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ayant pour objet : Procédé de production de glycoprotéines antitumorales Qualification proposée : BREVET D'INVENTION Priorité d'une demande de brevet déposée au Japon le 4 août 1982 sous le n Sho 57-135852
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La présente invention concerne un procédé de production d'une glycoprotéine antitumorale possédant un poids moléculaire plus faible que celui de la glycoprotéine antitumorale de départ, caractérisé en ce que l'on réduit le poids moléculaire d'une glycoprotéine antitumorale possédant un poids moléculaire
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élevé, en la soumettant à un traitement par un agent réducteur et en récupérant ensuite les glycoprotéines antitumorales possédant des poids moléculaires réduits à partir du mélange réactionne.
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En dépit du fait qu'un certain nombre de chercheurs de par le monde ont mis au point jusqu'à présent de nombreux agents thérapeutiques pour le traitement des tumeurs, le taux de guéri- son des tumeurs par ces agents thérapeutiques demeure encore très faible et l'on poursuit activement les recherches destinées au développement d'agents thérapeutiques toujours meilleurs.
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La présente invention a donc pour objet un procédé de pro- duction de glycoprotéines antitumorales.
La présente invention a également pour objet un procédé de production de glycoprotéines antitumorales possédant des poids moléculaires plus faibles à partir d'une glycoprotéine antitu-
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morale possédant un poids moléculaire supérieur. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un CLx (CL = carcinolyseur) avec un rendement élevé.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un CLx2 avec un rendement élevé.
Un autre objet encore de l'invention réside dans un procédé d'obtention d'un CLx3 avec un rendement supérieur.
L'invention a pour objet un procédé de production d'une ou plusieurs glycoprotéines antitumorales possédant des poids moléculaires plus faibles que ceux d'une glycoprotéine
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antitumorale de départ, caractérisé en ce que l'on réagir une glycoprotéine antitumorale possédant un poids moléculaire supérieur sur un agent réducteur et en ce que l'on recueille faitensuite les glycoprotéines antitumorales possédant un poids moléculaire réduit à partir du mélange réactionnel.
La mise en oeuvre du procédé suivant la présente invention permet d'obtenir un carcinolyseur (CL) à glycoprotéine antitu-
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morale d'un poids moléculaire souhaité avec un rendement élevé.
La présente demanderesse, concevant que des cellules réticuloendothéliales jouant un rôle important dans le mécanisme biophylactique seraient éventuellement capables d'engendrer une substance susceptible de guérir des tumeurs, a assigne pour tâche à ses chercheurs de poursuivre continuellement- et extensivement des études relatives à ce sujet.
Tout récem- ment, les chercheurs concernés ont découvert quatre types de glycoprotéines antitumorales possédant des poids moléculaires différents, à partir d'un surnageant d'une culture ou d'un extrait de cellules réticuloendothéliales, de lymphoblastes, de cellules de leucémie ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud
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et ces chercheurs les ont appelées carcinolyseur X (poids moléculaire 12. 000-17. 000), X1 (poids moléculaire 70. 000-90. 000), X2 (poids moléculaire 40. 000-50. 000) et X3 (poids moléculaire 7. 000-9. 000) (voir demandes de brevets japonais NO 28993/1982, 87674/1982, 87675/1982, 10846/1982, et la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 467. 840 du 18 février 1983 ;
ces glycoprotéines seront appelées dans la suite du présent mémoire CLy, , respectivement et, dans le cas où l'on s'y réfère de manière collective, on les appellera
28992/1982,CL).
Les demandes japonaises précitées correspondent au brevet belge NO 896. 027 déposé le 25 février 1983.
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Etant donné que les CL.,-CLy sont présentes en mélange dans un surnageant d'une culture ou un extrait de cellules réticuloendothéliales, de lymphoblastes, de cellules de leucémie
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ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud, il a été extrêmement difficile d'obtenir, d'une manière efficiente et exclusive un carcinolyseur possédant un poids moléculaire souhaité, c'est- à-dire CLX ou CLX3'en quantité importante.
Les chercheurs de la demanderesse ont intensément étudié la mise au point d'un procédé efficient d'obtention et de purification de CLX3, de CLX2 et/ou de CLx et ont découvert, en résultat de ces recherches, que par un traitement de dégradation d'une glycoprotéine antitumorale (c'est-à-dire un carcinolyseur) obtenue à partir d'un surnageant d'une culture ou d'un extrait de cellules réticuloendothéliales, de lymphoblastes, de cellules de leucémie ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud, par un agent réducteur, on pouvait obtenir à partir du mélange réactionnel liquide précité, une glycoprotéine antitumorale possédant un poids moléculaire de 40. 000-50. 000, c'est-à-dire CLX2'une glycoprotéine antitumorale possédant un poids moléculaire de 12. 000-17. 000, c'est-à-dire CLX et/ou une glycoprotéine antitumorale possédant un poids moléculaire de 7. 000-9.
000, c'est-à-dire CLx3'de manière aisée et avec un rendement élevé, l'objectif de la présente invention étant atteint de ce fait.
Les abréviations CL.,, , et CLx3'telles qu'utilisées dans la totalité du présent mémoire, se définissent comme désignant des glycoprotéines antitumorales qui constituent les carcinolyseurs dont il a été question au paragraphe précédent et qui possèdent les propriétés suivantes : Cl (1) poids moléculaire : 12. 000-17. 000 ;
(2) réactions de coloration : présente une coloration qui indique la présence de protéines au cours de la réaction de Lowry, présente une coloration qui la présence de liaisons peptidiques et d'acides aminés ou aminoacides cours de la réaction à la ninhydrine après hydrolyse à l'acide chlorhydrique et présente une coloration qui indique la présence de
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CLysucres au cours de la réaction au phénol-acide sulfurique, au cours de la réaction à l'anthrone-acide sulfurique, au cours de la réaction à l'indole-acide sulfurique et au cours de la réaction au tryptophane-acide sulfurique ;
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(3) aspect et solubilité : c'est une poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon au phosphate et médiocrement soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme ;
(4) teneur en sucres : elle est de 27 à 33 %, la composition de ces sucres étant de 17 à 20 % d'hexose, de 5 à 7 % d'hexosamines et de 5 à 6 6 d'acides sialiques ; (5) point isoélectrique : 4, 3-7, 3 ; (6) adsorbabilité : la substance est adsorbable sur du Sephadex conjugué à de l'agglutinine d'Ulex europeus dans un tampon au phosphate 0, 01 M (pH 7, 2) ;
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(7) stabilité : stable dans une solution aqueuse d'un pH de 2, 0, d'un pH de 7, 0 ou d'un pH de 11, 0 à 40C pendant 24 heures et plus et dans une solution aqueuse d'un pH de 7, 0 à 600C p ndant 3 heures et plus ;
(8) cytotoxicité : endommage sélectivement les cellules tumorales sans porter de préjudice sensible aux cellules normales ; et (9) différentiation : induit une différentiation des cellules tumorales, c'est-à-dire qu'elle provoque la récupération des cellules tumorales en cellules normales.
CLX1 : (1) poids moléculaire : 70. 000-90. 000 ; (2) réactions de coloration : présente une coloration
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qui indique la présence de protéines au cours de la réaction de Lowry, présente une coloration qui indique la présence de liaisons peptidiques et d'acides aminés ou amino-acides au cours de réaction à là ninhydrine après hydrolyse à l'acide chlorhydrique et présente une coloration qui indique la pré-
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sence de sucres au cours de la réaction au phénol-acide sulurique, au cours de la réaction à l'anthrone-acide sulfurique,
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au cours de la réaction à l'indole-acide sulfurique et au cours de la réaction au triptophane-acide sulfurique ;
(3) aspect et solubilité : c'est une poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon au phosphate et médiocrement soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme ; (4) teneur en sucres : 35 à 45 %, la composition de ces sucres étant de 23-28 % d'hexose, de 8-11 % d'hexosamine et de 4 à 6 % d'acides sialiques ; (5) point iso-électrique : 4, 3-6, 2 ; (6) adsorbÅabilité : adsorbable sur du Sephadex conjugué à de l'agglutinine d'Ulex europeus dans un tampon au phosphate 0, 01 M (pH 7, 2) ; (7) stabilité : stable dans une solution aqueuse d'un pH de 2, 0, d'un pH de 7, 0 ou d'un pH de 11, 0 à 40C pendant 24 heures et plus et dans une solution aqueuse d'un pH de 7, 0 à 600C pendant 3 heures et plus ; et (8) cytotoxicité : endommage sélectivement les cellules tumorales sans porter de préjudice sensible aux cellules normales.
CL (1) poids moléculaire : 40. 000-50. 000 ; (2) réactions de coloration : présente une coloration qui indique la présence de protéines au cours de la réaction de Lorry, présente une coloration qui indique la présence de liaisons peptidiques et d'amino-acides ou acides aminés au cours de la réaction à la ninhydrine après hydrolyse à l'acide chlorhydrique et présente une coloration qui la présence de sucres au cours de la réaction au phénol-acide sulurique, au cours de la réaction à l'anthrone-acide sulfurique, au cours de la réaction à l'indole-acide sulfurique et au cours de la réaction au triptophane-acide sulfurique ; (3) aspect et solubilité : c'est une poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon
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au phosphate et médiocrement soluble dans le benzène l'hexane et le chloroforme ;
(4) teneur en sucres : 30-37 %, la composition de ces sucres étant de 20 à 23 % d'hexoses, de 6 à 8 % d'hexosamine et de 4 à 6 % d'acides (5) point iso-électrique : 4, 2-7, 3 ; (6) adsorbabilité : adsorbable sur du Sephadex conjugué à de l'agglutinine d'Ulex europeus dans un tampon au phosphate 0, 01 M (pH 7, 2) ; (7) stabilité : stable dans une solution aqueuse d'un pH de 2, 0, d'un pH de 7, 0 ou d'un pH de 11, 0 à 40C 24 heures et plus et dans une solution aqueuse d'un pH de 7, 0 à 600C pendant 3 heures et plus ; et (8) cytotoxicité : endommage sélectivement les cellules tumorales sans porter de préjudice sensible aux cellules normales. r*T CLX3 (1) poids moléculaire : 7. 000-9. 000 ;
(2) réactions de coloration : présente une coloration qui indique la présence de protéines au cours de la réaction de Lowry, présente une coloration qui indique la présence de liaisons peptidiques et d'acides aminés ou amino-acides au cours de la réaction à la ninhydrine après hydrolyse à l'acide chlorhydrique et présente une coloration qui indique la présence de sucres au cours de la réaction au phénol-acide sulfurique, au cours de la réaction à l'anthrone-acide sulfurique, au cours de la réaction à l'indole-acide sulfurique et au cours de la réaction au tryptophane-acide sulfurique ; (3) aspect et solubilité : c'est une poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon au phosphate et médiocrement soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme ;
(4) teneur en sucres : 8-15 S composition de ces sucres étant de 6 à 10 % d'hexoses, de 1 à 2 % d'hexosamines
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et de 1 à 3 % d'acides sialiques ; (5) adsorbabilité : adsorbable sur la carboxyméthylcellulose au cours d'une chromatographie à échange ionique, en utilisant de la carboxyméthylcellulose dans un tampon au phosphate 0, 05 M (pH 6, 4) ; (6) stabilité : stable dans une solution aqueuse d'un pH de 2, 0, d'un pH de 7, 0 ou d'un pH de 11, 0 à 40C pendant 24 heures et plus et dans une solution aqueuse d'un pH de 7, à 600c pendant 3 heures et plus ; (7) cytotoxicité : endommage sélectivement les cellules tumorales sans porter de préjudice sensible aux cellules normales ; et (8) la séquence des amino-acides du N terminal de la partie protéinique est alanine-alanine-.
La présente invention se met, en général, en oeuvre de la façon suivante : on dissout une glycoprotéine antitumorale CL possédant un poids moléculaire supérieur au poids moléculaire souhaité, qui a été séparée et purifiée à partir d'un surnageant d'une culture ou d'un extrait cellulaire, à une concentration appropriée de, par exemple 10 à 10. 000 g/ml et on la soumet ensuite à un traitement de dégradation par réaction sur une quantité appropriée d'un agent réducteur. On dialyse le mélange réactionnel, on soumet le dialysat à une salification et on sépare les précipités formés par filtration.
Ensuite, on dissout ces précipités dans une faible quantité d'une solution physiologique saline ou d'une solution née et, après dialyse, on soumet la solution à une filtration à travers gel, en utilisant du Sephadex G-50 pour obtenir une glycoprotéine antitumorale possédant le poids moléculaire souhaité.
L'expression''traitement de dégradation''telle l'utilise dans le présent mémoire désigne un traitement destiné à convertir une glycoprotéine possédant un poids moléculaire supérieur en une glycoprotéine possédant un poids
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:moléculaire inférieur en provoquant chimiquement la rupture des liaisons intramoléculaires, comme les liaisons disulfure.
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La matière de départ que l'on utilise pour la mise en oeuvre de la présente invention est, de manière appropriée, CLX1 ou CLx2'bien que CLx puisse également être utilisé lorsque CLOY, constitue le produit souhaité. Bien qu'à titre de matière de départ, on utilise de préférence une solution de CLy.. et/ou CLx2 purifiée dans un tampon, une solution physiologique saline, l'eau distillée, etc., il est également possible d'utiliser un surnageant d'une culture ou un extrait cellulaire contenant CL en soi.
CL peut être obtenu à partir d'un surnageant d'une culture ou un extrait de cellules méticuloendothéliales, de lympho-
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bastes, de cellules de leucémie ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud. Les détails du procédé de production et l'effet antitumoral des CL sont décrits dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 840 déposée le 18 février 1983, correspondant au brevet belge NO 027 déposé le 25 février 4671983, précité, dont les descriptions sont incorporées au présent mémoire à titre de référence.
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A titre d'exemples de l'agent réducteur que l'on peut utiliser aux fins de la présente invention, on peut citer des composés du type thiol, comme le 2-mercaptoéthanol, le dithiothréitol, le dithioérythritol, l'acide thioglycolique, l'acide monothiophosphorique, etc., des complexes hydrogénés de métaux, comme le borohydrure de sodium, des amines tertiaires, telles que la tri-n-butylphosphine, la tris-diéthylaminoéthylphosphine, etc., des sulfites, tels que le sulfite de sodium, des sels de l'acide cynique, comme le bromure de cyanogène, des ions de métaux, comme des ions d'argent, etc.
Ces composés sont ceux généralement employés pour la décomposition et l'élimination de contaminants protéiniques à poids moléculaires élevés, pour la dégradation d'une structure d'une protéine d'une dimension supérieure et pour l'analyse de la structure fondamentale ou
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de base de ladite protéine, etc. Les protéines traitées par ces composés perdent fréquemment leur activité biologique, mais il est surprenant que le traitement de dégradation conforme à l'invention soit possible sans provoquer de perte de l'activité antitumorale.
Les conditions de mise en oeuvre de la présente invention comme la concentration de l'agent réducteur, la température de traitement, la durée de traitement, le pH de traitement etc., peuvent se choisir de façon appropriée en fonction du but, par exemple, CLx ou CLx3 doit être obtenue isolément ou que ces deux substances doivent être obtenues simultanément, etc. On peut utiliser l'agent réducteur en une concentration de 10-1 de préférence, par exemple, de 10-5 s'agit du 2-mercaptoéthanol, de de - préférence, par exemple, de 10 lorsqu'il s'agit du dithioérythritol, de lorsqu'il s'agit de l'acide monothiophosphorique, de s'agit du borohydrure de sodium, ou de lorsqu'il s'agit de l'acide thioglycolique.
La température de traitement n'est pas particulièrement limitée, pour autant que la glycoprotéine ne subisse pas de dénaturation et on peut commodément mettre en oeuvre une température de 0 à 370C, de préférence la ture ambiante avoisinant 15-250C. On peut choisir la durée de réaction de manière appropriée de façon à obtenir un carcinolyseur CL possédant un poids moléculaire souhaité, cette durée variant généralement de 10 minutes à 2 heures.
De préférence, on choisit le pH dans la gamme allant des pH faiblement acides à neutres, c'est-à-dire entre environ 5, 5 et 7, Au surplus, lors de la mise en oeuvre du traitement de dégradation, un agent tensio-actif ou surfactif, par exemple, un surfactif ionique, tel que le dodécylsulfate de sodium (DSS), un surfactif non ionique, tel que le Triton X, etc., peut, de préférence, être présent dans le mélange réactionnel, afin d'augmenter le rendement. La concentration optimale du surfactif fluctue en fonction de la matière de départ utilisée
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lorsquepour procéder au traitement de dégradation, cette concentra-
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tion fluctuant dans la plage de 0, 001 à 10 %. Les agents tensio-actifs ou surfactifs ioniques comprennent ceux du type anionique, cationique et amphotère.
A titre d'exemples de surfactifs anioniques convenables, on peut citer le DSS, un sel de l'acide colique, etc. A titre d'exemples de surfactifs cationiques convenables, on peut citer le bromure de dodécylammonium, etc. et des exemples de surfactifs amphotères appropriés sont la désoxylysolécithine, etc. A titre d'exemples de surfactifs non ioniques convenables, on peut citer le Triton,
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ceux du type Tween, ceux du type Span, etc. On peut utiliser les surfactifs individuellement ou en mélanges.
La présente invention sera à présent décrite avec plus de particularités à l'aide des exemples non limitatifs qui sui- vent.
EXEMPLE 1
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a) Préparation des matières de départ.
On a préparé des CL de poids moléculaire supérieur (c'est-à-dire CLX1, CLX2 et CLX), utilisés à titre de matières de départ dans les exemples 1-7.
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1 D On a mis des lymphocytes humains (2 x cellules) en suspension dans 4. 000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et, après l'addition de phytohémaglutinine (Difco Co.) jusqu'à une concentration finale de 50 g/ml, on a procédé à la culture à 370C pendant 48 heures dans une atmosphère constituée de 5 % de C02 et de 95 % d'air.
Ensuite, on a dialysé le surnageant du milieu de culture vis-à-vis d'un tampon au phosphate 0, 01 M (pH 7, 2) et on a procédé à la salification d'une fraction avec du sulfate d'ammonium à 40-80 % à partir du dialysat. On a redialysé cette fraction vis-à-vis du tampon au phosphate précité et on l'a ensuite soumis à une filtration à travers gel en utilisant du Sephadex G-100 (Pharmacia Co.).
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On a obtenu les CLy, brutes en fractions possédant des poids moléculaires de 70. 000-90. 000, 40. 000-50. 000 et 12. 000-17. 000, respectivement. On a adsorbé la CLy.. brute sur du Sephadex conjugué à de l'agglutinine d'Ulex europeus (Maruzen Oil Co.) et on a procédé à son élution par un tampon au phosphate 0, 01 M contenant contenant 0, 5 M de fucose. Après l'élimination de la fucose par dialyse, on a de nouveau adsorbé la CLX1 sur du Sephadex conjuguée à de l'agglutinine europeus, puis on a procédé à l'elution par un procédé à dients, en utilisant un tampon au phosphate (pH 7, 2), de façon à éluer la CLX1 purifiée. On a obtenu la CLX1 purifiée avec une activité spécifique de 50. 000 unités/mg, en une quantité totale de 5. 000 unités en une opération.
On a purifié la CLx2 brute de la même manière et on a obtenu la CLOY2 purifiée avec une activité spécifique de 20. 800 unités/mg, en une quantité totale de 5. 200 unités en une opération.
On a également purifié la CLx brute de la même manière et on a obtenu la CLx purifiée avec une activité spécifique de 10. 000 unités/mg en une quantité totale de 10. 000 unités en une opération. On a également obtenu la CLX purifiée avec une activité spécifique de 7. 500 unités/mg, en une quantité totale de 150 unités, au départ du même nombre de lymphocytes humains et on a ensuite employé le même procédé à l'exception que le milieu de culture ne contenait pas dephytohémaglutinine.
On exprime l'activité dans la totalité du présent mémoire sur base de la concentration qui une inhibition de 50 % de la prolifération de cellules de cellules KB servant d'unité. b) Traitement de dégradation.
On a dissous 200. 000 unités de CLy < , (poids moléculaire 70. 000-90. 000) dans une solution saline et on les a fait réagir pendant 1 heure à la température ambiante en préy sence de 5 x 10-7M de 2-mercaptoéthanol. Après la réaction,
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on a dialysé le mélange réactionnel et on a procédé à sa salifiction avec du sulfate d'ammonium à 80 % et on a séparé la fraction précipitée par filtration. On a dissous cette fraction dans une solution saline physiologique et on l'a ainsi soumise à une filtration à travers gel en utilisant du Sephadex G-50. On a recueilli les fractions correspondant aux poids moléculaires de 40. 000-50. 000, 12. 000-17. 000 et 7. 000-9. 000 et on les a appelées fraction A, fraction B et fraction C respectivement.
On a également répété les modes opératoires décrits ci-dessus en présence de 0, 05 % de DSS de manière à obtenir les mêmes fractions.
Les propriétés physicochimiques de ces fractions A, B et C ont été examinées et on les a identifiées comme étant respectivement à base de CLX2'CLx et CLx3. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I.
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TABLEAU l - Propriétés physicochimiques des fractions A-C
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<tb>
<tb> Fraction <SEP> A <SEP> Fraction <SEP> B <SEP> Fraction <SEP> C
<tb> (PM <SEP> 40. <SEP> 000-50. <SEP> 000) <SEP> (PM <SEP> 12. <SEP> 000-17. <SEP> 000) <SEP> (PM <SEP> 7. <SEP> 000-9. <SEP> 000) <SEP>
<tb> Identification <SEP> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3,
<tb> Aspect <SEP> et <SEP> solubilité <SEP> Poudre <SEP> blanche <SEP> soluble <SEP> dans <SEP> l'eau, <SEP> le <SEP> chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> aqueux
<tb> et <SEP> un <SEP> tampon <SEP> au <SEP> phosphate <SEP> et <SEP> médiocrement <SEP> soluble <SEP> dans <SEP> benzène,
<tb> hexane <SEP> et <SEP> chloroforme.
<tb>
Réactions <SEP> de <SEP> coloration <SEP>
<tb> Lowry <SEP> Bleu <SEP> (liaisons <SEP> peptidiques)
<tb> Ninhydrine <SEP> Bleu <SEP> violet <SEP> (aminoacides)
<tb> Phénol-acide
<tb> sulfuriqueê <SEP> Brun <SEP> grisâtre <SEP> (sucres)
<tb> Anthroneacide <SEP> sulfuriqueê) <SEP> Bleu <SEP> verdâtre <SEP> (sucres)
<tb> α
-Naphtolacide <SEP> sulfurique2) <SEP> Violet <SEP>
<tb> Indoleacide <SEP> sulfurique2) <SEP> Brun <SEP> grisâtre <SEP> (sucres)
<tb> Tryptophane-2)
<tb> acide <SEP> sulfurique <SEP> Violet <SEP> grisâtre <SEP> (sucres) <SEP>
<tb> Holff3) <SEP> Incolore <SEP> (pas <SEP> de <SEP> lipides)
<tb>
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<tb>
<tb> Fraction <SEP> A <SEP> Fraction <SEP> B <SEP> Fraction <SEP> C
<tb> (PM <SEP> 40. <SEP> 000-50.000) <SEP> (PM <SEP> 12.000-17.000) <SEP> (PM <SEP> 7.
<SEP> 000-9.000)
<tb> Teneur <SEP> en <SEP> sucre4) <SEP> 30 <SEP> - <SEP> 37 <SEP> % <SEP> 27 <SEP> - <SEP> 33 <SEP> % <SEP> 8 <SEP> - <SEP> 15 <SEP> %
<tb> Hexose <SEP> 20-23 <SEP> % <SEP> 17-20 <SEP> % <SEP> 6-10 <SEP> %
<tb> Hexosamine <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 8 <SEP> % <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 7 <SEP> % <SEP> 1 <SEP> - <SEP> 2 <SEP> %
<tb> Acide <SEP> sialique <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 6 <SEP> 01 <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 6 <SEP> % <SEP> 1-3 <SEP> % <SEP>
<tb> Adsorbable <SEP> sur <SEP> Sephadex <SEP> conjugué <SEP> à <SEP> de <SEP> Adsorbable <SEP> sur <SEP> carboxyAdsorbabilité <SEP> l'agglutinine <SEP> d'Ulex <SEP> europeus <SEP> dans <SEP> tampon <SEP> methylcellulose <SEP> au <SEP> cours <SEP>
<tb> d'une <SEP>
<tb> au <SEP> phosphate <SEP> 0,01 <SEP> M <SEP> (pH <SEP> 7, <SEP> 2)
<SEP> échange <SEP> d'ions <SEP> en <SEP> utilisant <SEP> de <SEP> la <SEP> carboxyméthylcellulose <SEP> dans <SEP> tampon
<tb> au <SEP> phosphate <SEP> 0,05 <SEP> M
<tb> (pH <SEP> 6, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Point <SEP> isoélectrique5) <SEP> 4,2 <SEP> - <SEP> 7,3 <SEP> 4,2 <SEP> - <SEP> 7,3 <SEP> 6,3 <SEP> - <SEP> 7,8 <SEP>
<tb> Stabilité <SEP> Stable <SEP> en <SEP> solution <SEP> aqueuse <SEP> d'un <SEP> pH <SEP> de <SEP> 2, <SEP> 0, <SEP> d'un <SEP> pH <SEP> de <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> ou <SEP> d'un
<tb> pH <SEP> de <SEP> 11,0 <SEP> à <SEP> 40C <SEP> pendant <SEP> 24 <SEP> heures <SEP> et <SEP> plus <SEP> et <SEP> en <SEP> solution <SEP> aqueuse
<tb> d'un <SEP> pH <SEP> de <SEP> 7,0 <SEP> à <SEP> 600C <SEP> pendant <SEP> 3 <SEP> heures <SEP> et <SEP> plus.
<tb>
Cytotoxicité <SEP> Endommage <SEP> sélectivement <SEP> les <SEP> cellules <SEP> tumorales <SEP> sans <SEP> porter <SEP> de
<tb> préjudice <SEP> sensible <SEP> aux <SEP> cellules <SEP> normales
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
1) le procédé de Seikagaku Jikken Koza, Vol. 1 (Tanpakushitsu Teiryohou), 1971 2) le procédé de Seikagaku Jikken Koza, Vol. 4 (Toshitsu Teiryohou), 1971 3) Suivant le procédé de Seikagaku Jikken Koza, 3 (Shishitsu Teiryohou), 1971 4) Spiro, J. A., Methods in Enzymology, Vol. 8, p. 3 1966.
E\ n ' en utilisant de l'Ampholine (mise sur le marché par la société LKB-Produkter. AB, Suède).
6 5 'On a procédé à la culture de cellules dans 1 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et à la culture de chaque fraction à 370C pendant 48 heures dans une atmosphère constituée de 5 % de C02 et de 95 % d'air, puis on a compté le nombre de cellules viables non colorées au bleu de Trypan et on a pris la concentration de la fraction à laquelle 50 % des cellules était tuées comme mesure de la cytotoxicité.
La récupération de l'activité de fraction dans l'exemple 1 est présentée dans le tableau II.
TABLEAU II
EMI16.2
<tb>
<tb> SuivantTraitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX1 <SEP> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 200. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoéthanol <SEP> 0 <SEP> 10. <SEP> 000 <SEP> 160. <SEP> 000 <SEP> 15. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoethanol
<tb> + <SEP> 0 <SEP> 5. <SEP> 000 <SEP> 150. <SEP> 000 <SEP> 25. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> DSS
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
EXEMPLE 2 On a dissous 200. 000 unités de CLX2 dans une solution saline physiologique et on les a fait réagir pendant 1 heure à la température ambiante en présence de de 2-mercapto- éthanol.
Après la réaction, on a procédé à une dialyse et à une salification au sulfate d'ammonium afin d'obtenir une fraction que l'on a soumise à une filtration à travers gel en utilisant du Sephadex G-50. On a recueilli des fractions d'un poids moléculaire de 12. 000-17. 000 (fraction B) et de 7. 000- 9. 000 (fraction C). On a également répété les modes toires décrits ci-dessus en présence de 0, 05 % de DSS. On a déterminé que les fractions étaient à base de CLx et de CLx3' de la même manière que celle décrite à l'exemple 1.
Le tableau III présente les résultats obtenus quant à la récupération de CLx et de CLx3' TABLEAU III
EMI17.2
<tb>
<tb> 10 <SEP> 7ItTraitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 200.000 <SEP> - <SEP> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoéthanol <SEP> 0 <SEP> 170. <SEP> 000 <SEP> 20. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoéthanol
<tb> + <SEP> 0 <SEP> 140. <SEP> 000 <SEP> 37. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> DSS
<tb>
EMI17.3
EXEMPLE 3 On a traité 200. 000 unités de CLx par 5 x 10-7M de 2-mercaptoéthanol et, d'une manière similaire à celle décrite à l'exemple 1, on a obtenu une fraction possédant un poids moléculaire de 7. 000-9. 000 (fraction C). On a identifié cette fraction comme étant à base de CLx3 de la manière décrite à l'exemple 1.
Le tableau IV présente la récupération de la CLX3
<Desc/Clms Page number 18>
obtenue.TABLEAU IV
EMI18.1
<tb>
<tb> Traitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 200. <SEP> 000 <SEP> - <SEP>
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoéthanol <SEP> 110. <SEP> 000 <SEP> 58. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoéthanol
<tb> + <SEP> 90. <SEP> 000 <SEP> 73. <SEP> 000 <SEP>
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> DSS
<tb>
EXEMPLE 4
EMI18.2
On a traité un mélange de 100. 000 unités de CLX1 et de 100. 000 unités de par 5 x de d'une manière similaire à celle décrite à l'exemple 1. Les résultats de la récupération de CLx2'de et de CLX3 sont présentés dans le tableau V.
TABLEAU V
EMI18.3
<tb>
<tb> CLX2Traitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX1 <SEP> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 100. <SEP> 000 <SEP> 100. <SEP> 000 <SEP> - <SEP> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoethanol <SEP> 0 <SEP> 20.000 <SEP> 150.000 <SEP> 20.000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoéthanol
<tb> + <SEP> 0 <SEP> 3. <SEP> 000 <SEP> 140. <SEP> 000 <SEP> 42. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> DSS
<tb>
EXEMPLE 5
EMI18.4
On a traité un mélange de 100. 000 unités de CLX1 et de 100. 000 unités de CLx par 5 x 10-7M de 2-mercaptoéthanol, d'une manière similaire à celle décrite à l'exemple 1.
Les résultats de la récupération de CLx2'de et de Cl, sont présentés dans le tableau VI.
<Desc/Clms Page number 19>
CLxTABLEAU VI
EMI19.1
<tb>
<tb> Traitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX1 <SEP> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 100. <SEP> 000 <SEP> - <SEP> 100. <SEP> 000 <SEP> - <SEP>
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoethanol <SEP> 0 <SEP> 19.000 <SEP> 130.000 <SEP> 40.000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoéthanol
<tb> + <SEP> 0 <SEP> 7. <SEP> 000 <SEP> 120. <SEP> 000 <SEP> 57. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> DSS
<tb>
EXEMPLE 6
EMI19.2
On a traité un mélange de 100. 000 unités de CLX et de 100. 000 unités de CLx2 par 5 x 10-7M de 2-mercaptoéthanol, d'une manière similaire à celle décrite à l'exemple 1.
Les résultats de la récupération de CLx et de CLx3 sont présentés dans le tableau VII.
TABLEAU VII
EMI19.3
<tb>
<tb> Traitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 100. <SEP> 000 <SEP> 100. <SEP> 000 <SEP> 0
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoéthanol <SEP> 0 <SEP> 120. <SEP> 000 <SEP> 65. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoethanol
<tb> + <SEP> 0 <SEP> 90. <SEP> 000 <SEP> 77. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> DSS
<tb>
EXEMPLE 7
EMI19.4
On a traité un mélange de 100. 000 unités de CLx1'de 100. 000 unités de CLX2 et de 100. 000 unités de CLX par 5 x 10-7M de 2-mercaptoéthanol, d'une manière similaire à celle décrite à l'exemple 1. Les résultats de la récupération
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
de CLX2'de et de CLx3 sont présentés dans le tableau VIII.
TABLEAU VIII
EMI20.2
<tb>
<tb> CLxTraitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX1 <SEP> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 100. <SEP> 000 <SEP> 100. <SEP> 000 <SEP> 100. <SEP> 000 <SEP> - <SEP>
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoéthanol <SEP> 0 <SEP> 23. <SEP> 000 <SEP> 240. <SEP> 000 <SEP> 22. <SEP> 000
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> 2mercaptoéthanol
<tb> + <SEP> 0 <SEP> 8. <SEP> 000 <SEP> 240. <SEP> 000 <SEP> 33. <SEP> 000 <SEP>
<tb> Traitement <SEP> au <SEP> DSS
<tb>
EXEMPLE 8
EMI20.3
On a traité un mélange contenant 100. 000 unités de CLy, de 100. 000 unités de CLX2 et de 100. 000 unités de CLx par chacun des agents réducteurs présentés dans le tableau IX, selon un procédé similaire à celui décrit à l'exemple 1.
Les résultats de récupération des CLx2'CLX et CLX3 obtenues figurent dans le tableau IX.
<Desc/Clms Page number 21>
EMI21.1
TABLEAU IX
EMI21.2
<tb>
<tb> Agent <SEP> réducteur <SEP> Concen-Activité <SEP> (Unités)
<tb> tration
<tb> CBX1 <SEP> CBX2 <SEP> CBX <SEP> CBX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> - <SEP> 100,000 <SEP> 100,000 <SEP> 100,000 <SEP> Acide <SEP> thioglycolique <SEP> 10-6 <SEP> M <SEP> 0 <SEP> 26,000 <SEP> 240,000.
<SEP> 25.000
<tb> Acide <SEP> monothio
<tb> phosphorique <SEP> 10-5 <SEP> M <SEP> 0 <SEP> 27,000 <SEP> 260.000 <SEP> 11.000
<tb> Tri-n-butylphosphine <SEP> 10-6 <SEP> M <SEP> 0 <SEP> 23,000 <SEP> 230.000 <SEP> 32,000
<tb> Tris-diéthylamino-10-6 <SEP> M <SEP> 0 <SEP> 21,000 <SEP> 230.000 <SEP> 27,000
<tb> Sulfite <SEP> de
<tb> sodium <SEP> 10-7 <SEP> M <SEP> 0 <SEP> 25,000 <SEP> 220,000 <SEP> 29,000
<tb> Bromure <SEP> de <SEP> cyanogène <SEP> 10-7M <SEP> 0 <SEP> 24.000 <SEP> 240.000 <SEP> 28,000
<tb> Ions <SEP> argent <SEP> 10-6 <SEP> M <SEP> 0 <SEP> 23,000 <SEP> 240,000 <SEP> 25,000
<tb>
EMI21.3
EXEMPLE EXEI@LE 1 x 1011 cellules de cellules BALL-1 humaines (Miyoshi, Nature, Vol. 267, p.
843-844, 1977) qui avaient proliféré voie subcutanée dans des souris nues ont été mises en sion dans 20 1 de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et, après l'addition de 1 x 108 pfu (unités formatrices de plaques) du virus Sendai, cultivées à 370C en atmosphère constituée de 5 de C02 et de 95 % d'air, pendant 48 heures.
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
On a utilisé le surnageant de culture que l'on en a obtenu à titre de matière de départ. Ce surnageant de culture contenait un mélange de CLyj, Lyp, et CLX3. On a mis le traitement de en oeuvre sur ce surnageant de culture par l'addition de 10-6M de 2-mercaptoéthanol et de 0, 1 % de DSS à la température ambiante, pendant 1 heure. On a dialysé le mélange réactionnel et on a procédé à sa salification à l'aide de sulfate d'ammonium en vue d'obtenir une fraction que l'on a soumise à une filtration à travers gel en utilisant du Sephadex G-50 pour obtenir du CLX2'du et du CLX3. Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau X.
TABLEAU X
EMI22.2
<tb>
<tb> 9Traitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX1 <SEP> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 47. <SEP> 000 <SEP> 49. <SEP> 000 <SEP> 98. <SEP> 000 <SEP> 500
<tb> Après <SEP> traitement <SEP> 0 <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> 150. <SEP> 000 <SEP> 37. <SEP> 000
<tb>
EMI22.3
EXEMPLE On a répété le mode opératoire décrit à l'exemple IX, si ce n'est que l'on a utilisé 5 x de 2-mercaptoéthanol à titre d'agent réducteur et que l'on a utilisé chaque composé indiqué dans le tableau XI en une concentration donnée.
Les résultats obtenus également présentés dans le tableau XI.
<Desc/Clms Page number 23>
EMI23.1
TABLEAU XI
EMI23.2
<tb>
<tb> 10Agent <SEP> réduc-Activité <SEP> (Unités)
<tb> teur <SEP> Surfactif
<tb> (Concentration) <SEP> (Concentration)
<tb> CBX1 <SEP> CBX2 <SEP> CBX <SEP> CBX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 48.000 <SEP> 51.000 <SEP> 99,000 <SEP> 400
<tb> tcide <SEP> cholique. <SEP>
<tb>
(0,01%) <SEP> 0 <SEP> 2.000 <SEP> 154,000 <SEP> 36,000
<tb> Bromure <SEP> de <SEP> dodécyltriméthyllammonium <SEP> 0 <SEP> 1,000 <SEP> 149,000 <SEP> 39,000
<tb> 2-Mercapto- <SEP> (0,01%)
<tb> éthanol <SEP> Désoxylysolécithine <SEP> 0 <SEP> 3.000 <SEP> 160.000 <SEP> 31.000
<tb> (0,01%) <SEP>
<tb> (5 <SEP> x <SEP> 10-7 <SEP> M)
<tb> Tween <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 2.000 <SEP> 159.000 <SEP> 29.000
<tb> (0,01%) <SEP>
<tb> Span <SEP> 60 <SEP> 0 <SEP> 1.000 <SEP> 158.000 <SEP> 31.000
<tb>
EMI23.3
EXEMPLE 11 On a mis 5 x cellules de lymphocytes périphériques bovins en suspension dans 1. 000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et on les a soumises à culture à 370C dans une atmosphère constituée de 5 % de COp et de 95 % d'air, pendant 48 heures. On a utilisé le surnageant de la culture l'on en a obtenu à titre de matière de départ.
Ce geant de culture contenait un mélange de CLX1'CLX2'CLX et L)-A A CLX3. On a mis le traitement de dégradation en oeuvre sur ce AO surnageant de culture par l'addition de 10-3M de dithiothréitol à la température ambiante pendant 2 heures, puis on a mis en oeuvre des procédés similaires à ceux décrits à l'exemple 9,
<Desc/Clms Page number 24>
EMI24.1
en vue d'obtenir les CLx2'CLx et CLx3. Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau XII.
TABLEAU XII
EMI24.2
<tb>
<tb> 109Traitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX1 <SEP> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 13. <SEP> 000 <SEP> 12. <SEP> 000 <SEP> 23. <SEP> 000 <SEP> 200
<tb> Après <SEP> traitement <SEP> 0 <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> 32. <SEP> 000 <SEP> 11. <SEP> 000
<tb>
EMI24.3
EXEMPLE 10 On a mis 3 x cellules de fibroblastes humains Flow 7. 000 (Flow Co.) en suspension dans 6. 000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et, après addition de P1yrohémagglutinine pour obtenir une concentration finale de 500 g/ml, on les a soumises à culture à 370C dans une atmosphère constituée de 5 de C02 et de 95 % d'air pendant 48 heures. On a utilisé le surnageant de culture obtenu à titre de matière de départ. Ce surnageant de culture contenait un mélange de CLx1'CLx2'CLx et CLx3.
On a mis un traitement de dégradation en oeuvre sur ce surnageant de culture en présence de 0, 1 11 de borohydrure de sodium, à la température ambiante, pendant 2 heures, ce traitement étant suivi de la mise en oeuvre de procédés similaires à ceux décrits à l'exemple 9, en vue d'obtenir CLyp, Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau XIII.
TABLEAU XIII
EMI24.4
<tb>
<tb> 12Traitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX1 <SEP> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 16. <SEP> 000 <SEP> 1 <SEP> 8. <SEP> 000 <SEP> 35. <SEP> 000 <SEP> 600
<tb> Après <SEP> traitement <SEP> 0 <SEP> 1. <SEP> 700 <SEP> 52. <SEP> 000 <SEP> 17. <SEP> 000
<tb>
<Desc/Clms Page number 25>
EMI25.1
On a mis 2 x 10 de lymphocytes périphériques humains en suspension dans 4. 000 ml du milieu de Eagle contenant 10 5 de sérum de veau et, après addition de phytothémaglutinine pour obtenir une concentration finale de 50 g/ml, on les a soumises à culture à 370C dans une atmosphère constituée de 5 % de COp et de 95 % d'air, pendant 48 heures. On a utilisé le surnageant de culture que l'on a obtenu à titre de matière de départ.
Ce surnageant de culture contenait un mélange de CLx1'CLx2'CLX'CLx3. On a mis un traitement de dégradation en oeuvre sur ce surnageant de culture par l'addition de 5 x de dithioerythritol à la température ambiante pendant 1 heure, ce traitement étant suivi de la mise en oeuvre de procédés à ceux décrits à l'exemple 9, pour obtenir CLx2'CLx et CLX3'Les résultats sont présentés dans le tableau XIV.
TABLEAU XIV 1. 1
EMI25.2
<tb>
<tb> EXEl'lPLE <SEP> 13Traitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX1 <SEP> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> Avant <SEP> traitement <SEP> 23. <SEP> 000 <SEP> 25. <SEP> 000 <SEP> 51. <SEP> 000 <SEP> 800
<tb> Après <SEP> traitement <SEP> 0 <SEP> 2. <SEP> 000 <SEP> 83. <SEP> 000 <SEP> 13. <SEP> 000
<tb>
EMI25.3
.
EXEMPLE 14 10 On a mis 1 x cellules Ball-1 humaines que l'on avait fait préalablement proliférer par culture sur tissu, en suspension dans 2. 000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et on les a soumises à culture à 370C dans une atmosphère constituée de 5 % de COp et 95 % d'air, pendant 48 heures. On a utilisé le surnageant de culture l'on en a obtenu à titre de matière de départ. Le surnageant de culture en question contenait un mélange de CLX1'de et de CLX3. On a mis un traitement de dégradation en oeuvre
<Desc/Clms Page number 26>
EMI26.1
, sur ce surnageant de culture en présence de 5 x 10 de 2-mercaptoéthanol, à la température ambiante, soit pendant 2 heures, soit pendant 5 minutes, ce traitement étant suivi de la mise en oeuvre de procédés similaires à ceux décrits à l'exemple 9, afin d'obtenir des CLx2'CLX et CLy,.
Les résultats enregistrés sont présentés dans le tableau XV.
TABLEAU XV
EMI26.2
<tb>
<tb> 1010Traitement <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (unités)
<tb> dégradation
<tb> CLX1 <SEP> CLX2 <SEP> CLX <SEP> CLX3
<tb> . <SEP>
<tb>
Avant <SEP> traitement <SEP> 5. <SEP> 200 <SEP> 4. <SEP> 900 <SEP> 11. <SEP> 000 <SEP> 110
<tb> Après <SEP> traitement <SEP> 0 <SEP> 300 <SEP> 13. <SEP> 000 <SEP> 7. <SEP> 100
<tb> (2 <SEP> h)
<tb> Après <SEP> traitement <SEP> 3. <SEP> 600 <SEP> 5. <SEP> 400 <SEP> 12. <SEP> 000 <SEP> 120
<tb> (5 <SEP> mn)
<tb>
EMI26.3
Lorsque l'on a effectué le traitement de dégradation pendant 5 mn, on a pu obtenir des CLX2 et des CLX avec des rendements élevés, tandis que le traitement de dégradation effectué pendant 2 heures à engendré des CLX et des CLX3 avec des dements élevés.
EXEMPLE Purification de CLx2'CLX et CLx3.
Si on le souhaite, on peut davantage purifier les CLx2' CLX bruts obtenus par mise en oeuvre des procédés décrits dans les exemples précédents, de manière classique mise en oeuvre pour purifier des substances biologiques.
On a purifié les CLX2 et Clay, par exemple, par mise en oeuvre du procédé décrit à l'exemple 1 a) ci-dessus pour la préparation de matières de départ en utilisant du Sephadex conjugué à de l'agglutinine d'Urex europeus. On a obtenu des . de CLX2 et de CLX purifiées possédant des activités spécifiques de 2. 400 unités/mg et de 2. 500 unités/mg respectivement.
<Desc/Clms Page number 27>
EMI27.1
On a purifié la CLx3'par exemple, par adsorption sur de la séphalose conjuguée à de la concanavaline A, cette opération étant suivie d'une élution par un tampon au phosphate 0, 01 M (pH 7, 2) contenant 0, 5 M d'a-méthyl-D-mannoside. élimination de l'K-méthyl-D-mannoside par dialyse, on a appliqué la solution à de la carboxyméthylcellulose équilibrée à l'aide d'un tampon au phosphate 0, 05 M (pH 6, 0), cette tion étant suivie d'une élution à l'aide d'un tampon au phosphate 0, 05 M (pH 7, 8). Cette opération a engendré une préparation e purifiée possédant une activité spécifique de 2. 100 unités/mg.
Efficacité, toxicité, mode d'emploi et dosage des CL suivant la présente invention.
EXPERIENCE 1 Sélectivité de l'effet Cytotoxique.
Dans 1 ml de milieu de Eagle contenant 10 de sérum de veau et chaque substance testée, on a procédé à la culture, à 370C, pendant 48 heures et sous atmosphère constituée de 5 iso de C02 et de 95 % d'air, d'échantillons de 105 choisies parmi des cellules KB englobant de multiples lignées de cellules tumorales (cancer du nasopharynx), des cellules MX-1 (cancer mammaire), fournies par le Dr Shigeru Tsukagoshi, Institut du Cancer), des cellules HEp-2 (cancer de la gorge) et des cellules HEL (hépatome, Flow Co.) et de lignées de cellules normales comprenant des cellules d'intestin 407, des cellules de coeur de Girardi, des cellules de foie, Chang, des cellules Vero (rein de singe) et des cellules MDCK (rein de chien (Flow Co.),
cellules que l'on avait respectivement toutes soumises à une préculture de 24 heures et de cellules choisies parmi les cellules P388 et L1210 (leucémie, fournies par le Dr Shigeru Tsukagoshi, Institut du Cancer), qui furent utilisées immédiatement. On a ensuite compté le
<Desc/Clms Page number 28>
EMI28.1
de cellules viables non colorées par le bleu de Trypan sous un microscope à lumière et on a calculé la concentration de la substance testée pour laquelle 50 % des cellules furent tuées, en comparaison d'un témoin pris pour 100. A titre de substances testées, on a utilisé les CLx2'CLX'CLX3 obtenues à l'exemple 15, les a-, ss- par mise en oeuvre d'un procédé connu (Granger G. A. et coll., Cellular Immunology, Vol. 38, p. 388-402 (1978)) et de la Mitomycine C.
Une unité des lymphotoxines s'exprime par un indice classique se base sur la cytotoxicité sur des cellules de souris L (Eds., Bloom, B. R. et Grade, P. R.''In Methods in Cell-mediated Immunity", Press, 1979). Les résultats sont présentés dans le tableau 16.
<Desc/Clms Page number 29>
EMI29.1
TABLEAU-XVI r
<Desc/Clms Page number 30>
EMI30.1
Ainsi qu'il de toute évidence des résultats cidessus, CL endommage sélectivement les cellules tumorales, sensiblement sans provoquer aucun préjudice aux cellules nor- ren-males. Au contraire, tant les a-, ss- et y-Iymphotoxines que la mitomycine C ont manifesté une cytotoxicité non sélective vis-à-vis des cellules normales et des cellules tumorales.
EXPERIENCE 2 Influence sur des souris auxquelles on avait transplanté le
EMI30.2
Sarcome 180 ou la tumeur d'Ehrlich.
On a transplanté 3 x cellules du Sarcome 180 ou de la tumeur par animal à des souris mâles (souche ddY) pesant de 25 à 30 g, par la voie intrapéritonéale et on a observé la période de survie en jours. On a administré CLx, à l'exemple 13, par la voie intraveineuse à des groupes de 5 souris, l'administration étant
10quotidienne à partir d'un jour après la transplantation jus- qu'à la mort. Les résultats, exprimés en pourcentage de la moyenne des jours de survie des animaux des groupes testés par rapport à ceux d'un groupe témoin, sont présentés dans le tableau XVII.
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EMI31.1
TABLEAU
EMI31.2
<tb>
<tb> XVIIJours <SEP> de
<tb> Substance <SEP> Dose <SEP> quoti-survie
<tb> Tumeur <SEP> testée <SEP> dienne <SEP> moyens <SEP> (%)
<tb> 1,2 <SEP> ut/kg <SEP> 112
<tb> CBX
<tb> 4 <SEP> uts/kg <SEP> 132
<tb> 12 <SEP> uts/kg <SEP> 165
<tb> 1 <SEP> ut/kg <SEP> 114
<tb> CBX2 <SEP> 3 <SEP> uts/kg <SEP> 134
<tb> Sarcome <SEP> 10 <SEP> uts/kg <SEP> 160
<tb> l80
<tb> 1 <SEP> ut/kg <SEP> l09
<tb> CBX3 <SEP> 3 <SEP> uts/kg <SEP> 133
<tb> 10 <SEP> uts/kg <SEP> 154
<tb> Mitomycine <SEP> C <SEP> 0,5 <SEP> mg/kg <SEP> l41
<tb> Cyc1ophosphamide <SEP> 20 <SEP> mg/kg <SEP> 170
<tb> 1.
<SEP> 2 <SEP> ut/kg <SEP> 140
<tb> CBX <SEP> 4 <SEP> uts/kg <SEP> 160
<tb> 12 <SEP> uts/kg <SEP> 186
<tb> 1 <SEP> ut/kg <SEP> 136
<tb> Tumeur <SEP> CBX2 <SEP> 3 <SEP> uts/kg <SEP> 164
<tb> ascitique
<tb> d'Ehrlich <SEP> 10 <SEP> uts/kg <SEP> 187
<tb> 1 <SEP> ut/kg <SEP> 140
<tb> CBX3 <SEP> 3 <SEP> uts/kg <SEP> 155
<tb> 10 <SEP> uts/kg <SEP> 181
<tb> Mitomycine <SEP> C <SEP> 0,5 <SEP> mg/kg <SEP> 165
<tb> Cyclophosphamide <SEP> 20 <SEP> mg/kg <SEP> 205
<tb>
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EMI32.1
EXPERIENCE 3 Influence sur les jours de survie de souris porteuses du carcinome pulmonaire.
A des souris mâles de la souche BDF1'pesant 20 à 25 g, on a transplanté 2 x cellules de carcinome pulmonaire de Lewis, par la voie intramusculaire, dans la cuisse droite et on a observé les jours de survie. On a administré CLy, et CLX3'obtenues de la manière décrite à l'exemple 15, par la voie intraveineuse à des groupes de 6 souris, l'administration étant à partir du jour suivant la transplantation la mort. Les résultats, exprimés en pourcentages de la moyenne des jours de survie des animaux des groupes soumis à l'essai par rapport à ceux d'un groupe témoin sont rassemblés dans le tableau XVIII.
TABLEAU XVIII
EMI32.2
<tb>
<tb> 106Substance <SEP> Dose <SEP> Jours <SEP> de
<tb> survie
<tb> testée <SEP> journalière <SEP> moyens <SEP> (%)
<tb> 1, <SEP> 2 <SEP> ut/kg <SEP> 108
<tb> CBX <SEP> 4 <SEP> uts/kg <SEP> 114
<tb> 12 <SEP> uts/kg <SEP> 150
<tb> 1 <SEP> ut/kg <SEP> 107
<tb> CBX2 <SEP> 3 <SEP> uts/kg <SEP> 123
<tb> 10 <SEP> uts/kg <SEP> 145
<tb> 1 <SEP> ut/kg <SEP> 116
<tb> CBX3 <SEP> 3 <SEP> uts/kg <SEP> 140
<tb> 10 <SEP> uts/kg <SEP> 158
<tb> Mitomycine <SEP> C <SEP> 0,5 <SEP> mg/kg <SEP> 120
<tb> Cyclophosphamide <SEP> 20 <SEP> mg/kg <SEP> 162
<tb>
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EMI33.1
EXPERIENCE 4 Influence sur les métastases pulmonaires du cancer.
On a transplanté un fragment carré à cotés 2 mm de cancer pulmonaire de Levais dans les dos d'animaux de groupes de souris mâles de la souche BDF1 pesant 20 à 30 g chacune, les groupes étant constitués de 6 animaux chacun. On a administré CLX'CLX2 et CLX3'obtenues à l'exemple 15, par la voie intraveineuse, une fois par jour, pendant 12 jours à partir du 9ème jour après la transplantation. Le 21ème jour après la transplantation, on a isolé et pesé la masse de la tumeur primaire et on a calculé le nombre de de métastase dans les poumons des animaux, selon le procédé de Wexler, H. (J. Natl. Cancer Institute, Vol. 36, 641, 1966).
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau XIX.
TABLEAU XIX
EMI33.2
<tb>
<tb> deSubstance <SEP> Dose <SEP> Poids <SEP> de <SEP> la <SEP> Nombre <SEP> ce <SEP> nodules
<tb> testée <SEP> journalière <SEP> tumeur <SEP> (g) <SEP> de <SEP> métastase <SEP> dans
<tb> les <SEP> poumons
<tb> Control <SEP> 8,8 <SEP> # <SEP> 0,8 <SEP> 30,1 <SEP> # <SEP> 5,6 <SEP>
<tb> CBx <SEP> 3 <SEP> utsjkg <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 4* <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> # <SEP> 2, <SEP> 9*
<tb> 1 <SEP> 30 <SEP> uts/kg <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> # <SEP> 0, <SEP> 5** <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 0, <SEP> 3**
<tb> CBX2 <SEP> 3 <SEP> uts/kg <SEP> 4,5 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 5* <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP> # <SEP> 2,1*
<tb> 30 <SEP> uts/kg <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> # <SEP> 0, <SEP> 4** <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> # <SEP> 0, <SEP> 4**
<tb> CBX3 <SEP> 3 <SEP> uts/kg <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> # <SEP> 1, <SEP> 3* <SEP> 7,0 <SEP> # <SEP> 2,
<SEP> 8*
<tb> 30 <SEP> uts/kg <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> i <SEP> 0, <SEP> 3** <SEP> 0') <SEP> 6 <SEP> # <SEP> 0, <SEP> 3**
<tb> Cyclophosphaminde <SEP> 20 <SEP> uts/kg <SEP> 3,6 <SEP> # <SEP> 0,7** <SEP> 0,7 <SEP> # <SEP> 0 <SEP> 4**
<tb>
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EMI34.1
Notes) Les résultats qui figurent dans les tableaux sont exprimés sous forme de moyenne erreur standard.
* Doméesstatistiquement différentes du groupe témoin à un niveau de signification de p < 5 %.
** Données statistiquement différentes du groupe témoin à un niveau de signification de p < 1 %.
Ainsi que les résultats susmentionnés le montrent clairement, CLX'CLX2 et CLX3 ont supprimé avec succès le cancer pulmonaire primaire et ses métastases pulmonaires.
EXPERIENCE 5 Essai de toxicité (administration unique).
On a administré par la voie intraveineuse respectivement 10. 000 unités/kg de Cl'10. 000 unités/kg de CL ou 100. 000 A A < l unités/kg de CLX3 aux animaux de 3 groupes de souris mâles de la souche BDF1'pesant chacune 20 à 25 g, les groupes étant formés de 10 animaux chacun et on a observé les animaux pendant 7 jours. Les 10 animaux des groupes respectifs survécurent sans manifester de quelconque modification du poids corporel et de l'état général, malgré l'administration respective de ses fortes unités de glycoprotéines.
EXPERIENCE 6 Essai de toxicité (administration continue pendant 30 jours).
On a administré CLX'CLX2 ou CLX3 pendant 30 jours à des souris mâles de la souche BDF1'pesant chacune 20 à 25 g, chaque groupe comportant 10 animaux et on a observé le nombre d'animaux morts, la modification du poids corporel et l'état général. On a pris le poids corporel entre 9 et 10 heures avant midi et on a procédé à l'observation de l'état général le 10ème, le 20ème et le 30ème jours, selon le procédé de Arvien (Science, Vol. 36, p. 123 (1962)). Il s'ensuivit que l'on n'a pas observé d'animal mort au cours de ces 30 jours, lorsque l'on a administré 1. 000 unités/kg/jour de CLX ou de
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Cl2 10. 000 unités/kg/jour de CLx3 et la courbe de gain pondéral était approximativement la même que celle des animaux du groupe témoin.
Au surplus, on a constaté que les états généraux étaient normaux comme dans le cas de ceux des animaux du groupe témoin.
Ainsi qu'il ressort des expériences décrites ci-dessus, CLX'CLX2 et CLX3 suppriment sélectivement la croissance de cellules tumuroles et, au surplus, elles suppriment non seulement remarquablement les métastases cancéreuses, mais sont également extrêmement efficaces contre diverses tumeurs et sont toujours d'un emploi très sûr, même aux doses supérieures à la dose à laquelle l'effet pharmaceutique se manifeste de toute évidence. Par conséquent, CLy, et CLx3 sont extrêmement utiles pour le traitement thérapeutique de diverses tumeurs, comme le cancer d'estomac, le cancer pulmonaire, l'hépatome, le cancer du colon, le cancer mammaire, le cancer utérin, la leucémie, etc.
Au surplus, des formes à poids moléculaire relativement faible de CL (CLX'CLx2'CLx3) peuvent être dérivées de formes à poids moléculaires relativement élevés de CL (CLX'CLX1'CLX2) par traitement par un agent réducteur, sans pour autant porter préjudice à leur efficacité de traitement des tumeurs.