BG105158A - Предотвратяване образуването на слузести покрития(мускус) върху летателни писти с прилагане на противодействащо средство egf-r - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до потискане свръхсекрецията на мукус в белите дробове чрез въвеждане на антагонист срещу рецептора на фактора за епидермалнонарастване (EGF-R). Той може да бъде под формата на малка органична молекула, едно антитяло или част от антитяло, което се свързва към EGF рецептора и го блокира. За предпочитане е антагонистът срещуEGF-R да се въвежда инжекционно в количество, което е достатъчно да потисне образуването на гоблетни клетки в дихателните пътища в белите дробове. По-този начин се потиска дегранулацията на гоблетните клетки, която предизвиква образуването на мукус в дихателните пътища. Изобретението включва и изследвания за оценка на предлагани агенти, които потискат образуването и развитието на гоблетни клетки.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

В общия случай изобретението е свързано с областта на белодробното лечение. По-специфично, изобретението се отнася до подтискане на свръхсекрецията на мукус в белите дробове и дихателни пътища, посредством въвеждане на антагонист срещу EGF-R. В допълнение, настоящото изобретение също се отнася до методите за разработване и оценка на предлагани агенти, които са в състояние да подтискат свръхсекрецията на мукус в белите дробове.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

В проводящите дихателни пътища от дихателната система, секретоотделящата система служи като първичен защитен механизъм за отвеждане на вдишани частици или инфекцизни агенти извън дихателните пътища в белите дробове. В допълнение, наличните в течностите в дихателните пътища вещества служат да се ограничи токсичността на частиците и да се дезактивират инфекциозните агенти. Физическия механизъм на кашленето служи да се изхвърли секрет от дихателните пътища (виж напр., “Foundations of respiratory Care”, Piesrson and Kacmarek, eds (1992) Churchill Livingstone Inc. New York; “Harrison’s Principles of Intemat Medicine” Fauci et al., eds (1997) 14th Edition, McGraw Hill, New York, New York).

Секретоотделящата система се състои от усукани епителни клетки, гоблетни епителни клетки и клетки отделящи серум и мукус, разположени в субмукосни жлези. Усуканото снопче(цилиа) е обградено от един воден слой (перицилиарна течност), който се секретира в прохода(лумен) на дихателния канал от активния пренос на хлорид и пасивното движение на вода през епитела. Снопчето влиза в контакт с мукуса плуващ върху този воден слой и чрез еднопосочно въртеливо движение спомага за движението на мукуса към глътката, (виж Pierson and Kacmarek, supra and Fauci, et al., supra). Мукус се произвежда от епителните гоблетни клетки и клетките на субмукосната жлеза и се секретира в прохода на дихателния път след дегранулиране.

Докато, мукусът обикновено спомага за изчистване на вдишаните частици или инфекциозни агенти, свръхсекрецията на мукус в дихателните пътища може да причини прогресивното им запушване. В периферните пътища, кашлицата не е ефективна за изчистване на секретите. Още повече, поради техните малките размери, малките дихателни пътища съдържащи много гоблетни клетки са силно податливи на запушване с мукус. Свръхсекрецията в дихателните пътища поразява значителен брой хора; това е видно при различни белодробни заболявания, като хроничен бронхит, остра астма, цистична фиброза и бронхиектаза.

Свръхсекрецията на мукус е главен симптом при пациенти с хронични белодробни обструкции (COPD) и определя състоянието (напр. хронична кашлица и храчкоотделяне). Само това състояние обхваща 14 милиона американци и може да причини прогресивна нетрудоспособност и смърт. Направена е оценка, че от астма страдат най-малко 4% от населението на САЩ и тя води до най-малко 2000 смъртни случая годишно (Pierson and Kucmarek, supra). По време на един остър астматичен пристъп, бронхиалните стени се подуват, увеличава се обемът на секрет и се свива гладкия бронхиален мускул, като се стеснява дихателния път. В резултат от свръхсекреция при остра астма, едно широко мащабно запушване с мукус може да бъде главна причина за болезненост и смъртност.

Свръхсекрецията също е включена при диетичната фиброза, която е едно от най-често срещаните генетични заболявания с фатален край в света. Цистичната фиброза е едно възвратно автосомално заболяване,

което причинява мукусовата клетка в дихателния път да стане нечувствителна към активиране на цикличния-зависим от АМР протеин киназа в мембраната на каналите за хлоридни йони (Pierson and Kacmarek, supra and Fauci, et al., supra). Последвалият електролитен дисбаланс намалява нивото на хидратиране на мукус в дихателния път, като в белите дробове на индивида се получава мукус с висока плътност и те са поразени от диетична фиброза. Свръхсекрецията запушва въздушните канали на организма с диетична фиброза, което в последствие влошава функцията на белите дробове.

Други заболявания със свръхсекреция включват хроничните белодробни обструкции (COPD). Стресът от реагенти с окислително действие играе важна роля при патогенезата на COPD. Цигареният дим, който създава радикали без кислород е силно свързан с патогенезата. Нутрофилите се срещат често в мястото на възпалението при COPD, като е интересно да се отбележи, че радикали без кислород се освобождават от нутрофилите по време на активация.

Често се налага да се приложи механична интубация, за да се осигури принудителна инхалация на пациенти с различни белодробни заболявания. За тази цел през орофаранкса се вкарва тръба и се поставя в трахеята. За да се предотврати утечка на въздух около ендотрахеалната

тръба, около тръбата в долната трахея се надува един балон, който може да претрие епитела и да придизвика метаплазиа на гоблетните клетки. Нараняването на епитела води до възстановителни процеси, които могат да придизвикат обилна секреция. Такива продължителни инкубации на трахеята могат да доведат у пациентите до вредни ефекти дължащи се на свръхсекреция.

В резултат от високото ниво на секрет в белите дробове на пациенти с белодробни заболявания със свръхсекреция се намалява изчистването на секрета. Патологични агенти, като да кажем бактерии, напр. Pseudomonas aeruginosa, често създават колонии в секрета, като причиняват чести белодробни инфекции.

Класически форми на лечение на индивиди със свръхсекреция на дихателните пътища включват лечение с антибиотици, бронходилатори (като метилксантини, симпатомиметици със силни β2 адренергични стимулиращи качества, антихолинергитици), употребата на системни или инхалирани кортиокостероиди, на първо място при астма, втечняване на секрета посредством въвеждане орално на експекторанти, като гоифенезин, и аерозолно подаване на “миколитни” агенти, като вода, хипертоничен солен разтвор (виж Harrison’s supra). Една нова терапия на цистична фиброза е прилагането на DNAse, като се целят богатите на DNA мукус или храчки (Shak, et. al., (1990) Proc. Natl. Acad. (USA) 87: 9188-9192; Hubbard, R.C. et al., (1991) N. Engl. J. Med. 326:812). B допълнение, гръдната физическа терапия състояща се от перкусия, вибрации и дренаж също се използва, за да се подпомогне изчистването на мукус с висока гъстота. Трансплантация на бял дроб може да бъде един краен вариант за пациенти с тежки белодробни увреждания. Затова е необходимо по-ефикасно или алтернативно лечение, което да е насочено към мукусните секреции. По-специално, има потребност от специфична форма на терапия, която ще намали образуването на секрет в дихателните пътища.

Справочна литература

Употребата на EGF инхибитори за спиране нарастването на ракови клетки е разгледано от Levitski (1994) Eur J. Biochem. 226(1): 1-13; Powis (1994) Pharmac. Ther. 62: 57-95; Kondapaka and Reddy (1996) Mol. Cell. Endocrin. 117:53-58.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Свръхсекрецията на мукус в дихателните пътища е неблагоприятен симптом в редица различни белодробни заболявания. Секрецията е в резултат от дегранулация на гоблетни клетки, развитието на които се подпомага от стимулация на рецепторите за фактора на епидермално нарастване (EGF-R). С настоящото изобретение се лекува белодробна свръхсекреция посредством въвеждане на терапевтични количества от противодействащи на EGF средства, за предпочитане инхибитори на киназа. Антагонистите могат да бъдат под формата на малки молекули, антитела, или части от антитела, които се свързват към EGF или неговия рецептор. В друг аспект на изобретението, са осигурени методи in vitro или in vivo , които прогнозират терапевтичния потенциал на предлаганите агенти за подтискане на свръхсекрецията.

Първостепенен обект на изобретението е да осигури метод за лечение на заболявания включващи свръхсекреция в белите дробове.

Друг обект на изобретението е да осигури състави, които са полезни при лечение на заболявания включващи свръхсекреция в белите дробове.

Също друг обект на изобретението е да осигури едно изследване in vitro за оценка на предлаганите агенти, които подтискат свръхсекрецията, като този метод включва етапите (I) контакт с един in vitro модел на бързо развитие на гоблетни клетки с EGF или функционалния му еквивалент; (ii) в последствие контактуване на модел in vitro c един предлаган агент; и (iii) оценка бързото нарастване на гоблетните клетки, при което подгисканете на това нарастване е показателно за терапевтичния потенциал на предлагания агент.

Друг предмет на изобретението е да осигури едно изследване in vivo за оценка на предлагани агенти, които подтискат свръхсекрецията на слуз, като методът включва (i) създаване на животински модел на белодробно заболяване със свръхсекреция посредством индуциране на EGF-R, напр. с алфа-фактор на туморна некроза (TNF-α); (ii) стимулиране на индуцирания EGF-R с негов лиганд, т.е. трансформация в алфа-фактора на растежа (TNF-a) или EGF, за да се получат гоблетни клетки, които произвеждат муцин; (iii) лечение с предлаган агент; и (iv) оценка нарастването на гоблетните клетки или отделянето на мукус, като подтискането на растежа на гоблетните клетки или секрецията са показател за терапевтичния потенциал на предлагания агент.

Друг предмет на изобретението е да осигури изследвания in vitro и in vivo за оценка на антагонисти на EGF-R, които подтискат свръхсекрецията на мукус.

Едно приемущество на изобретението е в това, че то осигурява средства за предотвратяване на прекомерното образуване на мукус в дихателните пътища.

Една особеност на изобретението е в това, че за блокиране ефектите от EGF и/или TGF-a и тяхното взаимодействие с EGF-R може да се използва цял диапазон от различни типове антагонисти.

Един аспект на изобретението са състави от антагонисти на EGF за намаляване образуването на секреция в дихателните пътища на млекопитаещ пациент, за предпочитане хуманен пациент.

Друг аспект на изобретението е един метод за белодробно въвеждане на антагонисти на EGF за намаляване секрециите на мукус в дихателните пътища на млекопитаещ пациент, за предпочитане хуманен пациент.

Друг аспект на изобретението е да осигури метод за лечение на диапазон от различни заболявания, които имат като симптом прекомерно образуване на секреции от мукус в дихателните пътища. Тези заболявания включват, без ограничение, хронични бронхити, остра астма, диетична фиброза, бронхиектаза, хронични обструктивни белодробни заболявания, свръхсекреция в резултат от нарушаване на епитела като алергични стимули или механични увреждания и свръхсекреция през носа.

Тези и други предмети, предимства и особености на изобретението ще се изяснят на тези с опит в практиката след запознаване с подробностите от методите на лечение и методите за изследване in vitro и in vivo , които в пълнота са описани по-долу.

ПОЯСНЕНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ

Фигура 1А представлява западна разпечатка на EGF-R в NCLН292 и в клетки А431. Фигура 1В, имуноцитохимичен анализ с антиEGF-R антитяло в култури от NCL-H292 клетки. Фигура 1С северен анализ на EGF-R в клетки NCL-H292.

Фигура 2. Оцветяване в алцийско синьо/PAS на клетки NCL-H292 за идентифициране на гликипротеини от муцин.

Фигура 3. Северен анализ за изявяване на MUC5 ген в клетки HCLН292.

Фигура 4А и 4В. Имунохистохимичен анализ на EGF-R с едно анти-EGF-R антитяло в плъхове без патоген. Фигура 4А, плъхове третирани с TNFa. Фигура 4В, плъхове с чувствителност към овалбумин.

Фигура 5 е графика отразяваща ефекта от инхибитор (BIBX1522) на EGF-R тирозин киназа върху производството на гоблетни клетки (изразен като % от оцветената площ в епител на дихателен път зает от Алпийско синьо/РAS-положителни оцветени клетки).

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Осигурени са методи и състави за лечение на свръхсекреция на мукус в дихателните пътища, посредством въвеждане на терапевтични количества от антагонисти на EGF, за предпочитане инхибитори на киназа. Антагонистите могат да бъдат под формата на малки молекули, антитела или част от антитела, които свързват EGF или негов рецептор. При заболявания със свръхсекреция на дихателните пътища, като хроничен бронхит, бронхиектаза, цистична фиброза, остра астма, COPD, и т.н. се увеличава синтезата на муцин в дихателните пътища и се появява свръхсекреция на мукус. Секрецията на мукус придизвиква запушване в дихателните пътища, ефект който придизвиква смърт при тези заболявания.

Тук са показани няколко причини за увреждане и възпаление на дихателните пътища, за да се подбуди изявата на рецептора на фактора за епидермално нарастване в епителните клетки на дихателните пътища. След индуциране на EGF-R, последващо стимулиране на EGF-R както от лиганд-зависещи така и от лиганд-независещи механизми води до производство на муцин както в израза за гена, така и в нивата на протеин. Демонстрирани са подбрани инхибитори на EGF-R тирозин киназа, които блокират тази изява на муцин в ген и протеин.

Предлага се, без да се ограничава изобретението, че една еволюционна последователност на производството на гоблетни клетки, може да се основава на изявата на EGR-R. Стимулиране с TNFa подбужда интензивно оцветяване на негранулирани клетки от секрет; тяхното последващо активиране с EGF-R лиганди придизвиква нарастващо оцветяване за мукусни гликоконюгати в цитоплазмата, като клетките стават “пред-гоблетни” и след това “гоблетни” клетки. Данните подсказват, че активацията на EGF-R изявява селективна диференциация на клетките, но не и нарастване. Очевидно таблетните клетки се извличат от негранулирали клетки от секрет, които изразяват EGF-R и са стимулирани от EGF-R лиганди, за да произвеждат муцини.

Освен стимулиране от цитокини, EGR-F може да се стимулира от други сигнални медиатори. Например, продължителното тютюнопушене е свързано с прогресивни патологични промени на периферните дихателни пътища, включителни хиперплазиа на таблетните клетки. Придизвикващи възпаление нутрофили, активирани от цитокин и цигарен дим са показани като предизвикващи синтез на муцин в хуманни бронхиални епителни клетки посредством лиганд-независима активация на EGF-R, въвличайки рекрутирани нутрофили и цигарен дим като регулатори на деференциацията на епителни клетки, като се получава свръхнормална индукция на клетки произвеждащи муцин в дихателните пътища. Нутрофили активирани от разнообразни стимули, включващи IL-8, N-формил-метионил-леуцил-фениланин, TNF-a, цигарен дим или Н₂О, пререгулират изявата на муцин в епителните клетки, чийто синтез се подтиска от инхибиторите на EGF-R. Нутрофилите също са в състояние да произвеждат EGR-F лиганди, EGF и TGFa. В допълнение, епителните клетки са източници на EGF-R лиганди.

Механично нараняване на епитела на дихателния тракт може също да причини свръхсекреция и да е причина за мукусно запушване. Инхибиторите на EGF-R тирозин киназа служат за предотвратяване на мукусна свръхсекреция след интубация в трахеята.

Увреждане на епитела често се открива при изследване на пациенти дори и със слаба форма на астма, като увреждането нарастващо се свързва с влошаване на клиничните симптоми. Увреждането на епитела получено от алергична реакция, възбужда EGF-R активация, като в резултат се получава свръх нормално производство на гоблетни клетки. EGF-R участва при увреждане на епитела, например “премоделирането на дихателен път”, което се проявява при астма, възстановяване и затваряне на раната. Механично увреждане на епитела и нараняване на епитела при астма, може да включи подобна EGF-R нарастваща последователност, която резултира в свръхнормално нарастване на епителните секреционни клетки.

Свръхсекрецията е също една важна демонстрация на възпалителни заболявания на носа. Когато гоблетни клетки в носа са “раздразнени” чрез индуциране на дегранулат от гоблетни клетки, като се използва нутрофило-зависещ механизъм, изявата на EGF-R и муцини силно се пререгулира. Тези събития са свързани е повторна гранулация на гоблетните клетки. Когато възпаление, като стимулиране на инфилтрат от нутрофили, предизвика разпадане на гоблетни клетки и секреция на муцин, пререгулирането и активация на EGF-R отново доставя муцини в епитела на дихателните пътища.

Преди да се опишат настоящите методи за лечение и състави, трябва да се разбере, че това изобретение не е ограничено до специфични методи и състави, както са описани, тъй като, разбира се, те могат да се променят. Също трябва да се разбере, че използваната тук терминология е само с цел описване на специфични изпълнения и не се счита за ограничаваща, тъй като обхвата на настоящото изобретение ще бъде ограничен само до приложените претенции.

Освен ако не е определено по друг начин, всички използвани тук технически и научни термини имат същото значение, както обикновено се тълкуват от всеки, с нормален опит от практиката, към която принадлежи това изобретение. Въпреки, че в практиката или при изпитване на настоящото изобретение могат да се използват подобни или равностойни методи и материали на тези описани тук, сега са описани предпочитаните методи и материали. Всички публикации, споменати тук са включени в справка, за да се посочат и опишат методите и/или материалите във връзка със цитираните публикации.

Разгледаните тук публикации са дадени единствено с цел тяхното разкриване преди датата на завеждане на настоящата заявка. Тук нищо не може да се тълкува като допускане, че настоящото изобретение не е в правото си да постави в по-ранна дата такава публикация по силата на предхождащо изобретение. Понататък, датите на публикуване могат да се различават от датите на действителната публикация, които може да се наложи да се потвърдят независимо.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Под “фактор на епидермално нарастване” или “EGF” се има в предвид един протеин или част от него имащ биологична активност, характеризираща се от митогенната активност на епителните клетки ((e.g. Cohen (1986) Biosciences Reports 6(12): 1027; Aaronson, S.A., “Growth Factors and Cancer”, Science <1991) 254:1146-1153). Като пример може да се посочи хуманния фактор на епидермално нарастване, например както е описан от Urdea et al., (1983) Proc. Nat. Acad, Sei. 80:7461-7465.

Митогенната активност на EGF върху гоблетни клетки е от особен интерес за целите на настоящото изобретение. В тази дефиниция също се цели да се включат протеини и части от тях, които са функционален еквивалент на EGF по отношение на биологичната реакция предизвикана от EGF.

Под “рецептор на фактора за епидермално нарастване” или “EGFR” се има в предвид един протеин или една част от него, които са в състояние да свържат EGF протеин или част от него. Като пример може да се посочи, рецептора на хуманен фактор на епидермално нарастване (виж Ulrich et al., (1984) Nature 309: 418-425; No за оценка на генна банка NM 005228). За предпочитане, свързването на EGF лиганда активира EGF-R (като в резултат се постига активация на вътрешноклетъчното митогенно сигнализиране, автофосфорилация на EGF-R). Всеки с опит в тази област ще прецени, че други лиганди, в допълнение към EGF, могат да се свържат към EGF-R и да го активират. Примери за такива лиганди включват, но не се ограничават до: TGF-α, бетацелулин, амфирегулин, хепарино-свързващ EGF (ΗΒ-EGF) и нурегулин (също известен като хергулин) (Strawn and Shawver (1998) Exp.-Opin, Invest. Drugs 7(4)553753, and “The Protein Kinase Facts Book; Protein Tyrosine Kinasis” (1995) Hardie, et al., (eds.), Academic Press, NY, NY).

Под “EGF-R антагонист” се има в предвид всеки агент, който е в състояние директно или индиректно да подтиска ефекта от EGF-R, поспециално ефекта от EGF-R върху нарастване на гоблетни клетки или свръхсекреция на мукус от гоблетни клетки. EGF-R може да се задейства по лиганд-зависими и лиганд-независими механизми, като в резултат се постига, съответно автофосфорилация или транс-фосфорилация. Интересните антагонисти на EGF-R могат да подтискат единия или и двата горепосочени механизма, например, свързване на THF-α към EGFR води до една лиганд-зависима фосфорилация, която може да се блокира от едно антитяло, което свързва EGF-R, като по този начин предотвратява взаимодействие на EGF с лиганд, който би активирал рецептора на EGF. Примери на такива антитела са описани от Golds ein et al., (1995) Clin. Cancer res. 1:1311-1318; Lorimer et. al., (1995) Clin. Cancer Res. 1:859-864; Schmidt and Weis (1996) Br. J. Cancer 74:85 3-862. Инхибитори на тирозин кеназа от малка молекула също са ефек ивни като антагонисти на EGF-R.

Като алтернатива е посочено, че съединения като радикали със свободен кислород стимулират трансфосфорилация на EGF-R, като се получава лиганд-независима активация на рецептора. Други средства за активиране на EGF-R от трансфосфорилация включват ултравиолетов и осмотичен стрес, стимулиране на рецептор-куплиран с G-протен от ендотелин-1, лизофосфатидна киселина и тромбин, рецептор на ml мускаринов ацетилхолин, и хормон на хуманен растеж. Антагонистите на този лиганд-независим механизъм включва антиоксиданти, като упер окис дисмутаза, DMSO, DMTU, асорбена киселина и подобните им.

Антагонист на EGF-R може да бъде едно антитяло, което се свързва към фактор, който стимулира получаването на EGF или EGF-R, като по този начин се подтиска помощта на EGF за растежа на гобзетни клетки (т.е. един инхиботор на развитието на фосфорилация, която въздейства на EGF-R). Например, протеин за стапяне от Т 3FaPseudomonas екзотоксин 40, както е описан от Arteaga et al., (1995) Cancer Res. 54:4703-4709.

В едно предпочитано изпълнение, антагониста на EGF-R е един инхибитор на активността на тирозин киназа, по-специално инхибитори от малки молекули, притежаващи селективно действие върху EGF R, в сравнение с други терозин кинази - предпочитаните малки молекули блокират естествения рецептор на EGF-R в млекопитаещо за предпочитане човек и имат молекулно тегло под 1 kD.

Инхибиторите на EGF и EGF-R включват, но не се ограничават до инхибиторите на тирозин киназа, като куиназолини от рода на PD 153035, 4-(3-хлорианилино) куиназолин, или СР-358,774, пиридопиримидини, пиримидопиримидини, пиролопиримидини, като CGP 59326, CGP 60261 и CGP 62706, и пиразолопиримидини (Shawn and Shawver, supra.), 4-(фениламино)- 7H-nnpono[2,3-d] пиримидини (Traxler et al., (1996) J. Med. Chem 39:2285-2292), куркумин (диферулоил метан) (Lexamin arayana, et al., (1995), Carcinogen 16:1741-1745) 4-5-би(4флуороанилино)фталимид (Buchdunger et al., (1995) Clin.Cancer Res 1:813-821; Dinney et al., (1997) Clin. Cancer Res. 3:161-168); тирфостини съдържащи части нитротиофен (Brunton et al., (1996) Anti Cancer Drug Design 11:265-295); инхибиторът на протеин киназа ZD-1839 (AstraZeneca); CP-358774 (Pfizer, Inc.); PD-0183805 (Warner-Lambert); или както са описани в заявка за международен патент W099/09016 (American Cyanamid; WO98/43960 (American Cyanamid); WO97/38983 (Warener Labert); WO99/06378 (Warner Lambert); WO99/06396 (Warner Lambert); WO96/30347 (Pfizer, Inc.); WO96/33977 (Zeneca) и WO96/33980) Zeneca; всички са включени тук като справка; или антисенс-молекули.

Под “подтискане” се има в предвид, неутрализиране, смекчаване или предотвратяване на растежа на гоблетни клетки, дегранулация на гоблетни клетки или свръхсекреция на мукус от гоблетни клетки.

Термините “лечение”, “лекуване” и подобните са използвани тук с общ смисъл, постигане на желан фармакологичен и/или друг физиологичен ефект. Ефектът може да бъде профилактичен, в смисъл на пълно или частично предотвратяване на болест или симптом и/или може да бъде терапевтичен, в смисъл на частично или пълно излекуване на болест и/или вреден ефект допринасящ за болестта. “Лечение”, както е използвано тук, обхваща всяко лечение на болест в млекопитаещо, поспециално човек, и включва:

(а) предотвратяване появата на болест или симптом в един субект, който може да е предразположен към болестта или симптома, но все още не е диагностициран, че ги има;

(в) подтискане на болестта или симптома, т.е. спиране на тяхното развитие; или (с) облекчаване на болестта или симптома, т.е. предизвикване на регресия в болестта или симптома. Изобретението е насочено към лечение на пациенти с белодробни заболявания или заболявания на дихателните пътища, и по специално към лечение на пациенти със свръхсекреция на мукус, т.е. предотвратяване, подтискане или облекчаване на свръхсекреция на мукус. В смисъл лечение на симптоми, изобретението е насочено към намаляване мукус или спутум в дихателните пътища, подтискане на инфекция от паталогични организми, облекчаване на кашлица, и предотвратяване на хипоксия поради запушване на дихателни пътища.

По-специфично, се има впредвид, “лечение” да означава, осигуряване на терапевтично проследим и благоприятен ефект у пациент, страдащ от белодробно заболяване, включващо свръхсекреция на мукус.

Също по-специфично, “лечение” трябва да означава предотвратяване, облекчаване и/или подтискане на свръхсекреция на мукус със състав, избран от групата антагонисти на EGF и EGF-R, като антитела, инхибитори на протеин тирозин киназа и антисенс молекули и подобните им. Алтернативно лечение може да включва предотвратяване изявата на EGF-R в дихателните пътища, като се блокира прохода в ранна фаза. Например, реагенти, които блокират свързването на TNFa към негови рецептори, могат да предотвратят нарастването на EGF-R.

Лечението включва предотвратяване или подтискане на инфекции от паталогични агенти предизвикани от и/или свързани със свръхсекреция на мукус.

Под “антитяло” се разбира един протеин имуноглобулин, които е в състояние да свърже един антиген. Антитяло, както е използвано тук, трябва да включва фрагменти от антитяло, напр. F(ab’)2, Fab’, Fab, които са в състояние да свържат антигена или фрагмент от антигена, ко то се има в предвид. За предпочитане, свързването на антитяло към аи игена подтиска активността на EGF и EGF-R.

Терминът “хуманизирано антитяло” се използва тук, за да спите завършени молекули антитяло, напр. съставени от две завършени леки вериги и две завършени тежки вериги, както и като антитела, със оящи се само от фрагменти от антитяло напр. Fab, Fab’, F(ab’)2 и Fv, където CDR са извлечени от нехуманен изпочник, а остатъчната част от lg мулекулата или фрагмента са извлечени от хуманно антитял о, за предпочитане получено от поредица на нуклеинова киселина закодираща хуманно антитяло.

Термините “хуманно антитяло” и “хуманизирано антитяло” са използвани тук за описание на антитяло, в което всички части на молекулата, както и на фрагменти от антитялото, както са описани погоре в определението за термина “хуманизирано антитяло”.

Терминът “химерно антитяло” обхваща хуманизирани антитела. Химерните антитела имат поне една част от тежка или лека верига от аминокиселинна поредица извлечена от един първи млекопитаещ вид и друга част от тежка или лека верига от аминокиселинна поредица извлечена от втори, различен, млекопитаещ вид. За предпочитане, променливата зона се извлича от нехуманен млекопитаещ вид, а постоянната зона се извлича от един хуманен вид. Специфично, химерното антитяло, за предпочитане, се получава от една нуклеотидна поредица от нехуманно млекопитаещо, закодираща една променлива зона, а една нуклеотидна поредица от хуманен обект, закодираща постоянната част на едно антитяло.

Под “свързва специфично” се има впредвид, силен стремеж и/или силен афинитет за свързване на едно антитяло към специфичен полипептид. Антитяло свързващо се към своя епитоп в един специфичен полипептид е по-силно от свързване на същото антитяло към друг епитоп, особено този който може да се намира в молекули свързани със, или в същата проба, както специфичния полипептид, който се разглежда. Антитела, които се свързват специфично към един разглеждан полипептид, могат да са в състояние да свързват други полипептиди на едно слабо, но забележимо ниво, напр. 10% или по-ниско от свързването демонстрирано към разглеждания полипептид. Такова слабо свързване, или базово свързване, е добре различимо от специфичното антитяло, свързано към съединението или полипептида, който се разглежда, напр. с прилагане на съответни контролни средства.

Посредством “различимо надписано тяло”, “раличим надписан анти-EGF” или различим надписан анти-EGF фрагмент” се има впредвид едно антитяло (или фрагмент от антитяло, който запазва спецификата на свързване), което има прикрепен разпознаваем етикет. Този етикет

нормално се прикрепва посредством химично конюгиране, където етикетът е един полипептид, вариантно той може да се прикрепи с технологиите на генното инженерство. Методите за получаване на различими надписани протеини са добре известни в практиката. Различимите етикети могат да се подбират от едно множество такива етикети известни в практиката, но обикновено това се радиоизотопи, флуорофори, ензими, като пероксидаза от хрян или други части или съединения, които или емитират един различим сигнал (като радиоактивност, флуорисценция, цвят), или емитират един различим сигнал след излагане на етикета на негов субстрат. Различни различими двойки етикет/субстрат (като пероксидаза/диаминобензидин, авидин/стрептавидин, луцифераза/лузиферин), както и методи за надписване на антитела, и методи за използване на надписани антитела

за откриване на един антиген са добре известни в практиката (например, виж Harlow and Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

ТЕРАПЕВТИЧНИ МЕТОДИ

Настоящото изобретение осигурява метод за лечение на белодробна свръхсекреция посредством въвеждане терапевтични количества от антагонисти на EGF-R. Всяко заболяване и особено едно белодробно заболяване, което се характеризира от свръхсекреция на мукус или натрупване на патологични нива от мукус, може да се лекува с описаните тук методи. Примери на белодробни заболявания със свръхсекреция, които могат да се лекуват по този метод включват, но не са ограничени до цитираните заболявания с хронична обструкция на белия дроб, като хроничен бронхит, възпалителни заболявания като астма, бронхиектаза, белодробна фиброза, COPD, заболявания със свръхсекреция през носа, като носови алергии и други заболявания със свръхсекреция. Генетични заболявания като цистична фиброза, Картагенски синдром, недостиг на алфа-Гантитрипсин, вродена нецистична фиброза с натрупване на мукус в дихателния тракт, също се имат в предвид.

Предпочитат се антагонисти, които пряко са насочени срещу EGF EGF-R. При това, всеки с познания и опит в областта ще оцени, че всеки фактор или клетка, които са ангажирани в биологичната поредица, от която се постига стимулиране нарастване на гоблетни клетки от EGF-R може да бъде цел за подтискане с TGFa антагонисти. Без да се обвързва теоритично, една последователност (каскада) започва по време на реакция на възпаление, когато клетки, като масните или нутрофилите освобождават TNFa, който след това стимулира появата на EGF-R. Стимулиране на EGF-R, напр. от негов лиганд EGF, от своя страна, задейства нарастването на гоблетни клетки. По този начин, всички клетки или фактори ангажирани в каскадата, както и в пътеката на THFа, могат да бъдат цел на активността на антагонистите.

Антагонистите за EGF-R въведени по терапевтичния метод могат да бъдат под най-различна форма. По пътя на примера, EGF-R антагониста може да бъде под формата на малка молекула (като антисенс олигонуклеотид, инхибитор на тирозин киназа, и др.) антитела или част от антитела, които се свързват към EGF, TGFa или EGF-R.

МАЛКИ МОЛЕКУЛИ КАТО АНТАГОНИСТИ НА EGF-R

Инхибиторите на тирозин киназа, които действат върху EGF рецептора и са с избирателно действие за EGF-R, са известни в практиката и могат да се използват в предложените методи. По-горе са описани примери, които могат да включват BIBX 1522 Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Germany); CGP59326B (Novartis Corporation, Basel, Switzerland); 4-аминокуиназолин EGF-R инхибитори (описани в патент на САЩ 5,760,041); заместени стеринови съединения, които могат да бъдат също нафталин, индан или един бензоксазин; включително съединения на нитрил и молононитрил (описани в патент на САЩ 5,217,999) инхибиторите разкрити в патент на САЩ 5,773,476; инхибитор от картофена карбоксипептидаза (PCI), един инхибитор на 39-амино киселина протеаза с три дисулфидни моста. (Blanco-Aparicio et al., (1998) J. Biol Chem 273(200:12370-12377); бомбезин антагонист RC-3095 (Szepeshazi et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:10913-10918) и др. Други инхибитори на тирозин киназа включват куиназолини, като D153035, 4-(3-хлороанилино) куиназолин, или СР-358,774, пиридопиримидини, пиримидопиримидини, пиролопиримидини, като CGP 59326, CGP 60261 и CGP 62706, и пиразолопиримидини (Shawn and Shawer, supra.), 4-(фениламино)-7Н-пироло[2,3-0]пиримидини (Traxler et al. (1996) J. Med. Chem 39:2285-2292) куркумин (Korutla et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1224:587:600); (Laxmin arayana(1995), Сдгстоио£еи16:1741-1745);и др.

Предпочитаните инхибитори на тирозин киназа имат избирателно действие към EGF рецептора, като EGF-R рецептора се подтиска в поголяма степен от други рецептори по повърхността на клетката, които имат активност към тирозин киназа. Тази селективност се усилва от методите за подаване на състави и лекарства, т.е. когато инхибитора се подава за предпочитане към възпалените дихателни пътища, и др.

Типичните дозировки за системно въвеждане са в диапазон от 0.1 рг до 100 милиграма на кг тегло от субекта за единично въвеждане. Специалистите могат веднага да оценят, че нивата на дозата могат да се променят като функция от специфичното съединение, тежестта на симптомите и податливостта на субекта към странични ефекти. Някои от специфичните съединения са по-силни от други. Предпочитани дозировки за дадено съединение, могат лесно да се определят от специалистите с разнообразни средства. Едно предпочитано средство е да се измери физиологичната сила на дадено съединение, например с описаните тук изпитвания in vitro и in vivo.

АНТИТЕЛА КАТО АНТАГОНИСТИ НА EGF-R

Антитела като антагонисти на AGF-R представляват специален интерес (напр. Viloria, et al., American Journal of Pathology 151:1523). Антитела за EGF и EGF-R се получават посредством имунизиране ксеногенен имунокомпетентен млекопитаещ приемник, включително мишки, копитни, лагоморфни, овце, свине, говеда и др. с EGF или EGF-R, или техни части. Като имуноген, за предпочитане се използват хуманен EGF или EGF-R, или техни части. Изборът на определен приемник е основно въпрос на удобство. Имунизациите се извършват в съответствие с конвенционалните техники, като имуногенът може да се инжектира подкожно, мускулно, вътрешнокоремно, венозно и др. в животното приемник. Нормално, като имуноген се използват от около 1 мг/кг до около 10 мг/кг от EGF или EGF-R вътрешнокоремно ежедневно. Инжекциите могат да бъдат с или без ажувант, като пълен или непълен ажувант на Freund, спекол, алум и др. След завършване на програмата за имунизация, може да се събере антисерум, в съответствие с конвенционалните начини за получаване на поликлонална антисера специфична за EGF или EGF-R.

От имунизираното животно се получават както моноклонални така и поликлонални антитела, за предпочитане са моноклонални антитела. Поликлоналната антисера може да се събере от серум, по конвенционални методи, от животни след завършване на програмата за имунизация. За получаване на моноклонални антитела, от подходяща лимфоидна тъкан се събират лимфоцити- от далака, източване на лимфен възел, и пр. и се синтезират с подходящ за синтез придружител, обикновено миеломна линия, като се получава една хибридома, която секретира специфично моноклонално антитяло. В съответствие с конвенционалните методи се извършва преглед на клоните на хибридомите за антигенната специфичност, която ни интересува.

От особен интерес са антитела, за предпочитане моноклонални антитела, които се свързват към EGF или EGF-R, така че да подтиснат свързването на EGF към EGF-R, т.е. едно антитяло, което специфично се свързва към извънклетъчната област на EGF-R, като по този начин се предотвратява свързването на EGF. Такива антитела могат да се получат по конвенционалната методология описана по-горе, или по други известни в практиката. Примери за антитела, които биха функционирали като антагонисти на EGF включват, но не се ограничават до: неутрализиращо анти-EGF-R моноклонално антитяло С225 (Kawamoto et al., (1993) Proc. Nat’l. Acad Sci. (USA) 80:1337-1341; Petit et al., (1997) J. Path. 151:1523-153, produced by ImClone Systems Nwe York, NY) и антиEGF-R моноклонално антитяло EMD55900 (също наречено Mab 425), (Merck, Darmstadt, Germany).

Предложените антитела могат да се получат като една единична верига, вместо с нормална мултимерна структура. Антитела от единична верига са описани в Jost et al., (1994) J.B.C. 269:26267-73, и други. ДНК поредиците закодиращи променливата област от тежката верига и променливата област от леката верига, са свързани към един дистанциращ елемент закодиращ поне 4 аминокиселини от малките, неутрални амино киселини, включително глицин и/или серии. Протеинът закодиран с този синтез позволява да се изгради една променлива зона, която съхранява спецификата и афинитета на оригиналното антитяло.

Методите за хуманизиране на антитела са известни в практиката. Хуманизираното антитяло може да бъде животински продукт, имащ гени от постоянна област на трансгенен хуманен имуноглобулин (виж като пример, Международни патентни заявки WO 90/10077 и WO 90/04036). Като вариант такова антитяло може да се постигне с генно инженерство от рекомбиниращи ДНК технологии, за заместване на CHI, СН2, СНЗ, съединяващи области и/или утайки от рамката със съответстваща хуманна поредица (виж WO 92/02190).

Употребата на lg сДНК за изготвяне на гени от химерен имуноглобулин също е позната в практиката (Liu et al. (1987) P.N.A.S. 84:3489 and (1987) J. Immunol. 139:3521. тРНК се изолира от хибридома или друга клетка произвеждаща антитялото, като се използват специфични грундове (Патенти на САЩ 4,683,195 и 4,683,202). Като вариант, може да се направи библиотека, която се преглежда, за да се отдели интересуващата ни поредица. ДНК поредицата, която кодира аМШН променливата област на антитялото, след това се съединява към хуманни поредици от постоянна област. Поредиците гени от хуманни постоянни области могат да се открият в Rabat et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242. Гени от хуманна област С се намират от известни клонове. След това, химерното, хуманизирано антитяло се изразява по конвенционални методи.

Фрагменти от антитяло, като Fv, F(ab’)2 и Fab могат да се получат с кливаж на недокоснатия протеин, напр. с протеаза или химичен кливаж. Като вариант се конструира един отрязан ген, например, един химерен ген закодиращ част от фрагмент на F(ab’)2 би включвал ДНК поредици закодиращи СН1 област и свързваща област от една Н верига, последвани от един преводен стоп кодон, за да се извлече срязаната молекула.

В индивид страдащ от заболяване със свръхсекреция на мукус, отначало могат да се въвеждат количества от антагонист на EGF-R в диапазон от около 20 мг до около 400 мг за кг тегло на пациента, два пъти дневно, напр. чрез инхалация.

АНТИСЕНС МОЛЕКУЛИ КАТО АНТАГОНИСТИ НА EGF-R

В едно друго изпълнение на изобретението, предлаганите терапевтични агенти са антисенс молекули, специфични за хуманни поредици кодиращи за EGF или EGF-R. Въвежданият терапевтичен агент могат да бъдат антисенс олигонуклеотиди, по-специално синтетични олигонуклеотиди имащи химични модификации от естествени нуклеинови киселини, или строежи от нуклеинова киселина, които демонстрират такива антисенс молекули като РНК. Антисенс поредицата е допълнителна към шРНК на атакуваните EGF или EGF-R гени и подтиска изявата на атакуваните гении продукти (виж напр. Nyce et al. (1997) Nature 385:720). Антисенс молекулите подтискат генната изява посредством намаляване на количеството от тРНК, което е налично за транслация, чрез активация на PHKse Н или пространствено препятствие. Могат да се въвеждат една или комбинация от няколко антисенс молекули, като комбинацията може да включва многобройни различни поредици от единичен атакуван ген или поредици, които допълват няколко различни гена.

Един предпочитан атакуван ген е EGF или EGF-R. Достъп до генната поредица може да се получи посредством обществено достъпна базаданни (хуманен фактор за епидермален растеж, достъп до Геннабанка No К01166; хуманна мРНК за предшественик на рецептор на фактор за епидермален растеж, достъп до Геннабанка No Х00588). Обикновено, антисенс поредицата би имала същите родове на произход както животинския приемник.

Антисенс молекулите могат да се получат посредством изява на всички или една част от атакуваната генна поредица в подходящ вектор, като векторът се въвежда и представя в атакуваните клетки. Началото за транскрибиране е ориентирано по такъв начин, че антисенс снопчето се получава като една РНК молекула. Антисенс РНК хибридизира с ендигенното чувствително (сенс) снопче тРНК, като блокира изявата на атакувания ген. Може да се използва областта на естествено начало на транскрибиране, или една екзогенна област на естествено начало на транскрибиране. Ускорителят (промотора) може да се въведе посредством рекомбиниращи методи in vitro, или като резултат от хомоложна интеграция на поредицата в хромозома. В практиката са известни много, силни ускорители, които действат в мускулни клетки, включително β-ацтин ускорител, SV40 ускорители с ранно и бавно действие, ускорител от хуманен цитомегаловирус, ретровирусни LTR-и и т.н.

Векторите на транскрипция, обикновено притежават удобни страни за ограничение, разположени в близост до поредицата на ускорителя, за да се спомогне за вместването на поредиците от нуклеидни киселини. Касети за транскрипция могат да се изготвят, като се включи една област за начало на транскрибиране, атакувания ген или фрагмент от него, и една област за завършване на транскрипцията. Касетите за транскрипция могат да се въвеждат в множество от вектори, като пазмид, ретровирус, или линтивирус; и подобните им, като векторите имат възможност да се задържат в клетката в преходно или стабилно състояние, обикновено за период от поне един ден, по-често за период от поне няколко дни.

Като вариант, в едно предпочитано изпълнение на изобретението, антисенс молекулата е един синтетичен олигонуклеотид. Антисенс нуклеотидите в общия случай са от около 7 до 500, обикновено от 12 до 50 нуклеотиди, по-често от около 20 до 35 нуклеотиди, като дължината се регулира от ефективността на подтискането, спецификата, включително и липсата на кръстосана реактивност и други подобни. Открито е, че късите олигонуклеотиди, на дължина от 7 до 8 бази, могат да бъдат силни и избирателни инхибитори на генна изява (виж Wagner et al. (1996) Nature Biotrchnology 14:840-844).

Избира се една специфична област или области от ендогенното чувствително снопче от гпРНК поредица, която да се допълни от антисенс поредицата. Показано е, че 5’ област от шРНК е особено податлива на антисенс подтискане. При това, последни факти показват, че анализът на вторичната структура на шРНК може да има важна роля за достъпността на страните към подтискане. Подборът на една специфична поредица от олигонуклеотиди може да ползва един емпиричен метод, при който няколко предложени поредици се изследват за подтискане изявата на атакувания ген в един in vitro или животински модел. Една комбинация от поредици може също да се използва, като няколко области от шРНК поредица се подбират за антисенс допълване.

Антисенс олигонуклеотидите могат да се синтезират по химичен път с известни в практиката методи (виж Wagner et al. (1993) supra, и

Milligan et al., supra.). Предпочитаните олигонуклеотиди са химически модифицирани от естествена фосфодиестерна структура, с цел да се увеличи тяхната вътрешноклетьчна устойчивост и афинитет за свързване. В литературата са описани няколко такива модификации, които променят химията на скелета на олигонуклеотида, захари или хетероциклични бази.

Олигонуклеотидите могат да включват допълнително една атакуваща част, която засилва приема на молекулата от клетките. Атакуващата част, специфично свързва молекулите, напр. едно антитяло или част от него, което разпознава молекулите налични по повърхността на белодробните епителни клетки, по-специално, епителни клетки съдържащи EGF-R.

В практиката са известни двойно специфични антитела, химерни антитела и антитела с единична верига. Подходящо приготвени нехуманни антитела могат да се хуманизират по различни начини. Връзката между олигонуклеотида и атакуваната част може да се осъществява по всеки конвенционален метод, например от дисулфидна, амидна или тиоетерна връзка, в зависимост от химията на скелета на олигонуклетида. За препочитане е връзката да бъде разцепена вътре в клетката, за да се освободи олигонуклеотида.

Олигонуклеотидите могат да бъдат конюгирани към хидрофобни утайки, напр. холестерол, за да се предпазят ядрата и да се подобри преноса през мембраните на клетките. Като вариант, конюгиране към поли-Ь-лизин или други полиамини може също да засили подаването към клетката. Може да се направи и друга модификация, посредством добавяне на един вместващ се компонент, като акридин, който е в състояние да се вмести в атакуваната тРНК и да стабилизира получения в резултат хибрид. Антисенс олигонуклеотиди модат да бъдат в комбинация с ензим(и), който деградира антисенс-тРПК комплекси в клетката, напр. РНназа-Н. По подобие, може да бъде полезен и всеки протеин или ензим, който може с предимство да деградира или отдели антисенс-mPHK дуплекс.

Като алтернатива на антисенс инхибиторите, за подтискане на генна изява, могат да се използват каталитични съединения на нуклеидна киселина, напр. рибозими, антисенс конюгати и др. Рибозими могат да се синтезират in vitro и да се въвеждат в пациент, или могат да се кодират в един вектор на изява, от който се синтезира рибизима в атакуваната клетка (например, виж заявка за международен патент WO/9523225, и Beigelman et al. (1995) Nucl. Acids Res 23:4432-42). Примери за олигонуклеотиди c каталитична активност са описани в WO 9506764. Конюгати на антисенс олигонуклеотиди с един метален комплекс, напр. терфиридилСи(И), които са в състояние да способстват за хидролиза на тРНК са описани в Bashkin et al. (1995) Appl Biochem Biotechnol 54:43-56

ФАРМАЦЕВТИЧНИ РЕЦЕПТУРИ

Антагонисти на EGF-R могат да се постигнат в разтвор или под всяка друга фармацевтично подходяща форма за въвеждане , като една липозомна суспензия. Подходящите антитела или друга форма на антиEGF са предписани за въвеждане по един обичаен начин за въвеждане на такива материали. Типични рецептури са посочени в последното издание на Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Пътят за въвеждане се избира на база съединението, което ще се въвежда, състоянието на пациента и заболяването, което ще се лекува. Когато е налице свръхсекреция на мукус, съединението може да се въведе по различни пътища, в зависимост от тежестта на заболяването, напр. спешните случаи могат да изискват въвеждане in vitro , остри, но не застрашаващи живота състояния могат да се лекуват орално, докато хронично лечение може да се провежда с аерозол.

За терапевтична употреба при заболявания на носа и дихателните пътища се предпочита локално подаване. Подаването посредством инхалация на аерозоли осигурява високо ниво на концентрациите на лекарството, в сравнение с концентрацията при системно приемане. Като вариант, антагониста на EGF може да се въвежда чрез инжектиране, включително мускулно, венозно (IV), с подкожни или коремни инжекции, за предпочитане IV и локални инжекции. При това, могат да се използват и други форми за въвеждане, при положение, че са на разположение средства, които позволяват на антагониста на EGF-R да влезе в системна циркулация, като мускулни и подкожни рецептури, които могат да се приложат като капсули, лепенки или през носа. Всяка подходяща рецептура, която влияе на преноса на антагониста на EGF-R към кръвообращението или локално в белите дробове може да се използва правилно.

За инжектиране, обикновено подходящите рецептури включват водни разтвори или суспензии с използване на физиологичен солен разтвор, разтвор на Hank, или други буфери, вариантно съдържащи стабилизиращи агенти или други малки компоненти. Могат да се използват липозомни препаратури или други форми на микроемулсии. Антагонистът на EGF-R може също да се достави в лиофилизирана форма и да се преобразува за въвеждане. Мускулните и подкожни въвеждания, в общия случаи, включват агенти, които подпомагат преминаването през мускулната или кожна бариера, като жлъчна течност, соли, фусидна киселина и техните аналози, различни дезинфектанти и подобните им. Оралното въвеждане е също възможно, при положение, че са предписани подходящи ентерични покрития, за да се даде възможност на антагонистите на EGF-R оцелеят в храносмилателния тракт.

Естеството на рецептурата ще зависи до известна степен от естеството на избрания EGF-R антагонист. Една подходяща рецептура се изготвя като се използват познатите технологии и принципи за рецептури, които са добре известни на специалистите от практиката. Процентът на EGF-R антагонисти съдържащи се в даден фармацевтичен състав също ще зависи от естеството на рецептурата; процентът на един EGF-R антагонист, който представлява антитяло типично ще се изменя в широк диапазон от около 1% по тегло до около 85% по тегло.

В практиката са известни много методи за подаване, за да се усили приемането на нуклеиновите киселини от клетките. Полезните системи за подаване включват вирусно-липозомни системи за подаване на Sendai (Rapaport and Shai (1991) J. Biol. Chem. 269:15124-15131), катионни липозоми, полимерни гели за подаване или матрици, катетри с порест балон (както са разкрити от Shy et al. (1994) Circulation 90:955-951; and Shi et al. (1994) Gene Therapy 1:408-414). вектори за изява на ретровируси и подобни.

Употребата на липозоми като транспотиращо средство за подаване е един интересен метод за прилагането на EGF-R антагонисти. Липозомите се сливат с клетките в атакуваната страна и подават съдържанието на лумена вътрешноклетьчно. Липозомите остават в контакт с клетките за време достатъчно за сливане, като се използват различни средства, за да се запази контакта, като изолиране, свързващи агенти и подобни. Липозоми могат да се изготвят с пречистени протеини или пептиди, които посредничат при проникване през мембраните, като вирус на Sendai или грипен вирус и др. Липидите могат да бъдат всяка полезна комбинация от известни липозоми, образуващи липиди, включително катийонни липиди, като фосфатидилхолин. Остатъчния липид нормално представлява неутрални липиди, като холестерол, фосфатидил серин, фосфатидил глицерол и подобни. За изготвяне на липозоми, може да се използва процедурата описана от Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361.

В едно предпочитано изпълнение, EGF-R антагониста е капсулиран в стерилно стабилизирани “прикрити” липозоми т.е. закрепени липозоми. Когато такива липозоми се инжектират i.v., те остават в кръвообръщението за дълги периоди. Следкапилярните възли в междини на вените се отварят при възпаление на дихателните пътища и дават възможност да се събира течност и оставят молекули, напр. добавка, кининоген, да навлязат в тъканите, като поставят начало на възпалителни каскади. Такова възпаление позволява на липозомите и тяхното съдържание да се отлага селективно във възпалената тъкан (Zhang et al. (1998) Pharm Res 15:455-460).

EGF-R антагонисти могат да се въвеждат в засегнат пациент посредством една фармацевтична система за подаване по дихателен път. Съставите могат да се формулират във форма подходяща за въвеждане чрез инхалиране. Системата за фармацевтично подаване е тази, която е подходяща за респираторна терапия посредством въвеждане на EGF-R антагонисти към мукозните линии на бронхите. Настоящото изобретение може да използва система, която зависи от силата на сгъстен газ за изтласкване на EGF-R антагонистите от контейнер. За тази цел може да се използва аерозол или комплект под налягане.

Както е използван тук, терминът “аерозол” се използва в неговия конвенционален смисъл, колкото се отнася до пренасяне на много фина течност или твърди частици от движещ се газ под налягане към мястото на терапевтично приложение. Когато един фармацевтичен аерозол се прилага в това изобретение, той съдържа терапевтично активно съединение, което може да се разтвори, суспензира или емулгира в една смес от течен носител и движеща среда. Аерозолът може да бъде под формата на разтвор, суспензия, емулсия, прах или полутвърда препаратура. Аерозолите включени в настоящото изобретение са предназначени за въвеждане като фини, твърди частици или като течни мъгли през дихателния тракт на пациента. Могат да се използват

различни типове движещи среди, които са известни на специалистите от практиката. Примери за подходящи движещи среди включват, но не са органичени до: въглеводороди или други подходящи газове. В случая с аерозол под налягане, единичната доза може да се определи, като се посочи стойност за подаване от измерено количество.

Настоящото изобретение може също да се осъществи с пулверизатор, който представлява уред за създаване на много фини частици течност, с преобладаващо еднаква форма, в газ. За предпочитане е течност съдържаща EGF-R антагонисти да се разпръсне на капчици. Малките капчици могат да се носят от газов поток през изходящата тръба на пулверизатора. Получената мъгла прониква в дихателния тракт на пациента.

Един прахов състав, съдържащ EGF-R антагонисти или техни аналози, със или без лубрикатор, носител или движеща среда, могат да се въвеждат в млекопитаещо, което се нуждае от терапия. Това изпълнение на изобретението може да се постигне с конвенционално устройство за въвеждане на прахообразен фармацевтичен състав чрез инхалация. Например, прахова смес от състава и един подходящ базов прах, като лактоза или нишесте могат да се представят в единична доза, като например капсула или патрон, напр. желатин или блистерни опаковки, от които прахът може да се въвежда с помощта на инхалатор.

За лечение на белодробни заболявания със свръхсекреция могат да се използват комбинация от терапии. По специално, EGF-R антагонисти могат да се комбинират с конвенционално лечение за облекчаване на свръхсекрецията, като бронхиодилатори, експекторанти, муколитични агенти и подобните им за подпомагане очистването на мукуса.

В зависимост от състоянието на пациента, може да е за предпочитане да се подаде състав от настоящото изобретение с инжектиране (напр. венозно) или чрез инхалация. Пациенти с голямо количество мукус в дробовете, в общия случай не могат първоначално да

I се лекуват с инхалация. Това се дължи на факта, че белите дробове на пациента са със значителни обструкции, така че вдишването на аерозолни състави в дробовете може да не е особено ефективно. При това, след лечение с инжекции или, като вариант, поддържане за продължителен период или в случаи когато дробовете на пациента не са сериозно запушени, се предпочита въвеждане с инхалация. Това се предпочита, защото по-малките дози могат да се насочат локално до специфични клетки, които най-много се нуждаят от лечение. С подаване

на по-малки дози, се елиминират или значително се намаляват всички неблагоприятни странични ефекти. Посредством подаване директно в клетките, които най-силно се нуждаят от лечение, ефектът от лечението се постига по-бързо.

Съществуват няколко различни типа методологии за инхалация, които могат да се приложат във връзка с настоящото изобретение. Антагонисти от настоящото изобретение могат да се формулират основно в три различни типа от състави за инхалация. Първо, анатагонисти от изобретението могат да се съчетаят с движещи среди с ниска точка на кипене. Такива състави, в общия случай се въвеждат с конвенционални дозиметрични инхалатори (MDI). При това конвенционалните MDI могат да се модифицират така, че да се увеличи способността да се получава повторяемост на дозирането, като се използва технология, която измерва дихателния обем и дебит на пациента, както е разгледано в патенти на САЩ 5,404,871 и 5,542,410.

Като вариант, антагонистите от настоящото изобретение могат да се включат във водни или етанолови разтвори и да се въвеждат с конвенционални пулверизатори. При това, за предпочитане е, такива състави-разтвори да са аерозолни, като се използват устройства и системи, както са разкрити в патенти на САЩ 5,497,763; 5,544,646; 5,718,222 и 5,660,166.

И на последно място, съставите от антагонисти според настоящото изобретение могат да се изготвят като рецептури от сух прах. Такива рецептури могат да се въвеждат с обикновено вдишване на сухия прах след създаване на аерозолна мъгла от праха. Технология за това е описана в Патент на САЩ 5,775,320 издаден на 7 юли, 1998 г. и Патент на САЩ 5,740,794, издаден на 21 април, 1998 г.

Съобразявайки се със всички патенти цитирани по-горе, заявителите отбелязват, че тези патенти цитират други публикации в областта на белодробното въвеждане на лекарства и такива публикации трябва да се имат в предвид за специфичната методология, устройства и рецептури които могат да се използват във връзка с подаването на антагонисти от настоящото изобретение. По-нататък, всеки от тези патенти е включен тук с цел отнасяне към тяхната пълнота за целите на разкритите рецептури, устройства, опаковка или методология за подаване на рецептури с антагонисти от настоящото изобретение.

ИЗСЛЕДВАНИЯ ЗА ПРОВЕРКА

Предлагани лекарства

За да се определят предлагани биоактивни агенти като антагонисти на EGF могат да се използват изследвания за проверка. От особен интерес са изследвания за проверка на агенти, които имат слаба токсичност за хуманните клетки. За тази цел могат да се използват широк спектър от изследвания, включително надписани in vitro изследвания за свързване протеин към протеин, изпитвания за изместване на електрофоретна мобилност, имуноизследвания за свързване на протеини, и подобните им. Пречистения EGF или EGF-R протеин могат също да се използват за определяне на тримерната кристална структура, която може да се използва за моделиране на молекулното взаимодействие, преносна функция и др.

Терминът “агент”, както е използван тук, описва всяка молекула, напр. протеин или фармацевтично средство със способност за изменение или подтискане на физиологичната функция на EGF или EGF-R. В общия случай, едно множество от смеси за изследване успоредно действат при различни концентрации от агента, за да се получи различима реакция към различните концентрации. Обикновено, една от тези концентрации служи като отрицателен контрол, т.е. при нулева концентрация или под нивото на откриване.

Кандидатстващите агенти обхващат многобройни химически класове, въпреки че типично, това са органични молекули, за предпочитане органични съединения с молекулно тегло от над 50 и под около 2500 далтона. Кандидатстващите агенти включват функционални групи необходими за структурно взаимодействие с протеини, по специално свързващи водород и обикновено включват поне един амин, карбонил, хидроксилна или карбоксилна група, за предпочитане, поне две от функционалните химични групи. Участващите агенти често обхващат цикличен въглерод или хетероциклични структури и/или ароматни или полиароматни структури, заместени с една или повече от горните функционални групи. Агентите участници също могат да се открият измежду биомулекулите, включващи пептиди, захариди, масни киселини, стероиди, пурини, пиримидини, производни, техни структурни аналози или комбинации.

Кандидат агентите се получават от широк спектър източници, включващ библиотеки от синтетични или естествени съединения. Например, налице са многобройни средства за произволна или директна синтеза на широк спектър от органични съединения и биомулекули, включващи изява на произволни олигонуклеотиди и олигопептиди. Като вариант, налице са или се получват библиотеки от естествени съединения, под формата на бактериални, гъбични, растителни и животински екстракти. В допълнение, естествени или синтетично

произведени библиотеки и съединения могат лесно да се модифицират с конвенционални химични, физични и биохимични средства, и могат да се използват за получаване на комбинаторни библиотеки. Известни фармакологични агенти могат да се подложат на насочени или произволни химични модификации, като ацилация, алкилизация, естерификация, амидификация и т.н., за да се получат структурни аналози.

Когато изследването за проверка е едно изследване за свързване, една или повече от молекулите могат да се съединят към един етикет, като етикетът може пряко или непряко да подава различим сигнал. Различните етикети включват радиоизотопи, флуорисценти, химилуменисценти, ензими, специфични свързващи молекули, частици, като магнитни частици и подобните им. Специфичните свързващи молекули включват двойки, като биотин и стрептавидин, дигоксин и антидигоксин и др. При специфични свързващи участници, спомагателния агент нормално се надписва с една молекула, която позволява проследяване, в съответствие с известна процедура.

В изследванията за проверка могат да се включат разнообразни други реагенти. Те включват реагенти като соли, неутрални протеини, напр. албумин, дезинфектанти и др., които се използват за да се подпомогне оптимално свързване на протеин към протеин и/или да се намалят нехарактерни или базови взаимодействия. Могат да се използват реагенти, които подобряват ефективността от изследването, като инхибитори на протеаза, инхибитори на нуклеаза, антимикробни агенти и др. Сместа от компонентите се добавя в ред, който осигурява необходимото свързване. Извършва се инкубиране при подходяща температура, обикновено между 4 и 40°С. Периодите за инкубиране се подбират с цел оптимална активност, но могат също да се оптимизират, за да се спомогне за бърз преглед. Обикновено за достатъчни от 0.1 до 1 час.

Съединенията с желаната фармацевтична активност могат да се въвеждат с един физиологично приемлив носител в пациента за лечение на заболяване със свръхсекреция с описаните тук рецептури. В зависимост от характера на въвеждане, съединенията могат да се формулират по различни начини, които са описани тук. Концентрацията на терапевтично активно съединение в рецептурата може да се изменя от около 0.1 -100% по тегло.

Режим на дозиране

Подходящото ниво на дозиране ще се изменя в зависимост от определен брой фактори, включващи субекта който ще се лекува, естеството на състоянието на свръхсекреция, което ще се лекува и неговата тежест, естеството на EGF-R антагониста, който се прилага като активна съставка, формата на въвеждане, рецептурата и преценката на практикуващия лекар. Например, когато антителата се въвеждат от самосебе си, като анти-EGF или EGF-R в състав за инжектиране, дозировките са в диапазон от 20 мг/кг до около 40 мг/кг като единична доза. Може да се изисква повторно въвеждане след период от няколко дни или въвеждане с венозни средства за дълъг период. При хронични условия, ако е необходимо въвеждането може да продължи за по-дълги периоди.

Ефикасността на режима на дозиране се определя с оценка подобрената функция на белите дробове на пациента. Тази оценка може да включва измерване вискоеластичностга на спутума, подобрения на белодробната функция, включително подобрения в принудително изследван обем от спутум и максимален дебит на издишване. Преждеспоменатия терапевтичен режим може да бъде зададен във връзка със съпътстващи терапии, като антибиотици, ДНКаза I или други текущи терапии за лечение на белодробно заболяване със свръхсекреция. Ако антибиотиците се въвеждат като част от лечението на пациента, след терапията може да се включи количествена оценка на бактериите, с цел да се оцени ефикасността на лечението от намален бактериален растеж, намаляване вискозитета на мукуса или спутума и нарастване прочистването на белите дробове от мукус или спутум.

Изпитванията за оценка функцията на белия дроб, както и диагностични изпитвания за клинично развитие на белодробното заболяване със свръхсекреция са известни на специалистите в практиката. Стандартните изпитвания на белодробната функция включват съпротивление на дихателния път (AR); принуден витален капацитет (FVC); принуден обем на издишване за 1 сек (FEV(l)); принуден среден обем на издишване; и върхов дебит на издишване (PEFR). Други функционални белодробни изпитвания включват газов анализ на кръвта; лекарствена реакция; изпитване на дразнене и упражнения; измерване силата на дихателните мускули; изследване на дихателните пътища с оптични влакна; и подобните им. Някои основни процедури за изучаване на свойствата на мукус включват реология, напр. с използване на магнитен микрореометьр, прилепчивост, за да се характеризират силите на привличане между повърхност на прилепване и една система за прилепване, като се измерва ъгълът на контакт между капка мукус и повърхността. Преносът на мукус от цилиа (влакна по повърхността на клетките) може да се изследва с помощта на конвенционални технологии, както и с пряко измерване, напр. in situ на прочистването на мукуса. Трансепителната потенциална разлика, като нетен резултат от активността на йонно-преносната система на белодробния епител, може да се измери като се използват подходящи електроди. За да се характеризира състоянието на епителната повърхност, могат да се използват методите на количествена морфология.

Лекуваният пациент може да бъде примат, като човек, или всяко друго животно у което се демонстрират описаните симптоми. Тъй като методът на изобретението е специално пригоден за лечение на хуманни пациенти, става ясно, че изобретението е приложимо също и във ветеринарната практика.

Изследване за преглед in-vitro

В друго изпълнение на това изобретение, се използват изследвания in vitro, за да се оцени терапевтичния потенциал на предлаганите агенти да подтискат нарастването на гоблетни клетки, т.е. доколко такива агенти са активни като антагонист на EGF. В общия случай, такива изследвания обхващат следните етапи: (i) контакт на in vitro модел на нарастване на гоблетна клетка с EGF или негов функционален еквивалент; (ii) последващ контакт на in vitro модела с предлаган агент; (iii) оценка нарастването на гоблетната клетка, като подтискане на нарастването на гоблетната клетка е показателно за терапевтичния потенциал на предлагания агент.

Изследването, за предпочитане, се провежда с две контроли, като втора група клетки не влиза в контакт със съединение, а трета група е в контакт с EGF, но не и с предлагания агент. След което се правят сравнения, за да се определи степента на ефекта от EGF и от предлагания агент върху клетките.

Може да се използва всеки in vitro модел на нарастване на гоблетни клетки. Като пример, трахейни клетки от плъх могат да се изолират и запазят в култура, както е описано в Guzman et al. (1995) 217:412-419. Накратко, трахейните клетки от плъх се поставят върху полупропускливи мембрани покрити с колаген гел, като отначало те се култивират потопени в среда, а в последствие се поддържат в допир с въздух/течност. Образците от in vitro клетки включват първични хуманни бронхиални клетки (получени от Clonetics, San Diego); NC1-H292 клетки (ATCC CRL-1848); и A431 клетки (ATCC CRL-1555).

In vitro културата влиза в контакт с EGF и предлагания агент. Предлаганият агент може да контактува с културата преди, едновременно или в последствие добавянето на EGF, в зависимост от крайната точка за оценка и естеството на предлагания агент. Култивираните клетки се оценяват за подтискане нарастването на гоблетни клетки, което е свързано със средствата за контрол.

За оценка нарастването на гоблетните клетки могат да се използват различни молекулни или биохимични маркери. Образци молекулни и биохимични маркери, които могат да се използват, включват, но не се ограничават до: генна изява или протеинова изява характерна за гоблетни клетки. Някои гени на муцин, като MUC5W (Desseyn et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:3168-3178) се изявяват в дихателния път, и имат генен продукт силно изразен в мукуса. Изявата на гени от муцин осигурява подходящ маркер за определяне производството на мукус.

Изявата на ген на муцин може да се оцени с конвенционална технология като анализ със северно оцветяване (омастиляване), реакция на верига полимераза (PCR), изпитване за изява на ген на муцин, или анализ in situ. Като вариант, протеини на муцин се оценяват по конвенционална методология, като анализ със западно оцветяване, ELISA, имунохимия и подобните им, като се използват забележимо надписани антитела. За определяне присъствието или отсъствието на гоблетни клетки в културата също могат да се използват морфологични критерии; като оцветяване на муцини с Алпийско синьо/PAS оцветяване (Lou et al. (1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:1927-1934). Антитела спрямо муцини могат да се изследват с изследвания ELISA. Тъй като стимулирането на EGF-R от един лиганд, като EGF, TGF-α индуцира фосфорилация на киназа в специфичен рецептор на EGF и се произвеждат гоблетни клетки, фосфорилацията на EGF-R може да се измери като отражение на индукцията на гоблетни клетки (Donato et al. (1984)7 Biol. Chem. 264:20474-20481).

Намаляването на молекулните или биохимични маркери, свързано с нарастване на гоблетни клетки е показателно за терапевтичния потенциал на антагониста.

Модели in vivo

В друго изпълнение на изобретението, за оценка терапевтичния потенциал на предлагани агенти да подтискат нарастването на гоблетни клетки се използват животински модели in vivo. Обикновено изследването включва следните етапи: (i) създаване на животински модел на белодробно заболяване със свръхсекреция, посредством индуциране изявата на EGF-R; (ii) стимулиране индуцирания EGF-R да произведе гоблетни клетки произвеждащи муцин; (iii) лечение с предлагания агент; и (iv) оценка нарастването на гоблетни клетки или секреция на мукус, като подтискането на нарастването на гоблетни клетки или секреция на мукус е показателно за терапевтичния потенциал на предлагания агент.

Може да се използва всеки модел in vivo на белодробно заболяване със свръхсекреция. По пътя на примера, тук се предлага един модел на астма при мишки, както е описан от Temann et al. (1997) Am. J. Respir. Cell. Biol. 16:471-478. Като вариант, може да се използва един модел при плъх, както е описан от Takeyama et al. (1998) Am. J. Physiol. Примери на други животински модели, които могат да се използват, включват без да се оганичават до: Гвинейски прасета (вид, който съществено изявява гоблетни клетки) и плъхове.

Белодробна тъкан или трахейна тъкан от животинските модели може да се оценява със същите молекулни и биохимични маркери, както са описани за модела in vitro. Намаляване нарастването на таблетните клетки е показател за терапевтичния потенциал на EGF-R антагониста.

За да се представи на специалистите от практиката с нормални познания, едно пълно разкритие и описание, как да работят и използват

настоящото изобретение, са представени следните примери, като те нямат за цел да ограничат обхвата на това, което изобретателите считат за свое изобретение, както и нямат за цел да представят, че експериментите дадени по-долу са всички или единствените извършени експерименти. Положени са усилия да се осигури точност по отношение на използваните цифри (като количества, температури, и др.), но трябва да се даде сметка и за някои експерментални грешки и отклонения. Освен ако не е посочено по друг начин, части са части по тегло, молекулно тегло е средно молекулно тегло, температурата е в градуси по Целзий, а налягането е близо или равно на атмосферното.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛНА ЧАСТ

ПРИМЕР 1

EGF - СИСТЕМА РЕГУЛИРА ПРОИЗВОДСТВОТО НА МУЦИН В

ДИХАТЕЛНИТЕ ПЪТИЩА

Хиперплазия на гоблетни клетки се появява при различни заболявания на дихателните пътища със свръхсекреция, но тъй като не са известни скритите механизми, не съществува ефективна терапия. В здрави дихателни пътища, гоблетните клетки са малко, но при заболявания на дихателните пътища със свръхсекреция се проявява хиперплазия на гоблетните клетки. Беше изследвана една хуманна бронхиална клетъчна линия (NC1-H292). Тези клетки съществено изявяват EGF-R; изявата на EGF-R гени бе стимулирана допълнително от фактор на туморна некроза алфа (TNF-α). EGF-R лиганди, увеличават синтеза на муцини, като този ефект бе засилен от съвместна инкубация с

TNF-a.

Епителните клетки от плъхове без патоген изявяват малко EGF-R протеин, но вътрешнотрахиално по капково внасяне на TNF-a (200 ng) индуцира EGF-R в базисни, пред-гоблетни и гоблетни клетки, но не и в клетки с цилия; самостоятелно TNFa, EGF или TGFa не индуцират производство на гоблетни клетки. При това, по капково внасяне на TNFa, последвано от EGF-R лиганди води до нарастване броя на гоблетни и пред-гоблетни клетки и ударно нарастване в Алцийско синьо/PAS положително оцветяване (отразяващо мукозни гликоконюгати) и изява на ф MUC5 ген. При сенсибилизирани плъхове, овалбумина води до производство на гоблетни клетки и изява на EGF-R в епитела на дихателните пътища. В клетки NCL-H292, в плъхове стимулирани с TNFa, последвано от EGF-R лиганди, и при модел на астма в плъхове, предварително лечение с инхибитор на EGF-R тирозин киназа (BIBX1522) предотвратява производството на гоблетни клетки в дихателните пътища. Тези открития определят роля за инхибиторите на EGF-R каскада при заболявания на дихателните пътища със свръхсекреция.

© МЕТОДИ

ИЗСЛЕДВАНИЯ IN VITRO

Клетъчна култура. Хуманна белодробна мукоепидермоидна карциномна клетъчна линия, NCL-H292 клетки, прорастват в среда RPMI 1640, съдържаща 10% серум от говежди ембрион, пеницилин (100 U/ml), стрептомицин (100 μτ/мл) при 37°С в инкубатор с водна риза и 5% СО₂. В течно състояние, клетките се инкубират с EGF (рекомбиниран хуманен EGF, 25нг/мл, Genzyme, Cambridge, МА), TGFa (рекомбиниран хуманен TGFa, 20 нг/мл, Genzyme), EGF (25 нг/мл), плюс TNFa (20 нг/мл) или TGFa (25 нг/мл), плюс TNFa (20 нг/мл) за 12 ч., 24 ч. или 48 ч. При изследвания за подтискане с инхибитор на EGF-R тирозин киназа, BIBX1522 (10 цг/мл, щедро осигурени от Boehringer Ingelheim Inc. Germany), клетките са предварително обработени с BIBX 1522 30 мин преди да се добавят фактори за растеж. След инкубация, за пълна екстракция на РНК или екстракция на протеин са използвани клетки прорасли в колба Т-75, за да се представят визуално муцините са използвани 8-камерни слайди за оцветяване с Алпийско синьо/PAS.

Западно оцветяване. Клетки прорасли в колби Т-75 се лизират (дезинтегрират) и изгребват с PBS, съдържащ 1% Тритон X, 1% натриев диоксиколат и PMSF (10 мг/мл). Общото количество протеин се оценява с ВСА реагент за изследване на протеин (Pierce, Rockford, IL). Лизатите на клетките се сваряват в буфер от проба на Трицин и 2% βΜΕ при 95°С. Протеините се отделят от SDS-PAGE в 8% акриламидни гели. Получените в резултат гели се балансират в преносния буфер: 25шМ Три-НС1, 192 тМ глицин, 20% (vol/vol) метанол, pH 8.3. След това протеините се пренасят чрез електрофореза към нитроцелулозни мембрани. Мембраните се инкубират за 1 ч. в 5% обезмаслено мляко в PBS съдържащ 0.05% Tween 20. След което мембраните се инкубират с моноклонално анти- EGF-R антитяло от мишка (1:100) за една нощ при 4°С. Свързаното антитяло се показва визуално, съгласно стандартни протоколи за комплексен метод за авидин-биотин-алкална фосфатаза (ABC kit, Vector Laboratories). За положителен контрол за EGF-R се използват клетъчни лизати от А431 клетки (20).

Имуноцитохимична локализация на EGF-R в NCI-H292 клетки. Клетки прораснали върху 8-камерни слайди се фиксират с 4% параформалдехид за 1 ч. За да се оцвети наличието на EGF-R, като разредител за антитялото се използва PBS съдържащ 0.05% Tween 20.2% нормален серум от коза и 2 тМ ливамизол. Части са инкубирани с моноклонално антитяло от мишка към EGF-R (1:250) за една нощ при 4°С, след което се отмиват три пъти с PBS, за да се отстрани излишното първично антитяло. След това, клетките се инкубират с биотинилиран анти-миши имуноглобулин от кон (Vector Laboratories, Burliname, СА) при разреждане 1:200 за 1 ч. при стайна температура. Свързаното антитяло се показва визуално съгласно стандартни протоколи за комплексен метод за авидин-биотин-алкална фосфатаза (ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, СА).

Проби. Изявата на EGF-R тРНК се определя като се използва линеализиран шаблон на хуманна проба pTRI-EGF-R (Ambion, Austin, ТХ). Пробата съдържа един фрагмент 360 Ьр сДНК от хуманен EGF-R ген, чийто обхват е 12-14. Изявата на MUC5 ген се определя с помощта на MUC5AC проба, която съдържа един фрагмент 298 Ьр сДНК от хуманен MUC5 АС ген (щедро предоставен от Д-р Carol Basbaum).

Северно оцветяване. РНК изцяло се екструдира от NC1-H294 клетките прораснали в колба Т-75 за тъканна култура, като се използва Три-реагент (Molecular Research Ctr, Cincinnati, OH) за всяко състояние. Общата РНК се подлага на електрофореза на 1% агарозен/формалдехиден гел и се пренася на мембрана от найлон (Amsterdam, Arlington Heights, IL) посредством капилярно проникване. Пробите се надписват с ³²Р като се използва комплект за надписване Randon Primed DNA (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN). Блотовете се предхибридизират при 24°С за 4 ч., след което се хибридизират при 42°С за 16 ч. с ³²Р-надписана специфична с ДНК проба. Разтворът от хибридизация съдържа 250 тМ три-HCl (рН7.5), 5% SDS, 1% BSA, 1%поливинил-пиролидон, 1% Ficoll, и 0.5% натриев пирофосфат. След хибридизация, мембраните се промиват два пъти с 2 х

SSC за 30 мин при стайна температура, последвано от две промивания в 2 х SSC с 0.1% SDS за 30 мин при 50°С и изплакване в 0.1 х SSC s 0.1 %

SDS. Мембраните се експонират на Рентгенов филм.

ИЗСЛЕДВАНИЯ IN VIVO

Протоколът за експерименти с животни е одобрен от Комитет за изследване на животните, Калофорнийски университет, Сан Франциско. Характерни мъжки плъхове F344 на Фишер без патогени, с тегло 230-250 г (Simonsen Laboratories, Gilroy, СА) са държани в стая при контролирана температура (21 °C), и свободен достъп до стандартна лабораторна храна и вода.

Здрави плъхове. Плъховете са анестезирани с метохекситален натрий (Brevital sodium, 50 mg/kg, i.p.; Eli Lilly & Co, Indianapolis, IN), като им е дадена възможност да вдишват непринудено. За да се определи дали THFa преретулира EGF-R в дихателните пътища, THFa (200 нг, 100 рл) се внедряват в трахеята, като животните са подложени на евтаназия след 24 ч. За да се определи дали EGF или TGFa индуцират гоблетни клетки в епитела на дихателните пътища, в трахеята се внедрява EGF (600 нг, 100 рл) или TGFa (синтетичен TGFa от плъх, 250 нг, 100 рл; Sigma, St Louis, MI) самостоятелно или 24 ч. след внедряване на TNFa (200 нг, 100 рл), като животните са подложени на евтаназия след 48 ч. При всяко изследване, за контрол в трахеята се внедрява стерилен PBS (100 рл). За да се потвърди поява на производство на муцин при активация на EGF-R, е изследван ефекта от един EGF-R инхибитор на тирозин киназа, BIBX 1522 (като дозата е определена от изследвания, при които инхибитора се използва за предотвратяване нарастване на рак). Плъховете са третирани предварително с BIBX 1522 (3, 10 или 30 мг/кг),

ч. преди и 24 ч. след внедряване на TGFa. Трахеята и белите дробове са извадени за изследване 48 ч. след внедряване на TGFa,

Сенсибилизирани плъхове

Сенсибилизация. Плъховете са сенсибилизирани в ден 0 и 10 с коремни инжекции на овалбумин (10 mg, grade V; Sigma, St Louis, МО), в комплекс c 100 мг от алуминиев хидроксид в 0.5 мл стерилен солен разтвор. Плъховете са оставени да почиват за 10 дни. В ден 20, директно в трахеята се подава овалбумин; животните са подложени на дразнене с трикратно внедряване (ден 20, 22 и 24) в трахеята на 100 рл от 0.1% овалбумин в солен разтвор. Плъховете са подложени на евтаназия, или в ден 20, без да се подразнят или 48 ч. след третотото дразнене (ден 26). Тази процедура индуцира метаплазия на гоблетни клетки. За да се блокира хиперплазия на гоблетни клетки, сенсибилизирани плъхове са предварително третирани с EGF-R инхибитор на тирозин киназа, BIBX1522. В дните на дразнене с овалбумин (ден 20, 22 и 24), сенсибилизираните плъхове са предварително третирани с BIBX1522 (10 мг/кг, 1 ч. преди дразнене), като след това BIBX 1522 също се внедрява в трахеята заедно с овалбумина (BIBX 1522, 10'⁵М, 100 μΐ). BIBX 1522 също се инжектира на всеки 24ч., до деня преди плъховете да се подложат на евтаназия. След това, трахеята се изважда 48 ч. след третото дразнене.

Подготовка на тъканите. На предварително избрани интервали по време на анестезията, системното кръвообръщание се перфузира с 1% параформалдехид в PBS третиран с DEPC при налягане от 120 mmHg. След това трахеята се изважда и се поставя в 4% параформалдехид за 24 ч. След фиксация, трахеята и белите дробове се потапят в JB-4 плюс мономерен разтвор А за клетъчен анализ, или в О.С.Т. съединение (Sekura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, СА), за имунохистохимия и хибридизация на място. Потопените тъкани се разрязват в напречно сечение (с дебелина 4 мм) и се поставят на слайди.

Анализ на клетките. Преброява се общия брой от епителни клетки, като се броят ядра на епителни клетки над 2 мм от базовата плоскост (ламина) с една обективна леща за потопяне в масло (с увеличение х 1000). Линейната дължина на базовата плоскост под всяка анализирана област от епител се определя с проследяване контура на дигитализирания образ на базовата плоскост. След внедряване на стимулатор, “развиващ” формата на гоблетните клетки, тези клетки имат гранули позитивни към Алцийско синьо/PAS, но размерът на гранулите е малък и броят на цитоплазмените гранули е нисък. Наричаме тези “развиващи се” гоблетни клетки “пред-гоблетни клетки”, етап преди клетките да се превърнат в зрели гоблетни клетки. Гоблетните клетки са високи, по форма кубовидни, чашковидни, до оформени като ниски колони, като голямо количество гранули оцветени в Алцийско синьо/PAS запълват повечето от цитоплазмата между ядрата и повърхността на ламина. Предгоблетните клетки са определени като клетки с по-малки, покрити с мукус площи (< 1/3 височина в епитела от базовата мембрана до повърхността на лумена) или с частично и слабо оцветени в Алцийско синьо/PAS малки гранули. Цилиа клетките се разпознават по границите с цилиа, слабо оцветена цитоплазма и голямо кръгло ядро. Клетките с негранулирани сектори са по форма колонни и се подават от лумена до базовата ламина. Цитоплазмата се оцветява в слабо розов цвят, като в нея се наблюдават няколко малки PAS-позитивни и Алцийско синьонегативни гранули. Базовите клетки са малки и плоски с големи ядра, разположени малко над базовата ламина но не достигат до лумена на дихателния път.

Количествена оценка на производството на гоблетни клетки. Производството на гоблетни клетки се определя по обемната плътност на оцветените в Алцийско синьо/PAS мукозни вещества върху мукозната повърхност на епитела, като се използва полу-автоматична изобразяваща система, която е описана на друго място (Weber et al. (1984) Science 224:294-297). Измерени се площите оцветени в Алцийско синьо/РASположително и цялата епителна площ, като данните са изразени като процент от общата площ оцветена в Алцийско синьо/PAS. Анализът бе извършен с програмата за публичен достъп NIH Image Programe (разработена от Националния здравен институт на САЩ, на разположение в Интернет от анонимен FTP от zippy.nimh.gov или на флопи диск от National Technical Information Service, Springfield, VA, part number PB95-500195GEI).

Имунохистохимическа локализация на EGF-R в епител от плъхове. Локализацията на EGF-R е изследвана с прилагане на имунохистохимическо оцветяване на едно антитяло към EGF-R (Calbiochem, San Diego, СА) в замразени части от трахея на плъхове. След перфузия с 1% параформалдехид в PBS, тъканите се поставят в 4% параформалдехид в PBS за 1 ч., след което се преместват в 30% цукроза за 1 нощ с цел криопротекция. Трахеите са потопени в О.С.Т. съединение (Sakura Finetek U.S.A. Inc., Torrance, СА) и се замръзяват. Замразени секции (5 цм) се нарязват и се поставят на стъклени слаиди (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Имунооцветяване се извършва по начин подобен на изследванията in vitro.

Подготовка на пробите. сДНК за MUC5 на плъхове бе щедро предоставена от д-р Carol Basbaum. Един фрагмент от 320 Ьр сДНК от MUC5 на плъх бе субклониран в ХЬа/hindIII страна на вектор за транскрипция, pBluescript-SK(-) (Stratagene, La Jolla, СА). За да се приготвят проби РНК за хибридизация на място, този рекомбиниран плазмид, съдържащ фрагмента от MUC5 сДНК на плъх се линеализира и транскрибира in vitro с Т7 или ТЗ полимераза, за да се получат съответно антисенсни или сенсни проби. Пробите за хибридизация на място се създават в присъствие на [³⁵S]UTP. След транскрибиране, ДНК пластината се смила с ДНаза, и надписаната радиоизотопно РНК се пречиства през Sephadex G-25 Quick Spin ТМ колона (Boehringer Mannheim, Indianapolis, INO и се утаява в разтвор на етанол/амоняк/ацетат. Преди употреба, пробите РНК се отмиват с 70% етанол и се разреждат в 10 mM DTT.

Хибридизация на място. Замръзени сечения (5 цм) се отрязват и поставят върху положително заредени стъклени слаиди (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). За хибридизация c антисенсни и сенсни проби се използват сечения отрязани в непосредствена близост. Други сечения се използват за оцветяване с Алцийско синъо/PAS. Отделни образци се фиксират повторно в 4% параформалдехид, рехидрират се в 0.5% х SSC и се ацетилират в триетаноламин с оцетен анхидрид. Хибридизацията се провежда с 2500-3000 cpm/μΐ от антисенс или сенс проба в 50% дейонизиран формамид, 0.3 М NaCI, 20 mM Tris, 5 mM EDTA, lx разтвор на Denhard, 20mM дитиотреитол, 10% декстран сулфат, 0.5 мг/мл мая tPHK и 0.5 мг/мл звукообработена ДНК от сперма на сьомга при 55°С за една нощ. Обработката след хибридизация се състои в отмиване 2 х SSC, 1 mM EDTA, 10 тМ β-меркапгоетанол при стайна температура, инкубиране с РНаза разтвор (20 мг/мл) за 30 мин при стайна температура, още едно измиване в 0.1 х SSC, lmM EDTA, 10 тМ βмеркаптоетанол при 55°С за 2 ч., след което в 0.5 х SSC при стайна температура. Образците се дехидрират, изсушават с въздух и се покриват с емулсия за проследяване на ядрата с Kodak NBT (Eastman Kodak,

Rochester, NY) за авторадиография. След експониране при от 7 до 21 d при 4°С, слайдите се проявяват, фиксират и оцветяват обратно с хематоксилин (21).

Статистика. Всички данни са представени като средни +/- SEM. За да се определят статистически значимите разлики между групите се използва едностранен анализ на средното отклонение. F-Тест на Scheffe се използва, за да се коригират кратните съпоставки, когато се определят статистическите значимости при анализа на отклонението. Възприета е достоверна вероятност от под 0.05 за нулевата хипотеза, когато се обозначава една статистически значима разлика.

РЕЗУЛТАТИ

TNFa спимулира производството на EGF-R в NCI-H292 клетки. Първо се определя дали NC1-H292 клетки изразяват органично EGF-R. Западен анализ на имуноблоти показват наличие на EGF-R протеин в течни (конфлуентни) култури от NC1-H292 клетки (Фигура 1А, дясно). Клетките са изследвани след като са станали течни (кофлуентни). Лизатите се подлагат на електрофореза в 8% акриламидни гели и се обагрят с анти-EGF-R антитяло. Молекулните тегла на протеини-маркери са посочени от дясно. Положителен контрол за EGF-R бе протеин от А431 клетки (Фигура 1А, от ляво), който изразява органично EGF-R (Weber et al., supra). Имуноцитохимични изследвания с анти-EGF-R антитяло разкриват положително оцветяване, най-впечатляващо при разделяне на клетки (Фиг. 1В, Имуноцитохимичен анализ с анти-EGF-R антитяло в култури от клетки NH1-H292). При кофлуентност се наблюдава положително оцветяване, най-силно при разделящи се клетки(стрелките, отдясно). В отсъствие на първично антитяло, оцветяване не се наблюдава (от ляво). Северно оцветяване показва, че

THFa (20 нг/мл) пререгулира изявата на EGF-R гена, един ефект, който се появява след 12 ч. и нараства след 24 ч. (Фиг. 1С, Северен анализ на EGF-R в клетки NC1-H292). Анализът бе проведен с целия РНК екструдиран от кофлуентни култури инкубирани с TNFa (20 нг/μπ) за 12 или 24 ч. РНК се подлага на електрофореза върху гел от формалдехидагароза и се пренася върху мембрана от найлон, и се хибридизира с Р надписана EGF-R сДНК проба. След хибридизация, мембраната се измива и авторадиографира.

EGF-R лиганди стимулират изявата на мукозни гликоконюгати и изявата на MUC5 гена в клетки NCI-H292. EGF-R се изявява органично в клетки NC1-H292, така че е оценена способността на EGF-R лиганди (EGF, TGFa) да индуцират производството на мукозни гликоконюгати (Фигура 2, горна колона, оцветяване в Алцийско синьо/PAS на клетки NC1-H292 за разпознаване на гликопротеини от муцин) Горна колона=инкубиране на клетки без инхибитор, долна колона=инкубиране в присъствие на инхибитор на EGF-R тирозин киназа BIBX 1522 (10 цг/мл). Когато клетките са инкубирани самостоятелно (при контрол), наблюдава се известно PAS-позитивно оцветяване (стрелки, горна колона); инкубиране само с THFa (20 нг/мл) не влияе на оцветяването; инкубиране с EGF; (25 нг/мл) или с THFa (25 нг/мл) увеличава PASпозитивно оцветяване (стрелки); инкубиране с THFa и TGFa увеличава значимо оцветяването (стрелка).

Някои клетки за контрол показват оцветяване; инкубиране само с TNFa (20 нг/мл) не влияе на оцветяването; инкубиране с EGF или с TNFa увеличава много повече оцветяването, отколкото ако двата лиганда действат самостоятелно. По този начин, EGF-R лиганди индуцират мукозни гликоконюгати в клетки NC1-H292.

За изследване изявата на ген MUC5, се ивършва Северно оцветяване (Фигура 3). От клетките се извлича цялата РНК (10 цг), подлага се на електрофореза върху гел от формалдехид/агароза, прехвърля се върху мембрана от найлон и се хибридизира с Рнадписана проба от MUC5 сДНК. След хибридизация, мембраната се измива и се авторадиографира. Културите се получават самостоятелно в среда (С), EGF или TGFa (25 нг/мл), TNFa (20 нг/мл), или комбинация от TNFa и EGF или TGFa за 12 ч. (горна колона) или 24 ч. (долна колона) при изява на ген MUC5. Култури също са получени с TNFa и EGF- или TGFa, след предварително инкубиране с EGF-R инхибитор на тирозин киназа (BIBX 1522; 10 цг/мл; долна колона); инхибиторът предотвратява изявата на ген MUC5.

Клетки NC1-H292 показват известна изява в състояние на контрол (Фигура 3, долна лява колона); когато клетките се инкубират с EGF или TGFa, изявата на MUC5 гена се различава много слабо след 12 ч., но е ясно изявена след 24 ч. TNFa самостоятелно не влияе на изявата на MUC5 гена, но когато TNFa се добави в клетки инкубирани с EGF-R лиганди, изявата на MUC5 гена нараства забележимо, над нивото предизвикано от самостоятелно дейстие на EGF-R киганд (Фигура 3).

Инхибитор на EGF-R тирозин киназа (BIBX1522) предотвратява изява на мукозни гликоконюгати и на MUC5 ген в NCI-H292 клетки. За да се провери хипотезата, че активиране на EGF-R рецептори индуцира изява на MUC5 ген, се инкубират клетки с EGF-R тирозин киназа инхибитор BIBX1522. Когато NC1-H292 клетки се обработят предварително с BIBX1522 (10 цг/мл), PAS-положително оцветяване се инхибира в състояние на контрол, като увеличеното оцветяване, което се появява с EGF-R лиганди забележимо се подтиска (Фигура 1, долна колона). На един Северен анализ, изявата на MUC5 ген, която забележимо нараства от комбинацията на TNFa и EGF или с TGFa бе напълно подтисната от предварително инкубиране с BIBX 1522 (Фигура

3, долна колона). Тези резултати намесват активирането на EGF-R в инкубирането на ген от муцин и мукозни гликопротеини в клетки NC1Н292.

TNFa стимулира производство на EGF-R у плъхове. Плъхове без патоген (които органично имат няколко гоблетни клетки в епитела на дихателните пътища) са проучени, като се започва от ролята на TNFa. В състояние на контрол, епитела на трахеята съдържа няколко EGF-R позитивни клетки (Фигура 4А, от ляво). При това, вътрешно трахейно внедряване на TNFa (200 г) индуцира EGF-R протеин в различни типове клетки от епитела на трахеята (Фигура 4А, дясно). EGF-R-положително оцветяване се наблюдава в гоблетни клетки (G), пред-гоблетни клетки (РG), негранулирани секреционни клетки (S) и базови клетки (Ва)м, но не и в клетки с цилия. По този начин, TNFa индуцира производство на EGF-R протеин.

Роля на EGF-R лиганди при производството на мукозни гликоконюгати и изява на MUC5 ген при плъхове. В състояние на контрол, епитела на трахеята съдържа малко гоблетни и пред-гоблетни клетки. При внедряване в трахеята на EGF-R лиганди, EGF (600 нг; не е показан) или TGFa (250 нг; Таблица 1) самостоятелно нямат ефект върху производството в епитела на мукозни гликоконюгати. При това, когато TNFa се дава първи, последван за 24 ч. от EGF или TGFa (Таблица 1), като животните са подложени на евтаназия 48 ч. по-късно, оцветяването с Алцийско синьо/PAS забележимо се увеличава, като броя на гоблетни и пред-гоблетни клетки забележимо нараства, без да се промени общия брой клетки или броя на клетките с цилия (Таблица 1). Хибридизация на място на MUC5 ген не показва изява в контролираните животни. Когато

TNFa, последван от EGF или TGFa се внедрява в трахеята, изявата на MUC5 в епитела е видима. По този начин, индукцията на EGF-R самостоятелно или стимулиране с EGF-R лиганди самостоятелно е недостатъчно, за да се индуцира метаплазия на гоблетни клетки или производство на мукозни гликоконюгати. При това, след индуциране на EGF-R от TNFa, внедряването на EGF-R лиганди стимулира забележимо метаплазия на гоблетни клетки.

Таблица 1 Клетъчен анализ в епитела на трахеята

Ova сенсибилизация
Тип на клетката	control	TGFa	TNFa/TGFa	i.p. only	i.p. + i.t.
Гоблетна	2.8 ±0.7	5.8 ± 1.2	28.8 ± 3.4*	5.4 ± 1.5	38.2 ±6.3*
Пред-гоблетна	7.8 ± 1.3	12.8 ± 1.6	44.8 ± 3.6*	13.8 ± 1.4	36.0 ± 6.3*
Секреционна	82.0 ± 2.0	72.2 ± 4.0	40.8 ± 2.4*	67.6 ± 7.0	49.8 ± 4.2
Сцилия	49.6 ± 2.0	54.6 ± 2.3	53.2 ± 1.8	56.4 ±3.8	52.4 ±7.1
Базова	57.8 ±2.6	56.8 ±2.3	43.0 ±3.5	60.2 ±3.4	59.8 ± 2.9
Неопределена	1.4 ±0.5	2.0 ± 0.4	0.8 ± 0.4	1.4 ±0.2	2.6 ±0.5
Общо	201.4 ±2.2	204.2 ± 3.3	211.4 ± 4.8	204.8 ± 6.6	238.8±4.4*
% оцветена площ AB/PAS	2.4 ±0.8	6.8 ± 1.9	35.8 ±4.2*	7.8 ± 2.9	38.7 ±6.2*

Таблица 1. Ефект от медиатори и от сенсибилизация на овалбумин върху трахеални епителни клетки при плъхове. Клетките се анализират както е описано в Методите; пет плъха в група. Характеризирането се подпомага от оцветяване в Алпийско синьо (AB)/PAS (което оцветява мукозни гликоконюгати). Освен преброяване на клетките, се изчислява процентно цялата епителна площ заета от AB/PAS оцветяване. Контролните дихателни пътища и пътищата стимулирани с TGFa (250 нг) самостоятелно съдържат малко гоблетни и пред-гоблетни клетки; там е налице малко оцветяване с AB/PAS. С TNFa (200 нг), последван от TGFa се получава нарастване на броя на таблетните и пред-гоблетни клетки и нарастване на площта заета от клетки оцветени с AB/PAS. Сенсибилизация на плъхове с овалбумин (OVA) извършена коремно (ip) няма ефект върху разпределението на клетките или върху AB/PAS оцветяването, но когато OVA се дава ip, последвано от въвеждане в трахеята (it) на OVA, се разкрива шокиращо нарастване на таблетни и пред-гоблетни клетки и на процентната площ от AB/PAS оцветяване.

Сенсибилизация с овалбумин при плъхове индуцира производството на EGF-R и гоблетни клетки. Тъй като е обявено, че смъртта от остра астма се дължи на мукозно запушване на дихателните пътища, в плъхове без патоген бе произведен модел на астма. Инжектиране на овалбумин (10 мг, ip) в ден 0 и ден 10 не стимулира хиперплазия на гоблетни клетки (Таблица 1). Обаче, когато това се последва от трикратно внедряване на овалбумин в трахеята (it) (0.1% в 100 цл) в дни 20, 22 и 24, като животните са подложени на евтаназия на 26 ден, броят на гоблетни и пред-гоблетни клетки забележимо нараства; броят на клетките с цилия и базовите клетки остава непроменен (Таблица 1, дясна страна). Имунохистохимични изследвания с анти-EGF-R антитяло не показват оцветяване в контролните трахеи. Животни сенсибилизирани както i.p. така и i.t., показват EGF-R оцветяване (Фигура 4В, от ляво), избирателно в клетки, които са оцветени положително с AB/PAS (Фигура 4В, отдясно). След трикратно въвеждане в трахеята на овалбумин (0.1%, ЮОмл), имунореактивностга на EGF-R е силно изявена в гоблетни и пред-гоблетни клетки (долу, в ляво), същите клетки, които се оцветяват положително с AB/PAS (долу в дясно). По този начин, един овалбуминен модел на астма показва нарастване на гоблетни клетки в клетки, които произвеждат EGF-R.

Инхибитор на EGF-R тирозин киназа (BIBX1522) предотвратява производство на гоблетни клетки индуцирано от TNFa и EGF-R лиганди и от сенсибилизиране с овалбумин при плъхове. Тъй като BIBX 1522 предотвратява производството на муцин в култивирани клетки, влиянието на този инхибитор се изследва в плъхове без патоген. Оцветяване с AB/PAS, което нараства при внедряване в трахеята на TNFa, последвано от EGF-R лиганд TGFa, се подтиска по начин зависещ от дозата с предварително лечение с BIBX 1522 (3-30 мг/мл, ip; Фигура 5А). Внедряване трахейно на TNFa (да индуцира EGF-R), последвано от EGF-R лиганд TGFa, което води до ударна метаплазия на гоблетни клетки.

При плъхове сенсибилизирани с овалбумин, едно предварително лечение с BIBX1522 (10 мг/мл, ip) подтиска напълно производството на гоблетни клетки (оценено с AB/PAS оцветяване; Фигура 5В). Животни на които е даден i.p. само овалбумин, демонстрират в бронхиалния епител малко AB/PAS-положително оцветяване. Животни, които първо са сенсибилизирани с OVA i.p., последвано от трикратно внедряване (i.t) в трахеята на OVA, демонстрират забележимо нарастване на AB/PASположително оцветяване.

Тези изследвания показват, че когато EGF-R се стимулира от EGFR лиганди, се индуцира производство на гоблетни клетки, in vitro и in vivo, ефект, който се дължи на EGF-R и който се блокира от един инхибитор на EGF-R тирозин киназа. В един модел на астма с овалбумин, инхибиторът е ефективен също и за предотвратяване производството на гоблетни клетки.

Освен, че описват механизма за индуциране на гоблетни клетки, настоящите резултати предлагат последователност за развитие производството на гоблетни клетки на база изявата на EGF-R. Стимулиране с TNFa индуцира интензивно оцветяване на негранулирани секреционни клетки; тяхно последващо активиране от EGF-R лиганди предизвиква прогресивно оцветяване за мукозни гликоконюгати в цитоплазмата, а клетките се превръщат в “пред-гоблетни” и след това в “гоблетни” клетки. Внедряване на TNFa последвано от EGF-R лиганди индуцира производство на гоблетни клетки без да се променя общия брой епителни клетки, което предполага, че активирането на EGF-R предизвиква селективна диференциация (а не нарастване) на клетките. Откритията предполагат, че гоблетни клетки се извличат от негранулирани секреционни клетки, които изявяват EGF-R и се стимулрат от EGF-R лиганди, за да произвеждат муцин.

В пациенти, които са починали от остра астма, хиперплазия на гоблетни клетки и мукозно запушване са важни открития. В един миши модел на астма, се появява сенсибилизация на дихателните пътища след повторно внедряване на овалбумин, като се получава забележима хиперплазия на гоблетни клетки в дихателните пътища. Ние показваме, че EGF-R който не се изявява в контролиран епител от дихателен път, се изявява при сенсибилизирани животни. Оцветените клетки са предгоблетни и гоблетни, което предполага, че EGF-R е замесен в производството на гоблетни клетки. Предварително лечение с инхибитор на EGF-R терозин киназа рецептор (BIBX 1522) предотвратява производство на гоблетни клетки в дихателните пътища, като потвърждава ролята на активирането на EGF-R за производството на гоблетни клетки при експериментално развита астма.

Настоящите резултати, включват пътя на EGF-R при хиперплазия на гоблетни клетки. Минали изследвания показват, че различни стимулатори като озон, серен диоксид, вируси, липополизахариди, фактор активиращ наслояване, и интерлукин-4 пререгулират изявата на муцин и секрецията. Настоящото изобретение осигурява механизъм за оценка връзката на тези възпалителни стимулатори със системата на EGF-R.

Астмата служи като пример за терапевтичната стратегия на изобретението: Нормален хуманен епител от дихателен път притежава отношение от 3-10 клетки с цилия към всяка гоблетна клетка. При астма, броят на гоблетните клетки може да бъде равен или да превишава клетките с цилия; при пациенти, които са починали в status asthmaticus, съществува 30-кратно нарастване на процентната площ заета от гоблетни клетки, в сравнение с броят им при пациенти починали от не-астматични респираторни заболявания. Подтискане производството на гоблетни клетки трябва да илиминира този източник на свръхсекреция. Тъй като жизненият цикъл на гоблетните клетки е неизвестен, времетраенето за разрешаване хиперплазията на гоблетни клетки с лечение, не може да се предскаже с точност. При отсъствие на понататъшно подлагане на алерген, хиперплазия на гоблетни клетки, в предварително сенсибилизирани мишки се решава в рамките на 50 дни, съвместно с други изяви на алергични възпаления. Подтискане активирането на EGFR, може много по-бързо да подтисне хиперплазия на гоблетни клетки, в зависимост от жизнената продължителност на гоблетните клетки. Наскоро, са оповестени инхибитори на ATP-конкурентна тирозин киназа с висока селективност. Инхибиторите на EGF-R тирозин киназа са оценени за лечение на усложнения свързани с изявата на EGF-R.

Свръхсекрецията е главна изява на много хронични възпалителни заболявания на дихателните пътища. В настояще време, не съществува ефективна терапия за облекчаване симптомите и за спиране развитието на тези заболявания. Настоящите разкрития, осигуряват един механизъм и стратегия за терапия: посредством подтискане активирането на EGF-R, се предотвратява производството на гоблетни клетки. Инхибитори на активирането на EGF-R се предлагат като терапия при заболяване на дихателните пътища със свръхсекреция.

Пример 2

Роля на окисляващ стрес при производството на гоблетни клетки

При хората, продължителното тютюнопушене се предполага да е свързано с развиващи се паталогични промени в периферните дихателни пътища, включващи хиперплазия на гоблетни клетки. По подобен начин, експериментални модели на тютюнопушене при животни са показали, че предизвикват хиперплазия на гоблетни клетки в дихателните пътища. При това, механизмът по който цигареният дим може да индуцира синтез на муцин е неизвестен. Следните данни демонстрират, че провъзпалителни, активирани от цитокин нутрофили и цигарен дим предизвикват синтез на муцин MUC5AC в хуманни бронхиални епителни клетки, чрез активация на EGF-R, която не зависи от лиганди. Тези резултати въвличат рекрутирани нутрофили и цигарен дим като регулатори на диференциация на епителни клетки, които могат да постигнат над нормално индуциране на клетки, произвеждащи муцин в дихателните пътища.

Методи

Изолиране на нутрофили. Хуманни нутрофили се пречистват от периферна кръв, получена от здрави хуманни донори. Изолиране на нутрофили се извършва със стандартни техники на градиентна сепарация Ficoll-Hypaque, утаяване на декстран, и хипотонолиза на електроцити. Клетките са >95% жизненоспособни доказано с трипан синя боя изключване. За да се предотврати замърсяване с ендотоксини, всички разтвори са прекарани през 0.1 цм филтър.

Клетъчна култура. Клетки NC1-H292, една хуманна клетъчна линия от белодробна мукоепидермоидална карцинома, прорастват в среда RPMI 1640 съдържаща 10% ембрионален говежди серум, пеницилин (100 ед/мл), стрептомицин (100 μτ/мл) и Hepes (25 mM) при 37°С в овлажнен с 5% СО₂ инкубатор с водна риза. 6 - кладенчета пластини за култури или 8-камерни слайди се използват за култивиране на клетките. В кофлуентно състояние, клетките се инкубират за 1 ч. само с нутрофили (10⁶ клетки/мл), само с TNFa (рекомбиниран хуманен TNFa, 20 нг/мл, Genzyme, Cambridge, МА), само с IL-8 (хуманен рекомбиниран IL-8, ΙΟ'⁸ М, Genzyme), само с fMLP(10’⁸M, Сигма, Ст. Лоуис, МО), TNFa плюс нутрофили, IL-8 плюс нутрофили, fMLP плюс нутрофили, водороден пероксид (Н₂О₂, 200 μΜ), разтвор на цигарен дим или TNFa (рекомбиниранТОРа, 0.1-25 нг/мл, Calbiochem, San Diego, СА). След това клетките се измиват и инкубират само в прясна среда. Опитите са прекратени в предварително определени периоди от време (за тРНК, 6 ч. и 12 ч.; за протеин, 24 ч.). Като контроли, се инкубират клетки само в среда за същите периоди от време. В други изследвания с нутрофили, TNFa е избран като стимулатор, тъй като притежава найвисок потенциален ефект върху синтеза на MUC5AC. Клетки NH1-H292 се инкубират за 1 ч. с нутрофили, които са били инкубирани с TNFa (20 нг/мл) за 1 ч. и след това са измити със стерилен PBS, за да се избегне замърсяване със супернатант (състав плаващ отгоре на разтвора), (т.е. молекули освободени от нутрофили), или клетки NC1-H292 се инкубират само в супернатант. При изследвания за подтискане с инхибитори на EGF-R тирозин киназа, клетки NC1-H292 се обработват предварително с BIBX1522 (10 цг/мл, щедро предоставени от Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Germany) или тирфостин AG 1478 (10 μΜ, Calbiochem) 30 мин преди да се добави стимулатора. Също са изследвани ефектите от един селективен инхибитор от тирозин киназа рецептор на фактор на нарастване, извлечен от кръвни плочки (тирфостин А1, 100 μΜ, Calbiochem). При изследвания на подтискане с блокиращи антитела към EGF-R лиганди, супернатантите са обработени предварително с анти61

TNFa антитяло (Calbiochem), или анти-EGF антитяло за 30 мин, и след това се добавят към клетки NC1-H292. Ролята на радикали без кислород се изследва, като се използват прибавки от радикал без кислород DMSO (1% Sigma); 1,3-диметил-2-тиоуреа (DMTU, 50 mM, Sigma) или супероксид дисмутаза (SOD, 300 ед/мл, Sigma).

Изготвяне на разтвор от цигарен дим. За изследването са използвани публикации в Research cigarettes (code2Rl, produced for the University of Kentucky Tobacco and Health Research Foundation). Разтвор на цигарен дим е проготвен както бе описано по-рано (Dusser et al. (1989) J. Clin. Invest. 84:900-906). Ha кратко, цигарен дим се изтегля в спринцовка от полипропилен (35 мл) с дебит едно издухване/мин и бавно се вкарва на мехурчета в 20 мл от RPMI1640 съдържащ 50 тМ буфер от Hepes. След това разтворът от дима се титрува до pH 7.4 и се използва веднага след приготвяне.

Онагледяване на мукозни гликоконюгати и MUC5AC протеин в клетки NCI-H292. В края на експериментите, клетките прораснали в 8камерни слайди се фиксират в 4% параформалдехид за 1 ч. и след това се оцветяват с Алцийско синьо/периодичен кислинен- Schiff (PAS), за да се онагледят мукозните гликоконюгати, или се използват за имуноцитохимия на MUC5AC. За имуноцитохимия на MUC5AC, като разредител за антитялото се използва PBS съдържащ 0.05% Tween 20, 2% нормален серум от коза и Levamisol (2 mM). Клетки се инкубират с mAb от мишки към MUC5AC (клон 45 Ml, 1:200, Neo Markers, Fremont, СА) за 1 ч. при стайна температура, след което се измиват 3 пъти с PBS за отделяне на излишното първично антитяло. След това, клетките се инкубират с биотинилиран конски анти-миши IgG (Vector Laboratories Inc., Burlingame, СА) при разреждане 1:200 за 1 ч. при стайна пШМЙЙ температура. Свързаното антитяло се онагледява съгласно стандартен протокол за комплексен метод за авидин-биотин-алкална фосфатаза.

Хибридизация на място за хуманен MUC5AC ген. Един 298 Ьр сДНК фрагмент от хуманен MUC5AC се вмества в ТА клонинг вектор (Invitrogen, San Diego, СА). Приготвянето на РНК проби и хибридизация in situ се извършват, както е описано по-горе.

Имунно изследване на протеин MUC5AC. Протеин MUC5AC се измерва, както е описано по-горе. Накратко, клетъчни лизити се приготвят с PBS при многобройни разреждания, и 50 рл от всяка проба се инкубират с буфер на биотин-карбонат (50 рл) при 40°С в 96-кладенчета пластини (Maxisorp Nunc, Fisher Scientific, Santa Clara, СА), докато се изсушат. Пластините се измиват трикратно с PBS и се блокират с 2% BSA (фракция V, Sigma) за 1 ч. при стайна температура. Пластините отново се измиват трикратно с PBS, след което се инкубират с 50 рл от моноклонално MUC5AC антитяло от мишка (1:100), което е разредено с PBS, съдържащ 0.05% Tween 20. След 1 ч., кладенчетата се измиват трикратно с PBS и 100 рл пероксидаза от хрян-коза анти-миши IgG конюгат (1:10 000, Sigma) се разпръсква във всяко кладенче. След 1 ч., пластините се измиват трикратно с PBS. С ТМВ разтвор на пероксидаза (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaitherburg, MD) се развива цветна реакция, която се спира с 2N H2SO4. Абсорбиране се отчита при 450 нм.

Количествен анализ на TGFa протеин. TGFa протеин се измерва като се използва комплект наличен на пазара за ELISA (Sigma), като се следват инструкциите на производителя. Супернатант (състав отделен по повърхността) се извлича след инкубация на нутрофили с TNFa (20 нг/мл) за 1 ч. се смесва с лизитен буфер PBS, съдържащ 1% Triton Х-100,

1% натриев деоксихолат и няколко инхибитора на протеаза, (Complete

Mini, Boehringer Mannheim, Germany), след което се използва за измерване на TGFa.

Имуноутаяване за EGF-R протеин и имунооцветяване за тирозин фосфорилация. Клетките се оставят в условия на серумен глад за 24 ч., след което се стимулират с TGFa, Н₂О₂ или супернатант от активирани нутрофили за 15 мин. След стимулиране, клетките се лизират и инкубират за 30 мин. в орбитален шейкър при 4°С. За да се отдели неразтворимия материал, клетъчните лизати се центрофугират при 14 000 об/мин. за 5 мин. при 4°С. Аликвоти от супернатанти, съдържащи еднакви количества от протеин се имуноутаяват с антитяло на анти-EGF рецептор (поликлон, Ab4, Calbiochem) и 20 рл от протеин А-агароза (Santa Cruz) за 2 ч. при 4°С. Утайките се измиват трикратно с 0.5 мл от лизитен буфер, суспендират се в буфер от проба на SDS, и се кипват за 5 мин. Протеините се отделят от SDS-PAGE в 8% акриламид гел. Полученият в резултат гел се балансира в един преходен буфер: 25 тМ Tris-HCl, 192 тМ глицин, 20% (vol/vol) метанол, pH 8.3. След което, протеините се прехвърлят посредством електрофореза върху нитроцелулозни мембрани (0.22 рм), блокирани с 5% обезмаслено бито мляко в PBS, съдържащ 0.05% Tween 20, за една нощ, след което се инкубират с моноклонално анти-фосфотирозин антитяло (1:100, Santa Cruz) за 1 ч. Свързаното антитяло се онагледява съгласно стандартен протокол за комплексен метод на авидин-биотин-алкална фосфатаза (ABC kit, Vector Laboratories).

Статистика. Всички данни са изразени като средни +/- SEM. За определяне на статистически значими разлики между групите се използва еднократен анализ на променливата. За да се внесе корекция за сравнение на множествата, когато се определят статистически значимости в анализа на променливата се използва F тест на Scheffe.

Приета е вероятност по-малка от 0.05 за нулевата хипотеза, като показател за статистически значима разлика.

Резултати

Активирани нутрофили предизвикват синтез на муцин MUC5AC. Когато нутрофили със стимулатор, който активира нутрофили (IL-8, fMLP, TNFa) се инкубират с клетки NC1-H292 за 1 ч., синтезата на MUC5AC протеин значително нараства в рамките на 24 ч., докато нестимулирани нутрофили (10⁶/мл), IL-8 самостоятелно или fMLP самостоятелно не демонстрират ефект върху синтеза на MUC5AC; инкубиране с TNFa самостоятелно, предизвиква малко, незначително нарастване на синтеза на MUC5AC. Когато нутрофили се инкубират предварително за 1 ч. с TNFa, след което нутрофилите и техен супернатант се отделят, последващо инкубиране на супернатант за 1 ч. с клетки NC1-H292 пререгулира изявата на MUC5AC ген в рамките на 12 ч. и стимулира оцветяване с AB/PAS и с едно антитяло към MUC5AC протеин за 24 ч; почиващите NC1-H292 клетки показват малка изява на MUC5AC ген и малко, петнисто оцветяване от AB/PAS и MUC5AC протеин. Синтеза на MUC5AC протеин индуциран от супернатанта, е увеличен значително спрямо контролата; нутрофили отделени от супернатанта, след инкубиране са без ефект. Заключва се, че активирани нутрофили бързо секретират един активен продукт, който предизвиква синтез на MUC5AC.

Инхибиторите на EGF-R тирозин киназа предотвратява синтез на MUC5AC индуциран от супернатант на активирани нутрофили. Тъй като е известно, че EGF-R лиганди предизвикват синтез на MUC5AC в клетки НС1-Н292 посредством активиране на EGF-R тирозин киназа, се изследва ролята на активирането на EGF-R в синтеза на MUC5AC, индуциран от супернатант на активирани нутрофили. Предварително третиране на клетки NCI-H292 със селективни инхибитори на EGF-R тирозин киназа (BIBX1522, AG1478), предотвратява синтез на MUC5AC протеин, който обикновено се индуцира от супернатанта на активирани нутрофили. Един селективен, извлечен от кръвни плочки, инхибитор на рецептора на фактора за нарастване на киназа (AG1295) и негативен контрол за тирфостини (А1) не дадоха ефект. Тези резултати въвличат активирането на EGF-R тирозин киназа в синтеза на MUC5AC индуциран от супернатанта на активираните нутрофили.

Роля на EGF-R лиганди секретирани в супернатанта на активирани нутрофили при синтез на MUC5AC. За да се определи, дали активирането на EGF-R тирозин киназа зависи от EGF-R лиганди (EGF TGFa), супернатант на активирани нутрофили се инкубира предварително с неутрализиращи антитела в EGF-R лиганди. Предварителната обработка на супернатанта с анти-TGFa антитяло или с анти-EGF антитяло, не подтиска синтеза на MUC5AC, индуциран от супернатанта на активирани нутрофили. Още повече, TGFa не се открива в супернатанта. По този начин EGF-R тирозин фосфорилация предизвикана от супернатанта на активирани нутрофили се индуцира от един механизъм, който е независим от EGF-R лигандите, EGF и TGFa.

Цигарен дим и радикали без кислород предизвикват синтез на MUC5AC. Цигарен дим и радикали без кислород, НгО₂, пререгулират изявата на MUC5AC ген в рамките на 12 ч., както и TGFa. По подобен начин, всички стимулатори увеличават синтеза на MUC5AC протеин и производството на мукозен гликоконюгат в рамките на 24 ч. - ефекти които се проявяват по начин, който не зависи от дозирането. Максималният синтез на MUC5AC като реакция спрямо Н2О2 е значително по-малък от реакцията спрямо TGFa. Предварителна обработка с AG1478 предотвратява нарастване синтеза на MUC5AC протеин индуциран от всички стимулатори, което показва, че стимулаторите предизвикват синтез на муцин под въздействието на EGFR тирозин киназа. Синтези на MUC5AC причинени от супернатант на активирани нутрофили, цигарен дим и Н2О2 се подтискат значително от предварителна обработка с добавка на свободни радикали (DMSO и DMTU) и SOD, но синтеза на MUC5AC протеин от TGFa не се влияе от DMSO или SOD.

Индуциране на тирозин фосфорилация на EGF-R супернатант от активирани нутрофили и от Н₂О₂. Разпределението на EGF-R протеин в контролни условия на серумен глад и във всички стимулирани условия (супернатант от активирани нутрофили, цигарен дим, Н₂О₂ и TGFa) е подобно. Цялостна фосфорилация на протеин тирозин се появява в рамките на 15 мин. след добавяне на активирани нетруфили, цигарен дим, Н2О2 или TGFa; за контрола при серумен глад не се демонстрира ефект. Цялостната протеин тирозин фосфорилация, индуцирана от TGFa е по-голяма от ефекта при супернатант от активирани нутрофили, цигарен дим или Н₂О₂. За да се определи дали EGF-R е фосфорилатиран, се провежда имуноутаяване с анти-EGF-R антитяло: Супернатант от активирани нутрофили, разтворими продукти от цигарения дим и Н₂О₂, всички те индуцират EGF-R специфична тирозин фосфорилация в рамките на 15 мин., ефект който е подобен на този предизвикан от TNFa. Предварителна обработка на клетки NC1-H292 с AG1478 подтискат EGFR тирозин фосфорилация с всички стимулатори. Супернатант инхибиран с DMSO-, цигарен дим-, и Н2О2- индуцира EGF-R тирозин фосфорилация, s << -X ί но DMSO няма никакъв ефект върху индуцирана от TGFa, EGF-R тирозин фосфорилация.

Горните резултати показват, че нутрофилите предизвикват синтез на муцин MUC5AC в клетки NC1-H292, когато те се активират с IL-8, fMLP, или TNFa. Още повече, супернатанта, който се събира 1 ч. след инкубацията на нутрофили с TNFa предизвиква синтез на MUC5AC, ефект, който се подтиска от селективни инхибитори на EGF-R тирозин киназа. Подтискането на EGF-R напълно блокира синтеза на MUC5AC, предизвикан от супернатанта от активирани нутрофили; без ефект са: един инхибитор на тирозин киназа без EGF-R, един селективен инхибитор на киназа извлечен от кръвни плочки, действащ на рецептора за фактора на растеж (AG1295) и един отрицателен контрол за тирфостини (А1), като EGF-R тирозин фосфорилацията се очертава като сигналната посока за синтез на MUC5AC, индуциран от супернатант от активирани нутрофили.

За по-нататъшен анализ на механизма, по който супернатанти от активирани нутрофили индицират EGF-R тирозин фосфорилация, се изследват както лиганд-зависимите, така и лиганд-независимите EGF-R пътища. Първо, ние измерихме TGFa в супернатанта от активирани нутрофили, като се откри, че супернатанта не съдържа измерими количества от TGFa. Предишни публикации показват, че нутрофилите съдържат само ниски концентрации (2.5 pg/10⁶ клетки) от TGFa. Ефектът на супернатант от активирани нутрифили върху синтеза на MUC5AC е със сила равна на ефекта от 1 нг от TGFa, което е 400 пъти по-високо от количеството TGFa открито в нутрофили. Второ, извършихме изследвания за блокиране с неутрализиращи антитела на EGF-R лиганди: Предварителната обработка с неутрализиращи антитела на EGF и TGFa не можа да подтисне синтеза на MUC5AC предизвикан от супернатанта от активирани нутрофили. Тези резултати предполагат, че синтеза на MUC5AC индуциран от супернатант от нутрофили не се дължи на секрета от EGF-R лиганди (TGFa и EGF) от нутрофили. По-нататък, ние изследвахме лиганд-независимия път: Тъй като е известно, че по време на активиране на нутрофили се отделят радикали без кислород, като е известно, че те предизвикват преходно активиране на EGF-R тирозин киназа в различни клетки, нашата хипотеза е, че освобождаването на радикали без кислород от активирани нутрофили, предизвиква EGF-R тирозин фосфорилация и в резултат синтез на MUC5AC в клетки NC1Н292. Добавки от свободни радикали (DMSO и DMTU) и SOD подтискат синтеза на MUC5AC от супернатанта от активирани нутрофили. Докладвано е, че TNF предизвиква окислителен бум в нутрофили в суспензия, с максимална реакция в рамките на 1 ч.; настоящите резултати демонстрират подобно време за изява.

В настоящото изследване, екзогенен Н2О2, един основен продукт, който се освобождава от нутрофили по време на окислителен бум, предизвиква синтез на MUC5AC в клетки NC1-H292. Като максималната реакция към Н2О2 в синтеза на MUC5 АС е само наполовина от реакцията към TGFa. Едно значително откритие на настоящото изобретение е факта, че цигареният дим, самостоятелно предизвиква синтез на MUC5AC. Това преполага, че цигареният дим може да причини синтез на MUC5AC in vivo, както при директно стимулиране, така и при индиректно стимулиране, предизвикани от рекрутиране на нутрофили. Конкретните молекули в цигарения дим предизвикващи синтез на MUC5AC все още не са ясни. Показано е, че цигареният дим съдържа множество от продукти (напр. никотин, катран, акролеин и оксиданти). В нашите експерименти, DMSO и SOD частично подтискат синтеза на MUC5AC индуциран от цигарения дим. По този начин, стрес от оксиданти може да бъде един механизъм за получаване на тази реакция.

Фактът, че синтеза на MUC5AC индуциран от цигарен дим, напълно се блокира от инхибитори на EGF-R тирозин киназа, показва, че активирането на EGF-R играе главна роля в синтеза на MUC5AC предизвикан от цигарен дим.

При заболявания на дихателните пътища, нутрофилното възпаление на дихателни пътища е обща особеност, като нутрофилите се рекрутират и активират от цитокини и от цигарен дим. Настоящите изследвания показват, че рекрутираните нетрофили и цигарен дим също действат като регулатори на диференциация на епителни клетки, от което се получава индукция на клетки произвеждащи в дихателните пътища. Най-важното е, че подтискане активирането на EGF-R ще бъде полезно като терапия на заболявания на дихателните пътища със свръхсекреция.

Пример 3

Нараняването на епитела в дихателните пътища предизвиква метаплазия на гоблетни клетки

Като хипотеза се твърди, че агарозни тапи внедрени в дихателните пътища се настаняват хронично в бронхите без да им пречат, както и това, че присъствието на тапите ще предизвика възпаления, от които се получава матаплазия на гоблетни клетки. Показано е, че тапи от агароза индуцират забележимо локално производство на гоблетни клетки, както е показано с AB/PAS-положително оцветяване и изява на муцин MUC5AC ген, свързано с локално рекрутиране на възпалителни клетки. Резултатите ангажират активирането на EGF-R в метаплазия на гоблетни клетки индуцирана от запушване.

Методи

Животни. Протоколът от експерименти с животни е одобрен от Комитета за изследване на животни към Калифорнийския университет в Сан Франциско. Използвани са специфични, без патогени, мъжки плъхове F344 (с телесно тегло от 230 до 250 г, Simonsen Lab. Gilroy, СА).

Плъховете са настанени в клетки BioClean, без патогени, с контрол на околната среда през смукателен чадър за ламинарен поток; животните имат свободен достъп до стерилна храна и вода.

Лекарства. Използвани са лекарства от следните източници: циклофосфамид (Sigma, St Louis, МО), метохекситал натрий (Brevital, Jones Medical Industries, Inc., St. Louis, МО), пентобарбитал натрий (Nembutal, Abbott Lab., North Chicago, IL); BIBX 1522, селективен инхибитор на EGF-R тирозин киназа (щедро предоставен от Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Germany), е разтворен в следния разтвор: 2 мл полиетилен гликол 400 (Sigma, St. Louis, МО), 1мл 0.1 N НС1, и 3 мл 2% разтвор на манитол във вода (pH 7.0). NPC 15669 (инхибитор на левкоцитна подвижност), е щедро предоставен от Scios Nova, Inc., Mountain View, CA.

Тапи от агароза. Тапи от агароза (0.7-0.8 мм в диаметър) са направени от 4% агароза тип II среда ЕЕО (Sigma, St. Louis, МО) в стерилен, буфериран с фосфат солен разтвор (PBS). За да се онагледят агарозните тапи в тъканта, се добавя 3% суспензия Монастрално синьо В (Sigma, St. Louis, МО) след стапяне на агарозата при 50°С.

Протокол за опитите. Проучихме плъхове без патогени, тъй като при тях има малко гоблетни клетки в дихателните пътища. Животните се подлагат на анестезия с натрий метохекситал (Brevital, 25 мг/кг, i.p.). Трахеята се подлага асептично на разрез в тясната част, по оста, като агарозни тапи се въвеждат в бронха през калибър 20 Angiocath (Becton Dikinson, Sandy, UT), свързан към тръба от полиетилен (РЕ 90, вътрешен диаметър 0.86 мм и външен диаметър 1.27 мм, Clay Adams, Parsippany, NY), пришита в разрязаната трахея. Полиетиленовата тръба се огъва под

ъгъл 30°, за да се даде възможност за избираемо въвеждане в правилния бронх. След внедряване, разрезът се затваря с шев.

За да се оцени ролята на EGF-R върху метаплазия на гоблетни клетки, индуцирана от агарозна тапа, животните са подложени на лечение с BIBX 1522 (80 мг/кг, i.p.) 1 ч. преди внедряване на агарозните тапи, като това се повтаря ежедневно (40 мг/кг, i.p., препоръчително). Животните се подлагат на евтаназия 24, 48 или 72 ч. след внедряване на агарозните тапи.

За да се оцени ролята на TNFa при метаплазия на гоблетни клетки индуцирана от агарозни тапи, животните са подложени на лечение с антитяло неутрализиращо TNFa (Genzyme, Boston, МА). Първото лечение (100 цл в 2.0 мл солен разтвор, i.p.) се прави 1 ч. преди внедряване на агарозните тапи, като инжекциите i.p. се повтарят ежедневно. Освен това, антитялото неутрализиращо TNFa се инфузира (10 цл/ч) през една осмотична минипомпа (2ML1, Alza Corp., Polo Alto, СА), имплантирана подкожно.

За да се проучи ефекта от нутрофили върху метаплазия на гоблетни клетки, индуцирана от агарозни тапи, плъхове са предварително третирани с циклофосфамид (инхибитор от левкоцити на костен мозък) или с комбинация от циклофосфамид и NPC 15669. Циклофосфамида (100 мг/мл, i.p.) се дава 5 дни преди внедряване на агарозните тапи, а втора инжекция от циклофосфамид (50 мг/кг, i.p.) се прави 1 ден преди да се внедрят агарозните тапи. При изследвания с NPC 15669, лекарството (10 мг/кг, i.p.) се инжектира 1 ч. преди да се внедрят агарозните тапи, а след това ежедневно в продължение на три дни.

Всички лекарства (BIBX 1522, антитяло неутрализиращо TNFa, циклофосфамид, и NPC 15669) се дават i.p. 1 ч. преди внедряване на агарозни тапи, като дозите се повтарят ежедневно, в продължение на 3 дни.

Подготовка на тъкани. В различни периоди, след внедряване на агарозни тапи, плъховете се подлагат на анастезия с пентобарбитал натрий (65 мг/кг, i.p.), в кръвообращението се перфузират под налягане 120 мм ж. ст. 1% парафолмалдехид в PBS- обработен с диетил пирокарбонат. Десният бял дроб се отстранява, а за хистология се използва дясната мека част от опашката. При замръзени секции, тъканите се отделят и се поставят в 4% параформалдехид за 1 ч., след което се внасят в 30% цукроза за една нощ, с цел криогенна протекция. Тъканите се полагат в съединение О.С.Т. (Sekura Finitek U.S.A., Inc. Torrance, СА). За секции от метакрилат, тъканите се поставят в 4% параформалдехид за 24 ч., след което се дехидрират с калибровани концентрации от етанол и се полагат в метакрилат JB-4 (Polysciences, Inc., Warrington, РА). Тъканни секции (с дебелина 4 рм) се оцветяват с AB/PAS и се обезцветяват с хематоксилин.

Морфометричен анализ на бронхиален епител. Процентът от площта мукозни гликоконюгати в епитела, оцветена с AB/PAS се определя, като се използва система за анализ на изображението, съгласно методи публикувани по-рано. Площта от епител и оцветените с AB/PAS мукозни конюгати в епитела, се очертава по обиколката на ръка и се анализира с прилагане на програма за изобразяване NIH (разработена в Националния здравен институт на САЩ, на разположение в Интернет от анонимен FTP, или от флопи диск от Националната служба за техническа информация, Springfield, Virginia; part number PB95-5001195GEI). Данните се изразяват като процент от общата площ епител, заета от оцветяване с AB/PAS. За да се определи, полуколичествено, секрецията на мукус, се определя процентът от дължината на епителната повърхност, зает от AB/PAS-положително оцветяване, като се изчислява дължината, която се оцветява положително, като съотношение към общата дължина. Процентът от оголен епител се определя с изчисляване на отношението на дължината на оголения епител към общата дължина на епитела.

Разпознаване на типове клетки в секции метакрилат и анализ на клетка. Общият брой епителни клетки се определя посредством преброяване ядрата на епителните клетки върху 2 мм от базовата ламина с обективна леща за потапяне в масло (увеличение xlOOO). Линейната дължина на базовата ламина под всяка анализирана област от епител се определя посредством проследяване контура на дигитализираното изображение на базовата ламина. Епителните клетки са разпознати както бе описано по-рано. Накратко, базовите клетки се разпознават като малки плоски клетки с голямо ядро, разположени точно над базовата ламина, но не достигащи до лумена на дихателния път. Цитоплазмата се оцветява тъмно, като няма налични АВ или РAS-положителни гранули. Клетките с цилия се разпознават от тяхните цилийни граници, леко оцветена цитоплазма и големи, кръгли ядра. Негранулираните секреционни клетки са с форма на колони и се подават от бронхиалния лумен към базовата ламина. След внедряване на агарозни тапи в трахеята, се образуват “развиващи се” гоблетни клетки (пред-гоблетни клетки). Тези клетки демонстрират АВ/РAS-положително оцветяване, гранулите са малки, а клетките не са опаковани с гранули; те съдържат малки мукозни оцветени области (<1/3 височина от епител от базовата мембрана до повърхността на лумена) или разпръснати и слабо АВ/РAS оцветени, малки гранули. Клетки от неопределен тип се формулират като клетъчни профили, в които липсват цитоплазмени характеристики за правилна категоризация.

Имунохистохимична локализация на EGF-R. Наличието на EGF-R се определя с помощта на имунохистохимична локализация, като се използва моноклонално антитяло от мишка към EGF-R (Calbiochem, San Diego, СА). По-рано приготвени, 4 рм замръзени секции, в последствие се фиксират с 4% параформалдехид, третиран с 0.3% НгОг/метанол. Тъканите се инкубират с антитяло за EGF-R (разредено 1:250). За да се онагледят антиген-антитяло комплексите оцветени с 3.3’диаминобензидин тертрахидрохлорид (Sigma, St. Louis, МО) се използват биотинилиран конски анти-миши IgG (1:200; Vector Lab., Burlingame, СА), последван от стрептавидин - пероксидаза комплекс (ABC kit, Vector Lab., Burlingame, СА). Негативни контролни слайди се инкубират в първичното или вторичното антитяло пропуснато и заменено с PBS.

Хибридизация на място. От плазмид съдържащ 320 Ьр сДНК фрагмент от MUC5AC от плъх (любезно предложен от д-р Carol Blausbaum) са създадени [³⁵8]-надписани рибопроби. Секциите са хибридизирани с [³⁵8]-надписани РНК проби (2500-3000 срт/рл хибридизационен буфер) и се измиват при строго определени условия, включително обработка с РНаза А. След авторадиография за 7-21 дни, се проявява фотографската емулсия и слайдите се оцветяват с хематоксилин.

Преброяване на нутрофили в епитела на дихателния път. Оценката на навлизането на нутрофили в бронхите се извършва с оцветяване на нутрофили с 3-3’-диаминобензидин тетрахидрохлорид, като се преброява броя нутрофили в лумена на дихателния път и в епитела; резултатите са показани като брой оцветени клетки за мм дължина на базовата ламина.

Бронхоалвеолен лаваж (BAL). За да се оценят бройките отделни клетки във всяка група животни, на белите дробове се прави петкратен лаваж с 3 мл аликвоти от стерилен PBS, лаважите се обединяват и се измерва обема. Клетките в BAL се събират посредством развъртане на течността от лаважа при 1000 об/мин за 10 мин. След това, 10 мл от клетъчна суспензия се преброяват с хематоцитометър, за да се определи броя на клетките в BAL течността. Бройката на отделните клетки се определя при приготвяне на цитовлакна оцветени с Diff-Quik (American Scientific Products, McGaw Park, IL). Бройките отделни клетки са получени посредством проби от поне 200 клетки върху всеки слайд с цитовлакна.

Статистически анализ. Данните са изразени като средни +/- SE. За статистически анализ, както е по-подходящо, се използва двупосочен или еднопосочен анализ на променливата (ANOVA), последван от Student t тест, ако е необходимо. Вероятност по-малка от 0.05 се счита като статистически значима разлика.

Резултати

Влияние върху епителната структура на дихателните пътища: Метаплазия на гоблетни клетки. За да се определи дали тапи от агароза влияят на структурата на епитела на дихателните пътища, агарозни тапи се внедряват в десния бронх на 5 плъха без патогени. В контролни животни, бронхиалния епител съдържа няколко гоблетни клетки. При това, след локално внедряване на агарозни тапи, AB/PAS оцветяване показва нарастване на областта от гоблетни клетки, което зависи от времето, това бе открито, най-рано след 24 ч. и достига максимум 72 ч. след внедряване. На 24 ч., агарозните тапи причиняват значително нарастване в броя на пред-гоблетни и гоблетни клетки, а при 48 ч. се откриват по-зрели гоблетни клетки (Таблица 1). На 72 ч., агарозните клетки предизвикват нарастване на броя гоблетни клетки (Р<0.01); броят на базови и клетки с цилия не се променя (Р>0.05). Общият брой от епителни клетки за мм базова ламина, 72 ч. след внедряване, слабо, но не значително нараства (Р>0.05, Таблица 1); височината на епитела (измерена от базовата мембрана до повърхността на лумена на епитела) се увеличава от 16.0 +/- 1.2 цм в контролни дихателни пътища, до 38.1+/9.1 рм на 72 ч. след внедряване на тапите (и = 5, Р <0.01).

В лумена на дихателен път от контролни животни, няма AB/PAS оцветяване. При това, в съседство с агарозните тапи, в лумена се наблюдава положително оцветяване, което показва, че се появява

секреция на мукозни гликоконюгати. В дихателни пътища с агарозни тапи, оцветяването нараства с времето. Процентът от общата дължина на епитела, зает от AB/PAS-положително оцветяване в дихателните пътища съседни до тапите, нараства от 0.1 +/- 0.1% в контролни животни до 4.7 +/- 1.4%, 13.3+/-0.7%, и до 19.1+/-0.7% на 24 ч. и 72 ч. (п=5). По-нататък, агарозните тапи оголват епитела от запушените бронхи с 13.5+/-2.3%, и 5.1+/-1.5% от общата площ на 24, 48 и 72 ч., съответно (п=5).

Ефект на агарозни тапи върху изявата на ген на муцин. В контролни плъхове, не се получава различим сигнал с проба антисенс от MUC5AC в бронхите (п=4 за група). В бронхи, където са внедрени агарозни тапи, има сигнал за MUC5AC, който нараства в зависимост от времето от 24 ч. до 72 ч. (п=4). От други типове клетки не са намерени сигнали (като гладкомускулна, свързваща тъкан). Секциите изследвани със сенс проба за MUC5AC не показват изява.

Влияние на агарозни тапи върху изява на EGF-R в епител на дихателен път. В контролни животни, имунооцветени с антитяло към EGF-R се демонстрира разпръснато оцветяване в епитела. При това, след внедряване на агарозни тапи, епитела в съседство с агарозните тапи показва EGF-R-положително оцветяване с AB/PAS. Формата на оцветяване за EGF-R, върви успоредно с оцветяването за MUC5AC и AB/PAS. Пред-гоблетни клетки и негранулирани секреционни клетки са имуноположителни за EGF-R. Клетките с цилия не показват имунореактивност. В дихателни пътища, не запушени от агарозни тапи, епитела демонстрира малко оцветяване за EGF-R, което се явява подобно на оцветяването при контролни животни.

Влияние на инхибитор на EGF-R тирозин киназа върху метаплазия на гоблетни клетки и върху изява на ген на муцин. В настоящите изследвания, внедряването на агарозни тапи води до изява на EGF-R в клетките, при което се произвежда муцин. EGF-R е представител на класа от рецептори на тирозин киназа. По този начин, когато EGF-R-лиганди

(EGF или TGFa) се свържат към EGF-R, се активира специфична EGF-R тирозин киназа. По тази причина, за да се провери хипотезата, че активирането на EGF-R индуцира изява на ген MUC5AC и на мукозни гликоконюгати, след внедряване на агарозни тапи, инхибитор на EGF-R тирозин киназа (BIBX 1522) се инжектира, коремно в плъхове. BIBX 1522 забележимо подтиска индуцираната от агарозна тапа AB/PAS оцветена епителна площ на 24, 48 и 72 ч. Той също подтиска напълно, изявата на MUC5AC ген, 72 ч. след внедряване на тапа.

Влияние на антитяло неутрализиращо TGFa върху метаплазия на гоблетни клетки и върху изявата на EGF-R. Нашата хипотеза е, че по време на възпаление, причинено от агарозни тапи се освобождава THFa. По тази причина, изследвахме ефекта от предварително лечение на плъхове с антитяло неутрализиращо THFa, върху метаплазия на гоблетни клетки индуцирана от агарозни тапи; При животни предварително лекувани с антитяло неутрализиращо THFa (η = 5), агарозните тапи повече не стимулират протеин изявата на THFa или производството на AB/PAS-оцветени (гоблетни) клетки.

Рекрутиране на възпалителни клетки от агарозни тапи. Забелязано бе, че агарозните тапи причиняват повреда в епитела и проникване на възпалителни клетки. С THFa и EGF-R лиганди могат да произведат различни възпалителни клетки. EGF-R и неговите лиганди са ангажирани в EGF-R каскадата, която води до метаплазия на гоблетни клетки. Ние оценихме ролите на левкоцити и макрофаги в ефектите индуцирани от агарозни тапи по два начина. Първо, изследвахме клетки в бронхоалвеолни лаважи: В контролни плъхове, макрофагите са преобладаващите възстановени клетки (и = 5, Фиг. 4, Контрол). След внедряване на агарозни тапи, броя макрофаги се увеличава (Р<0.05), като в течността от лаважа се появява значителен брой нутрофили (Р<0.01). Броят лимфоцити не се променя.

Инфилтрираните клетки в тъканни секции също се оценяват: въздушни пътища без агарозни тапи съдържат малко нутрофили, а въздушни пътища съдържащи тапи, демонстрират наличие на нутрофили, както в епитела така и в лумена. Броят нутрофили в дихателния път бе 0.2+/- 0.2, 42.4 +/- 7.1, 40.7+/-7.7 и 20.1+/-7.2/мм от базовата ламина в контролни дихателни пътища, и съответно на 24, 48 и 72 ч. след внедряване на тапи (Р<0.05, п=5). Освен това, броят нутрофили в епитела на дихателните пътища бе 1.3+/-0.4, 15.6+/-2.6, 14.9+/-1.4 и 14.8+/-2.6/мм от базовата ламина при контрол и съответно 24, 48 и 72 ч. след внедряване на тапи (Р<0.01, п=5).

Влияние на циклофосфамид върху рекрутиране на нутрофили, метаплазия на гоблетни клетки и протеин изява на EGF-R. При плъхове, лекувани с циклофосфамид, кръвните нутрофили са изчерпани (броя нутрофили във венозна кръв след циклофосфамид, 1.8+/-0.5%, п=5), като се подтиска рекрутиране в BAL на нутрофили индуцирани от тапи. Броят на нутрофили в дихателните пътища (2.6+/-0.3/мм от базовата ламина) и в епитела намаляват значително (0.8+/-0.2/мм) след 24 ч. Циклофосфамида също подтиска метаплазия на гоблетни клетки, индуцирана от агарозни тапи и изявата на EGF-R протеин. Когато към циклофосфамид се добави люмедин, NPC 15669, подтискането на метаплазия на гоблетни клетки индуцирана от агарозни тапи е подобно на ефекта от действието на циклофосфамид самостоятелно. Тези резултати въвличат участието на нутрофилите в клетъчна метаплазия индуцирана от тапи.

Обсъждане

В настоящото проучване, ние изследвахме ефекта от внедряване на агарозни тапи върху метаплазия на гоблетни клетки в дихателните пътища на плъхове без патогени, които имат много малко гоблетни клетки във фазата на контрол. Епителни клетки в бронхите на контролни животни и бронхи без агарозни тапи (контролни бели дробове) се оцветяват еднакво негативно с AB/PAS. Внедряването на агарозни тапи води до едно изявено, зависимо от времето, нарастване на гоблетни клетки в зоната на гоблетни клетки от епител, в съседство с внедрените тапи, това е разкрито в рамките на 24 ч. и е най-силно около 72 ч. след внедряването. Дихателните пътища, в съседство до блокираните с тапи дихателни пътища също се оцветяват положително с AB/PAS. Целия брой клетки, броя базови клетки и клетки с цилия не се променя, но броя на гоблетните клетки нараства, а броя на негранулирани секреционни клетки намалява в зависимост от времето, след внедряване на агарозни тапи (Таблица 2). Тези резултати предполагат, че метаплазията на гоблетни клетки е в резултат от превръщането на негранулирани секреционн клетки в гоблетни клетки.

Таблица 2

Ефект от агарозни тапи върху разпределението на бронхиални епителни клетки в плъхове без патогени*

Тип на клетка	Контрола	24 ч	48 ч	72 ч
Гоблетна	о.о±о.о	13.115.6	25.7115.0	51.519.0
Пред-гоблетна	0.010.0	32.812.9	25.7115.0	51.519.0
Секреционна	43.513.0	24.413.3	18.413.7	8.912.3
Сцилия	98.514.0	83.817.9	81.615.0	84.013.9
Базова	18.415.7	10.610.8	11.61 1.7	11.012.3
Неопределена+	1.310.5	1.410.8	1.110.1	0.610.4
Общо	16117.2	166.116.1	175.516.2	180.917.5

Клетките се анализирани както е описано в Методите: п=5 за всяка група. Характеризирането е подпомогнато от AB/PAS оцветяване (което оцветява мукозните гликоконюгати). Контролните дихателни пътища съдържат няколко пред-гоблетни и гоблетни клетки. След внедряване на агарозни тапи, се наблюдава, зависимо от времето(24, 48 72 ч.), нарастване броя на пред-гоблетните и гоблетни клетки, и намаляване броя на негранулирани секреционни клетки, в сравнение с контролните животни.

* Данните са средни +/- SE, брой клетки/мм базова ламина.

+Р < 0.05 сравнено с контролата &Р <0.01 сравнено с контролата !! В клетките липсват достатъчни за категоризиция цитоплазмени характеристики.

Докладвано е, че гоблетни клетки в дихателните пътища изразяват MUC5AC гена. В настоящите изследвания, контролни бронхи не изразяват MUC5 АС ген, като дихателните пътища запушени с тапи или в съседство с тапите, които се оцветяват положително с AB/PAS, изразяват

MUC5AC ген, предполагайки, че MUC5AC гена е включен в производство на мукус, индуцирано от агарозна тапа. Тези резултати показват, че агарозните тапи индуцират изявата на гени муцин и производството на мукозни гликоконюгати в избрани клетки в дихателни

пътища на плъхове.

Изследван е механизмът на метаплазия на гоблетни клетки, индуцирана от агарозни тапи. EGF-R нормално не се изявяват в епитела на дихателни пътища от плъхове без патоген, но се индуцират от THFa. При наличие на EGF-R в епитела, внедряването на EGF-R лиганди (EGFR или TGFa) резултира в нарастване на ген муцин и изява на протеин. Един селективен инхибитор на EGF-R тирозин киназа (BIBX 1522) напълно подтиска тези реакции, като ангажира EGF-R сигнализиране при метаплазия на гоблетни клетки. Бе определено влиянието на BIBX 1522 върху метаплазия на гоблетни клетки, индуцирана от агарозна тапа; Подтискане производството на мукозни гликоконюгати и изява на MUC5AC ген, индуцирани от агарозни тапи. Тези резултати ангажират една EGF-R каскада при метаплазия на гоблетни клетки, индуцирана от агарозни тапи.

Изследвани са механизмите, по които EGF-R каскадата предизвиква метаплазия на гоблетни клетки с агарозни тапи. Първо, проучихме изявата на EGF-R протеин в бронхиален епител. Контролни дихателни пътища се оцветяват еднакво негативно за EGF-R, но дихателни пътища съдържащи агарозни тапи демонстрират, селективно, зависимо от времето, положително оцветяване за EGF-R. Положително оцветените клетки включват негранулирани секреционни, пред-гоблетни и гоблетни клетки. По този начин, агарозни тапи индуцират изявата на EGF-R протеин. Плъхове, които предварително са лекувани с антитяло за неутрализиране на THFa не развиват метаплазия на гоблетни клетки, индуцирана от агарозни тапи, като за изявата на EGF-R, индуцирана от агарозни тапи се ангажира THFa.

Циклофосфамид е лекарство, което избирателно подтиска производство на левкоцити, предотвратява рекрутиране на нутрофили в лаважна течност от дихателни пътища и в епитела на дихателните пътища, след внедряване на агарозни тапи, както и предотвратява метаплазия на гоблетни клетки индуцирана от агарозни тапи. Макрофагите също нарастват след въвеждане на агарозни тапи, но циклофосфамида не подтиска рекрутирането на макрофаги. Тези резултати ангажират нутрофилите в метаплазия на гоблетни клетки, индуцирана от агарозни тапи. Фактът, че циклофосфамида също намалява изявата на EGF-R протеин след агарозните тапи, предполага, че нутрофилите допринасят, най-малко частично, за изявата на EGF-R в това възпалително състояние.

Нутрофилите също са в състояние да произвеждат EGF-R лиганди, EGF и TGFa. Освен това, епителни клетки се получават от EGF-R лиганди и се получава шокиращо оголване на епитела в съседство до агарозните тапи. По този начин, епитела може да бъде важен потенциален източник на THFa и EGF-R лиганди.

Логично е да се приеме, че ефективеният стимулатор на агарозната тапа е свързан с движението на тапите при дишане, без последваща абразия на епитела. Докладвано е, че механично нараняване на епитела на дихателния път причинява свръхсекреция. Тези предходни изследвания дават доверие на хипотезата, че механична травма в епитела на дихателния път води до свръхсекреция. Съобщено е, че оротрахеална интубация води до обилна секреция на мукус при коне. Хронична интубация при пациенти, може да предизвика мукозна свръхсекреция и може да бъде причина за мукозно запушване. Инхибитори на EGF-R тирозин киназа може да послужат за предотвратяване мукозна свръхсекреция след трахеална интубация.

Повреда в епитела често се докладва като общо откритие в изследвания на пациенти, дори с мека форма на астма, като повредата нарастващо е свързана с влошаване на клиничните симптоми. Повреда в епитела предизвикана от алергична реакция може да индуцира активиране на EGF-R, като в резултат се получава свръхнормално производство на гоблетни клетки. Представените по-горе данни, ангажират активирането на EGF-R в една различна реакция, която ® характерно включва метаплазия на гоблетни клетки. Механично повреждане на епитела и нараняване на епитела при астма могат да включват подобна (EGF-R) каскада, като в резултат се получава над нормално нарастване на епителни секреционни клетки. Това осигурява механизъм за свръхсекреция, която се появява във фатални случаи на остра астма.

Пример 4

Обратно гранулиране на гоблетни клетки от рецептори на EGF-R ф Дегранулирането на гоблетни клетки в носов дихателен епител от плъхове се индуцира от вдишване през носа на fMLP. 4 ч. след вдишване през носа на fMLP (10‘⁷М) в носовия септален епител се индуцира значително дегранулиране. Обратно гранулиране на гоблетни клетки се появява 48 ч. след вдишване. В контролно състояние, протеин MUC5AC се изявява в гоблетните клетки, но EGF-R протеин не се изявява. Както EGF-R така MUC5AC муцин ген и протеин отсъстват в контролния епител, но се изявяват значително 48 ч. след вдишване. Предварително лечение с инхибитор на EGF-R тирозин киназа, BIBX1522, инхибира изявата на муцин MUC5AC ген и протеин, след индуцирана от fMLP дегранулация на гоблетни клетки. Тези резултати показват, че изявата и активирането на EGF-R са включени в обратното гранулиране на гоблетни клетки в носов епител на плъхове.

МЕТОДИ

Животни. Протоколът от експерименти с животни е одобрен от Комитета за изследвания с животни към Калифорнийския университет в Сан Франциско. Използвани са специфични мъжки плъхове без патогени F344 (с телесно тегло от 200 до 230 г Simonsen Lab, Gilroy, СА). Животните се помещават в клетки BioClean, без патогени, с покривни чадъри за ламинарен въздухообмен, животните имат свободен достъп до стерилна вода и храна.

Приготвяне на носова тъкан. В различни периоди, след вдишване, плъховете са подложени на анестезия с пентобарбитал натрий (65 мг/кг, i.p.). Сърцето на животното е открито, като игла с тъп връх се вкарва от апекса на левата кухина на възходящата аорта, а кръвообращението се перфузира с 1% параформалдехид. Един срез в левия атриум, осигурява вход за фиксатива. Очите, долните челюсти, кожата и мускулатурата са отделени, а главата се потопява в голям обем от същия фиксатив за 24 ч. След фиксация, главата се декалцира със Surgipath (Decalcifier II, Surgical Medical Industries, Inc., Richmond, IL) за 4-5 дни и се изплаква в солен разтвор буфериран във фосфат. Носовата кухина се разрязва напречно на нивото на острата папила от носовото небце (палата). Предния блок от тъкан се потапя в гликол метакрилат (JB 4 Plus, Polysciences, Inc., Warrington, PA), или в съединение OCT (Sekura Finetek, U.S.A., Inc., Torrance, СА) при замръзени секции. От най-свежата повърхност на блоковете потопени в гликол метакрилат се отрязват секции с дебелина от 5 цм и се оцветяват с Алцийско синьо (pH 2.5)/периодична киселинаSchiff (AB/PAS), за да се появят киселите и неутрални гликоконюгати, или с 3.3’-диаминобензидин (Sigma chemical, St. Louis, МО), за да се онагледят левкоцитите, които са мигрирали в епитела. От най-свежата повърхност на замръзените, потопени блокове се отрязват секции с дебелина от 5 цм и се оцветяват с AB/PAS или се използват за имунооцветяване на EGF-R и MUC5AC.

Преброяване на нутрофили в носов епител. Нутрофилите се броят в полета с голяма мощност от епителния слой оцветен с 3.3’диаминобензидин при увеличение х 400. Броят нутрофили в носовия чашечен (сепален) епител (от основната мембрана до върховете на клетките) се определя посредством преброяване на ядрените профили за единица дължина от базовата ламина.

Количествено определяне дегранулацията и обратната гранулация на гоблетни клетки. За да се определят дегранулацията и обратната гранулация на гоблетни клетки, измерихме обемната плътност на оцветените с AB/PAS мукосубстанции по мукозната повърхност на епитела, като се използва полуавтоматична система за изобразяване, съгласно прежде публикуван метод. Изследвахме оцветените слайди с микроскоп Axioplan (Zeiss. Inc.), който бе свързан към управлението на видео камера (DXC7550MD; Sony Corp, of America, Park Ridge, NJ). Изображенията на носов епител са записани в полета с висока мощност с фазова контрастна леща при х400, като се използва видео система IMAXX (PDI, Redmond, WA). Вътрешноклетъчният муцин в повърхностни епителни секреционни клетки се явява като овални по форма, виолетови гранули с различен размер. Измерихме площта оцветена AB/PAS положително и цялата епителна площ, като данните са показани, като процент на AB/PAS оцветената площ, спрямо цялата площ. Анализът бе извършен на компютър Macintosh 9500/120 (Apple Computer, Inc., Cupertino, СА), като се използва програма за публичен достъп NIH Image.

Имунолокализиране на EGF-R и MEJC5AC протеин. Замръзени секции от носова тъкан фиксирана в параформалдехид са обработени с 3% Н₂О₂/метанол към блок ендогенен пероксид и се инкубират с моноклонално антитяло от мишка към EGF-R (Calbiochem, San Diego, СА) MUC5AC (NeoMarkers Inc., Fremont, СА) за 1 ч. в разреден разтвор 1:100. Имунореактивните EGF-R или MUC5AC се онагледяват с Vectastain Elite ABC kit (Vector Lab., Inc., Burlingame, СА), като хромоген се използва 3,3-диаминобензидин тетрахидрохлорид. Контролите включват заместването на първично или вторично антитяло с PBS.

Методи. Изследвахме плъхове без патогени, които нормално имат много гоблетни клетки в носовия чашечен (септален) епител. За да се определи ефекта от fMLP, под формата на аерозол, върху дегранулиране на гоблетни клетки и върху миграцията на нутрофили в носовия мукозен епител, животните се подлагат на анестезия с натриев пентобарбитал (60 мг/кг, i.p.), и получават в носа с аерозол за 5 мин. N-формил-метиониллюсил-феналаланин (fMLP; 10’⁵М, Sigma, St. Louis, МО) в солен разтвор без пирогени. Подлагането на аерозол се осъществи с обдухване на животните с ултразвуков пулверизатор (PulmoSonic, DeVibliss Co., Somerset, PA), който създава аерозолна мъгла с дебит 0.3 мл/мин. По подобен начин, на контролни животни се дава през носа само аерозол със солен разтвор.

За да се изследва обратната гранулация на носови гоблетни клетки, след вдишване на fMLP аерозол, плъховете са подложени на евтаназия 48 ч. след подаване на fMLP през носа.

За да се оцени ефекта от активиране на EGF-R тирозин киназа върху обратното гранулиране на гоблетни клетки, животните предварително се обработват i.p., с един инхибитор на EGF-R тирозин киназа (BIBX 1522, 15 мг/кг, щедро предоставен от Boehringer Ingelheim

Inc., Ingelheim, Germany) 30 мин. преди да вдишат fMLP, като това се повтаря два пъти дневно.

Статистика. Всички данни са представени като средни +/-SEM. За всяка експериментална група се прилага еднопосочен ANOVA или тест Student 1. Вероятност по-малка от 0.05 се счита за статистически значима разлика.

Резултати

Влияние на дегранулация на гоблетни клетки от JMLP върху структурата на носов епител. В контролно състояние, носовия чашечен епител съдържа значителна площ от оцветени с AB/PAS гоблетни клетки, но луминалната повърхност остава неоцветена. Имунооцветяване за муцин MUC5AC протеин съответства на площта на AB/PAS оцветяване, но хибридизация на място демонстрира малка или никаква изява на MUC5AC гена. Имунохистохимичното оцветяване за EGF-R протеин бе отрицателно. Тези резултати показват, че контролния носов епител от плъх съдържа непокътнати гоблетни клетки, съдържащи MUC5AC протеин при липсата на изява на муцин ген. Отсъствието на оцветяване в лумина предполага, че дегранулиране (секреция) на муцини не е налице.

Хипотезата е, че нестимулиран носов епител от плъхове съдържа “стабилни”, не дегранулиращи гоблетни клетки, съдържащи муцин протеини. Показано е, че нутрофилни хемоатрактанти (т.е. fMLP) рекрутират нутрофили в епитела на дихателните пътища, където те причиняват дегранулация на гоблетни клетки, посредством процес зависещ от еластаза. За да се провери ефекта на дегранулация на гоблетни клетки, за 5 мин. в носа се въвежда аерозол от нутрофил хемоатракт, fMLP (10'⁷М). При плъхове подложени на евтаназия 4 ч. след fMLP, площта оцветена с AB/PAS и площта от МиС5АС-положително имунооцветяване са намалели значително, като в носовия епител се появява рекрутиране на нутрофили. АВ/РAS- оцветяване е изявено в повърхността на лумината от носов дихателен път, което потвърждава, че е настъпила дегранулация на гоблетни клетки. При това, на 4 ч. след fMLP, изявата на MUC5AC ген не се променя.

В плъхове подложени на евтаназия 48 ч. след fMLP, имунохистохимично оцветяване с антитяло на EGF-R, оцветява положително за EGF-R в пред-гоблетни и гоблетни клетки, площта от АВ/РAS- и МиС5АС-имунопозитивно оцветяване се връща на нивото, налично в контролното състояние, което показва, че се е появила обратна гранулация на носови гоблетни клетки. В това време, вече не се наблюдава рекрутиране на нутрофили; Изявата на MUC5AC ген е видна в площта заета от гоблетните клетки, което показва, че обратната гранулация на гоблетни клетки е свързана с нарастване изявата на муцин гена.

Роля на фосфорилация на EGF-R тирозин киназа при обратна гранулация на гоблетни клетки. От предходни изследвания с плъхове е докладвано, че активирането на EGF-рецептори (EGF-R) води до изява на муцин ген и протеин. За да се провери хипотезата, че активирането на EGF-R играе роля в обратната гранулация на носови гоблетни клетки от плъхове след fMLP, плъхове са предварително обработени (п=5) със селективен инхибитор на EGF-R тирозин киназа, BIBX 1522; аерозолна форма на fMLP предизвиква рекрутиране на нутрофили в носов епител и дегранулация на гоблетни клетки, но 48 ч. по-късно, площите на АВ/РAS оцветяване и МиС5АС-имуноположително оцветяване остават намалени. Тези резултати ангажират активирането на EGF-R в синтеза на муцин в носови клетки, след дегранулация от fMLP.

В настоящото изследване, ние проверихме регулирането на производството на муцин в носов епител от плъхове. Контролния епител съдържа значителен брой гоблетни клетки, като в тези клетки е налице MUC5AC протеин. При това, не се наблюдава изява на MUC5AC ген. Докладвано е, че изявата на MUC5AC муцин се явява в други епителни клетки от дихателни пътища посредством изявата на EGF-R и тяхната активация. В носови епителни клетки от контролни плъхове, не открихме изява на EGF-R ген или протеин. Тъй като не е налице оцветяване на лумена за AB/PAS или MUC5AC протеин, това предполага, че не настъпва значителна дегранулация (секреция) на клетки. В “стабилни” гоблетни клетки, EGF-R може да се подрегулира, като се предотвратява по-нататъшен синтез на муцин. Затова, ние “предизвикахме” носовите гоблетни клетки с индуциране дегранулация на гоблетни клетки и изследвахме последвалите промени в структурата на епитела в дихателни пътища.

Нутрофилни хемоатрактанти предизвикват в дихателни пътища от гвинейско прасе и човек дегранулация на гоблетни клетки, която зависи от нутрофили и е спомогната от нутрофилна еластаза, като между нутрофилите и таблетните клетки се осъществява близък контакт. За да индуцира дегранулация в нормални, налични гоблетни клетки в носов епител, през носа се вдишва fMLP. fMLP рекрутира нутрофили в носовия епител, последвано от дегранулация на таблетните клетки; AB/PAS оцветената площ забележимо намалява.

По-нататък, ние изучихме последващите събития в носовия епител, след дегранулиране на гоблетни клетки, индуцирано от fMLP. На 4 ч. след fMLP, когато се проявява максимална дегранулация на носови гоблетни клетки, все още липсва изява на EGF-R и MUC5AC. При това, 48 ч. след fMLP, EGF-R бе силно изявен в пред-гоблетни и гоблетни клетки. Изявата на MUC5AC ген сега е силно изразена в епитела, като тези събития са свързани с обратна гранулация на гоблетни клетки (нараства AB/PAS и MUC5AC оцветяването). В действителност, 48 ч. след fMLP, се появява обратна гранулация до точката, в която площта на

изява на гоблетните клетки е подобна на тази в контролно състояние.

Тези открития предполагат, че дегранулацията на гоблетни клетки води до изява и активиране на EGF-R, като по този начин се индуцира изява на

MUC5AC.

За да се провери ролята на активацията на EGF-R тирозин киназа в обратната гранулация на гоблетни клетки, обработихме предварително животни със селективен инхибитор на EGF-R тирозин киназа, BIBX1522. В животни предварително обработени с BIBX 1522, fMLP все още предизвиква дегранулация на гоблетни клетки. При това, предварителна обработка с BIBX 1522, предотвратява обратна гранулация на гоблетните клетки и тяхната изява на MUC5AC протеин. Тези резултати ангажират активирането на EGF-R в повторното нарастване на муцини след дегранулиране на гоблетни клетки. В плъхове без патогени, гоблетните клетки “не са активни” (т.е. не дегранулират), a EGF-R са подрегулирани. Когато възпаление (напр. стимулиране инфилтрация на нутрофили) предизвиква дегранулация на гоблетни клетки и секреция на муцин, свръхрегулиране и активиране на EGF-R повторно доставя муцини в епитела на дихателните пътища. Настоящите открития предполагат, че селективни инхибитори на EGF-R тирозин киназа могат да бъдат полезни за предотвратяване свръхсекреция при заболявания на носа.

Тъй като настоящото изобретение е описано с отнасяне до специфични негови изпълнения, трябва да стане ясно за тези, които имат необходимия опит и знания в областта, че могат да се направят различни промени и да се предложат еквиваленти за заместване, без те да се отделят от действителния дух и обхват на изобретението. В допълнение, могат да се направят много модификации, за да се адаптират към отделен случай, материал, състав, процес, етап или етапи от процес, в духа и обхвата на настоящото изобретение. Всички такива модификации имат за цел да бъдат в обхвата на приложените тук претенции.

Claims (27)

1. Метод за лечение на свръхсекреция на мукус в белите дробове, включващ: въвеждане на терапевтично ефективно количество от антагонист на рецептор на фактор за епидермално нарастване (EGFR) в пациент страдащ от свръхсекрция на мукус в дихателни пътища.

2. Метод, съгласно претенция 1, при който споменатия антагонист на EGF-R е инхибитор на киназа, селективен за EGF-R.

3. Метод, съгласно претенция 2, при който споменатия антагонист е BIBX 1522.

4. Метод от претенция 1, при който антагониста е едно антитяло.

5. Метод от претенция 4, при който антитялото е моноклонално антитяло, което специфично свързва фактора за епидермално нарастване (EGF).

6. Метод от претенция 4, при който антитялото е моноклонално антитяло, което специфично свързва рецептора на фактора за епидермално нарастване (EGF-R).

7. Метод от претенция 1, при който антагониста е една антисенсна молекула, характерна за поредица, кодираща протеин избран от групата състояща се от EGF и EGF-R.

8. Метод от претенция 1, при който антагониста подтиска трансфосфорилация на EGF-R.

9. Метод от претенция 8, при който споменатия антагонист е един анти-оксидант.

10. Метод от претенция 1, при който антагониста се въвежда с инжектиране.

11. Метод от претенция 10, при който антагонистът се въвежда венозно с носител под формата на нормален солен разтвор.

12. Метод от претенция 1, при който антагониста се въвежда с инхалация.

13. Метод от претенция 1, при който антагониста се въвежда посредством подаване на липозома.

14. Метод от претенция 13, при който споменатата липозома е пространствено стабилизирана и се въвежда венозно.

15. Метод in vitro за пресяване на предлагани агенти, включващ:

(i) контакт на един in vitro модел за нарастване(пролиферация) на гоблетни клетки с EGF или негов функционален еквивалент, (ii) последващ контакт на in vitro модела с предлаган агент; и (iii) оценка нарастването на гоблетни клетки; като едно намаляване нарастването на гоблетни клетки е показател за терапевтичния потенциал на агента.

ИМИМн»

16. Модел in vitro на претенция 14, при който in vitro моделите са белодробни епителни клетки.

17. Метод in vivo за пресяване на предлагани агенти включващ:

(i) създаване на един животински модел на белодробно заболяване със свръхсекреция с включване на EGF-R;

(ii) стимулиране на индуцирания EGF-R с лиганд, за да се получат гоблетни клетки произвеждащи муцин;

(iii) лечение с предлагания агент; и (iv) оценка нарастването на гоблетни клетки или секреция на мукус; като подтискане нарастването на гоблетни клетки или секреция на мукус е показателно за терапевтичния потенциал на предлагания агент.

18. Модел in vivo от претенцуия 17, при който животното използвано в модела in vivo е подбрано от групата състояща се от мишка, плъх, заяк или гвинейско прасе.

19. Модел in vivo от претенция 17, при който моделът in vivo е един астматичен модел.

20. Фармацевтична рецептура за лечение на свръхсекреция на мукус в дихателните пътища, включваща:

терапевтично ефективно количество от един антагонист на рецептора на фактора за епидермален растеж (EGF-R) е доза достатъчна да намали свръхсекрецията на мукус в дихателните пътища;

и един терапевтично приемлив носител.

21. Рецептура от Претенция 20, в която споменатия антагонист на EGF-R е инхибитор на киназа, селективен за EGF-R.

22. Рецептура от Претенция 20, в която споменатия антагонист на EGF-R подтиска трансфосфорилация на EGF-R.

23. Рецептура от Претенция 20, в която споменатия антагонист е един анти-оксидант.

24. Рецептура от Претенция 20, в която антагониста е едно антитяло.

25. Рецептура от Претенция 24, в която антитялото е моноклонално антитяло, което специфично свързва фактор за епидермален растеж (EGF).

26. Рецептура от Претенция 24, в която антитялото е моноклонално антитяло, което специфично свързва рецептор на фактора за епидермален растеж (EGF-R).

27. Рецептура от Претенция 20, в която антагониста е една антисенсна молекула, характерна за поредица кодираща протеин избран от групата състояща се от EGF и EGF-R.