"Procédé de préparation d'extrait bactérien total en vue de son utilisation
pour la production de vaccins et vaccins ainsi obtenus" La présente invention est relative à un nouveau procédé de préparation de supensions bactériennes antigéniques à utiliser dans la production de vaccins, basé. sur la capacité de rendre virulents des germes in vivo, la culture sur des milieux de culture usuels, la concentration au moyen d'ure ultrafiltration dans un système fermé et la lyse par des ultrasons dans une chambre
à flux continu.
Les problèmes liés à la préparation de substances destinées à être utilisées comme vaccins consistent essentiellement en deux types de facteurs : d'une part, il est nécessaire de pouvoir disposer de germes,
qui sont autant que possible proches de ceux qui pourraient par la suite être responsables du processus infectieux, c'est-à-dire des bactéries ayant acquis par une sélection naturelle les caractéristiques d'envahissement et les mécanismes s'opposant aux défenses immunologiques, appelés, d'une manière générale, sous la dénomination de virulence. D'un autre côté, le procédé d'inactivation des germes
(nécessaire pour les priver de leur potentiel pathogénique et pour s'assurer que l'administration de vaccin soit totalement sans danger) doit garantir la conservation des caractéristiques chimico-physiques chez les antigènes,
sans provoquer d'altérations ou de dénaturations. En
fait, ces altérations signifieraient l'inhibition de la production d'anticorps par l'organisme ou, du moins, <EMI ID=1.1>
cité et, par conséquent, avec une petite activité antibactérienne.
Les milieux de culture modernes garantissent les meilleures conditions de croissance pour la plupartdes micro-organismes ; malheureusement, les passages répétés dans des milieux de synthèse privent les germes de leurs caractéristiques liées à la virulence.
En ce qui concerne l'inactivation, des moyens trop faibles, tels que le simple fait de tuer par de la chaleur ou à l'aide de substances chimiques (qui n'entraînent pas la lyse des germes), bien qu'ils tuent les germes et les empêchent par conséquent de provoquer la maladie, rendent le vaccin rarement tolérable par l'organisme.
En fait, l'inoculation de corps bactériens entiers provoque souvent des effets secondaires locaux et généraux importants, rendant nécessaire l'administration de doses progressivement croissantes, et également une interruption de la thérapie. Parmi les systèmes de lyse adoptés, certains d'entre eux, tels que les méthodes enzymatiques sont, estime-t-on, à peine contrôlables et conduisent de toute manière à une fragmentation généralisée et sans discernement de la cellule bactérienne. Les méthodes physiques sont indubitablement meilleures, car elles n'impliquent
pas l'addition de substances étrangères à la préparation. Parmi les méthodes physiques les plus appropriées, on citera celles basées sur l'utilisation de hautes pressions à l'intérieur de presses particulières ou d'ultrasons, étant donné que sous ces conditions le degré de lyse et
les conditions opératoires (telles que la température) peuvent être soigneusement contrôlés. Le procédé apparaît
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Un autre problème lié à la production de vaccin au niveau industriel est la récolte de germes provenant du milieu de culture et leur purification. La méthode la plus ordinairement utilisée est la centrifugation, qui requiert un équipement complexe et coûteux et qui présente le danger de pollutions croisées.
Le but de la présente invention consiste en un nouveau procédé de préparation d'un extrait antigénique bactérien, permettant la production de vaccins qui présentent à la fois une grande efficacité et une très bonne tolérance. Le procédé est basé sur la capacité de rendre virulents ou virulentiation des germes de façon préventive, la concentration par ultrafiltration dans un système fermé et la lyse au moyen d'ultrasons dans un dispositif de conception nouvelle.
Le procédé de la présente invention est d'un grand intérêt, car il permet d'assurer :
1) la présence dans l'extrait de quantités optimales de
tous les antigènes liés à la virulence ;
2) une pureté absolue de la préparation, car le procédé
de concentration et de lyse en système fermé exclut le danger de pollutions croisées ;
3) la mise en évidence maximale par la lyse de tous les
composés antigéniques des germes, également de ceux qui dans les germes entiers restent à l'intérieur du corps bactérien ou "relativement" recouverts par d'autres molécules ;
4) la garantie maximale du système de lyse sous des condi-
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turations d'antigènes.
D'une manière détaillée, le procédé consiste à injecter une culture de bouillon du germe choisi pour la production de vaccins dans la cavité pleurale d'un lapin, en même temps que du bouillon de Mellin stimulant l'afflux de leucocytes. Environ 20 heures après l'inoculation, l'animal est tué et il est possible de procéder à l'extraction de l'exsudat pleural qui s'est développé, sous des conditions aseptiques et au moyen d'un dispositif d'aspiration à circuit fermé. L'exsudat est disposé sur une plaque et les colonies présentant des caractéristiques de virulence très marquées sont ensuite sépa rées, sélectionnées et utilisées pour une autre culture. On réalise ensuite une préculture pour la préparation du produit d'inoculation, qui sert à alimenter le fermenteur où on réalise la véritable culture.
L'étape suivante consiste en l'inoculation des germes dans un milieu approprié à l'intérieur d'un fermenteur sous des conditions de température, d'agitation, de flux de gaz et de pH constantes et contrôlables. A la fin du cycle de fermentation et lorsque tous les contrôles nécessaires sont réalisés (identification microscopique et comptage des germes, identification biochimique et sérologique, vérification de l'absence de germes étrangers, de levures et de moississures), on relie le fermenteur à un système d'ultrafiltration Millipore HPCF et on commence la concentration, en opérant
en continu et en système fermé avec des membranes de séparation d'un poids moléculaire de 100.000.
30 litres de bouillon de culture contenus dans le fermenteur sont concentrés en un litre en une période ne prenant qu'environ 30 minutes. On enlève ensuite le bouillon et on lave les germes par trois additions de 5 litres chacune de tampon à pH 7,2, refoidi à 4[deg.]C.
Un échantillon de la suspension concentrée est prélevé pour le comptage et l'examen microscopique de la culture, le récipient avec les germes étant ensuite relié au système de lyse. La lyse est réalisée au moyen d'un traitement par ultrasons à la fréquence de 22 KHz dans une chambre à flux continu de conception particulière. Cette chambre est réalisée en acier inoxydable Aisi
316, équipée d'une enveloppe extérieure de réfrigération, et contient, en position appropriée, deux sonotrodes de titane alimentées par un générateur ST.IM.UN d'une puissance de 1000 watts, qui est équipé d'instruments destinés à un contrôle constant de paramètres et permettant de vérifier le fonctionnement correct des deux sonotrodes.
On fait circuler une suspension bactérienne
à une vitesse de 0,5 litre/minute, et on maintient la température à 4[deg.]C grâce à un refroidissement approprié au moyen de l'enveloppe et d'un dispositif de refroidissement extérieur. La durée de la lyse varie suivant le type de bactéries de 30 à 120 minutes, compte tenu du fait que la lyse des germes en forme de baguettes est plus aisée que celle des germes en forme de coccoîdes,
et que la lyse des germes Gram est plus facile que celle des germes Gram . Le contrôle des produits de lyse est réalisé au moyen d'un microscope électronique : on dépose une goutte de la suspension sur une grille recouverte de charbon, de manière à l'examiner en la laissant sécher par exposition à l'air. La préparation est ensuite recouverte d'un mélange de palladium-or agencé suivant un angle de 30[deg.] par rapport à celle-ci et est examinée à un grossissement approximativement de 20.000 fois.
Le degré de lyse ainsi obtenu est très élevé; toutes les cellules paraissent endommagées,avec une libération plus ou moins abondante de matière cellulaire. La suspension est principalement constituée de parois cellu-laires plus ou moins fragmentées et de composants cytoplasmiques, partiellement en suspension (ribosomes) et partiellement en solution (protéines, etc.).
Les produits de lyse sont examinés en ce qui concerne la toxicité anormale, la teneur en histamine ou en substances analogues à l'histamine, la pyrogénicité, le stérilité et l'immunogénici té.
On constate que la suspension antigénique obtenue suivant la présente invention est exempte de toute toxicité, d'histamine ou de substances analogues
à l'histamine et est stérile. Lorsqu'on l'injecte à
des lapins pour le test de pyrogénicité, elle provoque des augmentations diverses de la température corporelle suivant les espèces bactériennes et la dose injectée, mais en tout cas inférieures à 1,5[deg.]C. Injectée aux animaux, elle peut provoquer la production d'anticorps qui agglutinent et neutralisent les germes contenus dans
le vaccin. Les animaux soumis à un cycle de vaccination et ensuite infectés par les germes présents dans
les vaccins montrent des périodes de survie sensiblement plus longues que celles enregistrées chez des animaux non traités.
EXEMPLE
Procédé de préparation d'une suspension antigénique à utiliser comme vaccin antistaphylococcique.
1) On cultive la souche de S. aureus choisie pendant 18 heures à 37[deg.]C dans 50 ml de bouillon de cervelle et de coeur Difco. A la fin de la culture, on dilue la suspebsion bactérienne à 1/100 dans du bouillon de Mellin.
2) On injecte 20 ml de la suspension précitée diluée
à 1/100 dans du bouillon de Mellin dans la cavité pleurale d'un lapin pesant environ 2,5 kg.
3) 20 heures après l'inoculation, on tue l'animal, on
le désinfecte et on rase la peau du thorax. Ensuite, on extrait l'exsudat pleural par un dispositif d'aspiration à circuit fermé.
4) On dispose l'exsudat pleural sur une plaque et on sélectionne les colonies présentant des caractéristiques de virulence très marquées.
5) Certaines de ces colonies sont inoculées dans 500 ml
de bouillon Difco BH et incubées pendant 18 heures à
37[deg.]C.
6) 30 litres de bouillon Difco BH contenus dans un fermenteur sont inoculés avec la suspension obtenue.
7) On cultive le germe pendant 24 heures à 37[deg.]C sous agitation à pH 7,4.
8) Une fois que l'on a vérifié l'identité du germe et
l'absence d'agents Polluants, il est possible de procéder à la concentration de la suspension au moyen d'un filtre Millipore HPCF pourvu d'une membrane de séparation d'un poids moléculaire de 100.000 et d'une surface de 0,46 m .
9) On concentre la suspension en un volume d'un litre
endéans une période d'approximativement 30 minutes,
on la lave ensuite trois fois avec 5 litres de tampon, chaque fois à pH 7,2, et on la refroidit à 4[deg.]C
(temps utilisé : 15 minutes).
10) La suspension obtenue, exempte de traces de bouillon
et contenant environ 2-6 x 10 il germes/ml, est ensuite reliée au système de lyse.
11) Au moyen d'un pompe péristaltique, on fait circuler
la suspension à une vitesse de 0,5 litre/minute dans la chambre de lyse, où sont agencées deux sonotrodes de titane, alimentées par un générateur de 1000 watts et émettant des ultrasons à une fréquence de 22 KHz.
Le dispositif est équipé d'une enveloppe réfrigérante et d'un dispositif de refroidissement extérieur, de manière à obtenir la température de la suspension sous 4[deg.]C.
12) La suspension est exposée aux ultrasons pendant 120
minutes, en obtenant une lyse complète avec une libération totale du cytoplasme chez 80 % des bactéries, tandis que 20 % paraissent comme étant partiellement vidées.
13) Le produit de lyse ainsi obtenu constitue la base
d'une production de vaccins; dilué de façon appropriée avec une solution à 0,2 % de phénol physiologique
(par exemple jusqu'à une concentration égale à
500 x 106 germes/ml ), il apparaît comme étant stérile, non toxique et exempt d'histamine ou de substances analogues à l'histamine. Si on le soumet à un essai de pyrogénicité, il provoque des augmentations
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et si on l'inocule chez un animal, il conduit à la formation d'anticorps qui confèrent une protection lors d'une infection provoquée expérimentalement.
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux. formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.
REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un extrait bactérien total en vue de son utilisation pour la production de vaccins, caractérisé en ce qu'il comprend la capacité de rendre préliminairement virulents des germes in vivo, la culture des germes dans un milieu de synthèse, la concentration de la suspension bactérienne par ultrafiltration en système fermé et finalement la lyse par ultrasons sous des conditions contrôlées.