BG51160A3 - Метод за получаване на рибозоми - Google Patents

Abstract

Методът е приложим в генноинженерните лаборатории за получаване на рибозоми, необходими за създаване на средства за лечение на вирусни заболявания по растения, животни и хора. Отличава се с висока ефективност и възпроизводимост. Представлява комбинация от генноинженерни операции, предвиждащи включване в цялостната нуклеотидна структура на хибридизационна област, съдържаща едно или повече разклонения, формирани от едноверижна рнк, комплементарна на най-малко част от мишенна рнк, асоциирането й с каталитична област, способна да разгражда мишенната рнк, след което структурата се подлага на стабилизиране. 4 претенции, 17 фигури

Description

(54) МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА РИБОЗОМИ

Изобретението се отнася до метод за получаване на рибозоми, имащи високо специфична ендорибонуклеазна активност за нуждите на генното инженерство.

Известно е, че в природата съществуват рибозоми, например във вируса на слънчевата мозайка по авокадото (А5ВУ), сателитните рибонуклеинови киселини на вируса на тютюневата мозайка (зТовКУ) и вируса на временната ивичестост по люцерната (зЬТУ).

Техен недостатък е, че макар и да могат да бъдат получени наготово, те претърпяват самокатализиращо се разграждане, което представлява съществена и уникална част от жизнения им цикъл. Реакциите на самокатализиращо се разграждане на РНК се дължат на общоизвестния факт за влиянието на бивалентните метални йони и неутрално или високо рН, и като резултат се получава РНК с край, имащ 5’-хид» роксил и 2’, 3’ циклични фосфатни групи /1/. Реакциите на саморазграждане се катализират от самите рибонуклеинови киселини, вероятно като резултат от конформационното привличане на реактивните групи в тясна близост. Сайтовете на самокатализираното разграждане в природно изолирани РНК-и са локализирани в тясно специфични области на вторичната структура на РНК /2/. Рибозомите, които се намират в природата в Тетрахимена термофолия (известни като 1У8, или Ь-19 1У8 РНК) и които са подробно описани в /3/, имат единадесет базисен активен сайт, който се хибридизира с мишенната последователност на РНК, подлежаща понататък на разграждане, изискващо свободен гуанозин или гуанозинови деривати. Фрагментите, които се получават след разграждането, съдържат 5’- краен фосфат и 3’ - крайни хидроксилни групи. Лимитираното количество нуклеотиди, способни на хибридизация с РНК субстрат, определя ефективността или производителността на Сеч ендорибонуклеазата като цяло, олигонуклеотидите, съдържащи по-малко от 12 нуклеотида хирбидизират лошо мишенната последователност. Установява се също, че известно количество от нуклеотидите в активния сайт на Сеч ендорибонуклеазата следва да бъде запазена е оглед ефективността на ендорибонуклеазната активност. Това ограничава числото на премутациите на активните сайт последователности, които могат да бъдат конструирани за ефективна хибридизация с мишенната последователност, поради което рестрикцията иа областта от РНК мишенна последова5 телност е подходяща за разграждане със Сеч ендорибонуклеаза. Сеч рибонуклеазата също така модифицира ДНК чрез добавяне на свободен гуанозин нуклеотид към 5’-края на разградената РНК.

Задачата на изобретението е да се създаде метод за получаване на рибозоми, имащи високоспецифична ендорибонуклеазна активност, който да е високоефективен и възпроизводим и чрез който да се избегне самокатализиращото разпа15 дане на природните продукти.

Тази задача се решава чрез конструиране на рибозоми от кореспондираща ДНК последователност (ДНК, която при транскрибцията произвежда рибозома, синтезирана съгласно извес20 тните методи за синтез на ДНК реч зе /10/), свързана към РНК полимеразен промотор, като напр. промотор за Т7 РНК полимераза, Р6РНК полимераза или...РНК полимераза. ДНК последователност, кореспондираща на рибозомите съгласно изобретението, може да бъде свързана в ДНК трансфериращ вектор, такъв като плазмид или бактернофагна ДНК. Тогава, когато трансфериращият вектор съдържа РНК полимеразен промотор, свързан с ДНК, кореспондираща на рибозомите,обикновено рибозомата се получава посредством инкубация с РНК полимераза. Поради това рибозомите могат да бъдат продуцирани ин витро чрез инкубация на РНК полимераза с РНК полимера35 зей промотор, свързан с ДНК, кореспондираща на рибозомата, в случая рибонуклеотидите. И и виво, прокариотичните или еукариотичните клетки (включително клетки на бозайници или растения), могат да бъдат трансферирани с под40 ходящ трансфериращ вектор, съдържащ генетичен материал, кореспондиращ на рибозомите съгласно изобретението, който да е свързан с РНК полимеразен промотор така, че рибозомата да бъде транскрибирана в клетката на гос45 топриемника. В случая трансфериращият вектор може да бъде бактериален плазмид или вирусна РНК или ДНК. Нуклеотидните последователности, кореспондиращи на рибозомите са подведени под контрола на силни промотори, като напр. 1ас, 8У40 1а1е, 8У40 еагу, метионин или промотори. Рибозомите могат да бъдат директно транскрибирани ин виво от трансфер вектора или обратно - могат да бъдат транскрибирани като част от една по-дълга молекула РНК. Така ДНК, кореспондираща на рибозомна последователност, може да бъде свързана към 3’ края на носещия ген, напр. след транслационния стоп сигнал. По-големи РНК молекули могат да подпомогнат стабилизирането на рибозомните молекули срещу нуклеазното усвояване вътре в клетките. При транскрибцията носещият ген може да доведе до протеин, чието присъствие да може да бъде директно установявано, напр. чрез ензимна реакция. Така например носещият ген може да кодира ензим.

Съгласно изобретението възможно е също да се създаде и ДНК трансфериращ вектор, който съдържа ДНК последователност, кореспондираща на рибозома, свързана с промотор за обезпечаване транскрибцията на рибозомата. За получаване на рибозомите, два синтетични олигонуклеотида от комплементарни последователности, създадени по известен начин /4/, се хибридизират заедно ,като един от олигонуклеотидите кодира желаната рибозома. Респективните краища иа хибридизираните олигонуклеотиди кореспондират на различни рестрикционни ензимни сайтове, наречени ЕсоК.1 при единия край и РзП при другия край. След разграждане с подходящи рестрикционни ензими (ЕсоК1 и РзП в горния пример), двойноверижният ДНК фрагмент може да бъде клониран в трансфериращ вектор. Там, където плазмидиият вектор съдържа РНК полимеразен промотор след ДНК последователността, кореспондираща на рибозомите от изобретението, РНК транскрибторите, кореспондиращите на рибозомите, могат да бъдат създадени както ин виво, така и ин витро. Когато рибозомата е създадена от две половинки, носени от чифт бази между комплементарните нуклеотиди, всяка от рибозомите може да бъде продуцирана съгласно горните похвати, а половинките - инкубирани заедно, за да формират рибозомите.

В случая за предпочитане е рибозомите да притежават хибридизационна област, включваща едно или повече рамена, формирани от едноверижна РНК и имаща последователност, комплементарна на най-малко една част от мишенната РНК. Тези едно или повече рамена са асоциирани с каталитична област, способна да разгради същата тази машина РНК. Там, където хибридизационната област включва едно рамо, то съдържа най-малко 9 нуклеотида, а където хибридизационната област включва 2 или повече рамена от РНК, сумата от нуклеотидите е повече от 9.

Според един от вариантите на изобретението, получените рибозоми имат формулата:

3’ 5 ’ / X /„ X х / х /_ж /I/ А С /I/

А С & 1_А С /II/

С · & в· А

5* 3* в която X е който и да е рибонуклеотид и всеки X остатък може да бъде същия или различен; сумата от η и η е по-голяма от 6 и η и η може да бъде същата или различна; знакът / + / представлява двойки чифтове между комплементарните рибонухлеотиди; X и X са олигонуклеотидите от комплементарни последователности по продължение най-малко на част от нейната дължина, за да позволят образуването на двойките бази между олигонуклеотидите? или X и X заедно формират едноверижна ДНК последователност, като най-малко част от тази последователност включва ствола, формиран от двойките бази между комплементарните нуклеотиди; необезателно е, но е възможно, във формула /1/ след 1а да бъде вмъкнат един нуклеотид, селекциониран от един от А,С,С или и.

Областта /I/ от формула /1/ представя рамената или фланкиращите последователности на рибозомата, които се хибридизират със съответните порции от мишенната последователност. Рамената могат да хибридизират по продължение на цялата дължина от мишенната последователност или част от нея. Такава каталитнчна област във формула /1/ се изобразява като област /II/. Каталитичната област може да съдържа един или повече допълнителни нуклеотида, които не влияят неблагоприятно на каталитичната активност. Каталитичната област може също да формира част от хибридизационната област.

Олигонуклеотидите X’ и X могат да включват до 5 000 или повече нуклеотида.

Един друг специфичен вариант на изобретението се илюстрира с формула на рибозома, която има вида:

А А η в с	»	х/х/п, ТА& 5 6 & А
X		X X
X	*	X
/X/	*
X X в и в която: X представлява който и да е рибо-

нуклеотид и всеки X остатък може да бъде съ- 15 щия или различен; знакът / + / представя двойките бази между комплементарните рибонуклеотиди; η и п’ са същите, определени по формула /1/; м и м’ са един или повече или могат да бъдат еднакви или различни; В представя 20 връзката, двойката бази, рибонуклеотида или олигонуклеотид, съдържащ най-малко 2 рибонуклеотида; след 1а би могло да бъде включен един допълнителен нуклеотид, селекциониран от който и да е от А,О,С или и, във формула 25 /2/.

Рибозомите съгласно изобретението разглеждат мишенна последователност от РНК, която съдържа последователността ΧθυΥ, в която Х° е който и да е рибонуклеотид, и е урацил и У 30 е фланкиращият регион, който не е свързан с двойка бази. За предпочитане е, но не в смисъл изключително, Х° да бъде гуанидин, а ΧθϋΥ да е ОиС или ОиА. Всяка РНК молекула, съдържаща тези последователности, може да бъде разградена с рибозоми по настоящото изобретение. Като изключение, последователността на РНК транскрибта, съдържащ Χ°ΌΥ е детерминирана. Разклоненията на рибозомалната последователност могат да бъдат така синтези- 40 рани, че да бъдат комплемеятарни, а по този начин и хибридизируеми на мишенната последователност, странично разположена на ΧθυΥ последователността. При хибридизация на страничните разклонения на рибозомите с ми- 45 шейната РНК последователност, странична на Χ°ϋΥ последователност, каталитичната област от рибозомите разцепва мишенната РНК вътре в Χ°υΥ последователността. Разцепването на РНК е улеснено в случая от магнезиев 50 или друг двувалентен катион при рН приблизително 8,0.

Съгласио изобретението съответно рибозомнте могат да бъдат конструирани така, че да разградят всяка РНК, чиято последователност е позната. Високата повторяемост на остатъците, 5 разградени с рибозоми в РНК означава, че (1:64 за СиС в РНК със случайна и еднаква повторяемост от разпределение на базите) голям брой от потенциални сайтове за рибозомални отрязъци могат да бъдат предсказани в която и 10 да е мишенна РНК.

Съгласно друг аспект на изобретението се обезпечава метод за инактивация на мишенна последователност от РНК, която включва реакция на посочената мишенна РНК последователност с рибозоми, конструирани по настоящото изобретение.

Ин виво, т.е. вътре в клетката или клетките от един организъм, един трансфериращ вектор като напр. бактериален плазмид или вирусна РНК или ДНК, който кодира една или повече рибозоми, може да ги пренесе в клетките /5/.

Вътре в клетките трансфериращият вектор може да се реплицира и транскрибира чрез целуларните полимерази и да продуцира рибозомални РНК, които след това да инактивират желана мишенна РНК. В противовес на това, трансфериращ вектор, съдържащ една или повече рибозомни последователности, може да бъде пренесен в клетки или въведен в клетките посредством микроманипулационни техники, като микроинжекция, така че трансфериращият вектор или негова част да се интегрират в генома на клетката гостоприемник. Транскрибцията на интегрирания материал достига рибо35 зоми, които действат така, че да инактивират желана мишенна РНК.

Получените съгласно изобретението рибозоми могат да бъдат екстензивно терапевтично и биологично приложими. Например болестите по хората и животните ,причинени от вируси, могат да бъдат инактивирани чрез даване на заразените обекти на рибозоми, съгласно изобретението, адаптирани да се хибридизират с разградени РНК транскрибти от вируса. Такива рибозоми могат да бъдат доставени чрез парентерално или каквото и да е друго снабдяване на организма. В противовес на това, обектът, инфектиран с вирус, може да бъде снабден с авирулентен вирус, като ваксина или аденовирус, които са генетично конструирани да съдържат ДНК, кореспондираща на рибозоми, свързани с промотор, така че рибозомите са транскрибира4 ни в клетките на гостоприемника, пренесени с конструиран за целта вирус, за да предизвика разграждане и/или инактивация на мншенна РНК, транскрибт от болестотворния вирус. Получените по изобретението рибозоми имат специално приложение за вирусни заболявания, като напр. вируса на херпес симплекс (Н8У) или вируса на СПИН (Н1У).

Рибозомите от настоящото изобретение имат също специално приложение за инактивиране на РНК транскрибтите в бактериите или други прокариотични клетки, растения или животни. В бактериите, РНК транскрибти от напр. бактериофаги, причиняващи загиването на бактериалните транскрибти от например бактериофаги, могат да бъдат инактивирани посредством трансфекция на клетки с ДНК трансфериращ вектор, способен да доведе до създаването на рибозоми съгласно изобретението, който да инактивира фаговата ДНК. И обратно, рибозомите могат да бъдат въведени или иззети от бактериалните клетки, за да предизвикат разграждане на фаговата РНК.

РНК транскрибтите в растения могат да бъдат инактивирани, използвайки рибозоми, кодирани от трансфериращ вектор като Т1 плазмид от Ао. Когато такива вектори са трансфектирани в растителни клетки, рибозомите са продуцирани под въздействието на РНК полимераза и могат да предизвикат разграждане на специфична мишенна последователност. Съответно растителни вируси, чиято РНК последователност е известна, или РНК транскрибти от растителни гени, също могат да бъдат инактивирани, използвайки рибозоми.

Ендогенни гении транскрибти в растения, животни или други клетъчни типове, могат да бъдат инактивирани, използвайки рибозоми от настоящото изобретение. Съответно на това, могат да бъдат модулирани различни нежелани генотипове или характеристики. Възможно е, например с използването на рибозомите, конструирани съгласно изобретението, да бъдат отстранени костилките от плодовете или лекуването на наследствени заболявания у хората, причинени от продуктите на вредни протеини или суперпродукцията на специфични протеини.

Изобретението се пояснява със следните фигури.

Фигура 1 показва разградените сайтове от диви и мутантни типове РНК; един електрофоретичен профил, показващ продукти на самокатализирано разграждане на РНК.

а/ Сумирайки запазените структури, асоциирани с изолирани от природата сайтове на разградена РНК в А8ВУ, сателитна ДНК от тритон и сателитни РНК от зТовКУ, ЬТ8У, вируса на мозаечната болест по тютюна и вируса на мозаечната болест по слънчогледа. Показани са нуклеотидни последователности, които са запазени между тези структури, докато други са представени като X. Двойките бази са представени с + и сайтовете на РНК разграждане - със стрелка.

б/ Показва нуклеотидните последователности, асоциирани с разградените от /+/ веригата ТовКУ РНК. Сайтът на разграждане е посочен със стрелка.

в/ Мутант ин витро на ТовКУ, съдържащ инерция от 11 нуклеотида заедно с фланкиращи дубликати от три нуклеотида (иСШ остатъци 7 до 9).

г/ Субклонирани Нае III фрагменти от див тип ТовКУ и Д-51 ин витро мутанти, всеки от които е транскрибиран в / + / и/-/ ориентация и белязани транскрибти, фракциониранн чрез полиакриламидна електрофореза. Позициите са иеразградените 159 и 170 бази транскрибти от див τΐ}π (АУТ) и мутант (Д-51) последователности са белязани със стрелка. Показани на размерите на продуктите на разграждане.

Фигура 2 показва нуклеотидната последователност на рибозома и продуктите на рибозомалното разграждане, сепарирани чрез гел електрофореза.

а/ Включените в мутант Д-51 нуклеотиди съдържат ВамН1 рестрикционно ендонуклеазен сайт (фигЛс). ВамН1 е използвана да разгради мутантната ДНК и две последователности са субклонирани и транскрибирани ин витро. РНК транскрибтите са показани схематично, с потенциалните двойки бази между РНК, белязани с + . Фрагментът, съдържащ сайт, белязан със стрелка за разграждане, се отнася до -РНК; фрагментът, съдържащ рибозомата е означен като Κζ - РНК.

б/ ³²Р/ -Κζ -РНК /101 бази/ се инкубира самостоятелно (линия 1), и с небелязана 8 -РНК (линия 2). Ρ -8-РНК се инкубира самостоятелно (линия 3), и с небелязана и с ³²Р -белязана ΚΖ - РНК (линии 4 и 5 респективно).

Фигура 3 показва схематичен модел на рибозоми съгласно един от вариантите на настоящо5 то изобретение. Областта А представя раздробяваната последователност вътре в мишенната РНК. Областта В представя каталитичната област и областите С представят разклоненията от рибозомата.

Фигура 4 представя дизайна на рибозомнте, явяващи се мншенни за САТ (хлорамфеннкол ацетил трансфераза) генна транскрибция. Рнбозомите, наречени КгСАТ - 1,2 и 3, са насочени срещу сайта вътре в 835 база, транскрибирана ин витро от САТ гена. Релативни локации от раздробените сайтове на транскрибтите са показани схематично с фланкиращи бази, номерирани а. Показани са трите рибозомални последователности (а до в) с техните мишенни последователности. Аминокиселинните последователности от САТ -гените са номерирани, предсказаните сайтове за РНК раздробяването са означени със стрелки. Κζ - САТ -1 и 3 съдържа 24 бази последователности получени от / + / верига зТовКУ (област В, фиг.З), докато Κζ САТ - съдържа единично и-А изменение в тази област.

Фигура 5 показва резултатите от САТ РНК раздробяване с рибозоми КгСАТ-1 до 3.

а/ РНК, белязана с Ри означена като / Р/САТ, се подлага на гел фракциониране след самостоятелно инкубиране с една от трите рибозоми КгСАТ -1 до 3 (линии 1,2 и 3 респективно). Локализацията на пълната транскрибция е показана със стрелки.

б/ 5 - краен базисен анализ. 3-фрагментнте, продуцирани чрез раздробяване на рибозомнте от САТ мРНК се подлагат на въздействието на киназа, гел пречистване, пълно нуклеазно усвояване и терминално фракциониране при рН 3,5 полиакриламидна гел електрофореза. 5’ - крайните нуклеотиди, определени чрез отнасяне към маркери (линия М), са А, и и С за фрагментите, продуцирани от Р САТ -1 до 3 (линии

1,2 и 3 респективно).

Фигура б показва времето на каталитична активност на рибозомата КгСАТ-1 срещу САТ РНК. Количеството на продуктите от разпадането на 139 -тия нуклеотид е определено и нанасено на диаграма. Вставката показва акумулацията на 139 базовия фрагмент във времето след полиакриламидна гел електрофореза.

Фигура 7 показва реалтивно степента на раздробяване на САТ РНК при различни температурни условия. Субстратната РНК е представена с плътна линия. Във всеки отделен случай продуктите на разпадане са показани с прекъсната линия.

Фигура 8 представя три рибозоми, кореспондиращи на КгСАТ -2, които имат разклонения или фланкиращи последователности с различна дължина.

Фигура 9 показва схемата на получаване на рибозоми, кореспондиращи на Κζ САТ -2, конто включват каталитични безсмислени РНК, съдържащи всяка от разградените области КгСАТ -1 до 3.

Фигура 10 показва рибозоми, хибридизиращи мншенни последователности, съдържащи СЧА (10а) и Сии(Юв), основни в САТ мРНК.

Фигура 11 показва сайтовете на самокатализирано РНК раздробяване у вируса по външната обвивка на цитрусови растения /СЕУ/ и неговите комплементи.

Фигура 12 показва рибозомата КгСЕУ 25х/ + /, хибридизирана с мишенна СЕУ РНК /а/ и гел електрофоретичен профил от /+/СЕУ РНК и комплементарна /-/ СЕУ РНК, инкубирана с КгСЕУ 25х/ + / , /в линия респективно. Продуктите на раздробяване са означени със стрелки.

Фигура 13 показва рибозомата КгСАТ-2, хибридизираща се с нейната мишенна последователност /а/ и рибозома КгЗСМоУ/в/. Каталитичната област във всяка рибозома е подчертана. Маркирани са различията в каталитичните области от КгЗСМоУ в сравнение с КгСАТ-2.

Фигура 14 показва рибозомата КгСЕУ-2, хибрндизираща се с мишенна последователност от РНК на вируса по външната обвивка на цитрусови /СЕУ/. Сайтът на раздробяване кореспондира на нуклеотид 336 в СЕУ РНК последователност. Алтернативната последователност в каталитичната област, в сравнение е каталитичната област от ЗТовКУ, е кръгова (а). Фигура 14 в показва един електрофоретичен профил от контролна верига от СЕУ/РНК, линия 7 и /+/ верига от СЕУ РНК линия 8, след инкубация с Р СЕУ₂.

Фигура 15 показва рибозомата КгСАТ-2/а, сравнена с рибозома КгСАТ-2В/в. Каталитичните области са показани чрез по-плътно изписване. Измененията на каталитичната област КгСАТ-2В,сравнена с Р САТ-2, също са подчертани.

Фигура 16 показва картата на плазмида ρ135Ν.

Фигура 17 представя графично осреднени чеб тири експеримента върху инхибицията на САТ експресия в растения (тютюневи протопласти).

Реакциите и манипулациите, включващи ДНК като свързване, рестрикционно ензимно разграждане, бактериална трансформация, подреждане на последователността на ДНК и др., се провеждат съгласно стандартни техники, описани напр. от МашаНя е! а1 /6/.

Манипулациите, включващи РНК са провеждани също съгласно стандартни техники /8/.

Предимствата на метода съгласно изобретението се състоят в това, че е високоефективен и възпроизводнм, а получаваните като резултат рибозоми са с широка приложимост в биотехнологичната практика.

Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения:

Пример 1. Самокатализиращо раздробяване на мутационна ТовРУ РНК.

Провежда се съгласуване на областите, асоциирани с природни сайтове в АЗВУ, сателитни ДНК транскрибти от тритон и сателитни ДНК от ЗТовКУ, ЬТЗУ, вируса на тютюневата мозайка (ЗУМоУ) и вируса на средиземноморската мозайка от люцерната (ЗСМоУ), както е показано на фигура 1а. Показани са нуклеотндни последователности, съхранени между тези структури, докато несъхранените последователности са представени като X. Един екстра и е позициониран след остатъка 1А ЬТ8У/+/ веригата.

Областта, асоциирана със самокатализиращо раздробяващата се / + / верига от ЗТовКУ е проучена за установяване на енизмната субстратна активност вътре в тази област. Най-напред, клонирането на ЗТОвКУ с ДНК се подлага на мутация, използвайки олигонуклеотиден линкер (ВамН1) инсерцнонен протокол.

Конструиране на вектор за ни витро експресия на ТовКУ.

Фрагмент 160 вр Та§ 1- 5ре1 от ЗТовРУ с ДНК се изолира от рЗР 653 /17/ и се свързва с Асс1 Зре1, срязва се и се третира с фосфатаза рСЕМ-ь за да промени сайта Асс1. Полученият в резултат клон се линеаризира с Асс1, третира се с фосфатаза и с 359 вр Та§1 фрагмент от ЗТовКУ с ДНК се инсертира. Получените в резултат клонове се подлагат на скрннннг за присъствието на циклична 520 вр ЗТовКУ с ДНК последователност, съдържаща терминални остатъци от 277 до 81 /рТТ/. Последователността ТовКУ е фланкирана от промоторите за Т7 и Р6 РНК лолимерази и транскрибцнята, проведена ин витро, довежда до / + / или /-/ ориентация, която съдържа два сайта за самораздробяване.

Ин витро мутагенезис.

Плазмидът рТТЗ/50и£/ е линеаризиран с ВамН 1, третиран, с 31 нуклеаза и отново свързан, за отстраняване на уникалния ВамН1 сайт. Резултантната конструкция, рТТ8-В, е третирана с 2x10⁴ единици дезоксирибонуклеаза 1 в 20 мМ Трис-НС1 рН 7,0;15 мМ МпСН за 10 мин при 37°С. Резултантната линеарна ДНК е балансирана или/и запълнена, използвайки Т4 ДНК полимераза, и пречистена с 0,7% ЬСТ агарозна гел електрофореза и екстракция. Обработения с киназа ВамН 1 линкер с последователност (ССОАТССС) е свързан към линеаризирания плазмид за едно денонощие при стайна температура в присъствието на 5% полиетиленгликол. Последователно, реакциите са проведени с ВамН 1 и линеарните плазмидни ДНК отново пречистени на 0,7% ЬСТ агарозна гел електрофореза (тук е установено, че е необходимо да бъдат отстранени последните малки количества от кръговия плазмид заедно с несвързаните линкери/. Плазмидите отново са върнати в тяхната кръгова форма, използвайки Т4 ДНК лигаза, и трансформирани в Е.еоН ДН1. Колонии (по-големи от 1000) са събрани от агаровите плочки, култивирани в течни култури за насищане и след това са приготвени смесени култури от плазмидна ДНК. Смесените ЗТовРУ с ДНК инсерти са изрязани с рестрикционнн ензими при фланкиращите ΕοοΚΐ и Р$т1 сайтове, пречистени с 1% ЬОТ агарозна гел електрофореза и субклонирани в ΕοοΚί -Ря11 отрязък, третиран с рСЕМ 4. Резултантните траисформанти отново са групирани, култивирани в течна култура и е изготвена плазмидна ДНК. Плазмндните ДНК са третирани с ВамН1, за да се раздробят само онези плазмиди, съдържащи ВамН1 линкерни последователности, и линеарните форми отново са пречистени на два пъти чрез 0,7%-на ЬСТ агарозна гел електрофореза, отново върната в кръгова форма с Т4 ДНК лигаза и трансформирана в Е.еоН ДН-1. Индивидуалните трансформанти са скринирани за крайни позиции от инсертираки ВамН1 линкери вътре в ТовКУ последователността чрез рестрикционни ензими, субклонирани в М13 и съгласувани чрез дидезоксинуклеотидна верижна терминална техника.

Библиотека от ЗТовКУ метантни остатъци и анализите на нуклеотидните последователности показват, че всеки мутант съдържа една линкерна ВамН1 последователност, която е инсертирана (СССАТССС) заедно с фланкираща или делетирана ЗТовКУ последователност. Мутантите са транскрибирани ин витро и РНК-те са изпитвани за възможността да бъдат подложени на раздробяване. От тези експерименти 52нуклеотидна последователност е идентифицирана като съдържаща едновременно и субстрата и частите от раздробяването на ЗТовКУ РНК. Тази 52-нуклеотидна последователност, показана на фиг.1 в, съдържа областта съхранени последователности, необходима за саморазграждането на други РНК (фиг.1а). Един мутант, означен като Д-51, съдържа единадесетнуклеотидна ВамН1 линкерна последователност, включена между три дупликационни ЗТовКУ нуклеотида, номерирани от 7 до 9. Този мутант търпи самокатализирано РНК разграждане.

Фрагментите с 97 и 108 двойки бази на НаеШ, съдържащи 52-нуклеотидна последователност от разграждането на дивия тип и мутантен тип Д-51 РНК-и (както е показано на фиг.1 в и 1с) са изрязани от плазмидии клонове. Фрагментите са свързани в Зма1 сайта от рСЕМд и скринирани за получаване на двете ориентации от инсерцията. Плазмидите са линеаризирани, използвайки ЕсоК1 и / + / и /-/ вериги от РНК с дължини 159 н 170 бази са транскрибирани, използвайки 200 единици (мл Т7 РНК полимераза в 50 мМ Трие - НО, рН 7,5, 10 мМ ΝηΟ, мМ М₈С1_2>2 мМ спермидин, 1000 единици/мл рибонуклеазин, 500 иМ АТФ, СТФ и ОТФ с 200 дМ/ а Р/ иТФ. Рибонуклеиновите киселини са фракционирани чрез електрофореза върху 10% полиакриламид, 7 моларна уреа, 25% формамиден гел и авторадиографирани.

Както е показано на фиг.И, нераздробени транскрибти от /-/ верига на РНК са изследвани. Според очакванията /-/ верига не съдържа сайт от самокатализирано разграждане. С /+/ вериги от дивия тип и Д-51 последователности, разграждане може да се осъществи, като разграждане на Д-51 РНК се реализира по-малко ефективно от това на дивия тип (фигура 1ά). Този експеримент показва, че област от едиоверижна бримка при дясностоящата 52-нуклеотидна последователност, включен в самокатализирано разграждане на РНК, не е основно.

Разделяне на ензимната и субстратна активност

Използвайки ВамН1 рестрикционен ендонуклеазен сайт, включен в Д-51, фланкирайки 5 НаеШ-ВамН1 и Вам-НаеШ фрагменти са получени и всеки е субклониран в Е.соН-плазмид, подходящ за ин витро транскрибция. Това води до елиминиране на мутантната едноверижна бримка от самораздробената област, разцеп10 вайки областта на два РНК сегмента (фиг.2а). По-малкият НаеШ-ВамН1 фрагмент съдържа нуклеотиди 321 до 9, включвайки активния сайт на разграждане и е наречен 3 фрагмент. ВамН1 - НаеШ фрагментът, съдържайки ЗТовКУ нук15 леотиди 7 до 48, е наречен рибозома или Κζ фрагмент. Плазмидите Е.соН, използвани за ин витро транскрибция, са рОЕМЗ и рОЕМ4 /10/.

Тези експресионни плазмиди съдържат: а/вид репликация; б/ избирателен геи, устойчив на ле20 карства /АМР/; в/ мултиплен клониращ сайт, фланкиран от РНК полимеразни промотери, които могат да бъдат използвани за ин витро продукция на транскрибтите.

Третиран с ДНК полимераза Т7, разкъсан с 25 Κρηΐ Κζ -рОЕМЗ и с Хва1 на 8-рСЕМ4, са транскрибирани, използвайки ЗРб РНК полимераза при същите условия, както са използвани по-горе.

Както е показано на фиг.2 и двете рибоиукле30 ннови киселини 3 и Р показват незабележимо разграждане при инкубация самостоятелно (фигура 2в, линии 1 и 3) при условия, подходящи за високо ефективно саморазграждане (50°С, 20 мМ М§С1₂,рН 8,0). Белязаните Κζ-ΡΗΚ се про35 явяват също като неизменени след инкубация с

5-РНК (фиг.2в, линии 2 и 5). Независимо от това, когато 8-РНК се смеси с Κζ -РНК се проявява ефективно раздробяване на 3-РНК (фиг.2в, линии 4 и 5), продуцирайки два фрагмента. Про40 дуктите са съставени чрез разграждане на 3РНК (84 бази) при обикновен сайт между нуклеотидите 359 и 1, за да даде 5 и 3 проксимални фрагмента от 67 и 17 нуклеотида, съответно. Това показва, че 8-РНК действа като субс45 трат за рибонуклеолитично раздробяване от Κζ-ΡΗΚ, която действа в каталитични условия.

Модел на рибозома, базирана на каталитичен район от ЗТовКУ РНК е показан на фиг.З. Рибозомата има две разклонения или фланкиращх последователности от едноверижни РНК, показани при С, хибридизирани до комплементарни последователности върху субстратиа РНК, т.е.

да бъде раздробена РНК. Всяка фланкираща последователност, показана при С, съдържа 8 рибонуклеотида. Някои от нуклеотидите, включени в областта С не са критични. Достатъчно количество нуклеотиди, обаче, трябва да присъстват, за да позволят на рнбозомите да хибридизират с мишенна РНК. Четири нуклеотида във всяка област С са необходими с оглед да представляват минималния броя за хибридизация.

Каталитичната област В съдържа последователности, които са добре запазени в природно намерените области на раздробяване (вж.фиг.1а). За сравнение с областите на разграждане от известните последователности, дължината на двойките бази от ствола II не е от значение, така както присъствието на асоциирана бримка при единия край.

Сайтът на раздробяване вътре в мишенната РНК е описан при А (фиг-.З) като СЬ1С. На основата на нашите експерименти (не показани), и други от Κοίζυπΰ (РЕВ5 ЬЕТТ 288; 229-230, 1988; и РЕВ5 ЬЕТТ 239; 285-288, 1988) при раздробяването на природно намерени РНК, последователностите сил, сис, сис, лис и ииС също действат като сайтове иа раздробяване вътре в РНК.

Пример 2. Демонстрация на дизайна, синтезата и активността на рибозоми с нова и високо специфична ендорибонуклеазна активност.

Като илюстрация на изобретението са описани три рибозоми, които са насочени срещу транскрибтите на широко използван индикаторен ген, получен от бактерия, Тп9 Хлорамфенокил ацетил трансфераза (САТ), който кодира синтезата на антибиотична устойчивост у бактерии, растения и животни и които могат да бъдат лесно изпитвани. Тези рибозоми, описани като Κζ САТ -1 до 3, кореспондират на потенциални СЬ1С сайтове в САТ РНК при позиции 139-140, 494-495 и 662-663 респективно. Последователностите на тези рибозоми са представени на фиг.4. Във всеки случай, фланкиращите последователности от рибозомата, която се хибридизира с мишенната САТ РНК, са с дължина 8 нуклеотида. Каталитичната област е така избрана, че да кореспондира на тези от 8ТовУ РНК, показани на фигура 3.

Генът САТ е получен от рСМ4 и субклониран като ВамН1 фрагмент в рСЕМ-32 (от Рготеда, МасНзоп, ЮТ, и.8.А.). Този плазмид е линеаризиран с ΗΐπάΙΙΙ и САТ ген транскрибти са получени, използвайки Т7 РНК полимераза с 220 32 м / а - Р/иТР. Рибозомните последователности са синтезирани като олигонуклеотиди, Κζ САТ-1,2 и 3 респективно. Те са обработени с киназа, свързани чрез фосфатазно обработване, срязани с ЕсоК1 -РзИ за рСЕМ4 и инкубирани с К1епо фрагмент на ДНК полимераза 1 преди бактериалната трансформация. Лннеаризираннте с ЕсоК1 плазмиди са транскрибирани с Т7 РНК полимераза за получаване на рибонуклеиновите киселини. Рнбозомите са инкубирани със САТ транскрибти в 50 мМ Трис-НС1 рН 8,0, 20 мМ М$С1₂ при 50°С за 60 мин и продуктите, фракционирани чрез 5% полиакриламид 7М урея, 25% формамид гелна електрофореза, следвано от авторадиография.

Когато 840-нуклеотидният САТ транскрибт е инкубиран с всеки един от трите рибозоми, осъществява се ефективно и високо специфично раздробяване (фигура 5), продуцирайки 2 РНК фрагмента във всяка реакция. Размерът на фрагментите е определен от сайтовете на разграждане (т.е. 139 и 696,494 и 341,662 и 173 бази фрагменти са 5’- и 3*-продукти от КгСАТ -1 до 3 катализирано раздробяване съответно). Условията, необходими за това катализирано от рибозомите раздробяване, са аналогични на онова, което бе разгледано при природните реакции на раздробяване /3, 11/ с по-ефективно раздробяване при повишено рН, температура и двувалентни йони (данни не са приведени). Когато присъстват в моларен излишък, трите рнбозоми катализират напълно и изцяло разграждането от САТ РНК субстрата след 60 мин в 50 мМ Трие НС1, рН 8,0, 20 мМ М§С1₂ при 50°С. При аналогични условия с 0,1 μΜ субстрат и 3 μ М рибозоми, Т ι/₂ от САТ мРНК субстрат е 3,5,3,5 и 2,5 мин в присъствието на КгСАТ -1 до 3 респективно. Рибозомните последователности са неактивни срещу комплементи от субстратната РНК (т.е + -та верига), и във форма на олигонуклеотиди (данни не са приведени). 3’-крайните фрагменти на раздробяване от всяка реакция, катализирана от рибозомите са изолирани и 5’ - е обработен с киназа Р³² (50 мМ Трие НС1, рН 9, 10 мМ МвС1₂, 10 мМ ДТТ с 50 и С1 у -³²Р АТФ и 5 единици Т4 полинуклеотид киназа за 30 мин при 37°С). Ефективното въздействие с киназа на фрагментите показва, че те обладават 5’-терминални хидроксигрупи, аналогични на тези, продуцирани в природно срещащи се реакции на раздро9 бяване.

Крайните нуклеотиди от фрагментите, получени чрез раздробяване на САТ последователностите с КгСАТ -1 до 3, са детерминирани. По-точно, радиобелязаните фрагменти са пречистени върху 5% полиакриламиден гел и обработени с еквивалентно количество от 500 единици на мл рибонуклеаза Т1, 25 единици на мл рибонуклеаза Т2 и 0,125 мг/мл рибонуклеаза А в 50 мМ амониев ацетат, рН 4,5 за 120 мин при 37°С. Продуктите са фракционирани на 20% полиакриламиден гел, съдържащ 25 мМ натриев цитрат, рН 3,5 и 7 моларна урея. Фигура 5в показва, че раздробяването на САТ последователността от К/САТ -1 до 3 се среща преди нуклеотидите А, и и С респективно.

Терминалната последователност от САТ генния фрагмент е детерминирана директно, чрез частично ензимно раздробяване по позната методика /12/, използвайки база-специфично и частично рибонуклеолитично раздробяване. Последователността от фрагментите потвърждава онова раздробяване, което се среща при очакваните локации вътре в САТ РНК (не е показано).

Ензимно катализиране.

За да се демонстрират тези рибозоми, които причиняват разграждане на САТ мРНК субстрат по каталитичен начин, всяка се инкубира с моларен излишък от субстрат, при условията, които трябва да стимулират едновременно и ефективно раздробяване и дисоцииране на продуктите. Фигура 6 показва резултатите от експеримент, в който след 75 мин при 50°С, рН 8,0 в 20 мМ М^СЦ, 10 рмола от Κζ САТ-1 са катализирали специфично раздробяване на 163 рмола от срязаната САТ м РН Киселина (от 173 бази), използвана като субстрат, за да даде 5 и 3 фрагменти от 139 и 34 бази, респективно. Средно, всяка рибозома взима участие в повече от десет единици на разграждане. След 75 мин при 50°С някои неспецифични разграждания на РНК са отбелязани благодарение на екстремалните условия, но 70% от останалите интактни РНК (163 рмола) са акумулирани като 139 базов фрагмент. Аналогични резултати са получени за Κζ САТ -2 и 3 (данни не са посочени), и така всеки действа като РНК ензим.

Пример 3.

Въздействие на температурата за рибозомалната активност

Изпитано е въздействието на температурата върху рибозомалната активност ин витро.

Проведена е серия от реакции за изпитване въздействието на рибозомите Κζ САТ -1 до 3 върху САТ РНК субстрат при 37°С и 50°С.

В този експеримент, реакциите за всяка рибозома са проведени в дубликати, използвайки условията на реакцията за рнбозомално раздробяване, установени по пример 2. Едната реакция е инкубирана при 37°С, а другата - при 50°С. Пробите са извадени след 90 мин и степента на реакцията е анализирана чрез денатурационна гел електрофореза. Фигура 7 показва времето на реакцията за всяка от рибозомите КгСАТ-1 до 3 при 37°С и при 50°С. Степента на реакцията за всяка рибозома нараства с нарастването на реакционната температура.

Времето, взето за 50% - но (ίι/г) разграждане на САТ РНК е изложено в таблица 1.

Таблица 1

	КгСАТ -1	КгСАТ -2	КгСАТ -3 11/2 /мину ти/
50°С	3,5	3,5	2,5
37°С	55,	70,0	65,0

Както се вижда от таблица 1, степента на реакцията рибозомите при 37°С е приблизително 20 пъти по-слаба от тази при 50°С.

Пример 4. Влияние на дължината на разклоненията на рибозомите (или флаикиращите последователности) върху рибозомалната каталитична активност.

Разклоненията или флаикиращите последователности на рибозомите (област I от формула

1) хибридизира рибозомата към мишенна РНК там, където РНК е раздробена. В този експеримент е изследван ефектът върху степента на разграждане на мишенната последователност чрез съпоставяне размера на комплементарността и съответната последователност на двойките бази на рибозомалните разклонения спрямо мишенната последователност.

Рибозомите са продуцирани с 4,8 и 12 базова комплементарност спрямо мишенната последователност КгСАТ-2 върху всяко разклонение (фигура 8а). Рибозомите са изготвени съгласно пример 2. Рибозомалната активност е опреде10 лена чрез инкубиране на рибозомалната РНК със САТ РНК, както е описано по-горе.

Рибозомата, която има 4 базова комплементарност върху всяко разклонение, не раздробява субстратната РНК. Рибозомата с 8 базова комплементарност на всяко разклонение раздробява САТ -субстрата както рибозомите, имащи 12 базисна комплементарност. Рибозомите с 12 базисна комплементарност раздробяват мишенна РНК по-ефективно, отколкото както е оценено при реакция ин витро с рибозомите, притежаващи по-малък брой базова комплементарност. Дори се явява необходимост от повече от четирибазова комплементарност, увеличаването иа дължината на хибридизационната област от рибозомите увеличава тяхната реакционна способност.

Във втория експеримент, ефективността на рибозомите, имащи а/ комплементарност до цялата дължина от САТ транскрибираната мишенна РНК и в/ са изследвани мултиплени каталитични области.

Избрани са четири СиС мишенни сайта в САТ РНК последователности. Рибозомални каталитични области срещу тези сайтове са инсертирани в пълна безсмислена /-/ последователност за САТ транскрибта и е изпитана каталитичната активност.

Избраните четири сайта са трите точно определени чрез КгСАТ -1 до 3, описани по-рано, и по-натагьк сайтовете, които могат да бъдат представени както следва:

Нови САТ сайтове * 192

Н18 Н18 А1а Уа1 Сух Азр С1у

5‘ 3‘ сли ели ссс сис иси оди сос където 192 се отнася до аминокиселина 192 и САТ полипептида и се отнася до сайта на раздробяване.

Олигорибонуклеотидите, съдържащи рибозомни каталитични области и покриващи всяка от тези сайтове на раздробяване, са използвани за М13 мутагенетични експерименти за получаване на последователност, съдържаща пълният компелемент от САТ последователността, но с четирите рибозомални каталитични области, инсертирани в тях. М13 мутагенеза е представен чрез свързване на олигонуклеотидите, съдържащи рибозомните инсерции към едноверижни М13 ДНК, съдържащи урацил, последвано от синтеза на комплементарни ДНК, съдържащи инсерцията. Комплементарните ДНК са възстановени, следвайки клонирането в известен щам на ЕзсЬепсМа соП (13).

Резултантната двойно-верижна с ДНК е клонирана в един ин витро експресионен вектор за получаване на рибозомална РНК, използвайки Т7 полимеразна транскрибционна система. Рибозомната активност е определена чрез инкубация на рибозомна РНК със САТ транскрибция, послеодвано от гел електрофореза на реакционната смес след глиоксално третиране за денатуриране на нуклеинови киселини.

Автолитично раздробяване е проявено при всички от очакваните сайтове на САТ транскрибцията. Съответно, фланкиращите последователности от разклоненията или рибозомите могат да се простират по продължение на цялата дължина от РНК транскрибта, който е подложен на раздробяване.

Фигура 9 схематично показва продукцията на каталитичните безсмислени РНК, съдържащи всяка от четирите рибозоми. Каталитичните безсмислени РНК съдържат приблизително 900 бази.

При горните условия на реакцията, рибозомалните и мишенни последователности формират високо молекулни тегловни комплекси вероятно чрез екстензивно формиране на двойки бази. Третиране с оглед силно денатуриране, такова като глиоксално третиране се препоръчва за разпадане на реакционните продукти по време на електрофорезата.

Пример 5. Мишенни последователности за рибозомално раздробяване.

Мотивът СиА в мРНК е изпробван, за да се установи дали рибозомата ще въздейства на разграждането на ДНК при тази последователност.

Специфичният сайт в САТ мРНК, включващ мотивът СиА (фигура 10а) е избран и една съответна рибозомна последователност е изготвена и изпробвана за активност. Рибозомите съдържат разклонения от 8 рибонуклеотида.

Синтетични олигонуклеотиди, кореспондиращи на рибозомите от фигура 10, са изготвени съгласно пример 2 и двойноверижна сДНК е клонирана в един ин витро експресионен вектор (рОЕМ 4,вж.по-горе) в Е.соП, за да продуцира рибозомна РНК, използвайки Т7 полимеразна транскрибционна система. Рибозомалната активност е детерминирана чрез инкубация на рибозомна РНК със САТ мРНК, последвано от гел електрофореза на реакционната смес, както е описано по-горе.

Рибозомите предизвикват разграждане на СиА мишенния сайт (не е показано). Съответно, мотивът СиА в РНК е субстрат за рнбозоми от настоящото изобретение. Това не е напълно очаквано докато един природно установен сайт в сателитна РНК от вирус, поразяващ люцерната изисква разпознаване на США сайта.

Аналогично на това, Сии мотив в САТ РНК мишенна последователност е тестуван с подходяща рибозома (вж. фигура 10в) и предизвиква раздробяване.

Пример 6. Рибозомно разграждане на вирусна РНК.

Вирусна РНК, по-специално от вируса по кората на цитрусови растения, е раздробена, използвайки рибозомите от настоящото изобретение.

Два СиС мишенни сайта са избрани от вируса по кората на цитрусови (СЕУ). Избран е също и един сайт от комплементарна верижна последователност. Рибозомите са изготвени срещу всички тези сайтове и изпитани за активност. Рибозомите са означени като СЕУ9х/ + /, СЕУ9х/-/ и СЕУ25х/ + /. Фигура 11 показва трите сайта на раздробяване в СЕУ РНК за всяка от тези рибозоми.

Рибозомите са изготвени съгласно предишни методи. Рибозома КгСЕУ25х/ + / е показана на фигура 12. Рибозомата раздробява ОиС мотива в нуклеотид 116 от СЕУ РНК.Фигура 126 показва раздробяването на СЕУ РНК с рибозома Р КгСЕУ9х/+/. Не е наблюдавано раздробяване с рибозома КгСЕУ9х/-/.

Експериментът показва, че рибозомите са активни срещу мишенни последователности на РНК от различни източници. Това се очаква, т.к. всички РНК са формирани от базични рибонуклеотидни строителни блокове от адении, гуанин, цитозин и урацил, независимо от произхода им от животно, растение или микроорганизъм.

Пример 7. Примери и рибозоми, притежаващи различни каталитични области.

Рибозомата, насочена срещу САТ-2 сайт е изготвена, използвайки каталитична област на последователност от сателитната РНК от вируса на средиземноморската петниста болест по детелината (ЗСМоУ). Дванадасетбазова комплементарност от рибозомална фланкираща последователност е инкорпорирана в структурата на рибозомата КгЗСМоУ. Рибозомите К₂САТ -2 и КгЗСМоУ са показани на фигура 13а и 136 респективно. Областта на бримката от КгЗСМоУ съдържа 5 нуклеотида, имащи последователността АААиС, в контраст с бримката от КгСАТ-2, която съдържа четири нуклеотида, имащи последователността АСАО. В допълнение, КтДСМоУ съдържа С в каталитичната област, на мястото на и в КгСАТ-2. Различните последователности в КгЗСМоУ, когато са сравнени с КгСАТ-2, са маркирани.

ΚζδΟΜον са продуцирани съгласно пример 2. Кг8СМоУ е активна, продуцираща два продукта на раздробяване, както се очаква.

В друг експеримент, вирусът по кората на цитрусови (СЕУ), имащ мишенен сайт при нуклеотид 336 в нейната комплементарна РНК, е раздробен, използвайки рибозома /КгСЕУг/, който притежава последователността, установена на фигура 14а. Областта иа бримката, означена с буква Ь на фигура 14 съдържа 6 нуклеотида, които притежават последователност 3’ -ССТАТА -5’. Това е различно от областта на 8ТовКУ, която съдържа четири нуклеотида, конто имат последователността 3’-АОАО-5*. Тази рибозома раздробява мишенна СЕУ комплементарна РНК при позиция -336, както е показано на електрофоретичния профил от фигура 146.

Този експеримент показва, че броят на нуклеотидите и нуклеотидните последователности от областта на бримката е важен за рибозомната активност. В тези експерименти, рибозомата е получена съгласно методите, описани погоре в описанието.

В друг експеримент е изследван ефектът от образуването на двойките бази в каталитичната област (областта на ствола) за рибозомалната активност.

Създадена е и е изследвана модифицирана рибозома, кореспондираща на КгСАТ-2, но съдържаща четири допълнителни двойки бази. На фигура 15а последователността от рибозомата КгСАТ-2 е показана хибридизирана към мишенната САТ РНК. Тестуването на рибозомата е показано на 156, с допълнителна двойка бази. Тестуването на рибозомата показва сравнителна активност с тази на КгСАТ-2. Това означава, че областта от двойки бази от каталитичния регион може да бъде с различна дължина, без да въздейства на каталнтнчната активност.

Стабилните ин виво форми (данни не са приведени) от ЗТовРУ иа РНК транскрибти, експресирани в трансгенни растения са предимно кръгови, благодарение вероятно на свързването на 5’ и 3’ края. Ето защо, използването на два автолитични сайта на разграждане, фланкирайки желана последователност в една ин виво РНК транскрибцкя като че води до циркуларизация на продукта, който може да даде по-висока стабилност от лннеарните транскрибти. Този подход водн към нов метод за ин виво стабилизация на рибозомните последователности. Наречен е циркуларизация

Пример 8. Активност на рибозомите ин виво.

Плазмиди, съдържащи антн-САТ (САТ -хлорамфеникол ацетилтрансфераза) или комбиниран антн-САТ (рибозомален ген, вж. по-долу), са въведени в тютюневи протопласти в същото количество и пропорции, релативни една на друга, заедно с друг плазмид, който съдържа функционална САТ генна конструкция. САТ активността е измерена и сравнена с нивото на базите от генната активност.

Материали и методи, а/ Електропорационни и САТ -проби. Представени са както е описано в /14/. По-специално, протопласти от ЬНсоПапа р1итЬа81тГоНа линия Т5 са изготвени от двудневна суспензионна култура, суспендирана в 10 мМ НЕРЕ5, рН 7,2, 150 мМ ИаС1, 0,2М манитол и допълнена до гъстота 3.10^б/мл. Електропорацията е проведена при въздействие за 50 м с прав ток при 250ν. Протопластите са разредени десетократно и култивирани за 20 часа при 26°С на тъмно. Те са разкъсани посредством въздействие с ултразвук (соиикация) и от тях е получен екстракт. Екстрактите са нормализирани за протеиново съдържание и изпитани за САТ активност ии витро посредством ¹⁴С-хлорамфеникол и ацетил СоА. Реакционните продукти са разделени чрез тънкослойна хроматография и визуализирани чрез авторадиография. Степента на реакцията е оценена по продукцията на радиоактивния продукт, получен от Схлорамфеииколиа матрица.

б/ Гении конструкции.

Гении конструкции са въведени в 0,1 м1 протопластна суспензия като плазмидна ДНК, която е пречистена от бактерии чрез екстракция и двукратно центрофугиране с СяС1 в равновесен плътностеи градиент. Те са ресуспендирани в 10 мМ Трис/1мМ ЕДТА/рН = 7,5 за използване.

Активната САТ генна конструкция е получена от плазмид, означен като рСАТ7 + . Той е изолиран чрез фузия на САТ генна последователност от плазмид рСМ4 /15/ в плазмида ρ1353Ν, получен от ρ355Ν /16/, така че тази генна конструкция е:

358

САТ

N05

355 се отнася до 355СаМУ (вируса на мозаичната болест по цветното зеле) промотора, N08 към безпалиново-синтетазен полиаденилизационен сигнал, Т/С към транскрибцията.

По продължение на рСАТ7 + с 0,2 и§ са добавяни различни гении конструкции както е описано по-долу. Гениите конструкции се съдържат вътре в плазмидите със следното означение.

Ρ.Ι358Ν - Това е векторен плазмид, картата на който е показана на фигура 16, съдържащ 358 СаМУ промотор и растително безпалиновосинтетазен 3 полиаденилизационен сигнал, който може да бъде представен както следва:

358

N08

рСАТ7 - Този плазмид съдържа САТ генна последователност, включена в ρ1358Ν, така че тази транскрибция да резултира в получаването на безсмислени САТ РНК, които могат да бъдат представени както следва:

358

САТ -

N05

рСАТ7 - Този плазмид съдържа САТ генна последователност, включена в ρ1355Ν, така че тази транскрибция да резултира в получаването на безсмислени САТ РНК, които могат да бъдат представени както следва:

355

САТ

N05

рСАТ19 - Той съдържа САТ-гена с четири каталитнчни рибозомни области, включени в него ( вж. пример 4 и фигура 9), инсертирани в ρΙ358Ν, такива, че транскрибцията да резултира в продукцията на безсмислени САТ РНК, съдържащи четири каталитнчни рибозомни области, представени както следва:

5’	358	САТ	N08
		а*-·····

електропорация. Активността е изразена като процент на конвертирал хлормафениколен субстрат в едночасова проба.

Резултати. Следната таблица показва релативните САТ активности в клетки 20 часа след 5

Таблица 2

Щ плазмйд, подложен на електропорация

Третиране рСАТ7+ ρ1358Ν

1А

1В

2А 0,2 18

2В 0,2 18

ЗА 0,2 9

ЗВ 0,2 9

4А 0,2

4В 0,2

5А 0,2 9

5В 0,2

6А 0,2

6В 0,2 (за всяко третиране А и В са дубликати)

От тези резултати могат да бъдат направени следните изводи.

Въвеждането на САТ генната конструкция резултира в забележителна САТ активност - сравнени 2А,В с 1А,В. Има вариабилност между дубликатите. От тенденцията, видна от другите проби (вж.следващите изводи), тя е като тези от 2А и показва наднормена активност.

Съпътстващото въвеждане на една безсмислена генна конструкция резултира в увеличаване нивото на активността - сравни ЗА,В и 4А,В с 2В. Размерът на увеличението е свързан директно с нивото на добавената като плазмйд безсмислена генна конструкция - сравни ЗА, В и 4А,В.

Съпътстващото въвеждане на комбинирани безсмислени/рибозомни гении конструкции резултира в увеличаване на генната активност сравни 5А,В и 6А,В с 2В. Нещо повече, увеличението е по-изразено от кореспондиращото ниво на безсмислената гениа конструкция - сравни 5А,В с ЗА,В и 6А,В с 4А,В.

Средните резултати за четири ин виво експеримента са показани на фигура 17. На тези фи10 рСАТ7- рСАТ19 % конверсия

28

32

26

19

19

22

14

16 тури контрола означава въздействие 2, безсмислен въздействие 4, каталитичен въздействие 6 и ниво въздействие 1.

Каталитичната рибозома инхибира САТ активността в средно 47%, сравнено със средното число 34% за една безсмислена рибозома.

Въвеждането на ген, произхождащ от рибозома в растителна клетка, инхибира активността на гените, срещу които те са насочени. Нещо, повече, инхибицията е по-висока от тази за кореспондиращата безсмислена РНК молекула.

Тези резултати показват, че рибозомите ще са активни в клетки на растения, животни или микроорганизми срещу определен кръг от мишенни РНК молекули.

Механизмите на въздействие на рибозомите в този пример не са ясни. Например, безсмислената рибозома може да се хибридизира необратимо с мишениа РНК и да катализира раздробяването на фосфодиестерната връзка при един или повече селекционирани мишенни сайта по продължение на мишенната РНК. Обратно, целуларните ензими могат да развият безсмислена РНК от тяхната мишениа последователност, така че мишенната последователност е разединена на две или повече фрагмента.

Пример 9. Активност ин виво на рибозоми в животински клетки.

В този пример се демонстрира активността на рибозомите при ннактнвация на мишенна РНК в клетки на животни (бозайници).

Материали и методи. Активните генни конструкции, кодиращи рибозоми, са трансферирани в диви подходящи клетки от клетъчна линия от малки маймунки СО31 посредством електропорация. В този метод, 3.10⁶/мл СО31 клетки, суспендирани в буферен разтвор с 10% РС8(фетален телешки серум), са поставени в контакт с различни генни конструкции и е приложен електрически заряд, за да предизвика електропорация на ДНК в клетките. Трансфектираните клетки са инкубирани при 37°С за 48 часа в хранителна среда преди изпитване на САТ и луциферазна активност.

САТ генната конструкция е получена от плазмида, означен като рТК САТ /18/. Този плазмид е получен чрез въвеждане иа САТ генна последователност в плазмид рЗУ2, така че да е под контрола на тимидин киназен промотор на вируса херпес симплекс.

Генните конструкции, кодиращи рибозоми, са получени на основата ена плазмид р8У232А /19/, съдържащ луциферазен ген, разтворен в 8У40 по-ранен промотор. ДНК, кодираща рибозоми, е свързана в Хоа1 сайт при 3 края от луциферазния ген съгласно стандартните методи иа МатаНз е! а1 /7/.

Следните конструкции са изготвени, използвайки стандартни техники на МашаНа е!.а1./8ирга/:

рРС58 - този плазмиден вектор съдържа ДНК, кодираща рибозомата КгСАТ-1, разтворена откъм 3*-края от луциферазния ген в нефункционална ориентация. Това може да бъде представено както следва:

3321

ЙТ40 еифу

' |(шПегаъе 1| р,сат -з)

4иай I

Рс^

23ЯА

като 232А се отнася до р8У232А последователност. 8У40 ранен се отнася до по-ранен промотор от 8У40 и малък Т е ДНК, кодираща малката Т последователност, произхождаща от 8У40. Тази конструкция резултира в продуциране на РНК молекула, кодираща луцифераза и рибозомата КгСАТ -1, по-късно ориентирана така както се очаква да бъде каталитична.

рРС1-6 - Този плазмид е същият както рРС58 с изключение на това, че ΚχΟΑΤ -1 е заместен с КгСАТ -3 в смислена ориентация (5’-3’).

рРС20 - Този плазмид е същият както рРС1 6 с изключение на това, че КгСАТ-З е заместен с КгСАТ -2, който има единадесет нуклеотидни фланкиращи последователности.

рРС12 - Този плазмид е същият както рРС20 с изключение на това, че рибозомата ΚζΟΑΤ-2 съдържа дванадесет нуклеотндни фланкиращи последователности.

рРС50 - Този плазмид съдържа САТ гена с четири каталитични рибозомни области, включени в него (вж. пример 4 и пример 9) в смислената ориентация (5’-3’), която при транскрибция води до неактивна рибозома.

Този плазмид може да бъде представен както следва:

ЗУ40 късни

САТ ген, съдържащ рибозомна област

Поли А+

не каталитична РНК рРС54 - Този плазмид е същият като рРС50, с изключение на това, че САТ генът и рибозомните области са в безсмислена (3’-5’) активна ориентация.

рРС64 - Този плазмид обладава ЗУ40 промотор и полиаденилизационни сигнали с рРС50 и съдържа див тип САТ ген с неинсертнрани рибозомни области. Този ген е с безсмислена ориентация и по този начин не продуцира САТ протеин.

рРС65 - Този плазмид е същият както рРС64 с изключение на това, че дивият тип САТ ген е в смислова (5’-3’) ориентация и е така продуктивен за САТ протеина.

Изследвания.

Луциферазната активност е изпитана съгласно методите на Ое \Уе1 е1 а1. (8ирга). По-специално, СОЗ клетки са лизирани за 48 часа след трансфекция и клетъчните лизати са инкубирани с луциферии, субстрат от луцифераза, като преброяването се осъществява със сцннтилационен брояч. САТ активността е също така измервана, използвайки СО клетъчни лизати (клетъчни лизати се разделят на две и всяка порция се изпитва за луциферазна или САТ активност) съгласно метода на 31е1£Ь, МЛ. /20/.

Изпитванията ин виво показаха, че рРС58 и рРС4 не въздействат върху САТ активността в трансферните клетки. Тази активност е означена като 100% САТ активност и 0%-на САТ супресия. САТ активността в клетки, трансфектирани с други плазмиди е измерена свързано с рРС58. Процентът от САТ супресията е измерен по следния начин:

100 САТ \ ^тест х 100

САТ / контрола ' нормализирано към луциферазната активност. САТтест = САТ изпитва резултатите за тест конструктите. САТюнтрол* ⁼ САТ изпитва резултатите за контролните конструкти (рРС4 и рРС58).

Луциферазната продукция е един вътрешен контрол за електропорация и дава възможност за измерване на рибозомиата продукция вътре 10 във всяка индивидуална тъканна култура, подложена на електропорация.

Резултати

Експеримент I.

μ% плазмид, подложен на електропорация /1,5.10⁶ клетки

Третиранер	ТКСАТ	рРС58	рРС20	рРС1-6	рРС12	%САТ суп- ресия
1	5		2			56
2	5		1	1		53
3	5				2	40
4	5	2				0

Експеримент II.

μ 8 плазмидна електропорация/1,5.10^б клетки

Третиране	рТКСАТ	рРС-1-6	рРС20	рРС12	рРС4	%САТ суп- ресия
5	5	2				75
6	5		2			75
7	5		4			62
8	5	1	1			70
9	5			4		51
10	5				2	0

Третираната от 5 до 10 са проведени в дубликати и са дадени средните стойности.

Експеримент III.

μ β плазмидна електропорация /1,5.10⁶ клетки

Третиране	рТКСАТ	рРС1-6	рРС4	%САТ суперсия
11	5	2		66
12	5		2	0

Третиранията са проведени пет пъти и са дадени средните стойности.

Експеримент IV.

μ £ плазмидна електропорация
Третиране	рТКСАТ	рРС50	рРС54	рРС64	рРС65	%САТ
						суп-
						ресия
13	5	2				0
14	5		2			26
15	5			2		2
16	0				2	ΝΑ

Всяко от третиранията от 13 до 16 са проведени четири пъти

Много експерименти са проведени с ТК промотор от рТКСАТ, заместен с човешки металотионен промотор. Когато тази САТ конструкция е ко-трансферирана в СО1 клетки с плазмиди, кодиращи една или повече рибозоми, е наблюдавано увеличение на САТ активността.

Горните резултати ясно демонстрират ин виво инактивиращата активност на рибозомите в животински клетки.

Независимо от липсата на ефективност ин виво на рибозомите, за която се счита, че е причинена от една или повече каталитични области, които са способни да раздробят мишенна РНК, присъствието на такива области в безсмислената” РНК тип рибозома може не винаги да води до раздробяване ин виво, ако цялата РНК/безсмислена РНК молекула не взима участие. Независимо от това дали молекулата взима участие или не, горните примери демонстрират липсата на ефект на инактивация на мишенната РНК. Изобретението е приложимо за всички рибозоми, които имат каталитични области, способни да причинят раздробяване и хибридизационна област, независимо от това дали раздробяването действително се проявява в мишенната РНК. Т.е. хибридизационната област може да бъде толкова голяма, че да осигури съвместното съществуване на комбинация РНК (рибозома и да се предотврати раздробяването на мишенната РНК на различни компоненти, дори ако каталитичната област е способна да причини раздробяването.

Claims (20)

1. Патентни претенции

   1. Метод за получаване на рибозоми, посред5 ством включване на хибридизационна област, комплементарна по нуклеотидна последователност на най-малко част от мишенна РНК и каталитична област, адаптирана за разграждане на тази мишенна РНК, характеризиращ се с това, че се включват едно или повече разклонения, формирани от едноверижна РНК и имаща последователност, комплементарна на наймалко част от мишенна РНК, разклоненията се асоциират с каталитична област, способна да разгражда мишенната РНК, след което цялата структура се подлага на стабилизиране.
2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че хибридизационната област от едно или повече разклонения е съседна на каталитичната област.
3. 3. Метод съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че хибридизационната област е съседна на подбран сайт на разграждане в мишенната РНК.
4. 4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че каталитичннте области са свързани чрез фланкиращи последователности, всяка от които включва последователност, комплементарна на мишенната РНК.
5. 5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че рибозомите се получават чрез транскрибция на екзогенна последователност от нуклеинови киселини,включваща ДНК или РНК-вектор на пренасяне вътре в клетката, в която да има място и инактивацията.
6. 6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че екзогенната последователност от нуклеинови киселини е осигурена чрез трансфекция на ДНК или РНК пренасящ вектор в клетката или чрез прекурсорен вектор.
7. 7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че трансфекцията е последвана от геномна интеграция на същата тази екзогенна последователност от нуклеинови киселини.
8. 8. Метод съгласно претенции от 1 до 7, характеризиращ се с това, че клетката е еукариотична.
9. 9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че еукариотичната клетка е растителна или животинска.
10. 10. Метод съгласно претенции от 1 до 7, характеризиращ се с това, че клетката е прокариотична.
11. 11. Метод съгласно претенции 1 до 10, характеризиращ се с това, че мишенната РНК е ендогенна за клетките.
12. 12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че мишенната РНК кодира протеиновата характеристика на генетично заболяване.
13. 13. Метод съгласно претенции 1 до 10, харак» теризиращ се с това, че мишенната РНК е екзогенна за клетките.
14. 14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че мишенната РНК е вирусна.
15. 15. Метод съгласно претенции 1 до 14, характеризиращ се с това, че последователностите от нуклеинови киселини с подходяща дължина и комплементарност представляват РНК последователност, която действа като безсмислена по отношение на мишенната РНК.
16. 16. Метод съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че разклоненията от едноверижната РНК с подходяща дължина и комплементарност, които се хибридизират с мишенната РНК при подбран сайт на разграждане включват 9 или повече нуклеотида.
17. 17. Метод съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че нуклеиновата последователност включва 16 или повече нуклеотида.
18. 18. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че сайтът на разграждане в мишенната РНК е разположен непосредствено след последователността Χ°υΥ, където Х° е който и да е рибонуклеотид, и е урацил и У е аденин, цитозин и урацил.
19. 19. Метод съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че Х° е С, У е С или А.
20. 20. Метод съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че рибозомите включват каталитични области, свързани чрез фланкиращи последователности, а всяка фланкираща последователност, комплементарна на мишенната РНК да може да бъде разграждана.

    Приложение: 17 фигури