BE904458A - Nouveau procede de preparation de (d-trp6)-lhrh et complexe de resine benzhydrylaminique et de peptide. - Google Patents

Abstract

Procédé de préparation de (D-Trp6)-LHRH en phase solide sur une résine benzhydrylaminique, caractérisé en ce que les aminoacides protégés sont introduits sur le support polymère avec une double condensation, en ce que le radical hydroxyle de la sérine est protégé grace à un groupe benzyle,le radical hydroxyle de la tyrosine grace à un groupe 2,6-dichlorobenzyle, le groupe guanidinique de l'arginine grace à un groupe tosyle, le noyau indolique du L- et D-tryptophane grace à un groupe formyle et l'azote- TT du noyau imidazolique de l'histidine grace à un groupe benzyloxyméthyle, et en ce que la suppression finale de la protection des chaines latérales et la séparation du peptide par rapport au support s'effectuent grace à un traitement ultérieur à l'acide fluorhydrique à basse et à haute concentration.

Description

  "Nouveau procédé de préparation de [D-Trp ]-LHRH et complexe de résine benzhydrylaminique et de peptide"  <EMI ID=1.1> 

  
de résine benzhydrylaminique et de peptide".

  
La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de [D-Trp ]-LHRH, ainsi qu'un nouveau complexe de résine-peptide utile dans ce procédé de préparation.

  
L'invention concerne plus particulièrement

  
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une résine benzhydrylaminique, ce procédé étant caractérisé en ce que les aminoacides particuliers protégés sont chargés deux fois sur le support polymère grâce à une double condensation, en ce que le radical hydroxyle de la sérine est protégé grâce à un groupe benzyle, le radical hydroxyle de la tyrosine grâce à un groupe 2,6-dichlorobenzyle, le groupe guanidinique de l'arginine grâce à un groupe tosyle, le noyau indolique du L- et D-tryptophane grâce

  
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grâce à un groupe benzyloxyméthyle, et en ce que la suppression finale de la protection des chaînes latérales et la séparation du peptide à partir du support polymère sont réalisés grâce à de l'acide fluorhydrique d'abord à basse concentration, puis à haute concentration.

  
Il est connu que le [D-Trp ]-LHRH, dont le nom chimique est L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-Ltyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-propylglycinamide est utile en médecine aussi bien pour des buts de diagnostic que pour des besoins thérapeutiques.

  
Suivant les procédés connus de préparation de [D-Trp ]-LHRH, la protection des groupes fonctionnels qui ne sont pas impliqués dans la formation du groupement peptidique, la suppression finale de la protection et la séparation du peptide à partir du support polymère présentent des désavantages bien connus qui se reflètent sur les rendements. 

  
Le procédé de la présente invention évite en grande partie les inconvénients susdits et permet de ce fait d'obtenir des rendements globaux, aussi bien chez le premier aminoacide que chez la résine, qui sont supérieurs à ceux que l'on peut obtenir par les procédés connus (brevet belge n[deg.] 842.857).

  
D'une manière générale, les abréviations utilisées dans la présente description pour désigner des aminoacides et les groupes protecteurs sont ceux qui sont recommandés par la Commission IUPAC-IUB pour la Nomenclature Biochimique (voir Eur. 3. Biochem
138, 9-37; 1984). A titre d'exemple, p-Glu, His, Trp, Ser, Tyr, D-Trp, Leu, Arg, Pro et Gly désignent respectivement des "restes" de 5-oxo-Lproline (acide L-pyroglutamique), de L-histidine, de L-tryptophane, de L-sérine, de L-tyrosine, de D-tryptophane, de L-leucine, de L-arginine, de L-proline et de glycine. Le terme "reste" désigne des radicaux dérivés des alpha-aminoacides correspondants par élimination du radical hydroxyle du groupe carboxylique et d'un atome d'hydrogène du groupe aminique.

  
Les autres abréviations utilisées dans la présente description sont :

  
AcOH = acide acétique, Boc = t-butyloxycarbonyle; Bom = benzyloxyméthyle; n-BuOH = n-butanol; Bzl= benzyle; C12-Bzl = 2,6-dichlorobenzyle; DCC = N,N'-dicyclohexylcarbodiimide; DMF = diméthylformamide; For = formyle; HOBt 1-hydroxybenzotriazole; MeOH = méthanol; i-PrOH = isopropanol; TEA = triéthylamine; TFA = acide trifluoracétique; Tos = tosyle.

  
En ce qui concerne la synthèse des peptides en phase solide, on se référera à la bibliographie en la matière, par exemple à G. Barany et R.D. Merryfield, "Solid-phase peptide synthesis", dans The Peptides-Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2 publié par E. Gross et 3. Meienhofer, Academic Press, New York, 1980; et J.M.

  
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Suivant la présente invention, le décapeptide produit est formé phase après phase, sur un copolymère de benzhydrylamine-polystyrène-l%-divinylbenzène. Durant toute la synthèse, on utilise  <EMI ID=5.1> 

  
utilisé sous une forme non dérivée. Tous les groupes fonctionnels qui ne sont pas impliqués dans la formation d'une liaison peptidique sont protégés grâce à des groupes protecteurs appropriés : le radical hydroxyle de la sérine et de la tyrosine respectivement grâce à un groupe benzyle et grâce à un groupe 2,6-dichlorobenzyle [Ser (Bzl)

  
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Les groupes protecteurs susdits sont stables dans les conditions de l'hydrolyse acide que l'on utilise pour débloquer les groupes protecteurs du groupement alpha-aminique (Boc) dans chaque phase de la synthèse, ils ne sont en outre pas séparés dans les conditions de la condensation et sont par contre écartés facilement à la fin de la synthèse. Les condensations sont effectuées grâce à du DCC dans du chlorure de méthylène ou du DMF. Le premier Boc- aminoacide est incorporé sur le support solide en utilisant un excès de trois fois et en effectuant une seconde condensation avec un excès de deux fois. Les groupes aminiques de la résine benzhydrylaminique, qui n'ont pas réagi, sont désactivés grâce à une réaction avec du N-acétylimidazole en excès de dix fois.

   L'incorporation du reste du premier aminoacide est déterminée par l'analyse de.l'aminoacide sur un échantillon de la résine après hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique 12N/acide propionique pendant 2 heures à 130[deg.]C. Le programme suivant consiste essentiellement à alterner des suppressions de protection par Boc avec du TFA à 50% dans du chlorure de méthylène et des condensations avec un agent de condensation, tel que le DCC, seul ou en présence de HOBt. L'incorporation complète de l'aminoacide est contrôlée grâce à l'essai à la ninhydrine de Kaiser (E. Kaiser et col., Anal. Biochem.
34, 595; 1970). La suppression finale de la protection de la chaîne latérale et la séparation du peptide depuis le support polymère se réalisent grâce au procédé récent à l'acide fluorhydrique à basse et à haute concentration (J.P. Tam. et col., 3. Am. Chem.

   Soc. 105, 6422; 1983). Le peptide est ensuite extrait de la résine avec de l'acide acétique aqueux et purifié grâce à une succession de processus chromatographiques.

  
La nouveauté de la présente synthèse réside aussi bien dans le choix approprié des groupes protecteurs de la chaîne latérale que dans les conditions opératoires pour les écarter. La protection du noyau indolique du tryptophane grâce à une formylation empêche aussi bien la dégradation oxydante que l'alkylation électrophile du noyau indolique durant les traitements répétés avec des acides; l'intro-

  
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de l'histidine empêche la racémisation de l'aminoacide durant l'activation au cours de la condensation, habituellement observée avec d'autres groupes protecteurs. (T. Brown et J.H. Jones, J.C.S. Chem. Comm.,
1981, 468).

  
A la fin des diverses phases de condensation  on obtient le complexe de résine benzhydrylaminique/peptide protégé, de la formule

  

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où R est la résine de support, et

  
 <EMI ID=9.1> 

  
tryptophyl(formyl)-L-séryl(benzyl)-L-tyrosyl(2,6-dichlorobenzyl)-Dtryptophyl(formyl)-L-leucyl-L-arginyl(tosyl)-L-prolylglycyle.

  
Ce complexe est nouveau et constitue de ce fait un objectif final de la présente invention.

  
Tous les groupes protecteurs sont ensuite écartés de manière appropriée grâce au procédé à l'acide fluorhydrique à basse et à haute concentration et on évite ainsi l'alkylation électrophile de la tyrosine. A cause de la réduction complète des réactions secondaires et de la formation de produits collatéraux, la purification est plus simple et les rendements sont meilleurs qu'ils ne le sont avec les autres procédés connus.

  
Les Exemples suivants illustrent la présente invention sans pour autant la limiter.

EXEMPLE 1.

  
 <EMI ID=10.1> 

  
L-séryl(benzyl)-L-tyrosyl(2,6-dichlorobenzyl)-D-tryptophyl(formyl)L-leucyl-L-arginyl(tosyl)-L-propylglycyl-résine benzhydrylaminique.

  
On met 3 g de chlorhydrate de résine benzhydrylaminique (0,8 mmole/g) dans un réacteur automatique pour la synthèse des peptides et on fait gonfler ce produit en l'agitant dans 30 ml de chlorure de méthylène pendant 1 heure. La résine est ensuite neutralisée avec du TEA à 10% dans du chlorure de méthylène grâce à un lavage préalable pendant 0,5 minute, suivi d'un traitement pendant 2 minutes. Le TEA est ensuite écarté avec du chlorure de méthylène (3 x minute), ceci étant suivi par des lavages au méthanol (3 x 1 minute) et au chlorure de méthylène (6 x 1 minute). On ajoute un excès de trois fois de Boc-Gly-OH (1,26 g; 7,2 mmoles) dans 15 ml de chlorure de méthylène et le mélange est mis en équili-

  
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dans du chlorure de méthylène et le réacteur est soumis à agitation à température ambiante pendant 2 heures. La résine est lavée trois fois pendant 1 minute chaque fois, avec du chlorure de méthylène, du méthanol et du chlorure de méthylène, une fois pendant 2 minutes avec du TEA à 10% dans du chlorure de méthylène, trois fois pendant 1 minute respectivement avec du chlorure de méthylène, du méthanol et du chlorure de méthylène. L'opération tout entière est répétée encore une fois avec un excès de deux fois de Boc-Gly-OH et du DCC. Un échantillon de 5 mg de Boc-Gly-résine soumis à analyse de l'aminoacide, a montré une incorporation de 0,65 mmole de Gly/g de résine.

  
Cette valeur est utilisée comme base pour tous les calculs ultérieurs. Les groupes aminiques qui n'ont pas réagi sont désactivés grâce à une réaction avec un excès de dix fois de N-acétylimidazole (2,18 g; 24 mmoles) dans 30 ml de chlorure de méthylène pendant 1 heure à la température ambiante. Tous les aminoacides suivants sont ajoutés avec un programme de double condensation semblable, ce programme variant en fonction du reste particulier (à moins d'indications contraires, dans le présent programme et dans le programme suivant, le volume des solvants et des réactifs est de 10 ml par g de résine).

  
Programme A.

  

 <EMI ID=12.1> 
 

  

 <EMI ID=13.1> 


  
A la seule exception de l'histidine, le programme susdit est utilisé sans modifications pour les liaisons répétées des autres dérivés d'aminoacides, dans l'ordre suivant : Boc-Pro-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-D-Trp(For)-OH,Boc-Tyr(CI 2- Bzl)-

  
 <EMI ID=14.1> 

  
Le dérivé protégé de l'histidine est introduit par le programme modifié suivant :

Programme B.

  

 <EMI ID=15.1> 
 

  
Après séchage sous pression réduite, l'ensemble résine-décapeptide montre une augmentation de poids qui est voisine de la valeur théorique.

  
EXEMPLE 2.

  
L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-séryl-Ltyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamide :
[D-Trp6]-LHRH.

  
Un échantillon de 1 g de résine-décapeptide protégée, décrite dans l'Exemple 1, est agité avec un mélange de HF (10 ml), de sulfure de diméthyle (26 ml), de p-thiocrésol (2 ml) et de p-crésol (2 ml) pendant 2 heures à 0[deg.]C. Ensuite, l'acide fluorhydrique et le sulfure de diméthyle sont évaporés sous pression réduite et remplacés par de l'acide fluorhydrique (40 ml). Après 1 heure à 0[deg.]C, l'acide fluorhydrique est évaporé sous pression réduite et on écarte, avec de l'acétate d'éthyle (3 x 50 ml), le thiocrésol, le crésol et leurs produits de substitution. Le peptide ainsi séparé et

  
débarrassé de ses protections est extrait avec de l'acide acétique à 30% (4 x 50 ml) et les extraits rassemblés sont traités avec une résine échangeuse d'ions AG3 x 4A (forme acétate) et lyophilisés pour donner 0,26 g (rendement de 65%) de produit brut. La purification est réalisée grâce à une chromatographie de partage sur du Sephadex G-25M en utilisant la phase supérieure d'un système éluant constitué

  
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d'abord avec la phase inférieure et ensuite avec la phase supérieure. Les fractions de la colonne sont contrôlées grâce à une analyse HPLC; les fractions dont la pureté est supérieure à 90% sont rassemblées et lyophilisées dans l'eau. Le produit semi-pur est ensuite purifié grâce à une chromatographie HPLC préparatoire. On utilise un gradient d'acétate d'ammonium (0,1 M, pH de 6) à 20-28% dans de l'acétonitrile sur une période d'environ 1,5 heure sur un support de silice à phase inversée C-18.

  
L'éluat est contrôlé à 210 nm et on récolte les fractions dont la pureté est supérieure à 99%. L'acétonitrile est écarté sous pression réduite et la portion aqueuse est lyophilisée deux fois dans l'eau. Le produit est finalement soumis à une filtration sur gel sur une colonne de Sephadex G-25 (2,5 x 200 cm) dans de l'acide acétique à 10%. Les fractions dont la pureté est supérieure à 90% sont récoltées et lyophilisées. Le produit est lyophilisé à

  
 <EMI ID=17.1> 

  
la nuit; on obtient 143 mg (rendement de 35%) de[Trp6]LHRH sous forme du diacétate. L'analyse des aminoacides (après hydrolyse avec de l'acide méthanesulfonique) a donné les résultats suivants:
Ser:0,94 (1); Glu: 1,02 (1); Pro: 1,02 (1); Gly: 1,00 (1); Leu: 0,99 (1); Tyr: 0,99 (1); His:l,00 (1); Arg: 0,99 (1); Trp : 2,02 (2).

Claims (2)

1. REVENDICATIONS. <EMI ID=18.1>

   phase solide sur une résine benzhydrylaminique, caractérisé en ce que les aminoacides protégés sont introduits sur le support polymère avec une double condensation, en ce que le radical hydroxyle de la sérine est protégé grâce à un groupe benzyle, le radical hydroxyle de la tyrosine grâce à un groupe 2,6-dichlorobenzyle, le groupe guanidinique de l'arginine grâce à un groupe tosyle, le noyau indolique du

   <EMI ID=19.1>

   imidazolique de l'histidine grâce à un groupe benzyloxyméthyle, et en ce que la suppression finale de la protection des chaînes latérales et la séparation du peptide par rapport au support polymère s'effectuent grâce à un traitement ultérieur à l'acide fluorhydrique à basse et à haute concentration.
2. 2. Complexe de résine benzhydrylaminique/peptide

   protégé, de formule :

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   dans laquelle R désigne la résine de support et

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   xyméthyl)-L-tryptophyl(formyl)-L-séryl(benzyl)-L-tyrosyl(2,6dichlorobenzyl)-D-tryptophyl(formyl)-L-leucyl-L-arginyl(tosyl)L-prolylglycyle.