IgG.
Ensuite, "anticorps anti-sarcome-180 purifié du lapin est amené à réagir
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ci-dessus aux fins d'obtenir un composé ayant pratiquement les mêmes propriétés physicochimiques que celles qui sont décrites ci-dessus.
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mycine D, la sarcomycine et au chlorhydrate de doxorubicine sont préparés par synthèse selon la méthode précitée.
EXEMPLE 2
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cet anticorps.
Les cellules de sarcome-180 de type ascites sont successivement obtenues par culture sur des souris de race ICR et dépourvues de leur activité prolifêratrice par de la mitomycine C; le composé obtenu est injecté par voie intrapéritonéale sur une souris de race ICR une fois par semaine, selon un taux de 107 cellules/animal, durant 4 semaines, et au 7ème jour de la dernière injection, on recueille le sang d'une large veine abdominale de la souris par laparotomie sous anesthésie, et prépare un antisërum à partir du sang à raison
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purification de l'anticorps sont effectuées ainsi qu'il est indiqué dans le point 1-1 de l'Exemple 1 et le procédé est interrompu après absorption
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A 30g de cellules de sarcome-180 du type ascites, séchées par lyophilisation, obtenues par culture sur des souris de race ICR, on ajoute une solution aqueuse
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ayant un pH de 7,4 afin d'extraire l'antigène en 20 heures.
L'extrait est centrifugé durant 10 mn à 65 OOOG; on client ainsi un liquide surnageant auquel on fait subir une centrifugation ultérieure durant 30 mn à
180 OOOG. Le liquide surnageant est recueilli et on dialyse à l'encontre d'eau
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(Durant .la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
La chromatographie par affinité de l'antigène de sarcome-180 ainsi obtenu est effectuée de la façon suivante:
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à une concentration de 1 g/ml, tout en maintenant le pH du mélange à 11,0 durant 8 mn, avant de l'amener en réaction, puis on filtre le mélange réactionnel dans un filtre en verre. Le filtrat séparé est lavé à l'aide d'eau distillée refroidie avec de la glace et d'une solution de carbonate acide de sodium Û,5M refroidie à la glace,' ce lavage étant effectué sur le filtre, puis on met le filtrat en suspension dans une solution de carbonate acide de sodium O,1M et ajoute ia solution d'antigène purifié obtenue ci-dessus à la suspension, tout en agitant durant la durée d'une nuit à température ambiante
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tampon phosphate de chlorure de sodium (0,85M, à pH 7,0).
Le produit lavé est utilisé pour former le garnissage d'un tube de verre de
13 mm de diamètre interne et 15 cm de haut qui est utilisé à titre de colonne de chromatographie par affinité.
3 ml d'antisérum obtenus par le procédé selon la méthode du point 2-1 .précité (impliquant un anticorps) sont injectés dans la colonne de chromatographie par affinité, puis ensuite on y fait passer une solution aqueuse de tampon de phosphate 5 mM de chlorure de sodium (0,85%, à pH 7,0), jusqu'à ce que l'on ne constate plus la présence de protéines dans les effluents, puis on ajoute une solution de chlorure de sodium 0,5M avec une solution de tampon de chlorhydrate de glycine 5 mM (à pH 4,0) aux fins de recueillir la
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(durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
La solution aqueuse de l'anticorps de sarcome-180 purifié par chromatographie par affinité est ainsi obtenue.
<EMI ID=73.1>
mates.
La cytotoxicité due à 1.'anticorps du sarcome-180 de la souris est déterminée par une méthode telle que décrite dans l'Exemple 1.
<EMI ID=74.1>
Ainsi que cela est montré dans ce Tableau IV. l'activité des cellules de sarcome-180 est notablement améliorée par chromatographie par affinité, ainsi qu'il est indiqué ci-après.
<EMI ID=75.1>
<EMI ID=76.1>
<EMI ID=77.1>
stance antitumorale.
Des anticorps anti-sarcome-180 de la souris, obtenus selon la méthode des points 2-1 et 2-2, respectivement, sont liés à la mytomycine C par la méthodedécrite dans le point 1-5 de l'Exemple 1. Les deux substances sont liées par une liaison amido. Par la même méthode, on lie à un anticorps par une liaison
<EMI ID=78.1>
Le cornposé pharmaceutique ainsi obtenu montre pratiquement les mêmes propriétés physicochimiques que le composé correspondant obtenu dans le point 1-5.
<EMI ID=79.1>
1'Exemple 1. et 2-4 de l'Exemple 2. respectivement, sont examinés pour ce qui concerne leur activité antitumorale.
EXEMPLE 3
<EMI ID=80.1>
sarcome-180 de type solide -
Des cellules de sarcome-180 de souris, obtenues par culture sur des sou-
<EMI ID=81.1>
chacun des groupes ICR; ce groupe est formé de 10 animaux, et la transplantation est faite à raison de 1 Il 106 cellules/animal. A partir de 24h après la transplantation, on effectue une injection par voie intrapéritonéale de chacun des agents suivants, tous les deux jours, et au total à 10 reprises, et puis, 5 jours après la dernière injection, toutes les souris sont sacrifiées en vue d'extirper la tumeur. Le poids moyen de la tumeur (T) est comparé à celui (C) de 10 souris auxquelles on a administré une solution saline physiologique aqueuse au lieu de l'agent dans la formule suivante; on obtient le taux d'inhibition de prolifération de la tumeur (sarcome-180) par l'agent:
<EMI ID=82.1>
<EMI ID=83.1>
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
<EMI ID=92.1>
<EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
Les agents mentionnés ci-avant sont:
(1) anticorps,
(2) médicament antitumoral du commerce,
<EMI ID=95.1>
chacun des médicaments antitumoraux du commerce, et
(4) composition pharmaceutique d'anticorps anti-sarcome-180 de la souris liés
à chacun des médicaments anti-tumoraux du commerce..
<EMI ID=96.1> <EMI ID=97.1> synthèse avec de la doxorubicine, et
- Le Tableau VIII, ci-avant, montre les résultats de l'administration des anticorps.
Ainsi que le montrent les Tableaux V à VII, le taux d'inhibition de la prolifération du sarcome-180 des compositions pharmaceutiques est, dans l'état, actuel, pratiquement le même que celui des agents antitumoraux du commerce lorsqu'on les utilise à des taux de l'ordre de 5 à 10 fois les doses d'agents antitumoraux du commerce. Ce fait montre que l'activité antitumorale de l'anticorps lui-même n'apparaît pratiquement pas et est véritablement naturelle.
La caractéristique de la composition pharmaceutique devient claire lorsque
la quantité administrée des agents antitumoraux du commerce est comparée à
la quantité d'agents antitumoraux du commerce formant l'un des constituants
de la composition pharmaceutique. Cela veut dire que, quoique la quantité
<EMI ID=98.1>
est pratiquement le même dans les deux cas. Le fait mentionné ci-dessus permet de constater que l'anticorps qui est l'un des constituants de la composition pharmaceutique apporte une petite quantité d'agent antitumoral du commerce, qui est également l'un des constituants de la composition pharmaceutique par rapport au site tumoral; c'est ce fait qui est à la base de l'idée de la présente invention.
La composition pharmaceutique présentant la fonction précitée, tout en réduisant la quantité à administrer de l'agent antitumoral du commerce qui a,
<EMI ID=99.1>
la quantité généralement administrée, donne lieu au même taux d'activité inhibitrice de la tumeur.
Il faut noter, en outre, quoique, à l'origine, l'anticorps n'a pas de relation avec le taux d'inhibition de la prolifération des tumeurs, lorsque le composé produit par liaison de l'anticorps, préparé à partir d'un lapin et généralement purifié, une substance antitumorale du commerce, est administré à 10 souris, on constate qu'environ 3 animaux témoignent d'un spasme général et d'un raidissement, un des signes d'un choc anaphylactique, tandis que l'administration de la composition pharmaceutique produite par liaison de l'anticorps purifie par chromatographie par affinité sur la substance antitumorale donne lieu à la constatation d'un choc anaphylactique extrêmement réduit. En fait , le composé préparé: par liaison de
<EMI ID=100.1>
choc anaphylactique, mais lorsque l'anticorps subit une nouvelle purification par chromatographie par affinité, ce choc anaphylactique n'est jamais observé.
EXEMPLE 4
9 4-1 : Préparation d'un anticorps et sa purification par chromatographie
par affinité.
Des cellules du sarcome de Yoshida, obtenues par culture sur des rats
de race Donryu, sont mises en suspension dans une solution saline physiologique et, après addition de mitomycine C (50 microgramme/ml) à la suspension, le mélange est maintenu sous incubation durant 30 mn, à une température de 37[deg.]C, et centrifugé aux fins de.récupérer la solution surnageante.
Les cellules sont lavées à trois reprises à l'aide d'une solution saline physiologique (0,85%). On ajoute alors l'adjuvant complet de Freund (appelé FCA) aux cellules du sarcome de Yoshida, que l'on a dépourvu de toute activité prolifératrice, et le mélange est injecté par voie sous-cutanée dans .la voûte plantaire d'un lapin pesant 2,9 kg, à un taux de 108'cellules/animal.
Deux semaines après la première injection, on effectue une deuxième injection de cellules sur le même lapin, avec la même méthode, aux fins d'immuniser le lapin, puis deux semaines après cette deuxième injection, on effectue encore une injection intraveineuse de ces cellules à ce-lapin. Une semaine après
<EMI ID=101.1>
d'une canule insérée dans l'artère carotide. L'antisérum préparé à partir du sang est purifié de la façon suivante:
A 100 ml d'antisérum, on ajoute une quantité de sulfate d'ammonium correspondant à 20 à 30% en poids de la saturation pour effectuer un relargage.
<EMI ID=102.1>
l'ordre de 4[deg.]C, durant 72 heures (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
<EMI ID=103.1>
3 reprises avec une solution aqueuse de chlorure de sodium, est mélangée au
<EMI ID=104.1>
du mélange destiné à être absorbé, on procède à une centrifugation et recueille le liquide surnageant. Le procédé d'absorption précité est répété à 4 reprises, le nombre total d'absorptions étant de 5.
L'anticorps ainsi obtenu est appelé anticorps de pré-purification (dénommé couramment IgG).
<EMI ID=105.1>
méthode suivante: Au liquide surnageant ayant subi 5 absorptions, on ajoute une quantité égale de cellules du sarcome de Yoshida, et maintient le mélange au repos durant 30 mn: à une température de l'ordre de 4[deg.]C, pour lier l'anticorps du sarcome de Yoshida aux cellules du sarcome de Yoshida, et le mélange est alors centrifugé aux fins de séparer le liquide surnageant.
On ajoute au précipité une solution tampon de chlorhydrate de glycine, ayant un pH de 3, aux fins de libérer j'anticorps. Le mélange est alors centrifugé pour recueillir le liquide surnageant contenu dans l'anticorps, et le liquide
<EMI ID=106.1>
obtention de la neutralité, et dialysé à l'encontre de PBS durant 24 heures, à une température de 4[deg.]C (le liquide de dialyse externe est échangé toutes les 8 heures).
Le dialysat ainsi obtenu est une solution aqueuse d'immuno-anticorps d'an-
-ti-sarcome de Yoshida du lapin.
<EMI ID=107.1>
normales.
<EMI ID=108.1>
vis-à-vis de cellules en présence d'un complément sérum de cobaye, est déterminée de la façon suivante: La solution aqueuse précitée de l'anticorps,
sa solution diluée 10 fois, sa solution diluée 100 fois et sa solution diluée
1000 fois, sont respectivement mélangées à une suspension de cellules de sarcome de Yoshida ou à' une suspension de cellules spléniques d'un rat de race Donryu normale (deux suspensions utilisent MEM de Eagle en tant que milieu et la concentration des cellules est de 5 x 106 cellules/ml), à un taux de 100 microlitres.
<EMI ID=109.1>
les cellules absorbent l'anticorps. Ensuite, 100 microlitres du sérum de cobaye, dilués à 2 volumes par MEM de Eagle (le sérum dilué est appelé complément), sont ajoutés au mélange précité, et le mélange final est maintenu à incubation durant 30 mn, à une température de l'ordre de 37[deg.]C, puis centrifugé. Le précipité ainsi obtenu est lavé à nouveau à l'aide de MEM de Eagle et, après addition d'une solution de bleu trypane,' la mortalité des cellules dans le précipité lavé et net est observée par voie microscopique
Les résultats des tests sont consignés dans le Tableau IX. ci-après.
<EMI ID=110.1>
++ et +++ (le cas où aucun décès ne s'est produit est indiqué par "-"), on observe que, quoique la toxicité de l'anticorps.pris après purification de
<EMI ID=111.1>
la toxicité du premier vis-à-vis des cellules spléniques du rat de race.Donryu normale est extrêmement faible et n'est pas suffisante pour tuer les rats.
Ce fait indique que la purification de l'antisérum convient aux fins de la présente invention.
Ensuite, des cellules spléniques de rat de race Donryu utilisées à titre représentatif des cellules normales, sont obtenues après extirpation de la rate, broyage fin de la rate avec une paire de ciseaux dans MEM de Eagle, et passage des fragments sur un tamis de 20 mesh, lavage des fragments passés à l'aide de MEM de Eagle, puis mélange avec 30 ml d'une solution de chlorure d'ammonium
<EMI ID=112.1>
pour détruire les érythrocytes dans 1 'échantillon et lavage des fragments à 3 reprises à l'aide de MEM de Eagle.
<EMI ID=113.1>
La purification suivante d'un anticorps est effectuée par chromatographie par affinité sur une colonne comportant un support sur lequel l'antigène . tumoral est lié. Tout d'abord,. l'antigène lui-même est purifié de la façon suivante: Les cellules tumorales du sarcome dé Yoshida, obtenues par culture sur des rats de race Donryu, sont tout d'abord séchées par lyophilisation,
<EMI ID=114.1>
par une solution d'un tampon de phosphate de potassium 5 mM (à pH.7,4), aux fins d'extraire l'antigène durant 20 heures, et le liquide extrait est cen-
<EMI ID=115.1>
centrifuger durant 30 mn à 180 OOOG.- On recueille le liquide surnageant
<EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
<EMI ID=118.1>
le liquide externe est échangé toutes les 24.heures)., Le dialysat est alors centrifugé à 65 OOOG pour éliminer le précipité et, après addition de sulfate d'ammonium au liquide surnageant, afin de porter sa concentration à 2M, le
<EMI ID=119.1>
précipité que l'on dissout alors dans de l'eau distillée. La solution ainsi obtenue est dialysée à l'encontre de l'eau distillée durant 72 heures
(durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
A partir de l'antigène du sarcome de Yoshida ainsi obtenu, on prépare la colonne de chromatographie par affinité de la façon suivante:
<EMI ID=120.1>
Pharmacia Japan Co., Ltd), on ajoute 20 ml d'une solution aqueuse de bromocyane à une concentration de 1 g/ml et, tout en maintenant le' pH à 11,0, le mélange est maintenu au repos durant 8 mn afin que les produits réagissent entre eux,
et le mélange réactionnel résultant est alors filtré sur un filtre de verre.
Le précipité restant sur le filtre est lavé à l'aide d'eau distillée refroidie avec de la. glace, puis à l'aide d'une solution de carbonate acide de sodium
0,5M refroidie avec de la glace, et enfin, le précipité est lavé et dispersé
<EMI ID=121.1>
Puis l.a solution aqueuse précitée de l'antigène purifié est ajoutée à la dispersion et pour que les deux constituants réagissent on effectue une agitation
<EMI ID=122.1>
l'aide d'une solution d'un tampon phosphate de chlorure de sodium (0,85%,
à pH 7,0).
Le produit réactionnel ainsi lavé forme le garnissage d'un tube de verre de 13 mm de diamètre et 15 cm de haut qui constitue une colonne pour la chromatographie par affinité. Dans cette colonne, 3 ml de la solution 'd'anticorps (IgG) sont préparés par le procédé du point 4-1 ci-dessus (à l'exception de l'étape de liaison avec les cellules du sarcome de Yoshida) et sont introduits dans le tube, puis on y fait passer une solution dans un tampon phosphate
<EMI ID=123.1>
fraction effluente, que l'on neutralise à l'aide d'un carbonate acide de sodium; le neutralisat est alors dialyse à nouveau à l'encontre d'une solution tampon dans l'acide phosphorique de chlorure de sodium (0,85%, à pH 7,0), durant 72 heures (durant la dialyse, le liquide externe-est échangé toutes les 24 heures). Ensuite, la solution aqueuse de l'anticorps purifié par chromatographie par affinité sur colonne contre un sarcome de Yoshida est obtenue.
<EMI ID=124.1>
normales.
<EMI ID=125.1>
dans le point 4-3 décrit ci-dessus est examinée par la même méthode que dans le point 4-2. Les résultats obtenus sont consignés dans le Tableau X. ci-après..
Les résultats de ce Tableau X montrent que l'activité de l'anticorps vis-à-vis des cellules du sarcome de Yoshida est fortement améliorée; cependant, celle de l'anticorps des cellules spléniques du rat est réduite par purification dans une colonne de chromatographie par affinité et, par ailleurs, la purification par chromatographie par affinité s'est révélée excellente.
<EMI ID=126.1>
<EMI ID=127.1>
à réagir sur l'un des agents antitumoraux du commerce, tels que chlorambucyle, melphalan (moutarde de phényl alanine), ACNU, urasmustine et cyclophosphamide, afin d'obtenir par synthèse chacun des composés liés.
Les exemples ci-dessous sont des exemples obtenus par synthèses:
EXEMPLE DE SYNTHESE 1
<EMI ID=128.1>
A 10 ml d'une solution aqueuse contenant l'anticorps du lapin purifié contre le sarcome de Yoshida obtenu dans le point 4-1 de 1'Exemple 4, à un débit de 10,0 mg/ml, on ajoute 40 mg de chlorambucile et, sous agitation, tout en ajustant le pH de la solution à 4,75 par de l'acide chlorhydrique,
<EMI ID=129.1>
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1>
et distillé durant 72 heures à une température de 4[deg.]C (durant la dialyse, le liquide externe est échangé à trois reprises).
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
Après condensation du liquide de dialyse interne, le condensat est passé sur une colonne de 3 cm de diamètre et 65 cm de haut, garni d'un dérive de dextrine (Sephadex G-200 , fabriqué par Pharmacie Japan Co., Ltd.) pour séparer complètement les substances de poids moléculaire élevé et les substances de poids moléculaire faible contenues dans la solution. L'effluent de la colonne subit une ultracentrifugation durant 60 mn, à 40 OOOG, et le liquide surnageant est séché par lyophilisation à -20[deg.]C, pour conduire à la substance faisant l'objet de la présente invention.
Le contenu en protéines du produit est déterminé par la méthode de Copper-Folin utilisant de l'albumine en tant que témoin, et la quantité liée de l'agent d'alkylation est déterminée par la méthode d'Epstein (Epstein, J. Anal. Chem.,
27, 1423 (1955 . Les résultats montrent que dans la compositions pharmaceutique obtenue, 10 microgrammes de chlorambucile sont liés à 1 mg d'anticorps.
EXEMPLE DE SYNTHESE 2
<EMI ID=134.1>
De la même façon que décrit dans l'Exemple de Synthèse 1, mais en utilisant toutefois la même quantité de melphalan que de chlorambucile et en
<EMI ID=135.1>
purifié du lapin est lié au melphalan aux fins d'obtenir la composition pharmaceutique dans laquelle 10 microgrammes de melphalan sont liés à 1 mg d'anticorps.
EXEMPLE DE SYNTHESE 3
<EMI ID=136.1>
De la même façon que décrit dans l'Exemple de Synthèse 1. mais en utilisant toutefois 40 mg d'uramustine au lieu de chlorambucine, l'anticorps de
<EMI ID=137.1>
Ensuite, on fait réagir de l'acide chloroacétique pour faire réagir l'uramustine et augmenter sa réactivité de la façon suivante:
A 10 ml de méthanol, on ajoute 500 mg d'uramustine et 139 mg de mêthoxyde de potassium de façon à obtenir une dissolution, puis 188 mg d'acide chloro-
<EMI ID=138.1>
la réaction est achevée, le mélange réactionnel est condensé sous pression réduite. Le résidu est recristallisé dans le méthanol et le chloroforme. On obtient ainsi 215 mg (rendement: 35%) de cristaux, ayant la structure du dérivé d'uramustine suivante, qui est confirmée par les analyses:
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
l'anticorps du lapin vis-à-vis du sarcome de Yoshida obtenu dans le point 4-1 de l'Exemple 4. de la même façon que dans l'Exemple de Synthèse 1.
On obtient une composition pharmaceutique dans laquelle 10 microgrammes d'uramustine sont liés à 1 mg de l'anticorps.
EXEMPLE DE SYNTHESE 4
<EMI ID=141.1>
Tout d'abord, un dérivé de melphalan est préparé par synthèse, à partir du melphalan de la façon suivante:
Dans 10 ml de diméthylsulfoxyde, 200 mg de sel d'argent de melphalan sont dissouts, et 100 mg d'acide chloroacétique sont ajoutés à la solution que l'on agite alors durant 64h dans une lumière non-directe.
Après élimination du précipité formé dans le mélange réactionnel, on sépare par distillation sous pression réduite, sur un bain d'eau, à une température
<EMI ID=142.1>
Après addition d'eau au résidu et refroidissement du mélange, on constate la formation de cristaux blancs. Les cristaux déposés sont séchés sous pression réduite. Le dérivé ainsi obtenu du melphalan (rendement: 40%) est utilisé dans la réaction avec l'anticorps obtenu dans le point 4-1 de l'Exemple 4, par le même procédé que celui décrit dans l'ExempLe de Synthèse 2; on obtient'ainsi une composition pharmaceutique dans laquelle 16 microgrammes du dérivé de melphalan sont liés à 1 mg de l'anticorps.
EXEMPLE DE SYNTHÈSE 5
L'anticorps de lapin du sarcome de Yoshida, obtenu et purifié dans le
<EMI ID=143.1>
de la même façon que celle qui est décote dans l'Exemple de Synthèse 1,
<EMI ID=144.1>
Synthèse 4) et un dérivé d'uramustine (cf. l'Exemple de Synthèse 3).
La composition pharmaceutique ainsi obtenue par synthèse est pratiquement la même que la composition -pharmaceutique obtenue dans les Exemples de Synthèses ci-dessus.
EXEMPLE 5
<EMI ID=145.1>
Des. cellules de sarcome de Yoshida de type ascites, obtenues par culture sur des rats de race Donryu, sont transplantées durant 4 semaines, à raison d'une fois par semaine, sur la cavité abdominale d'un rat de race Donryu;
7 jours après la quatrième transplantation, on recueille le sang à partir d'une large veine abdominale du rat, soumis à laparatomie sous anesthésie. L'antisérum contenant l'anticorps est préparé à partir du sang; la quantité est de 70 ml pour 100 rats. La préparation de l'anticorps à partir de
<EMI ID=146.1>
décrite dans le point 4-1 de l'Exemple 4; le procédé est cependant stoppé après absorption par des érythrocytes du rat.
<EMI ID=147.1>
Dans 30g de cellules séchées par lyophilisation du sarcome de Yoshida, obtenues par culture sur des rats de race Donryu, on ajoute une solution aqueuse de KC1 3M tamponnée par une solution tampon de phosphate de potassium 5 mM, à pH de 7,4, aux fins d'effectuer l'extraction de l'antigène durant 20h. Le liquide extrait est centrifugé pendant 10 mn à 65 OOOG; on recueille alors le liquide surnageant auquel on fait subir une centrifugation durant 30 mn
à 180 OOOG. Le liquide surnageant alors recueilli est dialysé à une température de 4[deg.]C durant 72 heures à rencontre d'eau distillée (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
Le procédé de chromatographie par affinité est effectué sur l'antigène
<EMI ID=148.1>
<EMI ID=149.1>
<EMI ID=150.1>
<EMI ID=151.1>
<EMI ID=152.1>
Les troubles dus à l'anticorps du rat du sarcome de Yoshida sont examinés par la même méthode que celle de l'Exemple 4.
Les résultats obtenus sont consignés dans le Tableau XI. ci-avant.
<EMI ID=153.1>
des cellules du sarcome de Yoshida est remarquablement augmentée par chromatographie par affinité ainsi que cela est le cas dans les exemples précédents.
<EMI ID=154.1>
antitumorales.
L'anticorps de rat du sarcome de Yoshida obtenu par le procédé des points 5-1 et 5-2 de l'Exemple 5. est lié respectivement au chlorambucile par une méthode pratiquement similaire à celle qui est décrite dans le point 4-5 de l'Exemple 4. On obtient ainsi des compositions pharmaceutiques ayant une liaison amido entre les deux constituants.
Par application de la même méthode au melphalan, au dérivé de melphalan et au dérivé d'uramustine, respectivement, on obtient des produits ayant une liaison entre l'anticorps et chacune des compositions pharmaceutiques précitées.
Chacune des compositions pharmaceutiques ainsi obtenues montre pratiquement les mêmes propriétés physicochimiques que celles des compositions pharmaceutiques obtenues par le procédé du point 4-5 de l'Exemple 4.
EXEMPLE 6
<EMI ID=155.1>
Des cellules du sarcome de Yoshida, obtenues par culture sur des rats de race Donryu, sont transplantées sur la cavité abdominale de 10 rats de chaque
<EMI ID=156.1>
après la transplantation, chacun des agents suivants est injecté par voie intrapéritonéale sur chacun des rats du groupe, tous les deux jours, durant
20 jours. Après observation du taux de mortalité des rats, le taux d'allongement de la vie de l'agent est obtenu par calcul de la valeur obtenue par division du nombre de jours moyen de survie des rats traités sur un groupe
<EMI ID=157.1>
ambucile et la chlorambucile + l'anticorps (Tableau XII), le melphalan et le melphalan + l'anticorps (Tableau XIII), un dérivé d'uramustine et un dérivé
<EMI ID=158.1>
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
<EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
<EMI ID=166.1>
<EMI ID=167.1>
<EMI ID=168.1>
<EMI ID=169.1>
<EMI ID=170.1>
<EMI ID=171.1>
<EMI ID=172.1>
administrées à des doses de l'ordre de 5 à 10 fois supérieures. Ce fait naturel montre que l'activité inhibitrice vis â vis de la tumeur n'apparaît pas pour l'anticorps aux doses généralement appliquées (cf. le Tableau XVI).
Les caractéristiques de la composition pharmacologique apparaissent clai-
<EMI ID=173.1>
formant le constituant de la composition pharmacolcgique est comparée à la quantité administrée de la. substance antitumorale constituant elle-même l'agent.
<EMI ID=174.1>
antitumorale du commerce sur le site de la tumeur grâce à l'anticorps qui est un autre constituant efficace de la composition pharmacologique; ce fait constitue la réalisation de l'idée de la présente invention.
<EMI ID=175.1>
même taux d'activité inhibitrice vis-à-vis de la tumeur malgré la réduction à 1/10e à 1/20e de la quantité de substance antitumorale du commerce à employer,
<EMI ID=176.1>
ment élevés.
En outre, il faut particulièrement noter que la possible apparition de choc anaphylactique,que l'on constate dans le cas où l'anticorps préparé
à partir de lapins et purifié par la méthode classique est lié à une substance antitumorale du commerce et que la substance liée est administrée aux rats, est bien réduite lorsque l'anticorps est purifié par le procédé de chromatbgraphie d'affinité selon la présente invention.
Une telle réduction de la possibilité de production de chocs anaphylactiques
a été constatée dans le cas de l'anticorps du sarcome-180 dans l'Exemple 3. et les avantages de la méthode de chromatographie par affinité sont encore constatés dans le cas du sarcome de Yoshida.
Dans le cas de l'anticorps préparé à partir de souris, purifiée par chromatographie par affinité, l'administration de la composition pharmacologiqûe produite à partir de l'anticorps ne donne pas lieu à un choc anaphylactique sur des rats.
EXEMPLE 7
Q 7-1 : Préparation et purification d'un anticorps des cellules tumorales.
50 ml de sang sont recueillis sur un patient, de sexe mâle, âgé de 50 ans, souffrant d'un cancer du rectum, et 22 ml d'un antisérum contenant un anticorps sont obtenus à partir du sang.
<EMI ID=177.1>
A la tumeur sèches par:lyophylisation, retirée du patient précité par opération, on ajoute 50 ml d'une solution de chlorure de potassium 3M
<EMI ID=178.1>
<EMI ID=179.1>
Après centrifugation du liquide extrait durant 10 mn à 65 OOOG, le liquide surnageant est recueilli et dialysé à l'encontre d'eau distillée durant 72h, à une température de 4[deg.]C (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24h). La chromatographie par affinité de l'antigène ainsi obtenu sur la tumeur du patient est effectuée pratiquement de la même façon que
<EMI ID=180.1>
de l' anti sérum contenant l'anticorps obtenu dans le point 7-1 précité du patient, au lieu d'utiliser l'anticorps obtenu d'une souris.
L'anticorps ainsi obtenu est également soluble dans l'eau, mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acétone et benzène, et présente un spectre d'absorption ultraviolette et infrarouge donné sur les Figures 2 et 3; son poids moléculaire est d'environ 150 000 et
Rf est de 0 à 0,1 dans le diagramme d'électrophorèse sur disque.
EXEMPLE 8
<EMI ID=181.1>
chromatographie par affinité (3),
La mytomycine C (50 microgramme/ml) est ajoutée aux cellules d'une tumeur.
P-338de type ascites, produites par culture sur des souris DBA/2, suspendues dans une solution saline physiologique et, après incubation du mélange durant
30 mn, à une température de l'ordre de 37[deg.]C, les surnageantes sont éliminées par centrifugation; les cellules sont lavées à 3 reprises à l'aide d'une solution saline physiologique à 0,85%.
On procède à l'inoculation des cellules ainsi traitées de tumeurs P-388 dépourvues d'activité prclifératrice, à des lapins, et on prépare des solutions aqueuses d'anticorps de tumeurs anti-P-388 du lapin par la même méthode que celle qui est décrite dans le-point 1-1 de l'Exemple 1.
<EMI ID=182.1>
normales.
La cytotoxicité due aux anticorps de tumeur P-388 de lapins sur les cellules est examinée en présence de complément (sérum de cobaye) par la méthode déjà décrite dans le point 1-2 de l'Exempte 1.
Les résultats obtenus sont consignés dans le Tableau XVII. ci-après. -
En outre, les cellules spléniques de souris DBA/2 utilisées à titre représentatif des cellules normales, sont traitées par la même méthode que celle qui est décrite dans le point 1-2 de l'Exemple 1.
<EMI ID=183.1>
L'anticorps de tumeur anti-P-388 de souris,purifié : sur une colonne comportant un support sur lequel des tumeurs d'antigène P-388 ont été liées. Le procédé employé est pratiquement celui qui est utilisé dans le point 1-3 de l'Exemple 1. si ce n'est que Ton utilise des cellules de tumeur P-388 produites par culture sur des souris DBA/2 au lieu de cellules de sarcome-180 de type ascites, produites par culture sur des souris ICR.
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normales.
La cytotoxicité due à l'immuno-anticorps de tumeur P-388 du lapin est examinée par la même méthode que dans le point 8-2 précité.
Les résultats obtenus sont consignés dans le Tableau XVIII. ci-après.
Les résultats de ce Tableau XVIII montrent que l'activité de l'anticorps des cellules de tumeur P-388 est remarquablement augmentée et que la toxicité de l'anticorps vis-à-vis des cellules spléniques est réduite par purification par chromatographie par affinité, ainsi qu'il a déjà été montré pour les anticorps précités; ceci montre l'action efficace de la purification par
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antitumoraux.
Les anticorps anti-P-388 du lapin, préparés par la méthode des points 8-1 et 8-3 et -purifiés par ces méthodes, sont amenés à réagir chacun avec la cytarabine, la méthotrexate et la 5-fluorouracile, aux fins de produire par synthèse des composés ayant une liaison amide entre l'anticorps et
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Les exemples qui suivent sont des exemples de telles liaisons.
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<EMI ID=190.1>
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P-388 du lapin purifiés dans 1 ml, on ajoute 20,0 mg de cytarabine, puis
30 mg de l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide, puis on fait réagir pendant la période indiquée ci-dessous, et ajoute alors 2 ml d'une solution d'un tampon acétate de sodium acide acétique aux fins de stopper
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distillée durant 72h, à une température de l'ordre de 4[deg.]C (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24h).
Après condensation du liquide interne, on le passe sur une colonne de 1,5 cm de diamètre et de 55 cm de hauteur, garnie d'un dérivé de dextrine (Sephadex
<EMI ID=193.1>
stance de faible poids moléculaire,dans le mélange réactionnel.complètement; . 1\effluent est séché par liophylisation à une température de -20[deg.]C pour conduire au produit recherché.
La quantité liée de cytarabine en tant que fonction de la période de réaction présumée par les résultats obtenus séparément dans l'essai de recherche est consignée dans le Tableau XIX, ci-après.
EXEMPLE DE SYNTHESE 7
Dans une solution aqueuse contenant 10 mg d'anticorps de tumeur P-388 du lapin, préparés et purifiés selon la méthode du point 8-1 de l'Exempte 8 dans 1 ml, on ajoute 6,0 mg de méthotrexate et, tout en ajustant le pH de la solution à 4,75 par addition d'acide chlorhydrique, sous agitation, on
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imide pendant une période de réaction indiquée ci-dessous. La réaction est alors arrêtée par addition de 2 ml d'une solution d'un tampon acétate de sodium acide acétique. Le mélange réactionnel subit une dialyse à l'encontre
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(durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
Le liquide interne de la dialyse est traité selon la méthode de l'Exemple de Synthèse 6 précité, aux fins d'obtenir la composition pharmacologique -recherche.
La quantité de mëthotrexate liée est indiquée dans le Tableau XX. également ci-après, en tant que fonction de la période réactionnelle.
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EXEMPLE DE SYNTHESE 8
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une réaction semblable à celle qui est décrite dans l'Exemple de Synthèse 7, dans laquelle cependant le produit obtenu ne contenait.aucun 5-fluorouracile. Après introduction d'un groupe carboxyle sur le 5-fluorouracile par le procédé suivant, la réaction de liaison est effectuée selon la même méthode que celle décrite dans le point 8-1 de l'Exemple 8.
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Le 5-fluorouracile carboxylé est préparé par synthèse de la façon suivante:
A 10 ml de m'éthanol, on ajoute 500 mg de 5-fluorouracile et 86 mg d'hydroxyde de potassium,et 3 ml d'eau distillée sont alors ajoutés.
Au liquide transparent ainsi formé, on ajoute, en une fois, 145 mg d'acide chlorhydrique, puis agite le mélange durant 60 heures à température ambiante. Une fois la réaction achevée, le mélange réactionnel est condensé sous pression réduite et le résidu est recristallisé dans l'éthanol et le chloroforme;
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rouge et analyse élémentaire
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EXEMPLE DE SYNTHESE 9
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méthode du point 8-3 de l'Exemple 8 est amené à réagir avec chacun des composés suivants: cytarabine, 8-azaguar,ine, méthothrexate, aminoputérine
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similaires aux compositions pharmacologiques obtenues dans les Exemptes de Synthèses 6 à 8.
EXEMPLE 9
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Les cellules de tumeur P-388 de type ascites, obtenues par culture sur des souris de race DSA/2 et dépourvues de toute activité prolifératrice par la mitomycine C sont inoculées par voie intrapéritonéale sur des souris de race DBA/2 une fois par semaine, selon un taux de 106 cellules/animal;
7 jours après la quatrième inoculation, le sang est recueilli par une large veine abdominale par laparatomie sous anesthésie, et le sérum contenant l'anticorps est préparé à partir du sang. La quantité totale . d'antisérum est de 53 ml pour 100 souris. La préparation et la purification d'anticorps à partir d'antisérum sont effectuées selon la même méthode que celle qui est décrite dans le point 8-1 de 1 1 Exemple 8.
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Les cellules séchées par lyophilisation de tumeur P-388 de type ascites, sont traitées selon la même méthode que celle des cellules du sarcome de Yoshida décrite dans le point 4-3 de l'Exemple 4, en omettant cependant le relargage par le sulfate d'ammonium et la centrifugation ultérieure. Ensuite, une solution aqueuse d'anticorps de tumeur P-388 de type ascites purifié par chromatographie par affinité est obtenue.
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normales.
Des troubles provoqués sur les souris par les anticorps de tumeur P-388 de type ascites, obtenus par la méthode décrite dans le point 9-2 précité, sont examinés par la même méthode que celle qui est décrite dans l'Exemple 1.
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<EMI ID=211.1>
<EMI ID=212.1>
Comme le montre le Tableau XXI.. ci-avant, l'activité de l'anticorps des cellules de tumeur P-388 est remarquablement augmentée grâce à la méthode de traitement par chromatographie par affinité, ainsi que cela est le cas dans les Exemples précédents.
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Les anticorps de tumeur P-388 de souris, obtenus par le procédé des méthodes des points 9-1 et 9-2 de l'Exemple 9. sont respectivement liés à chacun des antimétabolites suivants, à savoir, cytarabine, méthotrexate, aminoputêrine de sodium, 8-azaguanine et 5-fluorouracile par la même méthode que celle qui est décrite dans le point 8-5 de l'Exemple 8, aux fins d'obtenir les compositions pharmacologiques dans lesquelles l'anticorps est lié
<EMI ID=214.1>
présentent pratiquement les mêmes propriétés physiochimiques que celles des compositions pharmacologiques correspondantes obtenues en opérant selon la méthode du point 8-5 de l'Exemple 5.
EXEMPLE 10
<EMI ID=215.1>
tumeur P-388 -
Des cellules de cellules de tumeur P-388, obtenues par culture sur des souris de race DBA/2 sont transplantées sur la cavité abdominale de 10 souris
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24h après transplantation, une solution aqueuse de chacun des agents antitumoraux est administrée par voie intrapéritonéale aux souris une fois par jour durant 5 jours, et on observe ensuite le taux de mortalité des souris par détermination du nombre de jours moyen de survie des groupes de souris
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<EMI ID=218.1>
Les résultats sont consignés dans les Tableaux XXII à XXVI, ci-après,
le Tableau XXVI montrant les résultats obtenus lorsqu'on administre uniquement l'anticorps.
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<EMI ID=221.1>
<EMI ID=222.1>
<EMI ID=223.1>
<EMI ID=224.1>
<EMI ID=225.1>
<EMI ID=226.1>
<EMI ID=227.1>
<EMI ID=228.1>
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Les agents antitumoraux utilisés dans cet exemple sont:
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aminoputérine de sodium et dérivé de 5-fluorouracile.
(2) Composition pharmacologique de l'anticorps du lapin non-purifié
obtenu par chromatographie par affinité, liée à l'un des agents antitumoraux antimétaboliques précités.
(3) Composition pharmacologique d'anticorps purifié par chromatographie
<EMI ID=231.1>
précités.
(4) .Composition pharmacologique d'anticorps de souris non-purifié par
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antimétaboliques précités, et
(5) Composition pharmacologique d'anticorps purifié par chromatographie
par affinité (1), liée à l'un des agents antitumoraux antimétaboliques précités.
La caractéristique essentielle des compositions pharmacologiques n'apparaît pas tout d'abord lorsque la quantité administrée de l'agent antitumoral du commerce lui-même est comparée à la quantité administrée du même agent antitumoral en tant que constituant de la composition pharmacologique. En fait, malgré que.ce dernier ne forme que de 1/10e ou 1/20e du précédent,
la durée d'allongement de la vie conférée par ce dernier est presque égale à celle du premier, Ce fait résulte du phénomène que l'anticorps transfère d'une façon favorable l'agent antitumoral du commerce au site de la tumeur sur le corps animal et constitue la confirmation de l'idée de la présente invention. Les compositions pharmacologiques dues aux fonctions précitées présentent une activité anti tumorale du même degré que l'agent anti tumoral
du commerce, qui eux présentent des effets secondaires extrêmement élevés et qui conduisent à la réduction de leur emploi de 1/10e à 1/20e.
En. outre, il faut notamment remarquer que, dans le cas où l'anticorps. préparé à partir du lapin est lié à chacun des agents antitumoraux et
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raidissements n'apparaissent que sur 3 souris sur 10, alors que la composition pharmacologique produite par liaison de l'agent antitumoral avec l'anticorps préparé à partir du lapin et purifiée par chromatographie
par affinité, ne donne pratiquement pas lieu à ce choc.
La composition pharmacologique produite par liaison de l'anticorps préparé à partir de souris et purifié par chromatographie par affinité avec le même agent antitumoral du commerce ne donne jamais lieu a des chocs anaphylactiques.
Ces constatations ont été consignées déjà dans les Exemples 3 et 6. et ceci est la raison pour laquelle l'efficacité de la chromatographie par affinité pour éliminer les causes de tels chocs anaphylactiques est d'un grand intérêt.
Bien entendu, la présente invention n'est nullement 1 imitée aux exemples
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envisagées et sans que l'an ne s'écarte de l'esprit de l'invention.
REVENDICATIONS
1.- Composition pharmacologique ayant une activité antitumorale sans donner lieu à des effets secondaires de type pyrexie ou anaphylaxie, qui consiste en une substance antitumorale ayant au moins un groupe amino ou
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par chromatographie par affinité.