BE891160A

BE891160A - Composition pharmaceutique contenant de l'orgoteine

Info

Publication number: BE891160A
Application number: BE0/206577A
Authority: BE
Original assignee: Serono Ist Farm
Priority date: 1981-05-27
Filing date: 1981-11-17
Publication date: 1982-03-16
Also published as: IT1142524B; IT8148551A0

Description

Composition pharmaceutique contenant de l'orgotéine.

La présente invention concerne une composition à

l'activité anti-inflammatoire de l'orgotéine est notablement accrue et prolongée dans le temps.

L'orgotéine est une métalloprotéine contenant du cuivre et du zinc qui peut être extraite des globules rouges et de différents tissus de nombreuses espèces de mammifères.

Elle appartient à la classe des enzymes qui ont une activité de dismutation des peroxydes conduisant physiologiquement à <EMI ID=2.1>

la respiration cellulaire et..,,,qui sont nuisibles pour l'organisme.

La présence des radicaux peroxyde dans les fluides extracellulaires peut être considérée comme anormale du

fait que s'ils ne sont pas rapidement éliminés, ils peuvent déterminer dans les tissus[deg.] exposés des altérations graves accompagnées de manifestations pathologiques de divers ordres.

Des études récentes ont démontré qu'une produc-

tion anormale de radicaux peroxyde s'observe dans différents

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types d'inflammation.

Des recherches effectuées sur des patients atteints d'arthropatie de type soit inflammatoire chronique, soit dégénératif (arthrite rhumatoide, ostéoarthrose) ont mis en lumière que l'orgotéine administrée par voie intramusculaire, intra-articulaire ou perarticulaire exerce une action anti-inflammatoire puissante parce qu'elle est capable d'éliminer les radicaux peroxyde présents au niveau des articulations atteintes par le processus pathologique et d'interrompre ainsi l'un des processus pathogènes qui entretiennent cette affection.

d'action par lequel les enzymes ayant une activité de dismutation des peroxydes,et en particulier l'orgotéine,suppriment les radicaux peroxyde*nuisibles des fluides extracellulaires.

La réaction principale est une réaction de dismutation,dans laquelle les enzymes précitées exercent la fonction de catalyseurs, qui mène à la transformation des radicaux peroxyde en oxygène moléculaire et peroxyde d'hydrogène :

xyde, il peut v avoir une seconde réaction qui conduit

à la formation de radicaux OH: aussi dangereux que les radicaux peroxyde parce qu'ils sont capables de provoquer une dégradation des fluides extracellulaires tels que, par exemple, le liquide synovial:

Il résulte de manière évidente des indications ci-dessus que bien qu'utile aux fins d'interrompre le mécanisme inflammatoire pathogène, l'orgotéine (ou autre

de dismutase des peroxydes) peut être insuffisante par elle-même pour garantir une rémission complète des symptômes au niveau des articulations atteintes par le processus pathologique.

Le processus peut en fait procéder par la seconde voie indiquée sans que la dismutase des peroxydes précitée soit capable d'interrompre de manière définitive la production des radicaux libres.

Un but de l'invention est de procurer une nouvelle composition à usage thérapeutique contenant de l'orgotéine dans laquelle l'activité anti-inflammatoire de l'orgotéine est notablement accrue et prolongée dans le temps.

D'autres.buts de l'invention ressortent de manière évidente de la description et des exemples ci-après.

On atteint les buts précités au moyen d'une composition à usage thérapeutique contenant de l'orgotéine et

du mannitol.

Le mannitol est connu comme étant un excipient courant pour les préparations pharmaceutiques surtout les préparations à injecter.

Dans le cas spécifique de l'orgotéine, l'utilisation du mannitol comme excipient devrait être considérée comme inopportune en raison des résultats donnés dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3.637.640 qui a pour objet

des compositions stabilisées d'orgotéine avec du saccharose et d'autres sucres. Suivant le brevet précité, les sucres définis tels quels sont de nature à protéger l'orgotéine contre la dénaturation pendant le processus de lyophilisation et la durée de validité ultérieure du produit lyophilisé.

Les données rassemblées, ci-après (voir tableau

de l'exemple 2) démontrent que la lyophilisation en présence de mannitol ne provoque aucune dénaturation de l'orgotéine qui reste stable sous forme lyophilisée pendant plus de deux ans.

Bien que la validité de la présente invention

ne soit liée à celle d'aucune hypothèse particulière, on pourrait présumer que la qualité de l'orgotéine décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n* 3.637.640 précité devait être différente, surtout en ce qui concerne les impuretés, de celle qu'on peut atteindre actuellement et que l'absence de ces impuretés supprime la nécessité d'ajouter des substances particulières comme stabilisants à l'or-

La ritantité de mannitol qui peut être ajoutée dans les compositions pharmaceutiaues de l'invention peut varier dans un domaine très étendu. Au cours des expériences effectuées, on n'a observé aucune limite critique au-dessous ou au-delà de laquelle les propriétés caractéristiques de la composition varient sensiblement.

Il s'est généralement révélé utile d'ajouter un excès pondéral.de mannitol. Les compsoitions préférées contiennent 2 à 10 parties en poids de mannitol par partie en poids d'orgotéine.

d'une composition pharmaceutique typique conforme à l'invention contenant 3 mg d'orgotéine et 20 mg de mannitol par ampoule

de produit lyophilisé.

EXEMPLE 1 -

Préparation de 1000 ampoules de la composition pharmaceutique d'orgotéine (2 mg)/mannitol (20 mg)

On dissout 2200 mg d'orgotéine (surdosage de 10%) dans environ 1/3 du volume d'eau bidistillée apyrogène stérile à froid (4*C) à utiliser pour la préparation. Après dissolution, on filtre la solution en milieu stérile sur membrane Sartorius, type 11308,et on recueille le filtrat dans un récipient stérile refroidi au bain d'eau et de glace. On lave le filtre avec une solution aqueuse contenant la quantité calculée de mannitol nécessaire pour que chaque ampoule en contienne 20 mg.

On porte au volume requis en lavant le filtrat

avec de l'eau stérile apyrogène.

Au moyen d'une machine à remplir appropriée, on introduit la solution stérile en quantité mesurée dans des ampoules qui sont réparties automatiquement sur des plateaux pour la lyophilisation et immédiatement congelées à -40*C.

Après la précongélation, les plateaux sont introduits dans l'autoclave de lyophilisation et l'opération

est poursuivie pendant 36 heures.

Au terme de la lyophilisation, les fioles sont scellées en chambre stérile à la flamme au moyen d'une machine automatique appropriée.

L'exemple 2 ci-après décrit les expériences effectuées afin d'apprécier la stabilité dans le temps de la composition d'orgotéine et de mannitol préparée comme décrit dans l'exemple 1.

EXEMPLE 2 -

Essai de stabilité

On répartit des ampoules de produit lyophilisé préparées comme décrit dans l'exemple 1 et contenant chacune 2 mg d'orgotéine (soit 7700 unités par ampoule pour le sur-

ment à +4*C et à la température ambiante (20 à 25'C).

A intervalles déterminén, on prélève des ampoules dans chacun des groupes sur lesquelles on exécute les vérifications analytiques les plus appropriées permettant l'apprécia-

en détail ci-après consistent dans la détermination de l'activité de dismutation des peroxydes et dans l'exécution de l'analyse par électrophorèse.

Les résultats obtenus au contrôle périodique poursuivi pendant 27 mois sont rassemblés au tableau suivant:

Les variations observées lors des contrôles effectués à différents moments dépendent des limites d'erreur du procédé de détermination de l'activité de dismutation des peroxydes

(à exprimer en unités de dismutation des peroxydes U.S.). Comme les résultats rassemblés au tableau le prouvent, les produits en ampoule ont conservé dans les deux cas 100% de l'activité initiale.

2) Contrôles analytiques a) Activité de dismutation des peroxydes

Définition

Ce procédé est basé sur la réduction aérobie du bleu de tétrazole nitré par le NADH en présence de méthanesulfonate.de phénazine, réduction qui peut être inhibée

par la dismutase des peroxydes (R.Fried, Biochemie 57,

657, 1975).

Une unité de dismutase des peroxydes correspond

à la quantité d'enzyme requise pour inhiber de 50% la vitesse

et Fridovich I.J. Biol. Chem. 244, 6049, 1969).

Réactifs

1) Tampon phosphaté 0,1 M pH = 7,8

On dissout 13,6 g de phosphate sodique monobasique dans environ 800 ml d'eau. On ajoute goutte à goutte une

On porte le volume à 1 litre avec de l'eau.

2) Réactif oxydant

On dissout 83,4 mg de NBT pro analysi (Fluka),

à pH 7,8 dans un matrasjaugé de 250 ml (réactif 1).

On prépare séparément par chauffage au bain-marie <EMI ID=15.1>

précité. On verse la solution résultante dansl&#65533; matras

de 250 ml et on porte le mélange des réactifs au volume

de 250 ml avec le tampon. On filtre si nécessaire et on conserve à l'abri de la lumière et à la température ambiante pendant une durée de 3 heures au cours de laquelle la solution doit être utilisée pour l'analyse.

3) Réactif réducteur

On dissout 7,1 mg de sel disodique de NADH (nicotineadénine dinucléotide, sel sodique, Boehringer) dans du tampon

finale à 10 ml, pour obtenir une solution 1 mM en NADH (100 nanomoles dans 0,1 ml).

Solution standard (S) d'enzyme de dismutation des peroxydes

On pèse exactement 1 à 2 mg de dismutase des peroxydes (Standard Sigma: 2900 unités/mg) qu'on dissout

tion mère de concentration exactement connue d'environ 150

à 200 /ug/ml, soit 435 à 580 U.S.

Par dilution, on prépare des solutions de concentrations échelonnées (10, 20, 40, 80 et 160 .ug/ml) qu'on utilise pour l'analyse.

Solutions inconnues (C) d'enzyme de dismutation des peroxydes

On les prépare comme les solutions S en exécutant à peu près les mêmes dilutions à partir de 5 ampoules au moins. Procédé

On prépare une série de tubes à essai dans chacun desquels on verse 3 ml de réactif 2, 0,1 ml de solution S

dismutation de supcroxyde), puis 0,1 ml de réactif 3.

On verse dans un tube 3 ml du réactif 2, 0,1 ml de tampon phosphaté 0,1 N (pH 7,8) et 0,1 ml de réactif 3.

rité pendant 10 mirâtes au moins. On détermine l'absorbance de toutes les solutions inconnues à 540 nanomètres en effectuant la lecture contre un blanc constitué par le réactif 2. On reporte l'absorbance sur un graphique en fonction des microgrammes de l'étalon d'enzyme de dismutation des peroxydes, ou unités, pour obtenir de la sorte une courbe d'étalonnage

du NADH. On reportant les couples de valeurs absorbanceunité sur un diagramme semi-logarithmique, on observe une dépendance rectiligne.

Pour la détermination de l'activité de la solution C aux différentes dilutions, on procède de manière analogue.

Les lectures effectuées permettent de remonter par la courbe d'étalonnage à l'activité de l'enzyme de dismutation des peroxydes par ampoule.

b) Identification et pureté par analyse électrophorétique

On prépare des gels pour électrophorèse suivant le procédé de Davis en re.mplaçant dans le gel inférieur un volume d'eau par un volume de riboflavine à 0,004%. On obtient ainsi la composition suivante pour les gels:

1) Gel inférieur de résolution

1 volume de riboflavine aqueuse à 0,004&#65533;

4 volumes de persulfate d'ammonium aqueux à 0,14%.

2) Gel supérieur de concentration

1 volume de riboflavine aqueuse à 0,004% 4 volumes de saccharose à 40%.

3) Solution tampon: pH 8,3

on dilue à 1:10 avant usage.

Solutions à examiner

solution à la concentration prévue d'environ 2500 unités par ml dans une solution à 10% de saccharose dans le tampon à pH 8,3 (3) à laquelle on ajoute 1% d'une solution aqueuse

à 0,05% de bleu de bromophénol.

Procédé

On dépose 50 microlitres de la solution à examiner sur le gel de concentration et on débute la course d'abord à 1,5 mA par tube et ensuite à 3mA par tube pour la séparation des constituants. La course s'interrompt quand le traceur est arrivé près de la limite inférieure du tube.

On dépose ensuite le gel pour une durée de 20 minutes

<EMI ID=26.1> de potassium 0,036 M à pH 7,8. Après écoulement de 15 minutes, on expose le gel à la lumière d'une lampe de 15 W et on observe la formation d'une coloration violacée sauf à l'endroit

où se trouve l'orgotéine. A cet endroit, le gel reste incolore.

Parallèlement à cette détermination, on développe

un autre gel avec de l'amidon de Schwartz 0,05% dans de

l'acide acétique à 7% pour la détermination des bandes protéiques. L'orgotéine est caractérisée par trois bandes voisines vers le milieu du trajet.

L'exemple 3 ci-après prouve par des données pharmacologiques la supériorité de la composition conforme à l'invention sur l'orgotéine seule pour réduire l'&#65533;nflammation induite chez le lapin.

EXEMPLE 3 -

On réalise trois préparations différentes A, B et C. Préparation A

Cette préparation contient de l'orgotéine et du mannitol dans les proportions indiquées dans l'exemple 1, c'est-à-dire 2 mg d'orgotéine et 20 mg de mannitol sous

forme lyophilisée.

On dissout le contenu d'une ampoule de produit lyophilisé dans 2 ml de solution physiologique.

Préparation B

La préparation'B est analogue à la préparation A avec la seule différence qu'elle ne.contient pas de mannitol mais uniquement de l'orgotéine.

Dans ce cas également, on dissout l'orgotéine lyophilisée dans 2 ml de solution physiologique.

Préparation C

La.préparation C est formée uniquement de 2 ml de solution physiologique.

On évalue les préparations A, B et C expérimentalement sur le lapin par essai de leur activité anti-intlammatoire relative.

On exécute les expériences sur des lapins mâles type New Zealand de 1,5 à 2 kg.

On induit l'inflammation en injectant dans les

deux articulations du genou de la patte antérieure des animaux une composition constituée par 7,5 mg de poly-D-lysine et 7,5 g d'acide hyaluronique. Quatre jours après l'induction de l'arthrite, on répartit les animaux au hasard en groupes de 10 et on leur administre les préparations A, B et C par injection intra-articulaire dans le genou antérieur droit.

Le genou gauche non traité constitue le témoin.

On évalue le degré d'avancement de la réaction inflammatoire en mesurant la circonférence de l'articulation immédiatement avant l'injection de la composition inflammatoire, avant l'administration de l'agent pharmaceutique et ensuite une fois par jour pendant les quatre jours successifs.

Les résultats sont reportés à la Fig. 1 qui montre la diversité d'avancement des inflammations induites chez

le lapin par administration :
- d'une sc'ution physiologique (préparation C) <EMI ID=27.1>

Les résultats obtenus démontrent qu'il existe une différence significative et surprenante entre l'effet anti-inflammatoire de la composition orgotéine/mannitol et la composition d'orgotéine uniquement. En outre, l'effet anti-inflammatoire est proportionnel à la dose d'orgotéine en présence d'un excès constant de mannitol.

REVENDICATIONS

1 - Composition à usage thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'orgotéine et un excès pondéral de mannitol.

Claims

2 - Composition suivant la revendication 1, carac- <EMI ID=28.1>

mannitol par partie en poids d'orgotéine.

3 - Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est présentée sous forme dosée de médicament.

4 - Composition suivant la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est présentée sous forme de produit lyophilisé dans une ampoule.

5 - Ampoule de produit lyophilisé suivant la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle contient 2 mg d'orgotéine et 20 mg de mannitol.