BE882619A - Vaccin pour le controle de la pleuropneumonie chez le porc - Google Patents

Description

  Au début de 1960 des bactéries du genre Haemophilus ont été isolées en Grande-Bretagne, en Californie et en Argentine dans des troupeaux de porcs qui étaient attaqués par la pleuropneumonie. C'était la

  
 <EMI ID=1.1> 

  
pneumoniae comme la souche argentine a été dénommée - qui fût la cause de la maladie, la pleuropneumonie. Depuis lors des attaques de la maladie ont été signalées dans

  
de nombreux pays, dont le Danemark, cf. P. Nielsen, Nord.

  
Vet. Med. 22 (1970), 240-245.

  
La maladie a un cours très aigu et s'accompagne souvent d'une mortalité élevée et, comme elle apparait assez fréquemment dans de nombreux troupeaux de porcs, des efforts ont été consentis pour tenter de développer un vaccin qui pourrait protéger les porcs contre la maladie. Un trait commun à ces vaccins est leur utilisation de cellules tuées

  
de H. pleuropneumoniaé et, dans la plupart des cas aussi, une addition d'un adjuvant.

  
Des tests de vaccination ont été également effectués dans des conditions sur champ, cf. R. Nielsen, Nord. Vet. Med. 28 (1976), 337-348. Dans ces tests des cultures sur plaque d'agar âgées de 6 ou 24 heures de H. pleuropneumoniae sont utilisées comme antigène. Les cellules sont tuées avec de la formaldéhyde et le vaccin contient 1010 cellules par ml dans un salin tamponné au phosphate (physiologique) (en abrégé ci-après PBS) contenant 0,2% de formaldéhyde et avec addition d'un adjuvant. Le vaccin est administré sous forme d'injections souscutanées de 2 fois 4 ml ou 2 fois 2 ml à un intervalle de 14 jours.

  
La première vaccination est effectuée lorsque les porcs sont âgés de 9 semaines. 2 semaines après la seconde vac-

  
 <EMI ID=2.1>  pleuropneumoniae.Comme adjuvants on a utilisé 15% d'Alhydrogel (gel d'hydroxyde d'aluminium) et respectivement de l'adjuvant incomplet de Freund, cf. J. Freund, Am. Rev. Microbiol. 1 (1947), 291.

  
Les résultats de ces tests de vaccination sont résumés au tableau I suivant.

TABLEAU I

  

 <EMI ID=3.1> 


  
On ajoutera que l'utilisation de l'adjuvant incomplet de Freund donne lieu à une formation de granulomes au site de l'injection.

  
Des tentatives ont été également faites pour obtenir une protection en utilisant des cultures de 20 heures tuées à la formaline comme antigène et respectivement de l'Alhydrogel et de l'adjuvant incomplet de Freund comme adjuvant. La dose injectée est 2 fois 5 ml contenant 10 bactéries/ml. La première injection est faite par voie intramusculaire chez des porcs âgés de 50 jours et la seconde injection 1 semaine plus tard. Après 1 semaine les porcs sont infectés. Le résultat est une preuve significative que le vaccin a un effet protecteur, mais il n'y a pas d'indication significative qu'un adjuvant offre des avantages par rapport à l'autre.

  
E. Scholl et coll. , cf. Proc. Int. Pig Vet. Soc. Congress, Ames, Iowa, U.S.A. (1976), ont utilisé des cultures tuées de H. pleuropneumoniae comme antigènes et ont vacciné par deux méthodes : 1) avec des doses croissantes, à savoir, 0,5, 1 et 3 ml et 2) avec 2 fois 5 ml. Toutes les injections sont faites à un intervalle de 2 semaines. Un test sérologique d'échantillons de sang montre que des injections répétées de petites doses conduisent à des anticorps

  
dans le sang, mais pas à des lymphocytes sensibilisés, tandis que des injections de doses élevées conduisent à des lymphocytes sensibilisés mais non à des anticorps dans le sang.

Les mêmes auteurs, cf. Proc. Int. Pig. Vet.

  
Soc. Congress, Zagreb, Yougoslavie (1978) ont utilisé des cultures de H. pleuropneumoniae tuées à la formaline à

  
des concentrations de 10 9 bactéries/ml. Les doses de vaccination et les méthodes de vaccination sont les mêmes

  
que dans les travaux cités précédemment; mais, dans ces derniers travaux, un groupe de porcs placébo est inclus et les animaux sont placés dans un troupeau de porcs chroniquement infecté. On a observé les symptomes cliniques et, consécutivement à l'abattage, on a examiné les poumons et

  
la cavité thoracique. Les résultats montrent un bon &#65533;ffet

  
de la vaccination,mais pas de différences entre les deux méthodes de vaccination.

  
M.F. de Jong, cf. Proc. Int. Pig Vet. Soc. Congress, Zagreb, Yougoslavie (1978), a effectué des tests de vaccination avec des cultures de H. pleuropneumoniae

  
de 24 heures auxquelles a été ajouté un adjuvant incomplet

  
à base d'huile minérale. Pour chaque dose on utilise 20 mg
(poids humide) d'antigène et l'on effectue deux injections

  
à un intervalle de 3 semaines, la première vaccination lorsque les porcs sont âgés de 10 semaines. 3 semaines après la seconde vaccination, les porcs sont provoqués avec des cultures de 16 ou 24 heures. Avec des cultures de provocation de 24 heures, les porcs deviennent malades, mais récupèrent après 1 semaine. D'un autre côté, les porcs provoqués avec une culture de provocation de 16 heures meurent dans les

  
36 heures. La provocation, chose bien connue de l'homme

  
de l'art, comporte une infection expérimentale des animaux testés avec des cellules vivantes du microorganisme infectieux.

  
M.F. de Jong, loc. cit., a alors utilisé des cultures de 6 heures à la fois pour la vaccination et la provocation. Les porcs sont provoqués avec différentes quantités de cellules et le taux de mortalité est fonction

  
du nombre de cellules utilisées. De plus, des porcs qui

  
ont été vaccinés avec des cultures de 6 heures sont provoqués avec des cultures de 16 heures et 50% des porcs survivent.

  
1 semaine plus tard les porcs qui ont survécu sont infectés avec une culture de 6 heures et alors ils ne montrent même plus de symptômes de maladie.

  
Les travaux sur les tests de vaccination mentionnés plus haut montrent clairement qu'il est nécessaire d'ajouter un adjuvant à un vaccin comprenant des antigènes

  
de H. pleuropneumoniae en vue d'obtenir un effet satisfaisant de la vaccination. Les substances employées le plus communément comme adjuvants sont l'Alhydrogel et l'adjuvant de

  
Freund (complet ou incomplet). Parmi ces substances l'adjuvant de Freund s'est montré jusqu'ici le plus efficace, mais, comme signalé aussi, cf. R. Nielsen, loc. cit. (1976), il en résulte une formation de granulomes au site d'injection et

  
c'est pourquoi il est considéré comme impropre. Par conséquent le problème d'apporter un adjuvant qui soit efficace mais qui n'interfère pas avec les animaux n'a pas encore été résolu

  
par les vaccinations expérimentales rapportées précédemment.

  
Un autre problème non résolu est la préparation d'un antigène pour la production du vaccin. Ce problème

  
réside dans le fait que le H. pleuropneumoniae a une croissance assez médiocre sur les substrats classiques utilisés précédemment, qui impose des limites très restrictives quant à la quantité de vaccin qu'il est possible de produire.

  
Ainsi J. Nicolet, cf. Zbl. Bakt. I Abt. Orig.
216 (1971), 487-495, dans ses études sérologiques a utilisé un substrat comprenant du PPLO-agar (cf. DIFCO-Manual IX,

  
 <EMI ID=4.1> 

  
pneumoniae) auquel ont été ajoutés 0,1% de glucose, 2,5% d'extrait de levure, 5% de sérum de cheval et 5 mg/litre

  
de NAD (bêta-nicotinamide-adénine-dinucléotide). Le même substrat est utilisé par R. Nielse, loc. cit. (1976).

  
M.F. de Jong, loc. cit., a utilisé une infusion de cerveau-coeur contenant du NAD comme substrat et M. Kilian et coll., cf. Int. J. Syst. Bacteriol. 28 (1978), 20-26,

  
ont exécuté des études taxonomiques du H. pleuropneumoniae, en cultivant les souches sur un substrat comprenant :

  
1% de peptone bactériologique neutralisée ("Oxoid") 1% d'extrait de levure,

  
1% de glucose,

  
10 mg/litre de NAD et

  
une solution saline telle que divulgée par L.V. Holdeman et W.E.C. Moore dans Anaerobe Laboratory Manual,

  
3e éd. , Virginia Polytechnic Institute, Anaerobe Laboratory, Blacksburg (1975).

  
Quelques autres auteurs ont cultivé le H. pleuropneumoniae dans des cultures liquides, mais avec des résultats assez pauvres.

  
Un objet de l'invention est d'apporter un vaccin nouveau et amélioré pour le contrôle effectif de la pleuropneumonie chez les porcs, en apportant aussi un adjuvant nouveau et amélioré pour ce vaccin, sans les effets secondaires associés aux adjuvants de l'art antérieur.

  
Un autre objet de l'invention est d'apporter un procédé de fermentation nouveau et amélioré pour la préparation de l'antigène nécessaire pour la production du vaccin de la présente invention, en sorte qu'il soit possible de.produire un vaccin efficace en des quantités suf- . fisantes pour une vaccination étendue si la chose est souhaitée.

  
Un autre objet de l'invention est d'apporter un substrat nouveau et amélioré pour la culture du H. pleuropneumoniae, en sorte d'obtenir une croissance du microorganisme qui soit substantiellement meilleure que lorsqu'on cultive sur des substrats de l'art antérieur.

  
Un autre objet de l'invention est encore d'apporter un procédé pour combattre la pleuropneumonie chez les porcs par l'administration du vaccin de la présente invention.

  
Ces objectifs ainsi que d'autres sont atteints par l'apport d'un vaccin qui comprend des cellules d'Haemophilus pleuropneumoniae, des parties de ces cellules, des extraits et/ou produits métaboliques de celles-ci, que l'on obtient par culture d'une souche de H. pleuropneumoniae

  
dans une culture liquide à base du substrat divulgué par

  
S.M. Cohen et M.W. Wheeler dans Am. J. Publ. Hlth. 36 (1946),
371-376, ce vaccin comprenant aussi comme adjuvant du gel d'hydroxyde d'aluminium et/ou de l'adjuvant incomplet ou complet de Freund et/ou du vaccin de Bordetella pertussis, une biomasse et/ou des extraits de celle-ci, ainsi qu'une solution tampon stérile comme diluant.

  
La bactérie utilisée pour la production du vaccin de la présente invention est une souche de Haemophilus pleuropneumoniae, microorganisme connu déposé dans diverses collections de cultures, voir plus loin, et procurable auprès

  
de celles-ci.

  
Des investigations ont montré qu'il existe au moins 6 sérotypes différents de H. pleuropneuinoniae , cf.

  
M. Kilian et coll. , loc. cit. (1978). Cette référence de

  
la littérature explique aussi pourquoi le nom de H. pleuropneumoniae est considéré comme le nom correct de l'organisme causant la pleuropneumonie chez les porcs et elle

  
donne un aperçu général des caractéristiques du microorganisme.

  
Parmi les divers sérotypes de H. pleuropneumoniae décrits dans la'référence ci-dessus de la littérature, certains ont été déposés, ainsi le sérotype 1 dans l'Américan Type Collection, RocKville, Md., U.S.A. sous le N[deg.] ATCC

  
27088, le sérotype 2 sous le. N[deg.] ATCC 27089 et le sérotype 3 sous le N[deg.] ATCC 27090. De plus le sérotype 2 a été déposé

  
dans la National Collection of Type Cultures, Colindale, Londres, Royaume-Uni sous le N[deg.] NCTC 10976 et ces trois sérotypes ont tous été déposés dans la Czechoslovak Collection of Microorganisms, Brno, Tchécoslovaquie, sous les

  
N[deg.] CCM 5869, CCM 5870 et CCM 5871, respectivement.

  
En outre, M. Kilian et coll. loc. cit. (1978), décrivent des sérotypes désignés par sérotypes 4, 5 et NT. Toutefois, on n'indique pas de numéros de dépôt.

  
Les propres investigations de la demanderesse

  
ont confirmé que les bactéries de H. pleuropneumoniae

  
sont de petits bâtons gram-négatifs immobiles qui peuvent prendre un certain nombre de configurations en fonction du substrat de culture et des conditions environnantes.

  
Ainsi, sur des plaques d'agar ce sont le plus souvent de petits bâtons du genre coques ou courts, tandis

  
que dans les cultures liquides elles peuvent varier de bâtonnets en forme de coques jusqu'à des bâtons élancés plus longs ou épais, avec comme exception (assez rare) même des configurations filamentaires pléomorphiques. 

  
Cultivées sur plaques d'agar sur le substrat

  
de la présente invention (pour la composition se rapporter

  
au tableau III plus loin), les bactéries de H. pleuropneumoniae ont la configuration de petits bâtons genre coques

  
et les colonies individuelles ont un diamètre allant jusqu'à 3 mm après 48 heures à 37[deg.]C. Fermentées dans le bouillon nutritif de la présente invention (pour la composition se rapporter au tableau IV plus loin), les bactéries de H. pleuropneumoniae sont des bâtons courts qui souvent sont en chaînes plus courtes ou plus longues.

  
Au niveau biochimique, les bactéries de H. pleuropneumohiae se comportent de la manière décrite par M. Kilian, J. Gen. Microbiol. 93 (1976), 9-62, ayant les propriétés caractéristiques suivantes qui, ensemble, les rendent différentes d'autres espèces d'Haemophilus : dépendance du facteur V, aptitude à synthétiser de la porphyrine à partir d'acide delta-aminolévulinique, production d'uréase et aptitude à fermenter le mannitol, le xylose et le désoxyribose.

Plus spécifiquement on a utilisé une souche de

  
H. pleuropneumoniae qui a été isolée à partir d'un porc atteint de pleuropneumonie. Cette souche est du sérotype 2,

  
cf. R. Nielsen, loc. cit. (1976) et elle a été soumise au Statens Veterinaere Serumlaboratorium (Laboratoire de sérum vétérinaire de l'Etat), Copenhagen, Danemark, où on l'a désignée par sous-culture 4226.

  
Le substrat utilisé dans la mise en oeuvre de

  
la présente invention est à base du substrat divulgué par

  
S.M. Cohen et M.W. Wheeler, loc. cit., ayant la composition donnée au tableau II ci-dessous. 

TABLEAU II

  

 <EMI ID=5.1> 


  
 <EMI ID=6.1> 

  
Pour les objectifs de la présente invention, ce substrat est modifié en sorte d'améliorer la croissance du H. pleuropneumoniae et de fournir un substrat convenant pour la préparation d'un vaccin de H. pleuropneumoniae

  
 <EMI ID=7.1> 

  
si on le désire. Deux différentes modifications sont utilisées pour la culture sur plaques d'agar et respectivement la fermentation en milieu liquide.

  
Pour des plaques d'agar on utilise comme ingrédients essentiels un substrat comprenant du casamino acid,

  
 <EMI ID=8.1> 

  
adénine-dinucléotide (appelé par la suite NAD). De plus,

  
ce substrat devra contenir des sels appropriés et autres ingrédients nutritifs utilisés conventionnellement dans la culture des microorganismes, en particulier de l'espèce Haemophilus. Un substrat spécialement préféré a la composition donnée au tableau III ci-dessous. 

TABLEAU III

  
 <EMI ID=9.1> 

  

 <EMI ID=10.1> 


  
On prépare ce substrat de la manière suivante:
le casamino acid, l'extrait de levure, le glucose, le NaCl,

  
 <EMI ID=11.1> 

  
cystéine.HCl et l'agar-agar et règle le volume à 1000 ml par l'addition de H20 traitée par échange d'ions. On chauffe la solution à l'ébullition (en vue de dissoudre l'agar) et on l'autoclave à 121[deg.]C sous une pression de 2 atmosphères

  
 <EMI ID=12.1> 

  
le NAD et l'on verse le substrat dans des boîtes de Pétri.

  
Le substrat de la présente invention à utiliser en fermentation dans un milieu liquide comprend aussi du casamino acid, de l'extrait de levure, du glucose et du NAD comme ingrédients essentiels. Ce substrat devra contenir des sels appropriés et autres ingrédients nutritifs couramment utilisés dans la fermentation des microorganismes, en particulier de l'espèce Haemophilus. Un substrat spécialement préféré a la composition donnée au tableau IV ci-dessous.

TABLEAU IV

  
Substrat pour la fermentation en milieu liquide

  

 <EMI ID=13.1> 


  
Ce substrat, appelé en abrégé substrat CAY, est préparé de la manière suivante :

  
le casamino acid, l'extrait de levure, le glucose,

  
 <EMI ID=14.1> 

  
CuS04.5H20 et le cystéine.HCl, on règle le volume à 1000 ml par l'addition de H20 traitée par échange d'ions et l'on autoclave la solution à 121[deg.]C sous une pression de 2 atmosphères pendant 15 minutes. Après refroidissement on ajoute le NAD et le substrat est prêt à l'usage.

  
Les deux substrats divulgués aux tableaux III et IV comportent des sources assimilables de carbone et d'azote pouvant être assimilées par le microorganisme H. pleuropneumoniae. Sur les deux substrats on obtient une croissance abondante et dense de l'organisme.

  
Le processus de fermentation est comme suit:

  
on entrepose les souches de bactéries à l'état lyophilisé dans des ampoules préparées par une des méthodes décrites ci-dessous. L'entreposage est effectué dans un réfrigérateur à 5[deg.]C.

  
Méthode A 

  
On cultive les bactéries à 37[deg.]C pendant 18 heures sur plaques d'agar avec un substrat ayant une composition comme celle indiquée au tableau III. On récolte les cellules par l'addition de 1 ml de PBS (composition donnée au tableau v ci-dessous), avec abrasion ultérieure des cellules. Les cellules sent transférées dans des ampoules qui sont immédiatement refroidies à -25[deg.]C.,puis elles sont transférées dans un lyophiliseur et sont lyophilisées.

TABLEAU V

  
Composition du PBS

  

 <EMI ID=15.1> 


  
On dissout les sels dans de l'eau distillée et on les autoclave à 12l[deg.]C sous une pression de 2 atmosphères pendant 15 minutes. pH= 7,3.

  
Méthode B

  
Cette méthode est semblable à la méthode A, mais on utilise 1 ml de lait écrèmé pour chaque plaque

  
au lieu de PBS. Le lait écrémé a été traité à chaud à 100[deg.]C pendant 15 minutes les 3 jours qui suivent.

  
Méthode C

  
On cultive les bactéries pendant 6 heures au bainmarie dans du substrat CAY (voir tableau IV). On centrifuge la suspension complètement développée de bactéries et on remet les cellules bactériennes en suspension dans du lait écrèmé stérile, que l'on transfère dans des ampoules qui sont refroidies et lyophilisées comme décrit à la méthode A.

  
Les bactéries sont restaurées à partir des ampoules lyophilisées par l'addition de substrat suivie de l'inoculation sur plaques d'agar et dans des tubes contenant la substrat liquide.

  
Les cultures vivantes sont maintenues par une inoculation quotidienne sur plaques d'agar fraîches contenant le substrat du tableau III. Les plaques sont soumises à

  
une incubation dans un incubateur à 37[deg.]C.

  
On prépare une préculture par propagation des bactéries. Ceci se fait par inoculation à partir d'une plaque d'agar dans une fiole contenant 50 ml de substrat CAY liquide. On soumet la fiole à l'incubation dans un incubateur à 37[deg.]C

  
 <EMI ID=16.1> 

  
l'inoculation de la seconde préculture.

  
La seconde préculture consiste en 500 ml de substrat CAY liquide dans une fiole conique de 1 litre qui est soumise à l'incubation sur bain-marie avec secouage continu. La température est de 32[deg.]C et la période d'incubation est de 18 heures.

  
On utilise la seconde préculture pour la fermentation principale au cours de laquelle le substrat CAY liquide du tableau IV est utilisé comme milieu de fermentation. 

  
On prépare le milieu comme décrit plus haut pour le substrat CAY, à savoir en dissolvant le casamino acid, l'extrait

  
de levure, le glucose, le NaCl, le KH2P04 et le MgCl2.

  
6H20 dans de l'eau traitée par échange d'ions, en ajustant le pH à environ 7,2 , en ajoutant les ingrédients restants

  
à l'exception du NAD, en autoclavant le milieu à une température d'au moins environ 121 [deg.]C sous une pression d'au moins environ 2 atmosphères pendant au moins 15 minutes, en

  
 <EMI ID=17.1> 

  
contrôlant et en réajustant le pH à environ 7,2, et en ajoutant le NAD.

  
Puis on inocule le fermentateur avec la seconde préculture de H. pleuropneumoniae obtenue comme décrit plus haut. Au cours de la fermentation on maintient une température de préférence d'environ 37[deg.]C et l'on utilise une circulation d'air à travers le milieu en vue de maintenir une concentration adéquate d'oxygène dans le milieu. Ceci peut se faire en partie en contrôlant le débit du courant d'air et en partie

  
en réglant la vitesse du dispositif agitateur du fermentateur, en prenant ainsi en considération que ces paramètres sont mutuellement dépendants, en ce sens qu'une augmentation de

  
l'un de ceux-ci conduit à une concentration accrue en oxygène qui, à son tour, peut nécessiter une diminution de l'autre paramètre.

  
Pour la fermentation du H. pleuropneumoniae, la concentration en oxygène peut varier d'environ 1 à environ

  
30 ppm, la concentration la plus appropriée étant d'environ

  
8 à environ 20 ppm, en particulier d'environ 8 à environ 12 ppm, plus spécifiquement encore d'environ 10 à environ 12 ppm.

  
Le débit d'air et la vitesse d'agitation nécessaires en vue

  
de maintenir une telle concentration d'oxygène dépendra évidemment des dimensions, de l'équipement et de l'arrangement du fermentateur; mais, on a trouvé qu'un débit d'air allant jusqu'environ 0,5 litre d'air par minute par litre de milieu de fermentation, en particulier d'environ 0,15 à environ 0,4 litre, plus spécifiquement d'environ 0,2 à environ 0,3 litre d'air par minute et par litre de milieu de fermentation convient le mieux dans un fermentateur ayant une capacité d'environ 20 litres. Pour ce fermentateur une vitesse d'agitation appropriée est d'environ 200 à environ 600 tours/minute, en particulier d'environ 500 tours/minute.

  
On mettra l'accent sur le fait que ces paramètres ne sont pas critiques dans la pratique de la présente invention et que, pour un fermentateur-quelconque, l'homme de l'art sera en mesure d'ajuster les paramètres en sorte de maintenir la concentration désirée en oxygène.

  
Au cours de la fermentation il est préférable

  
de maintenir un pH substantiellement constant. Un pH convenable se situe dans l'intervalle d'environ 6,0 à environ

  
7,9, en particulier d'environ 6,9 à environ 7,5, plus spécifiquement d'environ 7,1 à environ 7,4, de préférence d'environ 7,3. Ceci peut s'accomplir par l'addition d'une base, avantageusement d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium si c'est nécessaire.

  
Il est préférable de ne pas ajouter un agent anti-mousse, mais il peut être nécessaire de le faire. Tout agent anti-mousse conventionnel à l'usage de procédés de fermentation convient dans ce but, en particulier un agent anti-mousse de silicone.

  
Le fermentateur est de préférence pourvu de

  
moyens permettant une addition automatique de base de réglage de pH et/ou d'agent anti-mousse au cours de la fermentation. Toutefois l'addition peut se faire aussi manuellement

  
si c'est nécessaire. 

  
Au cours de la fermentation, on prélève des échantillons par intermittence et on les utilise pour une détermination de la densité de cellules. On mesure la densité avec un "colorimètre Corning 252" à une longueur d'onde de 600 nm et on l'exprime en nombre d'unités formatrices de colonies (CFU) au moyen d'une courbe de référence standard. Cette mesure de la densité a pour objet

  
 <EMI ID=18.1> 

  
la fermentation au moment le plus approprié pour la production ultérieure d'un vaccin, à savoir lorsque la phase

  
dans laquelle les bactéries montrent une croissance exponentielle est expirée.

  
Lorsque la fermentation a été achevée, on ajoute une solution concentrée de formaldéhyde et une solution d'Alhydrogel au milieu de fermentation et, après agitation pendant une durée substantielle, par exemple une nuit, on soumet la suspension à une cantrifugation, ce qui donne une partie surnageante contenant de la formaldéhyde et un précipité comprenant les cellules de H. pleuropneumoniae et l'Alhydrogel. On recueille le précipité dans un récipient stérile. On prélève un échantillon pour vérifier que les bactéries ont été tuées.

  
Les exemples suivants vont illustrer supplémentairement les avantages obtenus en cultivant le H.pleuropneumoniae sur le substrat de CAY de la présente invention.

Exemple 1

  
Cet exemple montre la fermentation de l'Haemophilus pleuropneumoniae, souche ATCC 27089, sous-culture
4226, sur le substrat CAY de la présente invention.

  
Le fermentateur est un "Biomat E 20" (Moeller

  
 <EMI ID=19.1> 

  
nir 20 litres de substrat dans chaque fermentation et étant équipé d'un moyen d'agitation, moyen qui permet une variation manuelle de la vitesse d'agitation, d'un instrument qui indique continuellement la vitesse d'agitation (en tours/ minute), d'un moyen pour fournir de l'air stérile, d'un moyen de mesure continue et d'enregistrement de la concentration en oxygène du milieu de fermentation, d'un moyen continu de mesure et d'ajustage automatique de la température à une valeur prédéterminée, d'un moyen de mesure continu et d'enregistrement du pH du milieu de fermentation et pour l'addition manuelle ou automatique de bases de contrôle du pH ou d'acides, d'un moyen pour contrôler le moussage dans le fermentateur et pour l'addition automatique d'un agent anti-mousse si c'est nécessaire, et d'un moyen pour prélever des échantillons au cours de la fermentations

  
On charge le fermentateur avec 17 litres d'eau traitée par échange d'ions et on commence à agiter. Puis on ajoute 306 g de casamino acid, 238 g d'extrait de levure,

  
187 g de glucose, 42,5 g de NaCl, 8,5 g de KH2P04 et 1,7 g

  
 <EMI ID=20.1> 

  
42,5ml d'une solution à 1% en poids/volume de cystéine.HCl. On ferme le fermentateur, on autoclave pendant 15 minutes à
121[deg.]C sous une pression de 2 atmosphères puis on refroidit à
36[deg.]C. On ajoute ensuite 17,0 ml d'une solution à 2,5% en poids/volume de NAD. Ce mode opératoire conduit à un milieu de fermentation ayant la composition donnée au tableau IV, avec un pH de 7,45.

  
On inocule le fermentateur avec 600 ml d'une seconde préculture de H.pleuropneumoniae préparée à partir d'un stock de bactéries lyophilisées et cultivées de la manière décrite plus haut. La période de fermentation est de 7 heures et 50 minutes et des échantillons sont prélevés de manière intermittente et utilisés pour déterminer la densité absolue de cellules du milieu de fermentation. On mesure la densité au "Colorimètre Corning 252" à une longueur d'onde de 600 nm et on la convertit en cellules par ml en utilisant une référence standard et une table de conversion qui rend possible le tracé d'une courbe de croissance et de déterminer quand la phase de croissance exponentielle des bactéries est arrivée à son terme.

  
On effectue cette, fermentation principalement en tant que fermentation expérimentale et c'est pourquoi

  
on a pris la liberté de procéder d'une manière quelque peu '&#65533;normale", qui comprend le fait que le pH n'est pas ajusté durant la fermentation et qu'on n'ajoute pas d'agent antimousse.

  
Les résultats obtenus d'après l'analyse des échantillons sont donnés au tableau VI ci-dessous.

  
On verra que la concentration d'oxygène qui devrait être de préférence de 8 à 10 ppm diminue drastiquement au cours de la fermentation, en particulier dans la phase de croissance exponentielle. On combat ceci en augmentant en partie le débit d'air et en partie la vitesse d'agitation. On verra aussi que le pH diminue à un pH final de 5,30. 

  

 <EMI ID=21.1> 


  

 <EMI ID=22.1> 
 

  

 <EMI ID=23.1> 


  

 <EMI ID=24.1> 
 

  
Les résultats du tableau VI ont été utilisés pour tracer la courbe de croissance représentée à la figure

  
1 des dessins. Dans la figure, les abscisses indiquent le temps après l'inoculation et les ordonnées indiquent le nombre de cellules par ml de milieu de fermentation. On notera que les ordonnées sont représentées avec une échelle logarithmique. La figure montre que la phase de croissance exponentielle se termine environ 5 heures après l'inoculation, ce qui signifie que le fermentation aurait dû être arrêtée

  
en ce point si le milieu avait été destiné à servir pour la production d'un vaccin. Toutefois, comme cette fermentation est une fermentation expérimentale, elle est poursuivie jusque dans la phase de croissance stationnaire.

  
La fig. 1 des dessins permet aussi de calculer

  
le temps (Tg) nécessaire pour doubler le contenu en bactéries dans le milieu de fermentation au cours de la phase de croissance exponentielle. Tg est donné par la formule :

  

 <EMI ID=25.1> 


  
 <EMI ID=26.1> 

  

 <EMI ID=27.1> 


  
où C2 est le nombre de cellules par volume unitaire au temps

  
 <EMI ID=28.1> 

  
Dans la figure 1 la phase de croissance exponentielle est représentée par la partie rectiligne de la courbe. On voit que cette phase s'étend de pas plus tard que 1 heure jusqu'environ 5 heures après inoculation. En utilisant cette partie de la courbe (résultats marqués par un cercle dans la figure 1 , à savoir les échantillons portant les ? 6 à 18) pour un calcul selon la formule (II), on voit que : 

  

 <EMI ID=29.1> 


  
 <EMI ID=30.1> 

  
Suivant la formule (I) ceci veut dire que :

  

 <EMI ID=31.1> 


  
ce qui équivaut à 39,6 minutes.

Exemple 2

  
Cet exemple décrit une fermentation "normale"

  
 <EMI ID=32.1> 

  
ajusté à environ 7,2 qu'un agent anti-mousse est automatiquement ajouté si c'est nécessaire, qu'une agitation plus vigoureuse est maintenue et que la concentration d'oxygène

  
est continuellement maintenue à un niveau relativement élevé.

  
Le fermentateur est identique au fermentateur utilisé à l'exemple 1. Le volume du milieu de fermentation est d'environ 20 litres dont le milieu d'inoculation apporte 0,5 litre, la balance étant 19 litres d'eau traitée par échange d'ions contenant le casamino acid, l'extrait de levure, le glucose et les sels en des quantités produisant

  
un substrat CAY dont la composition relative est donnée au tableau IV. Le chargement du fermentateur, l'autoclavage,

  
le refroidissement et l'addition ultérieure de NAD se font comme décrit à l'exemple 1. Le pH initial du milieu est de

  
 <EMI ID=33.1> 

  
Lorsque le milieu d'inoculation a été ajouté, on démarre la fermentation et la poursuit pendant 7 heures

  
et 30 minutes. Le milieu d'inoculation est constitué par

  
500 ml d'une seconde préculture de H.pleuropneumoniae,

  
souche ATCC 27089, sous-culture 4226, cultivée de la

  
manière décrite plus -haut.

  
Pendant la fermentation le pH est maintenu à

  
une valeur presque constante d'environ 7,2 par une addition automatique d'une solution de NaOH 1 N lorsque c'est nécessaire. L'agitation est exécutée à 500 tours/minute et la concentration en oxygène est maintenue entre environ 8 et environ 12 ppm. Ceci est réalisé en augmentant le débit d'air lorsque c'est nécessaire. Un .agent anti-mousse de marque commerciale "Silicone RS Antifoam C. DAK" est automatiquement ajouté quand c'est nécessaire.

  
Des échantillons sont prélevés au cours de la fermentation et analysés comme décrit à l'exemple 1 pour pouvoir suivre le taux de croissance. La période de fermentation est de 7 heures et 30 minutes.

  
Les résultats de la fermentation ont été résumés au tableau VII. 

  

 <EMI ID=34.1> 


  

 <EMI ID=35.1> 
 

  

 <EMI ID=36.1> 


  

 <EMI ID=37.1> 
 

  
Les résultats donnés au tableau VII ont été utilisés pour le tracé de la courbe représentée à la figure 2 des dessins. Les abscisses et les ordonnées ont les significations données pour la figure 1, cf. exemple 1. D'après la figure 2, on voit que la fermentation est arrêtée alors que le microorganisme se trouve encore dans la phase de croissance exponentielle, bien que le taux de croissance soit un peu moins prononcé que dans la phase initiale de la fermentation, une légère diminution de la pente de la courbe se produisant à environ 3 heures et 30 minutes

  
après l'inoculation.

  
Les mesures indiquées avec des cercles

  
dans la figure 2 ont été utilisées pour les calculs conformément aux formules (I) et (II) de l'exemple 1, en partie pour la phase initiale (phase 1, échantillons

  
 <EMI ID=38.1> 

  
échantillons ? 15 à 27) de la fermentation. Les unités utilisées dans les calculs à l'exemple 1 sont utilisées également dans ces calculs, ce qui donne les résultats suivants.

  

 <EMI ID=39.1> 


  
ce qui équivaut à 45,5 minutes
 <EMI ID=40.1> 
 
 <EMI ID=41.1> 
 ce qui équivaut à 75,7 minutes.

  
Une comparaison des résultats obtenus selon les exemples 1 et 2 montre que bien que le procédé de fer-

  
 <EMI ID=42.1> 

  
le plus bas, ce qui signifie une croissance plus rapide

  
des bactéries dans le fermentateur et par conséquent une période de fermentation plus courte avant que le bouillon soit prêt pour l'emploi dans la production d'un vaccin de H.pleuropneumoniae, il conduit aussi à une transition plus rapide à la phase de croissance stationnaire, à savoir après une période de fermentation d'environ 5 heures, tandis que la fermentation "normale" conduit à une période prolongée

  
 <EMI ID=43.1> 

  
plus de 7 1/2 heures. Plus important . la fermentation "normale" conduit aussi à un rendement plus élevé en cellules par volume unitaire au moment où le bouillon est déjà

  
 <EMI ID=44.1> 

  
cellules par ml, à comparer avec environ 27 x 108 cellules par ml dans l'exemple 1 (échantillon ? 18 où la phase de croissance exponentielle se termine). Par conséquent, du point de vue commercial (production de vaccin) le procédé

  
de fermentation "normale" de l'exemple 2 est préféré parce que la plus grande consommation de temps est plus que compensée par le rendement plus élevé de cellules utilisables dans la production ultérieure de vaccin.

Exemple 3

  
Cet exemple est un exemple comparatif qui montre

  
que la fermentation du H.pleuropneumoniae, sous-culture

  
4226, sur un substrat connu, conduit à un taux de croissance beaucoup plus lent et à un rendement beaucoup plus faible que la fermentation dans le substrat de la présente invention.

  
Le fermentateur est identique à celui utilisé aux exemples 1 et 2.

  
 <EMI ID=45.1> 

  
crobiology" publié par E. Merck, Darmstadt, République Fédérale d'Allemagne, auquel a été ajouté 6 mg de NAD par litre de bouillon. Le fermentateur est chargé avec 17 li-

  
 <EMI ID=46.1> 

  
est de 7,3.

  
Comme milieu d'inoculation on ajoute une seconde préculture de H.pleuropneumoniae ATCC 27089, sous-culture
4226. Cette préculture a été cultivée de la manière décrite plus haut. Au cours de la fermentation on maintient une

  
 <EMI ID=47.1> 

  
le laisse diminuer jusqu'à un pH final de 6,85. La concentration initiale en oxygène est de 10 ppm, mais elle tombe très rapidement à 0, en partie parce que le débit d'air est faible et en partie parce que l'agitation est immédiatement arrêtée après l'inoculation et non reprise jusqu'à ce qu'une

  
 <EMI ID=48.1> 

  
Donc, c'est une caractéristique de cette fermentation qu'elle doit avoir lieu dans des conditions presque anaérobies pour obtenir un rendement acceptable qui, néanmoins, est bas, cf. tableau VIII ci-dessous.

  
La période de fermentation est de 6 heures et

  
 <EMI ID=49.1> 

  
prélevés et analysés de la manière et pour le paramètre décrits à l'exemple 1. Les résultats de la fermentation sont résumés au tableau VIII. 

  

 <EMI ID=50.1> 


  

 <EMI ID=51.1> 
 

  

 <EMI ID=52.1> 


  

 <EMI ID=53.1> 
 

  
Les résultats du tableau VIII ont été utilisés pour tracer la courbe de croissance représentée dans la figure 3 des dessins. Les abscisses et les ordonnées représentent les mêmes unités que celles citées à l'exemple 1 pour la figure 1. En comparant les courbes respectivement des figures 1 et 2, et de la figure 3, il apparait clairement que le taux de croissance de H. pleuropneumoniae est substantiellement plus rapide dans le substrat CAY de la présente invention (fig.l et 2&#65533; que dans le bouillon CASO connu
(figure 3), ceci étant confirmé par les calculs conformément <EMI ID=54.1> 

  
sous.

  
Par la figure 3 on voit que la phase de croissance exponentielle des bactéries se termine environ 5 heures après l'inoculation et que cette phase, comme c'était le cas dans la fermentation de l'exemple 2, comporte deux phases différentes dont la phase 1 se termine environ 3 1/2 heures après l'inoculation, à savoir environ au moment où l'agitation reprise conduit à une concentration en oxygène supé-

  
 <EMI ID=55.1> 

  
sont faits comme décrit à l'exemple 1. De nouveau la base pour les calculs est constituée par le points de la courbe de la figure 3 qui sont représentés avec des cercles. Les résultats sont les suivants :

  

 <EMI ID=56.1> 
 

  

 <EMI ID=57.1> 


  
 <EMI ID=58.1> 

  
Ces résultats montrent que le taux de croissance exponentielle des bactéries de H. pleuropneumoniae, en cas de fermentation sur le substrat CAY de la présente invention, est étonnamment plus rapide que celui de la fermentation sur bouillon CASO, à savoir environ deux fois plus rapide dans la phase 1 (Tg = 39,7 et 45,5 minutes contre 78 minutes)

  
et que le taux de croissance dans la phase 1 sur bouillon CASO est même encore plus lent que le taux de croissance dans la phase 2 de l'exemple 2 sur substrat CAY (Tg = 78 minutes contre 75,7 minutes).

  
 <EMI ID=59.1> 

  
surprenamment plus élevés que le rendement sur bouillon CASO
(26,4 x 108 cellules par ml à l'exemple 1 à la fin de la phase de croissance exponentielle et 37,2 x 108 cellules

  
par ml à l'exemple 2 , contre 10,2 x 108 cellules par ml

  
à l'exemple 3). Par conséquent les rendements sur le substrat de la présente invention sont respectivement 2,6 et 3,6 fois le rendement sur le substrat connu. 

Exemple 4

  
Après une période de fermentation de 7 1/2 heures, on stoppe la fermentation décrite à l'exemple 2 par l'addition de 60 ml de solution concentrée de formaldéhyde et

  
de 600 ml d'Alhydrogel. L'Alhydrogel ajouté est une solution à 2% en poids/volume d'hydroxyde d'aluminium. Après agitation vigoureuse durant une nuit (pendant environ 18 heures), on transfère le bouillon de fermentation dans un réservoir d'entreposage à partir duquel il est pompé dans une centrifugeuse à disque et séparé en une partie surnageante aqueuse de formaldéhyde qui est écartée et en un précipité comprenant les cellules de H. pleuropneùmoniae et l'Alhydrogel. Le volume de précipité représente environ 2% du volume initial de bouillon. On recueille le précipité dans un récipient. On prélève des échantillons et l'on vérifie que toutes les bactéries ont été tuées.

  
Le mode opératoire décrit dans cet exemple

  
est exécuté dans des conditions aseptiques, à savoir que les solutions ajoutées et l'équipement utilisé ont été stérilisés avant d'entrer en contact avec le bouillon de fermentation.

Exemple 5

  
Le précipité recueilli comme décrit à l'exemple

  
4 est utilisé pour la production d'un vaccin de H. pleuropneumoniae. On obtient un vaccin en diluant le précipité avec

  
un salin tamponné au phosphate (physiologique), solution
(PBS), ayant la composition montrée au tableau V, jusqu' environ la densité désirée pour le vaccin. Puis on ajoute

  
 <EMI ID=60.1> 

  
et facultativement de l'Alhydrogel, et on met en suspension le précipité, la solution PBS, le "Thiomersal" et l'Alhydrogel dans un tampon chlorure de sodium-phosphate ayant un pH de 7, on agite pendant 20 minutes et l'on prélève un échantillon pour l'analyse. Sur la base de cette analyse, on règle la densité du vaccin à la valeur désirée. Puis on ajoute une suspension de Bcrdetella pertussis (vaccin de

  
 <EMI ID=61.1> 

  
règle la densité et l'on verse le vaccin dans des fioles capsulées.

  
On comprendra que la totalité des stades décrits dans cet exemple sont exécutés dans des conditions aseptiques.

  
Pour l'utilisation ultérieure dans la vaccination de porcs, on a trouvé qu'une densité convenable du vaccin

  
est d'environ 20 I.O.U. et l'on préfère par conséquent que

  
le précipité de l'exemple 4 soit dilué avec la solution

  
de PBS à.environ cette valeur et que la densité finale du vaccin soit ajustée à un niveau de 20 I.O.U. avant l'addition de la suspension de B.pertussis. On a trouvé également qu'une concentration convenable de l'adjuvant "Thiomersal" est d'environ 0,01% en poids/volume et que l'adjuvant Alhydrogel devra de préférence être présent à une concentra-

  
 <EMI ID=62.1> 

  
Alhydrogel on doit tenir compte de ce qu'au moins la majeure partie de cet adjuvant a déjà été ajoutée au cours du traitement du bouillon de fermentation décrit à l'exemple 4. Ceci suppose en général qu'un ajustement mineur de la teneur en Alhydrogel est seulement nécessaire et qu'il peut même être superflu d'ajouter de l'Aihydrogel en même temps que le "Thiomersal".

  
La suspension de Bordetella pertussis qui, si on le désire, peut aussi être ajoutée sous la forme de biomasse de B. pertussis et/ou d'extraits de celui-ci,

  
est l'ingrédient dans le vaccin de H.pleuropneumoniae de la présente invention qui conduit aux propriétés et activités étonnamment supérieures du vaccin de l'invention lorsqu'il est utilisé pour la vaccination de porcs contre la pleuro-

  
 <EMI ID=63.1> 

  
Ni le vaccin de B. pertussis en lui-même
(biomasse et/ou extraits), ni la méthode pour sa production ne font partie de la présente invention, laquelle implique que tout vaccin de ce genre est utilisable comme adjuvant dans le vaccin de H.pleuropneumoniae de l'invention, à condition que le vaccin de B.pertussis ainsi que le vaccin final de la présente invention satisfassent à toutes les exigences imposées aux vaccins selon les standards nationaux et/ou internationaux. Donc, le vaccin de B.pertussis préféré pour l'usage dans la production d'un vaccin de H. pleuropneumoniae de la présente invention est un Vaccinum pertussis

  
qui a été préparé, identifié et testé comme décrit dans la Pharmacopée européenne, Vol. III (1975), 409, qui satisfait aux tests mentionnés ici.

  
Une quantité appropriée de l'adjuvant, la suspension de B. pertussis, dans le vaccin de H. pleuropneumoniae de l'invention, est d'environ 16 I.O.U. de vaccin, qui peut être adéquatement obtenue par l'addition de 100 ml de sus-

  
 <EMI ID=64.1> 

  
1 litre de suspension obtenue en mélangeant le précipité

  
de l'exemple 4, la solution PBS, le "Thiomersal", l'Alhydrogel quant il est utilisé, et le tampon chlorure de sodiumphosphate.

  
 <EMI ID=65.1> 

  
"Colorimètre Corning 252" à une longueur d'onde de 600 nm de la manière décrite plus haut.

  
Le vaccin est transféré dans des fioles capsulées

  
 <EMI ID=66.1> 

Exemple 6

  
En suivant le mode opératoire décrit à l'exemple 5, on prépare un vaccin de H. pleuropneumoniae comprenant :

  

 <EMI ID=67.1> 


  
tampon chlorure de sodium-phosphate (pH 7) pour faire 1 ml. Investigations cliniques

  
On a trouvé que le vaccin de la présente invention est efficace pour combattre la pleuropneumonie chez les porcs exposés à une infection par le micro-organisme Haemophilus pleuropneumoniae et qu'il est donc indiqué pour le traitement prophylactique des porcs, en particulier des porcs séronégatifs, avant qu'ils se rendent dans un environnement qui peut déjà être infecté par le H.pleuropneumoniae, ou bien où le risque d'une telle infection peut exister. En

  
vue de combattre la pleuropneumonie, les porcs sont vaccinés avec un vaccin de H. pleuropneumoniae de la présente invention par injection intramusculaire ou souscutanée du vaccin, une injection souscutanée étant préférable.

  
Pour assurer une vaccination efficace, le vaccin de la présente invention est administré deux fois, avec un intervalle adéquat entre les injections, qui est de préférence non inférieur à 3 semaines. La dose administrée dépendra évidemment du poids du corps des porcs, de la puissance du vaccin, des risques d'effets secondaires et de la nature de ces effets lorsqu'ils existent, ainsi que d'autres facteurs qui sont couramment pris en considération lorsqu'on effectue une vaccination, quelle que soit la substance active dans le vaccin. Toutefois, on a trouvé qu'une dose de 2 ml du vaccin décrit à l'exemple 6 est efficace en général chez les porcs

  
 <EMI ID=68.1> 

  
d'un poids du corps supérieur à 30 kg, une dose de 4 ml du vaccin peut convenir.

  
Les exemples suivants montrent les avantages obtenus par l'usage du vaccin de la présente invention pour la vaccination contre la pleuropneumonie, en faisant une

  
 <EMI ID=69.1> 

  
d'autres adjuvants.

Exemple 7

  
On donne à 45 porcs pesant environ 25 kg une injection souscutanée des vaccins A à E décrits plus en détail ci-dessous. 3 semaines plus tard on répète la vaccination. Le dosage est respectivement de 2 ml, 5 ml et 6 ml.

  
3 semaines après la seconde injection les porcs sont provoqués par des bactéries de H. pleuropneumoniae (environ

  
1010 bactéries de H. pleuropneumoniae par animal), et 3 porcs qui n'ont pas reçu de vaccination sont également provoqués et utilisés comme témoins. Les animaux témoins meurent et les animaux vaccinés survivent. Après abattage,

  
on examine les animaux pour établir si l'infection s'est traduite par des changements des poumons et/ou des changements pouvant affecter la valeur de l'animal abattu en vue de la livraison à la consommation humaine.

  
Les vaccins utilisés dans ce test de vaccination sont les suivants .

  
A. On cultive des cellules de H. pleuropneumoniae sur plaques d'agar et on les récolte avec une solution de

  
PBS (pour la composition cf. tableau V) contenant une solution à 0,01% en poids/volume de "Thiomersal". La suspen-

  
 <EMI ID=70.1> 

  
fugée et l'on ajoute 1 partie en volume d'adjuvant incomplet

  
de Freund à 3 parties en volume de la partie surnageante. 

  
Dosage 2 ml (2 fois). 

  
B. Comme le vaccin A, sauf que l'on fait bouillir

  
 <EMI ID=71.1> 

  
C. On cultive les cellules comme pour le vaccin A, on recueille avec une solution de PBS contenant une solution à 0,01% en poids/volume de "Thiomersal", on ajuste

  
à une densité de 20 I.O.U. et l'on ajoute alors 50% d'adjuvant incomplet de Freund. Dosage 5 ml (2 fois) contenant environ 10 9 cellules de H. pleuropneumoniae par ml.

  
D. On cultive des cellules de H. pleuropneumoniae dans une fiole jusqu'à ce que la densité atteigne 5 I.O.U., on les tue avec de la formaldéhyde et les précipite par l'addition d'Alhydrogel comme décrit à l'exemple 4. On dilue

  
le précipité avec de la solution de PBS jusqu'à une concen-

  
 <EMI ID=72.1> 

  
E. Vaccin de la présente invention de composition donnée à l'exemple 6 et préparé substantiellement comme décrit aux exemples 2, 4 et 5. Dosage 6 ml (2 fois).

  
Les résultats de la vaccination sont résumés au tableau ci-dessous.

TABLEAU IX

  

 <EMI ID=73.1> 


  
a) nombre d'animaux ayant des symptômes (changements, remarques)/nombre d'animaux testés. b) non déterminé. c) 1 animal mort, 2 sont tués alors qu'ils mouraient.

  
D'après le tableau IX, on voit que le vaccin E

  
 <EMI ID=74.1> 

  
de l'art antérieur dans l'apport d'une protection contre

  
les infections causées par les bactéries de H. pleuropneumoniae. Le vaccin E. est le seul pour lequel on n'observe pas de sympt8mes ou changements des poumons et/ou fait des remarques à l'abattage. Des changements dans les poumons,

  
à savoir des cicatrices dans le tissu du poumon à la suite d'une attaque de pleuropneumonie, sont observés chez 8 des
45 animaux vaccinés. A l'abattage on remarque une pleurésie chronique chez 4 des animaux. Néanmoins, tous les 45 animaux sont acceptables pour la consommation humaine.

Exemple 8

  
On exécute un autre test de vaccination sur 46 porcs et l'on utilise 2 animaux en guise de contrôle. Les animaux pèsent environ 25 kg. Les vaccinations et infections provoquées se font de la manière décrite à l'exemple 7. Les dosages utilisés pour la vaccination sont 2 fois 2 ml.

  
Le but principal de ce test est de comparer l'effet de l'adjuvant Bordetella pertussis de la présente inventio à celui de divers autres adjuvants, dont certains ont déjà été utilisés comme adjuvants dans l'art antérieur.

  
Les animaux témoins ont survécu jusqu'à l'abattage, mais 2 des animaux vaccinés sont morts avant abattage. Un porc du groupe L est tué; celui-ci montre clairement des signes de pleuropneumonie. Un porc du groupe E est mort

  
à la suite d'une bataille, autrement dit pour une raison qui n'a aucune liaison avec le test présent. L'examen des poumons n'a pas révélé de signes de pleuropneumonie. Les animaux abattus ont été examinés pour les buts indiqués à l'exemple 7.

  
Les compositions des vaccins d'essai sont données ci-dessous. On notera que le "vaccin L" n'est pas un vaccin dans le sens commun de ce terme; toutefois, les résultats obtenus démontrent que la pleuropneumonie n'est pas contrôlée avec succès par une administration pernasale et perorale de l'ingrédient actif dans le vaccin de la présente invention.

Les vaccins utilisés sont les suivants :

  
C,D,E : comme à l'exemple 7.

  
F. vaccin de la composition de l'exemple 6
(vaccin E), à l'exception d'une teneur en "Quil A" comme adjuvant au lieu du Vaccinum pertussis. Le "Quil A" est

  
un dérivé de saponine de composition connue, qui a été divulgué par K. Dalsgaard dans Acta Vet. Scand., Suppl. 69 (1978).

  
G. Comme F, à part une teneur en "Bortavac" comme adjuvant au lieu de "Quil A". Le "Bortavac" est un vaccin commercial de Bordetella bronchiseptica vendu par

  
le producteur, Kitasato, Tokyo, Japon.

  
H. Comme F, à part une teneur en "Levoripercol" comme adjuvant au lieu de "Quil A". Le "Levoripercol" est

  
du Levamisolum NFN anthelminticum vendu par la firme Lundbeck, Copenhagen, Danemark. Le Levamisolum est une dénomination non protégée, approuvée par le NFN (The Nordic Pharmacopoeia Council).

  
 <EMI ID=75.1> 

  
"Lymphocyte Proliferative Factor" (LPF) comme adjuvant

  
au lieu de Vaccinum pertussis. On extrait le LPF des bactéries Bordetella pertussis comme décrit par S.I. Morse et J.H.

  
 <EMI ID=76.1> 

  
K. Comme le vaccin E, à part une teneur de Vaccinum pertussis en une quantité de 180 I.O.U.

  
L. On cultive des cellules de H. pleuropneumoniae sur plaque d'agar, on les récolte et les transfère dans un aérosol, que l'on atomise dans le nez et la bouche des animaux.

  
Parmi les vaccins énumérés ci-dessus, les

  
 <EMI ID=77.1> 

  
Les résultats de la vaccination d'essai de cet exemple sont résumés au tableau X.

TABLEAU X

  

 <EMI ID=78.1> 


  
) nombre d'animaux ayant des symptômes (changements, re. marques)/nombre d'animaux d'essai. b) non déterminé. c) 1 animal meurt avant l'abattage.

  
Par le tableau X on voit que des symptômes cliniques n'apparaissent que chez les animaux traités par aérosol et chez les animaux témoins. Des 44 animaux restani 2 seulement montrent des changements dans les poumons et

  
 <EMI ID=79.1> 

  
que l'on puisse démontrer par des examens sérologiques que tous les animaux ont été attaqués par le H. pleuropneumoni:

Claims (34)

Le tableau X montre donc que la vaccination avec un vaccin de H. pleuropneumoniae comportant des bactéries de H. pleuropneumoniae tuées, préparé selon les instructions révélées aux exemples 2, 4 et 5 ci-dessus comme ingrédient actif, est très efficace pour la protection des porcs contre une attaque de pleuropneumonie. Quoique les divers adjuvants testés puissent paraître bien appropriés d'après le tableau X, l'adjuvant de vaccin B. pertussis (sa biomasse et/ou ses extraits) utilisé conformément à l'invention est supérieur; il est dès lors préféré parce qu'il conduit à une protection optimale et sans réaction au site de l'injection, ou alors à une réaction qui n'est que légère et de courte durée, alors que les adjuvants de l'art antérieur ont tendance à donner lieu à des granulomes au site de l'injection. On comprendra que la description qui précède ainsi que les exemples ne doivent être considérés que comme des formes de réalisation de l'invention et il sera évident, pour ceux versés dans l'art, que des modifications et variante peuvent être apportées ici sans s'écarter de l'esprit et de la portée de l'invention telle qu'elle est définie dans les revendications ci-jointes. En particulier, on comprendra que l'invention n'est pas restreinte à l'utilisation de la souche et/ou sous-culture de H. pleuropneumoniae mentionnée de manière spécifique. C'est pourquoi les cultures obtenues à partir de cette souche et/ou sous-culture par une sélection naturelle et/ou artificielle et/ou par mutation, ainsi que les cultures de l'un quelconque des divers sérotypes, sont aussi à la portée de la présente invention. REVENDICATIONS

1. Vaccin pour combattre la maladie infectieuse pleuropneumonie chez les porcs, maladie causée par le microorganisme Haemophilus pleuropneumoniae, qui comprend des cellules, parties de cellules, extraits et/ou produits métaboliques de H. pleuropneumoniae comme ingrédient actif et qui contient des adjuvants et un tampon, caractérisé par une teneur en un vaccin de Bordetella pertussis, en une biomasse de B. pertussis et/ou en ses extraits comme adjuvant.

2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé par une teneur en Vaccinum pertussis préparé, identifié et testé conformément à la Pharmacopée Européenne, Vol. III (1975), 409, en tant qu'adjuvant.

3. Vaccin selon l'une quelconque des revendication: 1 et 2, caractérisé par une teneur en Vaccinum pertussis

à 16 I.O.U. ( unités internationales d'opacité).

4. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par une teneur en cellules de H. pleuropneumoniae, en parties de ces cellules, en ses extraits et/ou produits métaboliques, suffisante pour produire une densité de 20 I.O.U.

5. Vaccin selon l'une quelconque des revendica- <EMI ID=80.1>

cellules de H. pleuropneumoniae par ml.

6. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il a la composition :

<EMI ID=81.1>

7. Procédé de fermentation aérobie du microorganisme Haemophilus pleuropneumoniae dans un milieu de fermentation liquide comprenant des sources assimilables de carbone et d'azote ainsi que des sels appropriés et autres ingrédients nutritifs conventionnellement utilisés dans

la fermentation des microorganismes,en particulier de l'espèce Haemophilus, caractérisé en ce qu'on fermente

dans un milieu comprenant du casamino acid, de l'extrait

<EMI ID=82.1>

dinucléotide (NAD) comme ingrédients essentiels.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on fermente dans un milieu liquide ayant la composition :

<EMI ID=83.1>

Eau traitée par échange d'ions pour compléter à 1000 ml.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 et 8, caractérisé en ce qu'on fermente avec agitation du milieu de fermentation au cours de la fermentation.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendi-

<EMI ID=84.1>

substantiellement constant du milieu de fermentation pendant la fermentation.

11. Procédé selon l'une quelconque des reven-dications 7 à 10, caractérisé en ce qu'on maintient un pH d'environ 6,0 à environ 7,9 dans le milieu de fermentation.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'on maintient un pH d'environ 6,9 à environ 7,5 dans le milieu de fermentation.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'on maintient un

pH d'environ 7,1 à environ 7,4 dans le milieu de fermentation.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce qu'on maintient un

pH d'environ 7,3 dans le milieu de fermentation.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 14, caractérisé en ce qu'on fermente dans un milieu ayant un pH initial substantiellement neutre.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on fermente dans un milieu ayant un pH initial

<EMI ID=85.1>

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 16, caractérisé en ce qu'on fermente dans un milieu ayant une concentration en oxygène d'environ 1 à environ 30 ppm au cours de la fermentation.

18. Procédé selon la revendication 17, caracté-

<EMI ID=86.1>

d'environ 8 à environ 20 ppm.

19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 et 18, caractérisé en ce qu'on fermente à une concentration en oxygène d'environ 8 à environ 12 ppm.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce qu'on fermente à une concentration en oxygène d'environ 10 à environ 12 ppm.

21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisé en ce qu'on maintient la concentration désirée en oxygène en faisant varier la vitesse d'agitation et/ou le débit d'écoulement d'air.

22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'on fermente à une vitesse d'agitation d'environ 200 à environ 600 tours/minute.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 et 22, caractérisé en ce qu'on fermente à une vitesse d'agitation d'environ 500 tours/minute.

24. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'on fermente dans des conditions aérobies maintenues en utilisant un débit d'écoulement d'air allant jusqu'environ 0,5 litre d'air par minute et par litre de milieu de fermentation.

25. Procédé selon la revendication 24, caractéri sé en ce qu'on fermente à un débit d'écoulement d'air d'en-

<EMI ID=87.1>

litre de milieu de fermentation.

26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 et 25, caractérisé en ce qu'on fermente à

un débit d'écoulement d'air d'environ 0,2 à environ 0,3 litre d'air par minute et par litre de milieu de fermentatic

27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 26, caractérisé en ce qu'on fermente à une

<EMI ID=88.1>

28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 27, caractérisé en ce qu'on fermente une sous-culture de la souche de H. pleuropneumoniae ATTC 27089 (NCTC 10976).

29. Procédé selon la revendication 28, caractér sé en ce,qu'on fermente la sous-culture 4226 (State Veterin, ry Sérum Laboratory, Copenhagen, Danemark) de la souche

H. pleuropneumoniae.

30. Substrat pour cultiver des microorganismes, convenant particulièrement pour cultiver le microorganisme Haemophilus pleuropneumoniae, comprenant des sources assimilables de carbone et d'azote ainsi que des sels appropriés et autres ingrédients nutritifs conventionnellement utilisés dans la culture des microorganismes, en particulier de l'espèce Haemophilus, caractérisé par une teneur en casamino acid, extrait de levure, glucose et bêta-nicotinamide-adéninedinucléotide (NAD) en tant qu'ingrédients essentiels.

31. Substrat selon la revendication 30, convenant particulièrement pour la fermentation aérobie du

H. pleuropneumoniae dans un milieu de fermentation liquide, caractérisé en ce qu'il a la composition:

<EMI ID=89.1>

32. Substrat selon l'une quelconque des revendications 30 à 31, caractérisé en ce qu'il a été ajusté

à un pH d'environ 7,2.

33. Substrat selon la revendication 30, convenant particulièrement pour la culture de H. pleuropneumoniae sur un substrat solide, comme par exemple sur des plaques d'agar, caractérisé en ce qu'il a la composition

<EMI ID=90.1>

34. Substrat selon la revendication 33, caractérisé en ce qu'il a été ajusté à un pH d'environ Messieurs,

<EMI ID=91.1>

Nous référant à la susdite demande, nos

<EMI ID=92.1>

quelques erreurs matérielles intervenues dans le mémo: descriptif:

- page 5, ligne 10, il faut lire: "Nielsen" - page 19, échantillon no 7, la concentration d'oxygè! (ppm) est de 7,2 <EMI ID=93.1> joint au dossier d'un brevet d'invention ne peut être nature à apporter soit à la description, soit aux des: des modifications de fond et déclare que le contenu dE note n'apporte pas de telles modifications et n'a d'at objet que de signaler ou une plusieurs erreurs matérie

Il reconnaît que le contenu de cette ne peut avoir pour effet de rendre valable totalement ou

<EMI ID=94.1>

<EMI ID=95.1> Il autorise l'Administration à joind note au dossier du brevet et à en délivrer photo,

<EMI ID=96.1>

distinguées.