"Nouvel extrait de plante, procédé de préparation, agent immunostimulant comprenant cet extrait comme composant
efficace et immunothérapie par son utilisation" La présente invention concerne un extrait obtenu à partir d'herbes de plantes appartenant au genre Epimedium sp. de la famille des Berbéridacées, un procédé de préparation de cet extrait, un agent immunostimulant comprenant cet extrait comme composant efficace et une immunothérapie par l'utilisation de cet extrait.
Parmi les plantes appartenant au genre Epimedium sp., on connaît Epimedium macranthum, M. et. D, var. violaceum, Fr., Epimedium sagittatum, Bak., Epimedium macranthum, M. et. D., Epimedium koreanum, Nak., etc. Ces plantes sont des herbes vivaces croissant naturellement au Japon, en Chine, en Corée, etc. Les tiges, les feuilles et les racines sont appelées "Inyokaku" dans le domaine des médicaments chinois. On infuse les herbes de ces plantes et on les utilise comme médicaments cordiaux ou toniques. Les effets exercés ne sont pas sensiblement différents parmi les espèces de plantes appartenant au genre Epimedium sp. Une seule espèce ou un mélange de deux espèces ou plus est commercialisé comme médicament brut appelé "Epimède". Les composants de cette Epimède ont été étudiés depuis longtemps et des rapports ont été publiés, par exemple,
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les détails donnés dans ces publications restent encore imprécis sur de nombreux points.
La Demanderesse a entrepris des recherches sur cette Epimède et elle a trouvé qu'une excellente activité immunostimulante était exercée par un extrait obtenu en extrayant des plantes appartenant au genre Epimedium sp., avec de l'eau ou avec un solvant mixte constitué d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau, pour recueillir ensuite, de l'extrait aqueux obtenu, une fraction contenant des composés de poids moléculaire élevé. Sur la base de cette découverte, la Demanderesse a abouti à la présente invention.
La présente invention sera décrite ci-après en détail.
On extrait une plante appartenant au genre Epimedium sp. avec de l'eau ou avec un solvant mixte constitué d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau, puis on concentre l'extrait obtenu sous pression réduite. Comme solvants organiques miscibles à l'eau, on peut utiliser, par exemple, des alcools inférieurs tels que le méthanol, l'éthanol et l'isopropanol,
des cétones telles que l'acétone et des éthers miscibles à l'eau tels que le dioxanne et analogues. On peut également utiliser un mélange de deux de ces solvants miscibles à l'eau ou plus.
En outre, comme solvants d'extraction, on peut utiliser des acides aliphatiques inférieurs tels que l'acide acétique, ayant
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miscibles à l'eau telles que l'éthanolamine en une concentration inférieure à 1 mole/1, de même que des hydroxydes alcalins aisément solubles dans l'eau tels que l'hydroxyde de sodium,
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En ce qui concerne le rapport de mélange entre l'eau et le solvant organique, il est préférable que la quantité
de ce dernier soit inférieure à 50% en volume. Compte tenu de la concentration, il est préférable que l'opération entreprise pour obtenir l'extrait aqueux envisagé soit effectuée en utilisant un solvant mixte constitué d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau.
Suivant la présente invention, on peut utiliser une herbe d'Epimède disponible dans le commerce telle quelle, mais il est préférable de l'utiliser après l'avoir finement divisée.
On décrira ci-après une forme de réalisation de l'opération d'extraction.
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tion précité à la température ambiante pendant une période de quelques heures à plusieurs dizaines d'heures, puis on effectue la filtration pour obtenir un filtrat. On soumet le résidu
à une extraction et une filtration de la même manière et l'on répète ces opérations. On combine tous les filtrats obtenus et on les concentre sous pression réduite pour obtenir un extrait aqueux. On effectue habituellement 1 'extraction à la température ambiante, mais on peut également l'effectuer avec chauffage afin de raccourcir le temps d'extraction. De préférence, cette extraction avec chauffage est effectuée au bainmarie à une température de 35 à 55[deg.]C pendant une période de
4 à 6 heures en utilisant un réfrigérant à reflux. On peut également l'effectuer selon la méthode de percolation. La quantité du solvant utilisé est égale à 5-15 fois (volume/poids celle de la plante appartenant au genre Epimedium sp. De préférence, on soumet trois fois ou plus le résidu d'extraction
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solvant en une quantité égale à 0,4-0,6 fois (volume/volume) celle du solvant utilisé en premier lieu. On peut effectuer la séparation par filtration sur papier, par centrifugation ou par des moyens analogues, mais on obtient de meilleurs résultats lorsqu'on effectue une filtration à la trompe en utilisant des adjuvants de filtration disponibles dans le commerce tels que, par exemple, "Radiolite" (vendu par "Showa Chemical Industry Co., Ltd.", Japon), "Celite" (vendu par "Wako Junyaku Industry Co., Ltd. Japon) ou "Fibra Cel" (vendu par "Johns Manville Co., Ltd.", E.U.A.), etc. On effectue la
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en utilisant un aspirateur, une pompe à vide ou des éléments analogues. On utilise un récipient d'extraction dont la surface intérieure est revêtue de verre ou recouverte d'émail, ou encore un récipient d'extraction réalisé en acier inoxydable.
Ensuite, on élimine la graisse de l'extrait aqueux ainsi obtenu. On effectue habituellement cette opération de dégraissage en ajoutant un ou plusieurs solvants organiques choisis parmi les esters aliphatiques inférieurs tels que l'acétate d'éthyle, les hydrocarbures halogénés tels que le
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diéthylique et les hydrocarbures aliphatiques tels que le n-hexane,, et analogues, tout en agitant suffisamment le mélange et en recueillant la couche aqueuse uniquement. On soumet à nouveau la couche aqueuse obtenue à la même opération et on la chauffe au bain-marie pour éliminer le solvant organique subsistant en une faible quantité, après quoi on le filtre pour obtenir un extrait aqueux dégraissé. Pour chaque opération,
il est préférable d'utiliser le solvant en une quantité égale
à 0,5-1,5 fois (volume/volume) celle de l'extrait aqueux et il est également préférable de répéter trois à cinq fois l'opération. On peut adopter un procédé dans lequel on effectue tout d'abord l'opération de dégraissage, pour procéder ensuite à l'opération d'extraction avec de l'eau ou avec un solvant mixte constitué d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau.
Ensuite, de l'extrait aqueux dégraissé, on recueille une fraction contenant des composés de poids moléculaire élevé par précipitation fractionnée, par dialyse ou par d'autres méthodes classiques. Ces méthodes connues peuvent être utilisée en combinaison pour recueillir cette fraction contenant des composés de poids moléculaire élevé. On concentre la fraction recueillie sous pression réduite pour obtenir l'extrait recherché.
Cette opération sera à présent décrite en détail en
se référant aux deux formes de réalisation spécifiques ci-après.
(1) On ajoute un solvant organique miscible à l'eau à l'extrait
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précipitation. La quantité du solvant utilisé n'est pas inférieure à celle de l'extrait aqueux (volume/volume). On récupère le précipité déposé par filtration et on le lave avec un solvant organique miscible à l'eau en une quantité égale à 5-20 fois
(volume/poids) celle du précipité. On verse le précipité lavé dans de l'eau en une quantité égale à 20-50 fois (volume/poids) celle du précipité. On ajoute ensuite un solvant organique miscible à l'eau à la solution en une quantité égale à 3 fois ou plus (volume/volume) celle de la solution pour effectuer
à nouveau la précipitation. On récupère le précipité formé par filtration et on le sèche sous pression réduite pour obtenir l'extrait recherché. Comme solvants organiques miscibles à l'eau, on peut utiliser, par exemple, des alcools inférieurs tels que le méthanol et l'éthanol, de même que des cétones telles que l'acétone et analogues. On peut également employer un mélange de deux de ces solvants organiques ou plus. On
peut purifier l'extrait ainsi obtenu par extraction avec de l'eau. Plus spécifiquement, on mélange l'extrait avec de l'eau en une quantité égale à 20 fois ou plus (volume/poids) celle de l'extrait à la température ambiante, on agite suffisamment le mélange, puis on le filtre. On concentre le filtrat sous pression réduite jusqu'à siccité pour obtenir un extrait purifié.
Lors de cette opération, on sépare le précipité du filtrat par filtration sur papier ou par centrifugation.
(2) On charge l'extrait aqueux dégraissé dans une membrane semi-perméable telle qu'un tube de cellulose pour dialyse et l'on effectue une dialyse en utilisant de l'eau distillée ou
de l'eau de distribution urbaine comme liquide externe, tandis que l'on recueille le liquide interne (c'est-à-dire la portion renfermant la fraction contenant des composés de poids moléculaire élevé). On obtient de meilleurs résultats lorsqu'on agite le liquide externe au moyen d'un agitateur ou lorsqu'on le maintient en circulation. Il est préférable d'effectuer
la dialyse pendant environ une semaine si l'opération est effectuée en maintenant le liquide externe en circulation.
Au lieu de cette méthode de dialyse, on peut également adopter les procédés de filtration sur gel, d'ultrafiltration� d'ultracentrifugation et d'osmose inverse . On peut adopter deux de ces méthodes ou plus en combinaison. Du point de vue industriel, il est préférable d'effectuer l'opération de dialyse en utilisant un appareil de dialyse comportant une membrane à fibres creuses, par exemple, les appareils "PVA Hollow Fiber Dialyzer"
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(vendu par "Kuraray Co., Ltd.", Japon) ou "Nitto Module" (vendu par "Nitto Denko Co., Ltd.", Japon) ou analogues.
On peut procéder à une opération de relargage en guise de traitement préliminaire avant d'effectuer l'opération de dialyse. Plus spécifiquement, on ajoute un sel hydrosoluble connu à l'extrait aqueux dégraissé jusqu'à une concentration de saturation, puis on récupère le précipité déposé et on le dissout dans l'eau, après quoi on effectue l'opération de dialyse. Comme sels pour l'opération de relargage, on peut utiliser, par exemple, des chlorures tels que le chlorure de sodium, le chlorure de calcium et le chlorure d'aluminium, des nitrates tels que le nitrate de potassium, le nitrate de calcium et le nitrate d'aluminium, de même que des sulfates tels que le sulfate d'ammonium et le sulfate de magnésium, et analogues.
Le liquide interne ainsi obtenu (c'est-à-dire la portion renfermant la fraction contenant des composés de poids moléculaire élevé) est concentré à environ 1/10. Au liquide concentré, on ajoute un solvant organique miscible à l'eau en une quantité égale à 3 fois ou plus (volume/volume) celle du liquide concentré. On récupère le précipité déposé par filtration et on le sèche sous pression réduite pour obtenir l'extrait recherché. Dans le cas de la forme de réalisation
(1) ci-dessus, on peut purifier l'extrait ainsi obtenu par extraction avec de l'eau.
L'extrait ainsi obtenu suivant la présente invention possède les caractéristiques suivantes :
(1) Propriétés :
(a) poudre brune <EMI ID=10.1>
100 mg de l'extrait dans 50 ml d'eau).
(2 ) Solubilité :
(a) soluble dans l'eau
(b) insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique, l'hexane et le chloroforme.
(3) Réactions chromogènes :
Positif à : (a) la réaction à l'anthrone/acide sulfurique, <EMI ID=11.1> la réaction au scatole, mais négatif à : (a) la réaction à la ninhydrine, (b) la réaction au 2,4-dinitrophénol, (c) la réaction de Seliwanoff et (d) la réaction au naphtorésorcinol.
(4) Composition en saccharides :
Lorsqu'on hydrolyse 20 mg de l'extrait en ajoutant
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que lorsqu'on chauffe pendant 2 heures à 100[deg.]C et lorsqu'on neutralise ensuite par addition d'hydroxyde de baryum à la solution qui est alors soumise à une analyse par chromatographie sur papier, on détecte la présence d'arabinose et de galactose.
(5) Absorption des rayons infrarouges :
La figure 1 annexée donne le spectre d'absorption des rayons infrarouges.
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(6) Absorption des rayons ultraviolets :
La figure 2 annexée donne le spectre d'absorption des rayons ultraviolets.
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Afin de confirmer l'utilité de l'extrait de la présente invention, on procède aux essais décrits ci-après.
(1) Essai de fonction phagocytaire des macrophages :
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Comme animaux d'essai, on utilise des souris femelles
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Deux jours après le début du traitement avec l'échantillon,
on lave la cavité péritonéale des souris du groupe traité avec l'échantillon, ainsi que des souris du groupe témoin (traitées avec une solution desérum physiologique tamponnée au phosphate et ayant un pH de 7) avec le milieu "RPMI-1640"
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199, pages 519-524 (1967)] (vendu par "Nissui Seiyaku Co., Ltd.", Japon) pour recueillir des cellules d'échappement péritonéal, puis on groupe respectivement les cellules recueillies On lave une fois les cellules d'échappement péritonéal avec le milieu "RPMI-1640", puis on les met en suspension dans le milieu "RFMI-1640 à 10% de FBS" (milieu de culture formé en
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0,1 ml d'une suspension de Staphylococcus aureus 209P ayant une concentration de 4 x 108 cellules par ml et l'on poursuit encore la culture pendant 20 minutes afin d'effectuer la phagocytose.
Après la culture, on lave trois fois le liquide de
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Ltd.", Japon). On fixe les macrophages adhérant sur les feuilles de recouvrement en verre au moyen de méthanol et on les soumet à une coloration de Giemsa afin d'obtenir des échantillons permettant de compter le nombre de bactéries phagocytées ; à chaque observation microscopique des .feuilles de recouvrement en verre avec un objectif immergé dans l'huile (agrandisse-
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pour déterminer le taux de phagocytose et le nombre moyen de bactéries phagocytées (nombre I de bactéries phagocytées). De plus, on compte le nombre de bactéries phagocytées par 100 macrophages de phagocytose afin de déterminer le nombre moyen <EMI ID=21.1>
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tandis que l'on effectue la culture pendant 60 minutes après addition de la suspension de bactéries. On effectue le calcul
<EMI ID=24.1>
Les résultats obtenus sont repris dans le tableau 1.
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Au cours d'une période de 5 jours, on traite quotidiennement des souris mâles de 7 semaines de la famille "ICR/JCL" (pesant 30 + 2 g) par injection intrapéritonéale de l'échantillon.
Afin d'examiner les influences exercées sur la phagocytose dans le système réticulo-endothélial, on injecte du
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dans les veines caudales des souris respectives du groupe traité et du groupe témoin 24 heures après le dernier traitement, puis on examine l'élimination hors du sang conformément aux procédés
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colloïdal avec une solution saline physiologique contenant 3% de gélatine de façon à réduire la concentration en carbone à 1/2, puis on injecte la dilution dans la veine caudale à raison de 10 ml/kg. Ensuite, on recueille 0,010 ml de sang au moyen d'une micropipette traitée à l'héparine par ponction dans la cavité oculaire et l'on transfère ensuite immédiatement ce sang
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l'absorption à 650 nm au moyen de l'appareil à faisceau double de "Hitachi", modèle 124 (vendu par "Hitachi Co., Ltd.", Japon).
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tillons de sang conformément aux formules suivantes :
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Les résultats obtenus sont repris dans le tableau 2.
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Dans chacun des essais 1 à 4, l'indice de phagocytose augmente à la suite du traitement avec l'extrait de la présente invention, tandis que la demi-période dans le sang est raccourcie. Dès lors, il se confirme que l'activité de fixation du carbone colloïdal dans le système réticulo-endothélial est améliorée suite au traitement avec l'extrait de la présente invention.
On divise les macrophages en type libre et en type fixe ; les cellules de type libre sont présentes dans la moelle osseuse, le sang, la cavité péritonéale et les alvéoles, tandis que les cellules de type fixe sont principalement présentes
dans la rate, le ganglion lymphatique et le foie. L'essai
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essais pratiqués sur les cellules de type libre, tandis que l'essai de la fonction réticulo-endothéliale (5) est un essai pratiqué sur les cellules de type fixe. D'après les résultats d'essai donnés ci-dessus, il se confirme que le nombre de bactéries et de matières étrangères devant être phagocytées
à la fois par les macrophages de type libre et par les macro-
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de la présente invention.
(2) Essai de cytotoxicité : <EMI ID=39.1>
femelles de 7 à 10 semaines de la famille "BALB/c" pesant
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souche étant cultivée en générations dans une éprouvette) par injection intrapéritonéale à raison de 1 x 10' cellules par
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<EMI ID=44.1>
munisation, on lave la cavité péritonéale de chaque souris des deux groupes ci-dessus et du groupe normal avec le milieu "RPMI-1640", pour recueillir les cellules d'échappement péritonéal. On groupe respectivement les cellules recueillies et on lave deux fois les cellules d'échappement péritonéal avec le milieu "RPMI-1640", on les lave une fois par centrifugation
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pension dans ce dernier milieu. Pour chaque groupe, on règle la concentration en cellules d'échappement péritonéal à
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au moyen de bleu Trypan.
(b) On met des cellules "BC-47" cultivées dans une <EMI ID=47.1>
pour former une suspension de cellules vivantes en une concentration de 8 x 104 cellules vivantes par ml.
(c) Dans une microcuvette de type à fond horizontal destinée à la culture de cellules [modèle N-1480 à 96 trous <EMI ID=48.1>
0,1 ml/trou de la suspension de cellules d'échappement péritonéal (3,2 x 104 cellules) et 0,1 ml/trou de la suspension de cellules "BC-47" cultivées en éprouvette (8 x 10<3> cellules)
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pendant 24 heures.
(d) Au terme de la culture, on lave chaque trou avec une solution saline tamponnée au phosphate et, au moyen d'un <EMI ID=50.1>
par "Dyaaetech Co., Ltd.", Grande-Bretagne), on recueille, sur un papier-filtre, les cellules "BC-47" adhérant et croissant <EMI ID=51.1>
les cellules "BC-47" de chaque trou (nombre d'atones de 14C détruits par minute) au moyen d'un scintillateur à liquide
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On calcule le taux d'inhibition de propagation conformément à la formule suivante :
<EMI ID=53.1>
où A indique la quantité (M) (nombre d'atomes de 14C détruits par minute/trou) de 14C fixé dans les cellules nBC-47" culti-
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dans les cellules "BC-47" cultivées ensemble avec les cellules d'échappement péritonéal de la souris normale, de la souris immunisée ou de la souris immunisée et traitée avec l'échantillon.
On calcule l'indice d'activation conformément à la formule suivante :
<EMI ID=55.1>
où C désigne le taux d'inhibition de propagation (M) de la souris immunisée et traitée avec l'échantillon, tandis que D indique le taux d'inhibition de propagation (M) de la souris immunisée (non traitée avec l'échantillon).
Les résultats obtenus sont repris dans le tableau 3. ci-après.
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inhiber la propagation de cellules "BC-47" chez les souris et l'on peut accentuer l'immunité cellulaire vis-à-vis des cellules "BC-47".
(3) Essai de toxicité aiguë :
On effectue l'essai de toxicité aiguë suivant le pro-
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préparé dans les exemples 12 à 36 ci-après est de 1.990 à 2.050
(par injection intrapéritonéale).
D'après les résultats des essais ci-dessus., on comprend aisément que l'extrait de la présente invention est efficacement utilisé pour empêcher et inhiber les maladies infectieuses chez des patients ayant une immuno-activité réduite, par exemple, chez des patients âgés ou chez des patients souffrant de cancers; tout en l'administrant en combinaison avec des agents carcinostatiques, ou encore pour guérir des maladies infectieuses provoquées par des bactéries, tout en l'administrant en combinaison avec des agents chimiothérapeutiques ; l'extrait de la présente invention peut également être administré à des patients dont la fonction hépatique est réduite, afin d'éliminer des substances étrangères (par exemple, des médicaments) en vue de rehausser la fonction hépatique réduite.
Les extraits de la présente invention peuvent être administrés au corps humain par voie orale, par injection (par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire) ou de n'importe quelle autre manière.
Lorsque les extraits de la présente invention sont utilisés sous forme de préparations solides pour une administration par voie orale, les préparations peuvent être des comprimés, des granules, des poudres, des capsules ou analogues. Les préparations peuvent contenir des additifs, par exemple, un excipient tel qu'une préparation à base de saccharide ou de cellulose, un agent liant tel que la pâte d'amidon ou la méthyl-cellulose, une charge, un agent désintégrant, etc., tous ces additifs étant habituellement utilisés dans la fabrication de préparations médicamenteuses.
Lorsque les extraits de la présente invention sont utilisés sous forme de préparations liquides pour administration par voie orale, ils peuvent être sous l'une ou l'autre des formes choisies parmi les préparations aqueuses pour usage interne, les suspensions, les émulsions, les sirops., etc. et, en outre, ils peuvent se présenter sous forme de produits séchés que l'on dissout avant 1: utilisation.
Lorsque les extraits de la présente invention sont administrés par voie orale à des adultes, on peut les utiliser en une dose de 3 à 20 mg/kg/jour. Bien entendu, à cet égard, on peut augmenter ou réduire la dose d'une manière appropriée suivant l'état de la maladie, l'âge du patient, la forme de préparation administrée, etc.
Les extraits de la présente invention peuvent être injectés sous forme de solutions aqueuses, de suspensions,
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tant en suspension dans des milieux liquides aqueux tels que l'eau stérile des solutions salines physiologiques. Au besoin, à ces injections, on peut ajouter des agents dissolvants, des stabilisants, des agents de conservation, des additifs pour préparation de solutions isotoniques, etc., que l'on emploie habituellement.
Les préparations ainsi obtenues pour injection sont administrées par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, par voie sous-cutanée ou de n'importe quelle autre manière appropriée. Lorsque les injections sont administrées à des
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5 mg d'extrait/kg/jour. Bien entendu, on peut augmenter ou réduire cette dose d'une manière appropriée suivant l'état de la maladie, l'âge du patient, la forme de préparation administrée et le mode d'administration.
La présente invention sera décrite ci-après en détail en se référant aux exemples suivants qui n'en limitent nullement le cadre.
Exemple 1
On ajoute 40 litres d'éthanol à 50% (volume/volume)
à 5 kg d'Epimède finement divisée et disponible dans le commerce
(Epimedium Koreanum, Nak en provenance de Corée) et on effectue une
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en utilisant un réfrigérant à reflux. Après extraction, on filtre le mélange alors qu'il est encore chaud et l'on soumet encore trois fois le résidu à une extraction de la même manière que celle décrite ci-dessus en utilisant chaque fois 20 litres d'éthanol frais à 50% (volume/volume). On combine tous les filtrats récupérés, puis on les concentre à 45 [deg.]C sous pression réduite pour obtenir 30 litres d'un extrait aqueux. On charge cet extrait dans un entonnoir à décantation et on y ajoute
20 litres d'acétate d'éthyle, puis on agite suffisamment le
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soumet encore trois fois cette couche aqueuse à une extraction de la même manière que celle décrite ci-dessus en utilisant chaque fois 20 litres d'acétate d'éthyle frais. On concentre la couche aqueuse sous pression réduite et on élimine l'acétate d'éthyle résiduel par distillation, puis on filtre le résidu pour obtenir 22,5 litres d'un extrait aqueux dégraissé.
Exemple 2
On ajoute 20 litres d'eau à 2 kg d'Epimède finement divisée et disponible dans le commerce (Epimedium Koreanum�
Nak en provenance de Corée) et on effectue une extraction avec chauffage à 50[deg.] C pendant 6 heures au bain-marie en utilisant
un réfrigérant à reflux. Après extraction� on filtre le mélange alors qu'il est encore chaud et l'on soumet encore trois fois le résidu à une extraction de la même manière que celle décrite ci-dessus en utilisant chaque fois 10 litres d'eau. On combine
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réduite pour obtenir 12 litres d'un extrait aqueux.
Ensuite, à partir de l'extrait aqueux ainsi formé, on obtient 9 litres d'un extrait aqueux dégraissé de la même manière que celle décrite à l'exemple 1.
Exemple 3
On ajoute 20 litres d'éthanol à 50% (volume/volume)
à 2 kg d'Epimède finement divisée et disponible dans le commerce
(Epimedium.. M. ET. DN VAR VIOLACEUM, FR. en provenance du Japon)
et on laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant une nuit. Ensuite, on filtre le mélange et on soumet encore trois fois le résidu à une extraction de la même manière que celle décrite ci-dessus en utilisant chaque fois 10 litres d'éthanol frais à 50% (volume/volume). On combine tous les
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pour obtenir 12 litres d'un extrait aqueux.
Ensuite, à partir de l'extrait aqueux ainsi formé, on obtient 9 litres d'un extrait aqueux dégraissé de la même manière qu'à l'exemple 1.
Exemple 4
On ajoute 20 litres d'eau à 2 kg d'Epimède finement divisée et disponible dans le commerce (Epimedium, M. ET DN
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le mélange à la température ambiante pendant une nuit, puis on le filtre et on extrait encore trois fois le résidu de la même manière que celle décrite ci-dessus en utilisant chaque fois 10 litres d'eau fraîche. On combine tous les filtrats.,
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12 litres d'extrait aqueux.
Ensuite, à partir de l'extrait aqueux ainsi formé, on obtient 9 litres d'un extrait aqueux dégraissé de la même
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Exemple 5
On ajoute 16 litres d'acétate d'éthyle à 2 kg d'Epimède finement divisée et disponible dans le commerce (Epimedium
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utilisant un réfrigérant à reflux. Après extraction, on filtre le mélange alors qu'il est encore chaud et on soumet encore
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celle décrite ci-dessus en utilisant chaque fois 16 litres d'acétate d'éthyle frais. On sèche à l'air le résidu subsistant après élimination de la fraction soluble dans l'acétate d'éthyle
<EMI ID=72.1>
pendant 6 heures au bain-marie en utilisant un réfrigérant à reflux. Ensuite, on extrait encore le résidu et on le filtre deux fois de la même manière que celle décrite ci-dessus en utilisant chaque fois 16 litres d'eau fraîche. On combine les
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les filtre pour obtenir 9 litres d'un extrait aqueux.
Exemples 6 à 11
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on traite 2 kg d'Epimède finement divisée et disponible dans le commerce (Epimedium Koreanum, Nak.,en provenance de Corée),avec cette exception que l'on modifie le solvant d'extraction et le solvant de dégraissage comme indiqué ci-dessous. Les résultats obtenus sont indiqués ci-après
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Exemple 12
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mélange et on le laisse reposer pendant une nuit en récupérant le précipité déposé par filtration. On lave le précipité avec
100 ml d'éthanol et on le dissout dans 400 ml d'eau, puis on ajoute 1,6 litre d'éthanol à la solution et, par filtration,
on récupère le précipité déposé. On sèche le précipité récupéré sous pression réduite pour obtenir 10 g de l'extrait recherché. Ensuite, on soumet cet extrait à une extraction avec 500 ml d'eau et on le filtre, puis on concentre le filtrat et on le sèche sous pression réduite pour obtenir 8 g d'un extrait purifié sous forme d'une poudre brune
Exemples 13 à 22
On obtient les extraits et les extraits purifiés de la présente invention à partir de 4,5 litres de chacun des extraits aqueux dégraissés obtenus dans les exemples 2 à 11 de la même manière que celle décrite à l'exemple 12. Les résultats obtenus sont indiqués ci-dessous.
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Exemple 23
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obtenu à l'exemple 1 de la même manière que celle décrite à l'exemple 12, avec cette exception qu'au lieu d'éthanol, on utilise du méthanol comme solvant de précipitation ; on
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trait purifié.
Exemple 24
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obtenu à l'exemple 1 de la même manière que celle décrite à l'exemple 12, avec cette exception qu:au lieu d'éthanol, on utilise de l'acétone comme solvant de précipitation et l'on obtient ainsi 8,8 g d'un extrait recherché et 6,4 g d'un extrait purifié.
Exemple 25
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obtenu à l'exemple 1 dans un tube de dialyse en cellulose
(tube "Vic-,king" vendu par "Union Carbide Co., Ltd.", E.U.A.)
et l'on effectue la dialyse dans de l'eau courante pendant
une semaine. On concentre le liquide interne (portion renfermant la fraction contenant des composés de poids moléculaire élevé) sous pression réduite jusqu'à 500 ml. On ajoute 2 litres d'éthanol au liquide concentré et, par filtration, on récupère le précipité déposé. On sèche le précipité récupéré sous pression réduite pour obtenir 12 g d'un extrait recherché. Ensuite, on soumet l'extrait à une extraction avec 500 ml d'eau et on le filtre, puis on concentre le filtrat et on le sèche sous pression réduite pour obtenir 10 g d'un extrait purifié sous forme d'une poudre brune.
Exemples 26 à 33
De la même manière que celle décrite à l'exemple 25, on traite 4,5 litres de chacun des extraits aqueux dégraissés obtenus dans les exemples 2 à 11 pour obtenir des extraits recherchés et des extraits purifiés suivant la présente invention. Les résultats obtenus sont indiqués ci-dessous :
<EMI ID=82.1>
Exemple 34
On soumet 4,5 litres de l'extrait aqueux dégraissé obtenu à l'exemple 3 à une dialyse au moyen d'un appareil de dialyse à fibres creuses d'alcool polyvinylique comportant une membrane à fibres creuses d'alcool polyvinylique (modèle
<EMI ID=83.1>
1,6 litre d'éthanol à 400 ml du liquide concentré ainsi obtenu et, par filtration, on récupère le précipité déposé. On sèche le précipité récupéré sous pression réduite pour obtenir 10,6 g d'un extrait recherché. Ensuite, on soumet cet extrait à une extraction avec 500 ml d'eau et on le filtre, puis on concentre le filtrat et on le sèche sous pression réduite pour obtenir
<EMI ID=84.1>
Exemple 35
<EMI ID=85.1> purifié.
Exemple 36
<EMI ID=86.1>
de l'extrait aqueux dégraissé obtenu à l'exemple 1 avec du sulfate d'ammonium jusqu'à ce que ce dernier atteigne la concentration de saturation� puis on laisse reposer le mélange pendant une nuit. Par filtration, on récupère le précipité déposé, on le sèche à l'air et on l'extrait avec 6 litres d'eau. On charge l'extrait dans un tube de dialyse en cellulose (tube
<EMI ID=87.1>
effectue la dialyse dans de l'eau courante pendant 6 jours.
On concentre le liquide interne (portion englobant la fraction
<EMI ID=88.1>
sion réduite jusqu'à 500 ml. On ajoute 2 litres d'éthanol au liquide concentré et, par filtration, on récupère le précipité déposé. On sèche le filtrat récupéré sous pression réduite
<EMI ID=89.1>
cet extrait à une extraction avec 500 ml d'eau et on le filtre, puis on concentre le filtrat et on le sèche sous pression réduite pour obtenir 6 g d'un extrait purifié.
Il se confirme que les extraits recherchés obtenus dans les exemples 12 à 36 possèdent les caractéristiques mentionnées ci-dessus.