BE898329A

BE898329A - Pepsine immobilisee et son procede d'emploi pour l'elimination d'immunocomplexes du sang.

Info

Publication number: BE898329A
Application number: BE0/211947A
Authority: BE
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1982-05-31
Filing date: 1983-11-29
Publication date: 1984-05-29
Also published as: SE459556B; GB8332856D0; WO1983004180A1; NL8220181A; GB2131028A; GB2131028B; EP0110995B1; EP0110995A1; CH664496A5; SE8306424L; CA1222452A; US4608253A; DE3249491T1; EP0110995A4; SE8306424D0

Abstract

La présente invention concerne une pepsine immobilisée à utiliser pour l'élimination d'immunocomplexes, qui se caractérise par une pepsine fixée sur un support approprié. L'invention concerne aussi un procédé d'élimination d'immunocomplexes, caractérisé en ce que l'on met le sang ou le plasma d'un patient souffrant d'une maladie à immunocomplexes, comme la polyarthrite chronique évolutive et le lupus érythémateux systémique, en contact avec la pepsine immobilisée.

Description


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 ayant pour objet : Pepsine immobilisée et son procédé   d'   emploi pour l'élimination d'immuno- complexes du sang Qualification proposée : BREVET D'INVENTION Il est signalé à toutes fins utiles qu'une demande de brevet PCT correspondante a été déposée le 31 mai 1982 sous le   nO PCT/JP   82/00212 

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La présente invention est relative à une pepsine immobilisée que l'on peut utiliser pour l'élimination d'immunocomplexes du sang, ainsi qu'un procédé pour l'élimination d'immunocomplexes du sang par l'emploi de la pepsine immobilisée en question. 



   Des troubles auto-immunitaires ou des maladies à immunocomplexes, typiquement représentées par la polyarthrite chronique évolutive, le lupus érythémateux systémique (LES) et le lupus néphrétique, sont, ainsi que leurs appellations l'impliquent, des troubles provoqués par un complexe de divers antigènes et anticorps,   c'est-à-dire   un immunocomplexe. Les mécanismes des maladies à immunocomplexes sont si compliqués quede nombreux points en demandent toujours clarification ; cependant, on considère que ces maladies se déroulent, dans leur ensemble, de la manière suivante. 



   Lorsque des tissus sont endommagés par une infection bactérienne ou virale, des anticorps sont produits contre les cellules viralement infectées ou les auto-antigènes nouvellement formés et les anticorps réagissent sur les antigènes correspondants pour engendrer des immunocomplexes. 



  Etant donné que ces immunocomplexes activent les plaquettes et le système complémentaire, des substances vasoactives, telles que l'histamine et la sérotonine, sont libérées et la perméabilité des vaisseaux sanguins s'en trouve augmentée. Ensuite, les immunocomplexes en circulation pénètrent dans les parois des vaisseaux dont la perméabilité a été augmentée et se déposent le long de la membrane de base. 



  Des leucocytes polymorphonucléaires se rassemblent à l'endroit du   dépôt   des immunocomplexes, en raison de l'existence 

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 des facteurs chimiotactiques leucocytaires qui ont été formés par la réaction du complément sur les immunocomplexes déposés. Les leucocytes   polymorphonucléaires,   réagissant sur les immunocomplexes, libèrent diverses substances qui endommagent les tissus, comme les cathepsines D et E, la collagénase, l'élastase et des facteurs de perméabilité et ces substances portent éventuellement des préjudices aux tissus. Chez les patients souffrant de maladies à immunocomplexes, comme le LES, les taux sériques en complément sont généralement faibles et l'aggravation de l'état maladif est étroitement en corrélation avec la diminution des taux en complément.

   On pense que cette diminution est due à une abondante consommation du complément à l'endroit de la réaction entre les antigènes et les anticorps qui se produit, comme dans les reins et les vaisseaux sanguins. 



  Au surplus, les immunocomplexes sont également en relation 
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 avec les systèmes de coagulation sanguine et l'on suppose que les immunocomplexes entraînent de sérieux    l'apparitionsymptômes   par divers mécanismes, par exemple par l'accélération du   dépôt   de   fibrinoldes   sur les tissus endommagés. 



   Pour le traitement de ces maladies à immunocomplexes, il est courant de faire appel à la physiothérapie et à une thérapie de remplacement du plasma, outre le traitement médical par des   stéroïdes,   des agents immunosuppresseurs, des agents anti-inflammatoires ou antiphlogistiques, etc. 



  Plus particulièrement, la thérapie par remplacement du plasma constitue l'une des méthodes de traitement les plus fiables pour éliminer les immunocomplexes, des facteurspathogène mais les avantages de cette méthode ne sont pas suffisamment exploités en raison de la difficulté de fournir le lot de plasma nécessaire à utiliser pour le remplacement du plasma. 



   La demanderesse a fait procéder à des recherches nombreuses et poussées, afin de mettre au point un procédé de 

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 taitement qui est de la même efficacité que la thérapie par remplacement du plasma, sans cependant exiger le remplacement de ce plasma. A la suite de ces recherches, on a découvert à présent que la pepsine et une enzyme analogue à la pepsine, contenue dans les leucocytes, décomposait spécifiquement les immunocomplexes dans la région des pH neutres sans pour autant affecter les protéines normales du plasma. La présente invention est fondée sur cette découverte et concerne, par conséquent, un agent de traitement des maladies à immunocomplexes, qui contient cette enzyme à titre d'ingrédient effectif, tel que décrit dans la demande de brevet japonais   NO 18   429/1981 (PCT/JP82/00037). 



  La présente invention constitue un perfectionnement de l'invention décrite dans cette demande de brevet précédente et concerne un procédé d'élimination des immunocomplexes sans pour autant endommager les fonctions inhérentes des protéines du plasma. Ce procédé se caractérise en ce que l'on traite le plasma d'un patient souffrant d'une maladie à immunocomplexes par de la pepsine immobilisée. L'invention a également pour objet la pepsine immobilisée à utiliser pour la mise en oeuvre de ce procédé. 



   Etant donné que l'objectif principal de la thérapie par remplacement du plasma réside dans l'élimination de substances pathogènes non dialysables du plasma d'un patient, plus particulièrement les immunocomplexes, le traitement du plasma d'un patient par la pepsine immobilisée susmentionnée peut avoir la même efficacité que le remplacement du plasma, sans qu'il soit pour autant nécessaire de recourir à un tel remplacement. Par exemple, en soumettant le plasma d'un patient souffrant d'une maladie à immunocomplexes à une circulation extracorporelle, en faisant passer le plasma à travers une colonne garnie de la pepsine immobilisée susmentionnée, seuls les immunocomplexes sont éliminés du plasma, sans pour autant que d'autres protéines 

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 du plasma soient affectées.

   Au surplus, étant donné que le procédé suivant l'invention n'exige pas l'emploi d'un plasma de substitution (provenant du patient ou d'une autre personne), l'apparition d'effets secondaires, comme une hépatite sérique ou une réaction nuisible due à l'incompatibilité sanguine peut être laissée hors de considération. 



   La pepsine utilisée aux fins de la présente invention constitue une enzyme connue (Journal of Clinical Investigations, Vol. 27, p. 818,1948) ; la pepsine immobilisée conforme à la présente invention peut être obtenue en purifiant le pepsinogène contenu dans l'estomac, le sang, l'urine,   etc.,   de divers animaux, par mise en oeuvre d'un procédé approprié et fixation du pepsinogène purifié sur un véhicule convenable, cette opération étant suivie de l'activation du pepsinogène immobilisé par un traitement à l'acide.

   A titre de pepsine mise en oeuvre pour la préparation de la pepsine immobilisée suivant la présente invention, on utilise, de préférence, une pepsine qui provient d'êtres humains, parce qu'elle est la plus sûre et la plus efficace, mais on peut également se servir d'une pepsine provenant d'êtres vivants autres que les humains. 



  Comme support à utiliser pour l'immobilisation, il est préférable d'utiliser des supports qui possèdent une très faible aptitude d'adsorption des protéines, comme le Sepharose) (un adsorbant bien connu, fabriqué par la société Pharmacia Fine Chemicals   Co.),   l'agarose, les perles de verre, etc. Il est même plus avantageux encore d'utiliser une pepsine immobilisée sur la surface interne de la membrane filtrante d'un dialyseur artificiel, ou bien encore, on utilise également un tube, tel qu'un tube de nylon, à titre de support auquel on peut directement fixer la pepsine. 



  On peut utiliser des techniques bien connues pour procéder à l'immobilisation. On peut également utiliser une enzyme immobilisée comprenant une enzyme analogue à la pepsine, 

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 fixée sur un support convenable, où l'enzyme analogue à la pepsine purifiée s'obtient en faisant passer un liquide surnageant de leucocytes homogénéisés d'un mammifère à tra- vers une colonne de DEAE-cellulose, équilibrée avec un tam- pon à l'acétate 0,1 M (pH :

   5, 3), de façon à provoquer l'adsorbption de l'enzyme analogue à la pepsine sur la colonne, en éluant l'enzyme avec le même tampon contenant du chlorure de sodium 0, 5 M et en   soumettant l'éluat   à une chromatographie en gel de Séphadex   G-iod   (un adsorbant bien connu, fabriqué par la société Pharmacia Fine Chemicals Co. ), gonflé dans une solution saline physiologique à   0, 9 %0   
Par exemple, conformément au procédé de Sijffers et coll.

   (American Journal of Physiology, Vol. 206, p. 1106, 1964), on peut préparer l'enzyme immobilisée en faisant passer de l'urine humaine à travers une colonne de DEAE- cellulose équilibrée par un tampon à l'acétate   0, 1   M (pH : 5, 3) de façon à provoquer l'adsorption du pepsinogène sur la colonne, en procédant ensuite à l'élution du pepsinogène avec le même tampon contenant du chlorure de sodium 0,3 M, en concentrant l'éluat, en poursuivant la purification du concentré par l'intermédiaire d'une chromatographie en gel 
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 utilisant du Séphadex G-100, gonflé dans une solution saline physiologique à 0, et en couplant le produit purifié'du Sépharos purifié l'emploi de bromure de cyano- 
9 %gène, afin d'obtenir le pepsinogène immobilisé, cette opération étant suivie de l'activation du pepsinogène dans des conditions acides. 



   Lors de la mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, il est commode d'utiliser ce que l'on appelle une circulation extra-corporelle, conformément à laquelle le sang provenant d'un patient souffrant d'une maladie à immunocomplexes est guidé vers un circuit extracorporel et on traite le sang entier par la pepsine immobilisée susmentionnée, ou bien on ne traite que le plasma 

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 séparé du sang par mise en oeuvre d'un séparateur de plasma, par la pepsine immobilisée susmentionnée et on le recombine ensuite aux cellules qui composent le sang séparées, le sang ainsi traité étant ramené dans le corps. 



  On réalise de préférence le traitement par la pepsine immobilisée soit par perfusion du plasma séparé par mise en oeuvre d'un séparateur de plasma, à travers une colonne garnie de pepsine qui a été fixée sur des particules de Sépharose ou analogues ou par perfusion du sang ou du plasma à travers un tube creux qui porte une pepsine immobilisée sur sa surface interne ; cependant, le traitement n'est pas limité à ces modes de mise en oeuvre. 



   Pour la circulation extra-corporelle du sang, il est commode de se servir d'un appareil composé d'une pompe destinée à prélever le sang, d'un séparateur de plasma destiné à la séparation du plasma des cellules sanguines et d'un appareil de réglage pour la commande de ces dispositifs. 



  A titre d'appareil de ce genre, on peut utiliser un appareil d'assistance hépatique artificielle d'un type à perfusion de plasma séparé (Noboru Inoue : Chiryogaku (Therapeutics), Vol. 5, p. 477, 1980). Conformément à cette méthode, on utilise généralement, de manière appropriée, de 1 à 100 mg, de préférence de 5 à 50 mg, de la pepsine immobilisée par 100 ml de sang, mais la quantité de la pepsine immobilisée peut varier adéquatement en fonction de la proportion d'immunocomplexes. La présente invention sera à présent expliquée plus en détail en se référant aux exemples non limitatifs qui suivent. 



  EXEMPLE 1   On a ajouté de l'eau distillée à 150 ml de Sépharose 4Er (un adsorbant bien connu, fabriqué par la société   Pharmacia Fine Chemicals Co.) jusqu'à constituer un volume de mélange de 300 ml et on a ajusté le pH du mélange ainsi 

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 obtenu à   11, 0   à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium 6N. Au mélange, on a ensuite ajouté 300 ml de bromure de cyanogène à 2,5 % et on a maintenu le pH du mélange entre 11,0 et 11,5 pendant 30 minutes, cependant que l'on maintenait la température à   16oC.   On a lavé le Sépharose avec de l'eau distillée et avec une solution de bicarbonate de sodium 0,1 M, que l'on avait toutes deux préalablement refroidies jusqu'à 50C pour éliminer le bromure de cyanogène.

   On a ensuite mis le Sépharose en suspension dans 300 ml de la même solution. A 300 ml de la suspension ainsi obtenue, on a ajouté 100 mg de pepsinogène d'urine humaine et on a fait réagir le mélange sous agitation modérée à 50C pendant 16 heures afin de préparer le pepsinogène immobilisé. On a ensuite activé le pepsinogène immobilisé à un pH de 2,0 pendant 10 minutes pour le convertir en pepsine immobilisée (pepsine 1 mg/ml de résine), dont on a introduit 100 ml dans une colonne de verre (4 x 8 cm). 



   On a fait passer du plasma héparinisé (100 ml) provenant de patients souffrant de polyarthrite chronique évolutive et de patients souffrant de Lupus érythémateux systémique, dont on avait prouvé que le sang était porteur d'immunocomplexes, à travers la colonne contenant la pepsine immobilisée, préalablement chauffée jusqu'à une température de 370C, au débit de 30 ml par heure. En prenant des aggrégats d'IgG humaine comme substance standard, on a déterminé les quantités d'immunocomplexes dans le plasma avant et après le traitement par une réaction hémolytique d'érythrocytes de mouton en se servant de compléments de cobaye, conformément à la méthode de Fust et coll.

   (Atherosclerosis, Vol.   29,   p. 181, 1978) ; d'autre part, les quantités d'albumine et de gamma-globuline dans le plasma avant et après le traitement ont été déterminées par électrophorèse en utilisant une membrane d'acétate de cellulose 

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   (Ikagaku-jiken   Koza (Lectures on Experiments in Médical Chemistry), Vol. 5, p.   201,   1973). Les tableaux 1 et 2 présentent les résultats respectifs obtenus. 



   Après le passage du plasma à travers la colonne de pepsine immobilisée, le taux d'immunocomplexes dans le plasma diminua dans le cas des deux maladies, tandis que celui des protéines du plsma ne subit aucune modification. 

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  Tableau 1 
 EMI10.1 
 
<tb> 
<tb> No. <SEP> de <SEP> Taux <SEP> d'immuno-complexes
<tb> Maladie <SEP> plasma <SEP> (  <SEP> g/ml)
<tb> Avant <SEP> Après
<tb> traitement <SEP> traitement
<tb> Polyarthrite <SEP> 1 <SEP> 184 <SEP> 63
<tb> chronique <SEP> 2 <SEP> 125 <SEP> < <SEP> 50
<tb> évolutive <SEP> 3 <SEP> 134 <SEP> < <SEP> 50
<tb> Lupus <SEP> 1 <SEP> 403 <SEP> 123
<tb> érythémateux <SEP> 2 <SEP> 253 <SEP> 71
<tb> systémique <SEP> 3 <SEP> 196 <SEP> < <SEP> 50
<tb> Tableau <SEP> 2
<tb> No. <SEP> Albumine <SEP> &gamma;

  -Globuline <SEP> 
<tb> de <SEP> (g/dl) <SEP> (g/dl)
<tb> Maladie <SEP> plasma <SEP> 
<tb> Avant <SEP> Après <SEP> Avant <SEP> Après
<tb> traitement <SEP> traitement <SEP> traitement <SEP> traitement
<tb> Polyarthrite <SEP> 1 <SEP> 4,3 <SEP> 4,3 <SEP> 0,8 <SEP> 0,8
<tb> chronique <SEP> 2 <SEP> 4,9 <SEP> 4,9 <SEP> 1,0 <SEP> 1,0
<tb> évolutive <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 5,0 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 2
<tb> Lupus <SEP> 1 <SEP> 4,8 <SEP> 4,8 <SEP> 1,3 <SEP> 1,3
<tb> érythémateux <SEP> 2 <SEP> 5,0 <SEP> 5,0 <SEP> 1,3 <SEP> 1,3
<tb> systémique <SEP> 3 <SEP> 5) <SEP> 1 <SEP> 5, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> 
 

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 EXEMPLE 2
Dans 100 ml d'eau, on a mis en suspension 500 mg de perles de verre aminopropylé et on a ajusté le pH de la suspension à 10 à l'aide d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 5 N.

   A la suspension, on a ajouté 15 ml d'une solution de tétrahydrofurane contenant 1,5 g de bromure de cyanogène et on a maintenu le mélange à un pH de 10 en l'espace de 10 minutes, tout en ajoutant une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 5 N à des intervalles appropriés. On a recueilli les perles de verre par filtration et on les a lavées avec une solution de bicarbonate de sodium 0,1 M. On a mis les perles de verre ainsi traitées en suspension dans un solvant mixte constitué de 25 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1 M et de 25 ml de méthanol, lequel solvant mixte contenait 3 moles de chlorhydrate de 11-aminoundécanoate de méthyle et on a laissé réagir la suspension jusqu'au lendemain à 40C, tout en maintenant le pH à 9.

   On a recueilli les perles de verre par filtration, on les a lavées à l'eau et au méthanol et on les a mises en suspension dans 20 ml de méthanol absolu. 



  On a ajouté 1 ml d'hydrazine hydratée à la suspension et on a agité le mélange pendant 3 heures. On a lavé les perles de verre à l'aide de méthanol, d'acide chlorhydrique 0,1 N et d'eau, dans l'ordre indiqué. Ensuite, on a mis les perles en suspension dans 20 ml d'acide chlorhydrique 1 N. 



  On a ajouté 280 mg de nitrite de sodium à la suspension et on a fait réagir le mélange sous agitation à   OOC   pendant 20 minutes. Après l'achèvement de la réaction, on a lavé les perles de verre avec une petite quantité d'eau, on les a mises en suspension dans 20 ml d'une solution aqueuse 0,1 M de bicarbonate de sodium (pH 8). On a ajouté du pepsinogène porcin (50 mg). et on l'a dissous dans la suspension, puis on a laissé réagir le mélange à   4 C   sous agitation jusqu'au lendemain. On a activé le pepsinogène 

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 immobilisé ainsi obtenu à un pH de 2 par chauffage pendant 10 minutes, de façon à le convertir en pepsine immobilisée que l'on a mise en suspension dans 10 ml d'une solution saline physiologique 0,15 M et on a introduit la suspension dans une colonne de verre (1 x 8 cm).

   On a fait passer du plasma héparinisé (10 ml) contenant des immunocomplexes (provenant de patients souffrant de polyarthrite chronique évolutive et de lupus érythémateux systémique respectivement) à travers la colonne susmentionnée, au débit de 3 ml par heure. On a déterminé le taux en immunocomplexes du plasma et on a examiné les caractéristiques des autres protéines du plasma avant et après le traitement, de la même manière que celle décrite à l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 3 et 4 respectifs. 



   Après le passage du plasma à travers la colonne de pepsine immobilisée, le taux d'immunocomplexes dans le plasma diminua dans le cas des deux maladies, cependant que les protéines normales du plasma ne subirent aucun changement. 
 EMI12.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Tableau <SEP> 3
<tb> No. <SEP> de <SEP> Taux <SEP> d'immunocomplexes
<tb> Maladie <SEP> plasma <SEP> (g/ml) <SEP> 
<tb> Avant <SEP> Après
<tb> traitement <SEP> traitement
<tb> Polyarthrite <SEP> 1 <SEP> 193 <SEP> 58
<tb> chronique <SEP> 2 <SEP> 167 <SEP> 65
<tb> évolutive <SEP> 3 <SEP> 143 <SEP> 50 <SEP> 
<tb> Lupus <SEP> 1 <SEP> 353 <SEP> 134
<tb> érythémateux <SEP> 2 <SEP> 296 <SEP> 88
<tb> systémique <SEP> 3 <SEP> 199... <SEP> G. <SEP> 50
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 13> 

 
 EMI13.1 
 
<tb> 
<tb> Tableau <SEP> 4
<tb> No.

   <SEP> Albumine <SEP> Y-Globuline <SEP> 
<tb> de <SEP> (g/dl) <SEP> (g/dl)
<tb> Maladie <SEP> plasma
<tb> Avant <SEP> Après <SEP> Avant <SEP> Après
<tb> traitement <SEP> traitement <SEP> traitement <SEP> traitement
<tb> Polyarthrite <SEP> 1 <SEP> 4,8 <SEP> 4, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 
<tb> chronique <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> JO <SEP> 
<tb> évolutive <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> Lupus <SEP> 1 <SEP> 4, <SEP> 8 <SEP> 4, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> érythémateux <SEP> 2 <SEP> 51 <SEP> 5, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> systémique <SEP> 3 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 1. <SEP> 2 <SEP> 
<tb> 
 EXEMPLE 3
On a plongé un tube de nylon d'une longueur de 15 cm (diamètre interne :

   3 mm) dans un bain-maire dont la température était réglée à 35"C. Ensuite, on a rempli l'espace intérieur du tube d'acide chlorhydrique 4,5 N et on a soumis le tube à réaction pendant 15 minutes. On a lavé l'intérieur du tube avec de l'eau distillée et avec une solution de bicarbonate de sodium 0,2 M (pH : 9,4). On a ensuite rempli l'espace intérieur du tube d'une solution à 5 % de glutaraldéhyde dissoute dans la solution susmentionnée et on a laissé réagir le tube pendant 20 minutes. 



  On a alors lavé la surface interne du tube de manière suffisante avec un tampon au phosphate 0,05 M (ph : 8,0) et on 

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 a fait circuler 5 mg d'uropepsinogène de rat en solution dans le tampon au phosphate à travers le tube en vue de la réaction au débit de 0,2   ml/min.   pendant 2 heures, de manière à fixer le pepsinogène sur la surface interne du tube. On a ensuite activé la surface interne du tube par traitement à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique d'un pH de 2 pendant 8 minutes, afin de convertir le pepsi-   nogène   en pepsine immobilisée. 



   Conformément au procédé de Suzuki et coll. (Folia Pharmacologica Japonica, Vol. 68, p. 572 (1972)), on a injecté du sérum de rein de lapin antirat, par la voie intraveineuse, à la dose de 5 mg/kg, dans des rats mâles de la souche Wistar, en groupes constitués chacun de 6 rats, afin d'induire une néphrite. 21 jours après l'induction de la néphrite, on a introduit 2 aiguilles pour injection qui avaient été traitées par de l'héparine et on les a fixées dans la veine jugulaire de chaque rat pour former un circuit extra-corporel en raccordant les deux aiguilles pour injection au tube susmentionné et on a entrepris la circulation au débit de 2 ml par heure pendant 4 heures. A titre de témoin, on a utilisé de la même manière un tube ne comportant pas de pepsine immobilisée. 



  On a déterminé les taux d'immunocomplexes dans le sang après la circulation extra-corporelle, de la même manière que celle décrite à propos de l'exemple 1. Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau 5. 



   Le taux en   immunocomplxes   du sang diminua de manière remarquable par la circulation du sang à travers le tube à la surface interne duquel de la pepsine immobilisée était fixée. 

 <Desc/Clms Page number 15> 

   l P < : 0, 05    EXEMPLE 4
On a monté un séparateur de plasma du type à filtration avec des fils creux d'acétate de cellulose dans la veine cubitale de chacun de 5 chiens adultes anesthésiés au pentobarbital (poids corporel : 10-15 kg). On a raccordé la colonne de pepsine immobilisée, préparée à l'exemple
1, à un circuit de perfusion héparinisé pour plasma et on a introduit le plasma dans le circuit à un débit réglé de 30 ml par heure, à l'aide d'une pompe à débit réglable (pompe Perista Ato).

   On a mutuellement réuni le plasma qui avait passé à travers la colonne de pepsine immobilisée et les cellules constituantes du sang qui avaient été séparées et on a ramené le tout dans le corps par un circuit de circulation extra-corporelle formé avec la veine cubitale de l'autre côté. Par la voie intraveineuse, on a injecté 40 mg/kg d'immunocomplexes solubles (préparés à un rapport d'IgG humaine : anticorps d'IgG de lapin antihumaine = 4 : 1) dans la veine fémorale par l'intermédiaire d'une seringue pour perfusion continue (du type Truth   A-II)   en l'espace de
3 heures.

   Comme témoin, on a utilisé de la même manière 
 EMI15.1 
 
<tb> 
<tb> Tableau <SEP> 5
<tb> Taux <SEP> d'immunocomplexes
<tb> (Pg/ml)
<tb> Groupe <SEP> témoin. <SEP> 283 <SEP> + <SEP> 29
<tb> Groupe <SEP> avec <SEP> pepsine <SEP> immobilisée <SEP> 195 <SEP> + <SEP> il* <SEP> 
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 une colonne de Sepharose exempte de pepsine immobilisée. 



  3 heures après l'amorce de la circulation extra-corporelle, on a déterminé le taux en immunocomplexes du plasma de la même manière que celle décrite à l'exemple 1. Le tableau 6 présente les résultats obtenus. 



   Après le passage du plasma à travers la colonne de pepsine immobilisée, le taux en immunocomplexes du plasma diminua de manière remarquable. 
 EMI16.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Tableau <SEP> 6
<tb> Taux <SEP> d'immunocomplexes
<tb> (pg/ml)
<tb> Groupe <SEP> témoin <SEP> 343 <SEP> + <SEP> 27
<tb> Groupe <SEP> avec <SEP> pepsine <SEP> immobilisée <SEP> 105 <SEP> ¯ <SEP> 11**
<tb> 
   ** p < 0, 01    EXEMPLE 5
On a fixé 100 mg de pepsinogène gastrique humain sur la surface interne d'une membrane filtrante d'un dialyseur artificiel du type à fibres creuses (Dow-4 Cordis) avec emploi de bromure de cyanogène et on l'a ensuite activé avec de l'acide chlorhydrique d'un pH de 2,0 pendant 10 minutes, afin de le convertir en pepsine immobilisée. 



  On a fait circuler 200 ml (5 cas) de sang héparinisé contenant des immunocomplexes à travers le dialyseur artificiel, au débit de 10 ml par minute. A titre de témoin, on a utilisé de la même manière, un dialyseur artificiel ne 

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 comportant pas de pepsine immobilisée. Après 2 heures de circulation, on a séparé le plasma et on a déterminé le taux en immunocomplexes par mise en oeuvre du procédé décrit à l'exemple 1. Le tableau 7 rassemble les résultats obtenus. 



   Après la circulation du sang à travers la pepsine immobilisée, le taux en immunocomplexes du sang avait notablement diminué.. 
 EMI17.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Tableau <SEP> 7
<tb> Taux <SEP> d'immunocomplexes
<tb> (pg/ml)
<tb> Groupe <SEP> témoin <SEP> 203 <SEP> + <SEP> 19
<tb> Groupe <SEP> avec <SEP> pepsine <SEP> immobilisée <SEP> 128 <SEP> ¯ <SEP> 17*
<tb> 
   *p < 0 J 05    
Comme on l'a décrit dans les exemples précédents, la pepsine immobilisée suivant la présente invention diminue la quantité d'immunocomplxes dans le sang, sans pour autant affecter de quelque façon que ce soit, les protéines normales du plasma.

   Par conséquent, les immunocomplexes dans le sang d'un patient souffrant d'une maladie à   immuno-   complexes peuvent être éliminés sans porter aucun dommage aux fonctions physiologiques du sang, en traitant le sang ou le plasma du patient par la pepsine immobilisée, cette opération étant suivie du retour du sang ou du plasma ainsi traité par perfusion dans le corps du patient. Cette caractéristique est extrêmement importante parce qu'elle signifie que l'utilisation de la pepsine immobilisée et 

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 du procédé d'élimination des immunocomplexes peut produire le même résultat que celui obtenu par une thérapie de remplacement du plasma, sans qu'il soit en aucune façon nécessaire de recourir au remplacement du plasma en question.

Claims

REVENDICATIONS 1. Pepsine immobilisée à utiliser pour l'élimination d'immunocomplexes du sang, caractérisée en ce qu'elle est constituée par de la pepsine fixée sur un support.
2. Pepsine immobilisée suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la pepsine provient d'urine humaine.
3. Procédé d'élimination d'immunocomplexes, caractérisé en ce que l'on amène un sang ou un plasma contenant des immunocomplexes en contact avec de la pepsine immobilisée.
4. Procédé d'élimination d'immunocomplexes suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la pepsine provient d'urine humaine.
5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que l'on utilise la pepsine immobilisée après introduction dans une colonne.
6. Procédé pour l'élimination d'immunocomplexes suivant l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que l'on utilise la pepsine à l'état immobilisé sur un tube.
7. Procédé pour l'élimination d'immunocomplexes suivant l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que l'on utilise la pepsine à l'état immobilisé sur une membrane filtrante d'un dialyseur artificiel.
8. Matériau à utiliser pour l'élimination d'immunocomplexes du sang, caractérisé en ce qu'il est constitué par un support pharmaceutiquement acceptable et un agent efficace, choisi parmi la pepsine et une enzyme analogue à la pepsine, provenant de leucocytes de mammifères immobilisés sur le support précité.
9. Matériau suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'agent est constitué de pepsine provenant d'urine humaine. <Desc/Clms Page number 20>
10. Matériau suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'agent est constitué de pepsine provenant non d'un être humain, mais bien d'un animal.
11. Matériau suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le support est choisi parmi le Sepharose, l'agarose et les perles de verre.
12. Matériau suivant la revendication 9, caractérisé en ce que le support est choisi parmi le Sepharose, l'agarose et les perles de verre.
13. Matériau suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le support est constitué par la membrane filtrante d'un dialyseur artificiel.
14. Matériau suivant la revendication 9, caractérisé en ce que le support est constitué par la membrane filtrante d'un dialyseur artificiel.
15. Matériau suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le support est constitué par la surface interne d'un tube.
16. Matériau suivant la revendication 9, caractérisé en ce que le support est constitué par la surface interne d'un tube.
17. Procédé pour éliminer des immunocomplexes du sang ou du plasma, caractérisé en ce que l'on met ce sang ou ce plasma contenant des immunocomplexes en contact avec un matériau constitué d'un agent efficace, choisi parmi la pepsine et une enzyme analogue à la pepsine, provenant de leucocytes de mammifères, immobilisé sur un support pharmaceutiquement acceptable.
18. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que l'agent est constitué de pepsine provenant d'urine humaine.
19. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que l'agent est constitué de pepsine provenant non d'un être humain, mais bien d'un animal. <Desc/Clms Page number 21>
20. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que le support est choisi parmi le Sepharose, l'agarose et les perles de verre et le matériau est introduit dans une colonne avant sa mise en contact avec le sang ou le plasma précité.
21. Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que le support est choisi parmi le Sepharose, l'agarose et les perles de verre et le matériau en question est introduit dans une colonne avant d'être mis en contact avec le sang ou le plasma précité.
22. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que le support est constitué par la membrane filtrante d'un dialyseur artificiel.
23. Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que le support est constitué par la membrane filtrante d'un dialyseur artificiel.
24. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que le support est constitué par la surface interne d'un tube.
25. Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que le support est constitué par la surface interne d'un tube.
26. Procédé pour traiter un patient souffrant d'une maladie à immunocomplexes, caractérisé en ce que l'on met le sang ou le plasma d'un tel patient en contact avec un matériau constitué par un agent efficace, choisi parmi la pepsine et une enzyme analogue à la pepsine, provenant de leucocytes de mammifères, immobilisé sur un support pharmaceutiquement efficace.
27. Procédé suivant la revendication 26, caractérisé en ce que ladite maladie appartient au groupe formé par la polyarthrite chronique évolutive, le lupus érythémateux systémique et le lupus néphrétique.
28. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 26 et 27, caractérisé en ce que l'on met le sang <Desc/Clms Page number 22> entier non traité en contact avec le matériau.
29. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 26 à 28, caractérisé en ce que l'on met le sang ou le plasma en contact avec ledit matériau dans un circuit extracorporel.
30. Procédé suivant la revendication 29, caractérisé en ce que le circuit extracorporel est constitué par un dialyseur artificiel et en ce que le support est constitué par la membrane filtrante du dialyseur artificiel précité.
31. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 26 à 29, caractérisé en ce que le support est choisi parmi le Sepharose, l'agarose et les perles de verre.
32. Procédé suivant la revendication 26, caractérisé en ce que le support est constitué par la surface interne d'un tube.
33. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 26 à 32, caractérisé en ce que l'on met de 1 à 100 mg du matériau précité en contact avec chaque fois 100 ml du sang ou du plasma concerné.
34. Procédé suivant la revendication 33, caractérisé en ce que l'on met de 5 à 50 mg du matériau précité en contact avec chaque fois 100 ml du sang ou du plasma concerné.
35. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 26 à 34, caractérisé en ce que l'on met le sang ou le plasma concerné en contact avec le matériau précité au débit de 3 à 30 ml/h.
36. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 26 à 35, caractérisé en ce que l'agent est constitué par une pepsine dérivée de l'urine humaine.