Nouvelle glycérol kinase et sa production La présente invention concerne une nouvelle glycérol kinase et sa production.
La glycérol kinase est déjà connue comme étant une enzyme qui catalyse la réaction suivante :
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transférase,nom courant : glycérol kinase_7
La glycérol kinase déjà connue (on désigne ci-après la glycérol kinase par GK) est une enzyme
<EMI ID=3.1>
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<EMI ID=6.1>
Enzymology, Vol. 5, 476 (1962), Biochem. Z., 329, 320
(1957), J. Biol. Chem., 211, 951 (1954�7.
On a trouvé qu'une souche de Streptomyces A 2408 isolée à partir d'un échantillon de terre d'un champ de soja de Kakegawa-shi, Shizuoka-ken, Japon, produit une enzyme qui catalyse une réaction avec le
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rophosphate dans ses cellules et qui, après purificaticn,est électrophorétiquement homogène. Comme résultat, cette enzyme appartient au groupe GK, toutefois ses propriétés physico-chimiques et biochimiques sont inconnues jusqu'à présent et on l'a qualifiée de nouvelle enzyme GK.
Les propriétés taxonomiques de la souche de Streptomyces A 2408 sont les suivantes.
I. Propriétés morphologiques :
La couleur des hyphes aériens portant des spores mûres va d'un gris brunâtre à un brun grisâtre. Mycélium du substrat brun jaunâtre. Produit un pigment soluble brun jaunâtre.
Les observations sur la gélose à l'ami-don et aux substances inorganiques à 30[deg.]C pendant 10 jours sont illustrées comme suit. On observe les mêmes caractéristiques morphologiques sur de la gélose à la farine d'avoine et de la gélose glycérolée à l'asparagine.
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de diamètre, sont droits ou ondulés, se développant par ramification simple et forment de nombreuses chaînes de spores. Les chaînes de spores forment des spirales comportant 3 à 5 spires lâches, en forme de crochet, de boucle ou flexueuses.
Les spores sont de forme globuleuse ou cvalc,
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Les mycéliums de support sont ramifiés, se développant en hyphes ondulés ou flexueux de
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blement des hyphes et port de spores.
Pas de formation de spores flagellaires ni de sporanges.
II. Composition de l'acide diaminopimérique :
On a détecté de l'acide L-diaminopimérique.
III. Caractéristiques sur divers milieux :
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pendant 20 jours sont illustrées dans le Tableau 1.
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of American, E.U.A)7.
IV. Propriétés physiologiques :
1) Température de développement : 12-45[deg.]C
2) Liquéfaction de gélatine : positive
3) Hydrolyse de l'amidon : positive
4) Peptonisation du lait écrémé : positive; coagulation négative 5) Formation de pigment du genre mélanine :
négative
6) Utilisation de sources de carbone :
sont utilisés : L-arabinose, D-fructose, D-glucose, i-inositol, D-mannitol, raffinose, L-rhamnose, saccharose et D-xylose.
Comme illustré ci-dessus, la présente souche de micro-organisme A 2408 appartient aux Streptomyces d'après les caractéristiques du mycélium aérien ayant des chaînes de spores développées à partir du véritable mycélium du substrat sans division, le diamètre du mycélium, la grosseur des spores et le type L
de l'acide diaminopimélique. La souche A 2408 a les caractéristiques suivantes : La couleur du mycélium aérien est d'un gris brunâtre à un brun grisâtre. La chaîne de spores est constituée de spirales lâches
de 3 à 5 spires. La surface des spcrcc a des épines:
Le mycélium du substrat est d'un brun jaunâtre. Formation de pigment soluble brun jaunâtre. Large utilisation de sucre. Pas de formation de pigment du genre mélanine. Ces caractéristiques peuvent être détectées pour Streptomyces canus (Heinemann et autres
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La comparaison entre la présente souche A 2408 et Streptomyces canus ISP 5017 a montré la ressemblance en ce qui concerne les propriétés morphologiques, culturales et physiologiques.
En conséquence, la présente souche A 2408 est appelée Streptomyces canus A 2408. Cette souche a été déposée à l'Institut pour l'Industrie et la Technologie microbiennes au Japon comme collection permanente FERM-P N[deg.] 4977.
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tomyces canus A 2408 était une enzyme nouvelle ayant les propriétés physicochimiques et biologiques illustrées ci-après.
On peut utiliser GK comme réactif de recherche ou réactif de diagnostic pour le métabolisme
de triglycérides dans des liquides du corps comme le sérum.
Un but de la présente invention est de fournir une nouvelle GK et un procédé pour sa production.
Un micro-organisme utilisé dans la présente invention peut être mentionné, par exemple Streptomyces illustré ci-dessus, mais ce n'est pas limitatif et on peut utiliser le présent micro-organisme producteur de GK et ses souches mutantes.
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vant un micro-organisme producteur de GK tel qu'une souche productrice de GK appartenant au genre Streptomyces dans un milieu classique pour la production d'enzymes. La culture est habituellement une culture en milieu liquide et une culture immergée avec aération est avantageuse pour une production industrielle.
On peut utiliser un milieu nutritif classique pour micro-organismes. En ce qui concerne les
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une source de carbone assimilable, spécialement du glycérol. On peut aussi utiliser d'autres sources
de carbone comme du glucose, du saccharose, du lactose, de l'amidon, de la mélasse. En ce qui concerne les sources d'azote, on peut utiliser une source d'azote assimilable comme de la liqueur de macération de
mais, de la poudre de soja, de la poudre de graines
de coton, de la levure sèche, de l'hydrolysat de caséine, de l'extrait de levures, de l'extrait de <EMI ID=22.1> inorganique de magnésium, de calcium, de potassium, de fer, de manganèse ou de zinc.
La température de culture peut être choisie dans l'intervalle convenable pour le développement des micro-organismes et la production de GK et est
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on conduit la culture dépend des conditions et elle doit être arrêtée à la production maximale de GK, habituellement après 1 à 3 jours.
La présente enzyme peut être isolée à partir du mycélium. On centrifuge le bouillon de culture pour recueillir le mycélium qu'on soumet à une sonication, puis à une centrifugation pour recueillir la solution surnageante. On traite cette solution par relargage en utilisant par exemple du <EMI ID=24.1> fate de sodium pour séparer les impuretés. On soumet ensuite le liquide surnageant à un relargage et on effectue une centrifugation pour obtenir le précipité contenant GK. La GK précipitée est ensuite purifiée par relargage avec Sephadex G-25 (nom commercial, Pharmacia Co.), Biogel P-2 (nom commercial, Biorad Corp.), par dialyse à travers une membrane ou au moyen de fibres creuses et traitée par échange d'ions comme en utilisant de la DEAE-cellulose.
La fraction de GK ainsi obtenue est relarguée et concentrée au moyen d'une membrane d'ultrafiltration comme l'Amicon XM-50 (nom commercial, Amicon Co.). La fraction relarguée est soumise à une chromatographie d'absorption comme en utilisant une colonne de gel de phosphate de calcium pour séparation des impuretés et en effectuant ensuite une élution à gradient au moyen d'un tampon phosphate. La fraction contenant GK est relarguée et concentrée à l'aida d'une membrane d'ultrafiltration comme l'Amicon XM-50. On soumet le concentré à une chromatographie par filtration à travers un gel en utilisant par exemple Biogel
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puis la fraction de GK est lyophilisée.
La GK obtenue par la technique de purification ci-dessus a les propriétés physico-chimiques et biochimiques suivantes.
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glycérophosphate déshydrogénase
(Boehringer Co., 2 mg/cm<3>, 65 U/mg) 5 /il
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pré-incubation à 37[deg.]C pendant 5 minutes, on y ajoute une solution de GK (50 ul) %-diluée avec du tampon GL
(tampon phosphate 10 mM contenant du glycérol 10 mM,
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On arrête la réaction en ajoutant 0,1 N HC1 et on opè-
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Une unité de GK est définie par la libération de 1 mole de glycéro-3-phosphate par minute.
On calcule l'activité enzymatique comme suit :
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Action de l'enzyme : catalyse au moins la réaction suivante
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Masse moléculaire : 72000 + 7200
72000 : mesurée sur Sephadex G-100
65000 : mesurée sur SDS polyacrylamide
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Spécificité concernant le substrat :
(1) spécificité pour le glycérol, le phosphate de dihydroxy-acétone et le D-glycéraldéhyde :
(méthode d'essai)
Mélange réactionnel :
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en pré-incubation à 37[deg.]C pendant 3 minutes et on y ajoute la solution d'enzyme (dissoute dans du tampon
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cuber le mélange à 37[deg.]C pendant 10 minutes. On arrête la réaction par ébullition pendant 3 minutes. Après refroidissement à 37[deg.]C, on détermine la quantité d'ADP. On détermine ADP en ajoutant une solution de titrage d'ADP (2,0 cm<3>) comprenant le mélange suivant :
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On fait incuber le mélange réactionnel à
37[deg.]C pendant 15 minutes. La couleur formée est mesurée à 550 nm pour calcul de la spécificité envers le substrat.
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(2) activité spécifique pour les nucléotides .
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(Méthode d'essai)
Dans la méthode d'essai (1) ci-dessus, on remplace 10 mM ATP par CTP, ITP, GTP et UTP et on mesure le glycéro-3-phosphate formé. Comme illustré ci-après, tous les nucléotides essayés peuvent être
un substrat; on a observé une spécificité particulièrement élevée pour ATP et CTP.
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figure 1.
/-Sur la figure, [deg.]_[deg.] : tampon diméthylglutarate-NaOH (pH 6 - 7,5), *-.: tampon tris-HCl
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<EMI ID=45.1> la figure 2.
On utilise un tampon diméthylglutarate (pH
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tenant chacun 10 mM glycérol. L'incubation est effectuée à 37[deg.]C pendant 60 minutes.
Effet d'ions de métaux et du p-chloromercuribenzoate
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La GK de la présente invention est acti-
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de la présente GK est complètement inhibée par 7,5 x
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représenté sur la figure 3.
Titrage : tampon 10 mM phosphate (pH 7,8) <EMI ID=52.1>
Comme illustré ci-dessus, l'enzyme selon la présente invention appartient à un groupe d'enzy-
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+ L-alpha-glycérate.
La comparaison de glycérol.kinases connues,
la GK de Candida mycoderma (appelée ci-après C.My.-GK),
la GK d'Escherichia coli (appelée ci-après Pig.-GK ouE.co-GK) avec la GK selon la présente invention est la suivante.
La masse moléculaire de E.co-GK est de
300 000 et celle de C.My.-GK est de 250 000 (tétramère'
de la masse moléculaire de 60 000), tandis que la GK
selon la présente invention est un monomère d'une masse moléculaire de 70 000 environ. La stabilité au pH
est : pH 6,5 - 7 pour E.co-GK, pH 4,5 -5,5 pour Pig.-GK
et pH 6,7 pour C.My.-GK, au lieu de pH 5,5 - 10 pour
la présente GK. Comme la réaction exigeant ATP exige
un ion de métal divalent, la GK ci-dessus exige aussi
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présente GK.
De plus, les spécificités concernant les
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présente une activité presque deux fois plus forte pour le phosphate de dihydroxy-acétone que pour le glycérol, tandis que la présente GK fait montre d'une plus haute spécificité pour le glycérol que
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agit seulement pour ATP, et la présente GK agit pour ATP et CTP et aussi pour ITP, GTP et UTP. Comme résultât, la masse moléculaire, la stabilité au pH, l'exigence en ion de métal divalent et la spécificité envers le substrat prouvent que la présente glycérol kinase est une nouvelle GK.
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Par exemple, on peut utiliser la présente GK pour titrage des triglycérides et du glycérol en faisant réagir les triglycérides et de la lipoprotéinelipase, en faisant incuber le mélange de réaction
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phosphate que l'on fait incuber ensuite avec de la glycéro-3-phosphate oxydase, puis on mesure l'oxygène consommé ou l'eau oxygénée libérée.
L'exemple suivant illustre la présente invention, mais ne doit pas être considéré comme la limitant.
Exemple
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est stérilisé à 120[deg.]C pendant 20 minutes. On y inocu-
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inoculé dans un fermenteur cylindrique de 30 litres contenant le même milieu (20 litres) et on conduit
la culture dans des conditions aérobies à 26[deg.]C pendant
40 heures, 300 tpm, aération 20 litres par minute. Deux litres du bouillon obtenu sont centrifugés
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du mycélium. On met le mycélium en suspension dans du tampon GL (800 cm<3>) et on le soumet à une sonica-
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à ultrasons (KUBOTA INSONATOR 200M, nom commercial).
On centrifuge la.solution à 4[deg.]C pendant
10 minutes à 15 000 tpm pour obtenir un liquide sur-
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<EMI ID=68.1>
puretés par centrifugation à 4[deg.]C, 5000 tpm pendant <EMI ID=69.1>
10 minutes pour recueillir le précipité. On ajoute une quantité supplémentaire de solution saturée de sulfate d'ammonium (pH 7,5, 37,2 cm<3>) à la solution du précipité dans 62 cm<3> de tampon GL pour précipiter les impuretés. Le liquide surnageant (82 cm<3>) est obtenu par centrifugation à 4[deg.]C, 15 000 tpm pendant
10 minutes, puis on ajoute une solution saturée de sulfate d'ammonium (pH 7,5, 20,5 cm<3>). Une centrifugation supplémentaire à 4[deg.]C, 15 000 tpm pendant 10 minutes donne un.précipité.
On dissout le précipité dans du tampon GL
(11,0 cm ) et on charge la solution sur une colonne
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puis on élue avec le même tampon à 25[deg.]C, débit
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absorption à 280 nm (environ 21 cm<3>). On charge ces fractions sur une colonne de DEAE-cellulose (2,2 x 17 cm) remplie de tampon GL, on lave avec du tampon GL
<EMI ID=72.1>
suite on élue les impuretés avec du tampon GL conte-
<EMI ID=73.1>
tion) . On recueille les fractions actives N[deg.] 63 à 79 par élution à gradient linéaire avec un tampon GL
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fraction 5,8 cm<3>). Un éluat actif combiné (98.cm<3>) est relargué et concentré sur Amicon XM-50 à 4[deg.]C pendant 4 heures pour donner la solution concentrée
(10 cm<3>). On charge le concentré sur une colonne
de gel de'phosphate de calcium (2,0 x 17,2 cm) remplie de tampon GL, on lave avec du tampon GL (100 cm<3>) et on élue par un gradient linéaire de 200 cm de tam- <EMI ID=76.1>
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On recueille les fractions actives N[deg.] 48 à 58 et la solution combinée est concentrée par Amicon X-50 pour donner un concentré (2 cm<3>). On charge ce concentré sur une colonne de Biogel P-200 (3 x 60 cm) remplie de tampon GL, on élue avec le même tampon (débit
25 cm<3>/h, 6 cm<3> par fraction) et on recueille les fractions actives N[deg.] 17 à 20, qui sont combinées et lyophilisées pour donner la GK purifiée (activité spécifique 57,6 U/mg, 16,9 mg de protéine).
Explication simple des dessins :
Figure 1 : Courbe de pH optimal de la présente GK. Figure 2 : Courbe de stabilité au pH de la présente GK. Figure 3 : Courbe de stabilité à la <EMI ID=78.1>
REVENDICATIONS
1) Nouvelle glycérol kinase ayant les propriétés suivantes :
(1) action enzymatique : catalyse au moins la réaction suivante :
<EMI ID=79.1>
2) Procédé pour la production de glycérol kinase caractérisé en ce qu'on cultive un micro-organisme producteur de glycérol kinase dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote et un sel inorganique, de manière à isoler la glycérol kinase ainsi produite.