"Procédé pour la préparation de cultures de spores d'une
souche virulente de claviceps purpurea sur seigle,
produisant de l'ergocristine" La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'une culture de spores d'une nouvelle souche virulente de Claviceps purpurea sur des plantes de seigle, produisant de l'ergocr.istine.
A ce jour, on connaît deux voies distinctes pour la préparation d'alcaloïdes d'ergot de seigle. Il existe d'une part un procédé classique dans lequel des drogues cultivées et recueillies sur des plantes de seigle sont utilisées en tant que substances de départ et les alcaloïdes sont obtenus à partir de celles-ci par extraction. D'autre part, on sait produire des alcaloïdes à partir
de souches de Claviceps appropriées par fermentation stérile. A ce jour on connaît déjà plusieurs procédés réalisables industriellement pour la mise en oeuvre
de cette seconde méthode (voir par exemple les brevets hongrois n[deg.] 150 631, 151 724, 152 238 et 164 816). Cependant, la culture de drogues d'ergot de seigle a conservé toute sa valeur. En effet, une partie importante de la production mondiale d'alcaloïdes peptidiques est encore aujourd'hui obtenue par différentes drogues cultivées, enrichies du type alcaloïde. Ceci est en particulier le cas de la production d'ergocristine et d'ergotamine. La chaîne latérale d'alcaloïdes peptidiques consiste en proline, un groupe d'amino-acides caractéristiques ainsi que d'un amino-acide caractéristique spécifique dudit alcaloïde (à l'intérieur du groupe précité). Le groupe amino-acide caractéristique relatif aux deux
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phénylalanine, Il est cependant extrêmement difficile d'assurer le développement et la surproduction de phénylalanine pendant la biosynthèse fermentative qui
se déroule à l'intérieur d'un intervalle de temps de quelques jours, étant donné qae pendant la même période
de temps se déroule également la genèse biosynthétique
de la fraction acide lysergique de la molécule d'alcaloïde et que de surcroît, d'importantes quantités de tryptophanes sont nécessaires à la synthèse des amino-acides aromatiques. Au cours de l'entretien de la souche et des réinfestations successives, la fraction initialement présente de la souche
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par la régulation d'égalisation des voies de métabolisme dans le sens de la production d'ergocornine puis ensuite d'alcaloïdes hydrosolubles. Cette circonstance particulière a également contribué au fait que divers procédés de fermentation n'ont pas pu être reproduits par la suite avec succès (voir par exemple brevet tchécoslovaque n[deg.]
104 613, brevet allemand n[deg.] .1 215 637 et brevet britannique n[deg.] 1 192 912). Etant donné que dans les procédés fondés sur le traitement de drogues on ne rencontre pas de telles difficultés, ces procédés seront certainement utilisés
à une grande échelle dans l'avenir et il subsiste la nécessité d'apporter certains développements technologiques à de tels procédés. La condition fondamentale d'un tel développement consiste cependant en la production de souches de Claviceps purpurea dotées d'une aptitude élevée à la production d'alcaloïdes.
Différents procédés pour la production de souches
de Claviceps purpurea ayant une bonne aptitude à la production d'alcaloïdes d'ergoline sont déjà décrits
dans de nombreux brevets. Diverses voies ont déjà été proposées pour obtenir des souches dotées d'aptitude
de production élevée. Conformément au procédé décrit
dans le brevet soviétique n[deg.] 232 468, une souche pour
la production d'ergotoxine a été sélectionnée en tenant compte des propriétés morphologiques de colonies particulières, ainsi que des caractéristiques des spores.
Dans le brevet soviétique n[deg.] 232 467 se trouve décrite
une souche produisant 80 % d'ergocryptine, qui présente des propriétés morphologiques sensiblement voisines de
celles précédemment évoquées lorsqu'elle est cultivée sur des milieux de culture synthétiques. Dans le brevet hongrois n[deg.] 154 035 se trouve décrit un procédé qui peut être mis en oeuvre rapidement et de façon efficace, selon lequel les cultures aptes à produire de l'ergotoxine peuvent être enrichies en fonction de la couleur des colonies par rapport aux représentants produisant l'ergotamine.
Pour la préparation de souches à production élevée d'alcaloïdes, il est nécessaire d'observer les principales étapes suivantes :
1. la culture d'une souche de Claviceps purpurea améliorée;
2. la préparation de spores appropriées pour infestations
de plantes de seigle par multiplication fermentative
de la souche ;
3. la conservation de ces spores jusqu'à leur utilisation.
La présente invention a eu pour but de préparer une telle souche particulière présentant une aptitude élevée de production d'ergocristine, pareille souche présentant er. particulier les propriétés avantageuses suivantes :
- la souche présente une bonne sporulation sur des milieux de culture synthétiques, aussi bien que sur des surfaces agar ainsi que sur des cultures submergées et aérées; - les spores sont suffisamment résistantes et par suite sont dotées de bonnes propriétés de conservation'; f les spores sont viables et virulentes, de sorte que lorsqu'elles sont à nouveau amenées dans un milieu de
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produisent une infestation efficace de cette dernière ;
- la quantité de drogues produite par unité de surface est élevée, et
- la drogue présente une teneur élevée en alcaloïdes principaux et contient à côté de ces alcaloïdes principaux seulement des quantités insignifiantes d'alcaloïdes secondaires.
Selon la présente invention, la nouvelle souche
est obtenue par utilisation combinée d'une amélioration sexuée et sélective, de la manière suivante :
A partir de la souche de départ, qui est enregistrée sous le n[deg.] 661/1974 dans la collection de l'Institut
de Recherche hongrois de plantes officinales, on sélectionne en se plaçant d'un point de vue morphologique
des sclérotes présentant une surface lisse, qui sont susceptibles d'un bon développement et qui sont parfaitement exempts de défaut. Ces sclérotes sont posés sur du sable humide et sont maintenus pendant environ 6 semaines à
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sclérotes sont.ensuite lavés et déposés sur une éponge humide maintenue dans des conditions stériles. Après
12 jours commence le développement de stromata;les stromata apparus se sont entièrement développés en environ 6 jours. Pour l'obtention de spores on a sélectionné les stronata des sclérotes qui n'ont produit que quelques (3 à 4) têtes de champignon ou têtes à peritheces ; parmi ceux-ci on a prélevé les stromata présentant un diamètre supérieur à
4 mm et dont l'analyse microscopique révèle en surface les plus grands bombements de peritheces. Ces stromata
sont ensuite amenés dans des conditions de sporulation
sur un milieu nutritif liquide de malt , dans des conditions stériles et sous l'influence de la chaleur. Sous contrôle microscopique, un liquide contenant des ascospores est ensuite amené dans des conditions de propagation sur un milieu nutritif solide malt -agar. Les colonies obtenues à partir d'une telle spore sont alors sélectionnées au
vue de leur rythme de développement et de leur aptitude
à la formation de spores. Les spores des colonies sélectionnées sont isolées selon leur multiplication et placées dans des conditions parasites, c'est-à-dire que les
épis des plantes de seigle avant l'anthese sont infestés avec ces spores à l'aide de seringues d'inoculation.
A partir de ces plantes de seigle sont alors sélectionnés les sclérotes parmi lesquels le développement de sclérotes est obtenu à l'intérieur d'une courte période après apparition du miellat. Les grains sélectionnés de cette manière sont alors analysés par chromatographie en couche mince. La sélection ultérieure a été réalisée en tenant compte
de la teneur en ergocristine ainsi que de la teneur
en alcaloïdes secondaires non purs présents.
Les cultures de sclérotes obtenues de cette manière par amélioration sexuée sont alors soumises à une autre série de sélections; à partir des particules de sclérotes, des colonies sont cultivées sur des milieux de culture solides et à l'aide de ceux-ci des milieux de culture liquides sont inoculés. A partir de ces cultures submergées ainsi réalisées on sélectionne alors dans des essais en plein champ. des cultures qui sporulent le mieux et qui présentent la plus grande viabilité et la plus forte virulence,en tenant compte de la quantité et de la teneur moyenne des alcaloïdes produits par la drogue.
Conformément â ce processus, on réalise une autre :
série de sélections comprenant des étapes successives
de cycles de multiplication, ce qui permet d'obtenir
une nouvelle souche de Claviceps purpurea dotée de propriétés bien supérieures.à celles des souches précédemment connues.
La nouvelle souche, enregistrée sous le n[deg.] 00163 auprès de l'Institut National hongrois pour l'hygiène publique (OKI), s'est révélée particulièrement appropriée pour la production industrielle de préparation de spores d'inoculation, étant donné qu'elle permet d'élever considérablement la production de spores de la fermentation.
On notera également que cette souche présente des propriétés tout particulièrement intéressantes dans la production
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rendement de la production de drogues et en améliore la qualité de façon notable.
Dans les tableaux figurant ci-après on a rassemblé
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souche OKI 00163 et, 5 titre de comparaison, avec la souche de départ n[deg.] 661/1974 de l'Institut de Recherche hongrois de plantes officinales. Les essais réalisés sont des essais de fermentation et des essais en plein champ.
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Caractérisation morphologique de la nouvelle souche obtenue par la sélection faite dans le cadre de l'invention, ainsi que de la souche de départ :
Souche OKI 00163 - a) Malt-agar :
Après 28 jours colonies blanches, de grandeur allant de 0,5 à 0,6 cm, avec de courtes mycelles aériennes ;
formation de conidies à partir du douzième jour ; ré-
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b) Mannitol-citrate-agar :
Après 28 jours colonies plissées, planes, de couleur crème et de grandeur allant de 1,0 à 1,5 cm ; formation de conidies débutant Ci partir du quinzième jour.
c) Grandeur moyenne des conidies (à partir de 100 grains <EMI ID=9.1>
Souche de départ 661/1974 a) Malt-agar :
Après 28 jours colonies blanches-grises, de grandeur allant de 0,8 à 12,0 cm avec des mycelles aériennes déployées ? formation de conidies à partir du quinzième
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b) Mannitol-citrate-agar :
Après 28 jours colonies blanches, de grandeur allant de 1,5 à 2,0 cm, feutrées et déployées ; formation de conidies à partir du vingtième jour ; grandeur moyenne
<EMI ID=11.1> pris au hasard) 18 mm, surface extérieure fendillée.
La production de spores d'inoculation de la fermentation se trouve multipliée par deux du fait de l'utilisation de la nouvelle souche ; la production des drogues
se trouve améliorée de 50 % et la teneur en alcaloïdes
de la drogue obtenue se trouve améliorée de presque
100 %. Le rendement en alcaloïdes se trouve également très favorablement influencé du fait de la teneur essentiellement plus élevée en alcaloïdes. A titre d'exemple d'autres avantages, on peut encore mentionner que l'augmentation de la teneur en alcaloïdes n'est pas accompagnée d'une augmentation correspondante de matières grasses, de sorte que la quantité relative de matières grasses présentes dans la drogue devient très faible.
Le procédé selon l'invention sera illustré plus en détail à l'aide des exemples non limitatifs de mise en oeuvre particuliers mentionnés ci-après.
Exemple 1
Dans un fermenteur en verre d'une capacité de
5 litres, on inocule une culture de souche OKI 00163 malt-agar vieille de 24 jours sur un milieu de culture répondant à la composition suivante :
<EMI ID=12.1>
<EMI ID=13.1>
sous une agitation de 440 Tr/min., sous aération à l'aide de 0,5 litre d'air par litre de liquide de fermentation et par minute.
A l'aide de la culture d'inoculum obtenue comme indiquée ci-dessus, on inocule alors 100 litres d'un milieu de culture répondant à la composition suivante :
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La fermentation est réalisée dans une cuve de fermentation d'une capacité de 160 litres, résistante aux acides et équipée d'un dispositif d'agitation.
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sous agitation à 230 Tr/min., sous aération à l'aide de 1,0 litre d'air par litre de liquide de fermentation et par minute, et dans des conditions de pH de 4,5 à 5,0. La valeur du pH du liquide de fermentation est maintenue dans les limites indiquées par addition d'hydroxyde d'ammonium.
A la fin de l'opération de fermentation, le liquide de fermentation présente un nombre de spores de 4,2 :
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La biomasse obtenue est séparée, diluée à l'aide de 30 litres d'une solution à 10 % de saccharose, placée dans des bouteilles et conservée sous réfrigération
à basse température.
La préparation de spores d'inoculation obtenue comme
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Cette préparation de spores d'inoculation est alors diluée jusqu'à une concentration de 30 000 spores/mm3 et utilisée dans cet état pour l'infestation de plantes de seigle avant la formation d'épis. A partir du produit de la récolte
on obtient ainsi 250 kg de drogue par ha ; la teneur de la drogue en huiles grasses atteint 20 %.
Teneur en ergocristine : 6,2 mg/g
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Teneur en ergométrine : 0,2 mg/g
Exemple 2
La souche OKI 00163 est incubée pendant 21 jours à
24[deg.]C sur malt-agar. Les spores obtenues sont lavées à partir de la surface de la culture avec une solution physiologique stérile de sel de cuisine. Au moyen de cette solution saline contenant des spores, on infeste alors des plantes de seigle cultivées au phytotron. Les spores sont apportées au corps des plantes au moyen d'une seringue d'injection, à raison de 5 piqûres par épi.
A titre de comparaison, on effectue le même processus dans les mêmes conditions à l'aide de la souche de départ 661/1974. A chaque fois 100 épis ont été infestés partir de chaque souche.
Les sclérotes entièrement développés ont été collectés à l'état de maturité. Les résultats obtenus au cours de l'expérimentation ont été rassemblés dans le tableau suivant :
<EMI ID=19.1>
Exemple 3
Une culture de la souche OKI 00163, vieille de
28 jours, cultivée sur malt-agar est lavée avec une solution stérile de sel de cuisine, et le nombre de spores du liquide de lavage est réglé à 30 000 spores/mm3. A l'aide de cette solution, on infeste des parcelles d'essai de plantes de seigle d'une surface de 30 m2 chacune au cours de quatre essais parallèles. A titre de comparaison, on réalise, dans des conditions identiques, des essais parallèles avec une culture préparée de façon rigoureusement identique à partir de la souche de départ
661/1974.
L'infestation a été réalisée à la main, à l'aide
de plateaux d'infestation. Les sclérotes mûrs ont été collectés à la main sans aucune perte. Les résultats comparatifs obtenus ont été rassemblés dans le tableau suivant :
<EMI ID=20.1>