BG60509B2 - Човешки тъканен плазминогенен активатор - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до производството на активатор (т-па) без контаминанти, с които обикновено е свързан в неговата естествена клетъчна среда. Човешкият т-па се произвежда в значително количество чрез методите на рекомбинантна днк (рднк) технология. Изобретението се отнася и до необходимите за произвеждането му методи, експресионни вектори и различни клетки гостоприемници. 15 претенции

Description

Този заявка е продължение на заявка Ser. Να.483 052 от 7 април 1983 г.. понастоящем U.S. Pat. No.4766075, която е част от пооаължение на заявки Ser. No

98003, подадена на юли 1982 г. и Ser

No. 374860, подадена на 5 май 1982 г., сега отказани

Представяното е за човешки плазминогенен активатор, кореспондираш с този.

който се намира в човешкия сеозм и/или тъкани и за съединения и нововъведени Форми като заместители, както и за способите и методите за неговото хомогенно произвеждане в терапевтично значими л сличестба.

Изоооетението откпитието за а минокис елините чобешки плазминогенен ак тиватоо

Теб а откритие даде о tзможност плазминогенен активатоо посредством приложението на технология за реконбиниране на ДНК, предлагащ;

получаването на започването и провеждането на изпитания върху опитни животни и в клинични условия като неоохсюимо условие за получаване на разрешение за продажба.

без· неооχодимите ограничения присъщи на методите за използвани досега, включващи □свиване екстрахираме от съществуващи клетъчни култури

Изобретението е насочено във всички възможни аспекти.

Публикациите и другите материали, използвани за осветяване на произхода на изобретението, както и 6 отделни елзчаи за осигуряване на допълнителни детайли за неговото действие, са приложени^библиогрзФска справка и за удобство са номерирани,отбелязвани в текста и групирани в прибавената

ч. Човешки тъканен плазминогенен активатор

Фибоинолитичната система на организма е в динамично равновесие с коагулационната система и двете поддържат нормалното постоянно интзктно състояние на кръвното русло. Козгулаи,йонната система отлага Фибрин, като матрица служеща възстановяване на хемостазния статус. Фибринолитичната система отстранява Фибриновата мрежа, след като хемостатичното състояние е постигнато. Фибринолитичният процес се осъществява посредством протеолитичния ензим

BAD ORIGINAL ксито се получава от плазмения протеинов прекурсор плазминоген. Плазминогенът се превръща в плазмин посредством ак тиваи,ия . осъжестбенз от ак тиватор

По: <3 стоя шем б аптечната мрежа се предлагат два ктиватсоа, стрептокиназа и урокиназа. И двата са показни за лечение на остой съдови заболявания като ми ок a р g ен инф а ο κт дълоок ите вени □зпзшбзне на периферните артерии и други венозни тромбози

ο. χ ест и η ρ ί g с т а β л я β а τ голяма опасност за здравето на човек а осноria на тези заболявания посочва при ня κ о и с /-.уча и ч a с т и н н о най-често и пълно запушване на ο τ κ ръ ое н с ъс up ек тром5 или тромбоембол

Τ р а с и и.и о н н а т знтикоагмлантна терапия, като тази с хепаоин и умаоин, не боди до директно повишаване на разтварянето нз тромоите и л!.( τ ρ о м б о е м б о л и т е

Тромболитичните вече по-горе стрептокиназа и урокиназа имат широко и еФективно приложение

Но всеки един от тях има строги протибопсказания.Те нямат висок афинитет към Фибрина абата антикоагуланта активират цирк алирзшя и <hu6pt.«несвързан плазминоген относително иноискриминативно а з: 1н ъ τ ι ι л л и о ще Ф и б р и н о л и з и н ) образуван в и,и р к у л и р а ща т твърде бързо и губи тромболитичните си

HTD3лизис

Остатъчният плазмин снижава някои коагулиращи белтъчен произход, като Фибриноген,

Фактор ν и ъс т = □я щи >·: е м ο р а ги ч н и я потен и, и а л допълнение стрептокиназата е силен антиген и пациентите бисок титъо ително лечение

Урокинавната терапия е скъпа, дължаща се на нейното изолиране от човешка урина или

BAD ORltniv тъканни култури и тооа е всеобщо възприета вила субект ния насечените п а а з r-ι ι j. н о г е н н и активатори са изолирани от човешки тъкани напр от сео ум .1 4 н ^isjПолучените съединения са описани

П л a s н и н о г е н н и т (·;

активатори,

1' произлезли от тези източнициj

OU А и

ГО УПи

TUH плазминогенни ак тиватори плазминоген н и активатори (т—ПА) основаващи се на разликите те;(Ни т е и м у н α л о r и-ί н и качества предложени на XXVIII Конгрес на Международния комитет по тромбоза и хемостаза, Бергано. Италия, 27 юли 1982 г.)

Ч а пое л eat· Iоеше идентифицирана чобешк. а мелзнопна която секретиоа т—ПА

Изучаването на този плазминогенен показа, че той не се имунологично и по състава на аминок ис еа инни т е от плазминогенния активатор.

изолиран от нормални тъканни летк и

[19. 8в]

Прооуктът беше изолиран в относително чист вид изучен .1 ое устзнооено, че притежава качества на високо

[] акои изсдесбания

Р?5 go 98^ , пай които се т—Пн меланомна к летънн □оказбат неговия висок афинитет към Фибрина, в сравнен!.

урокиназния тип плазминогенни активатори.

По-инте проучвания на човешкия т-ПА като потенциален TpoMSoAuw-eh агент са били ек с тоемално кръвта.

тък анните

BAD ORIGINAL зкстсакти. съ -добите пеофазатаои и клетъчните култури.

Баша бьзпоието. че поиложението на рекомбинантна ДНК :бъозаните с -^г:-'· ге: <но легии е най — еФектибния способ : ; т ..-гПг?н-:-тз на необходимите големи келичестта от високо качествен чабешки тип тъканен плазминогенен ак-ибатор, ο с 1ч л - ι- о пречистен от друг и ч ο б е ш н: и проте и н и. Т а к и в ά м а тер и а л и ще покажат беооятно бисан:тивност, даваща достъп до клинично приложение при лечението на различни кароисбзскаларни л ·?·Σ тоя ни.я или п слести · нолегия на

На

ДНК е постигнала са състояние аа различни секвенции на лек ота, ъздавайки нови ДНК молен: или,способни да продуцират копирани личеетба от екзогенни белтъчни продукти в трансформирани микроорганизми или клетъчни култури изразяват в in vitro лигиране

Общите способи и методи на лепливите крайни ефективни експресионни на пригодни за трансформиране микроорганизми, като по този начин се

направлява тяхната спосооност до желан е кзогенен продукт

Обаче, поради индивидуалните особености изходните продукти, пътят си остава лъкатушещ и науката успешни резултати оез солидна експериментална поема рио

Р е н: ο м 5 и н а и,и ята €1 на

ДНК от есенцизлни елементи на реплик ация, на една или повече селен: ционни аоак теристик и.

експоесионния промотор, етероложния генен инсертор остатъчния обик: новено се дзвършва извън к летн: ата

BAD ORIGIN/-.-

к сято

LIHC SDTLID 5 HUfl опоеаеля може на а το тема ген аава ек споесия драг:.

кода , на гена nDoyect'T

Полученият □ 3i се добие посредством лизинг гостоприемник последващо подходящо от оелтъци на технология за на могат да се експресupат изцяло етер ол ож ни πо л и пептид и директна експресия или алтернативно може да се експресира етероложен полипептид синтезиран като сегмент от аминокиселинна омоложен полипептио

В последните случаи, очакваният

5иоак ти.бен продакт понякога се оказва биоинактивиран при синтезирането.

омоложния/ етероложния полипептид в извънклетъчното пространство и 22J

По са установени правилата за изследването на генетик ата и клетъчната както за клетъчни, така и за тъканни калтари

са способите и методите за поддържането на летъчни линии, подготвени от успешни серийни от изолирани ноомални клетки

За изс л еебанията тези клетъчни линии се запазват върха подложка в течна среда или чрез растеж саспенсия □анителни съставки

Увеличаването на побива производства изглежда поставя решаване само на проблеми от механично естество

По съшия начин биохимичните качества на протеините се използват, като се прилагат в биотехнологиите. Клетките

BAD ORIGINAL

Lпрсруииозщи желания протеин, произвеждат съшо стотини драги поотеини. енαсгенни πрοоак ти на клетичния метаδοлизъм. Тези к онтаминиращи протеини.

също и драги съединения. ако не бъдат отстранени от желания протеин.

могат да се пропеят като токсини, ако се приложат на животни или ора в хода на т ерапе6т и ч н ия каре с ж е л а ни я протеин.

Техниката на белтъчната биохимия предлага възможност за сепараиионни поо и.е д а о и _t π о д : ο а я ши з а с ъ ο т β е т н и те системи за по л а ч а в а н е т о на хомогенни продукти, годни за употреба. Белтъчната биохимия потвърждава идентичността на желания продукт и обезпечава достоверността на продукцията, без алтерации или мутации. Този клон на науката включва и създаване на лекарствени средства, предварителни изследвания и други необходими пооцедури за изпълнение преди успешните клинични изпитания и маркетингови проучвания.

Представяното изобретение се базира на откритието |ча технологията за рекомбиниране на ДНК и може успешно да се използва за производство на човешки тъканен плазминогенен активатор (т—ПА), за предпочитане по директен способ, и в количества достатъчни за започване и провеждане на изпитания върху опитни животни, както и клинични тествания, задължителни преди просажба . Полученият човешки т-ПА е годен ipu а ожение във всички него6 и Форми, за πрοфила ктиката или пои лечението на човешки същества при различните к зр диов аск улар н11 състояния или заболявания.

Затова предлаганото изобретение. в един много важен аспект, е предложено като метод за лечение на съдови болести пои хората, г.осрееством приложението на т-ПА и за съответните негови Фармацевтични Форми.

Представяното по-нататък изобретение обхваща есени,излно

Г _ч

BAD ORIGINAL &

ч: лс т ч οо ашк и. та: а нен пл а зминогенен ак тиба тор

Прооактът се генно инженерство от микроорганизми или.

и осигурява възможности за произбодстбото на човешки тъканен плазминогенен активатор по дин твърде ефикасен способ

В допълнение, б зависимост от нлетката гос топриемник човешкия“ тъканен плазминогенен активатор може да съдържа асоциирани глиносиа ати б по-маака t с естествения продукт

Във л уча и не съдържа контаминантите, с които свързан б неговата нерекомбинантна

клетъчната среда

Представяното pen л и к а и, и. о н н и клетъчни или

ДНК изобретение се експресори носители.

отнася носещи сг ва човешки тъканен плазминогенен активатор за колонии от микроорганизми или култури трансФомирани к летъчни от

К С Л OHULI и А и К ч л т у р и , епос Ο Ο н и тъканен тях или за микробиални така да продуцират ак тибатоп

В тези изобретение е насочено към различни процеси за ек споесивни носители нови щамове клетъчни к ултури човешкия аспекти това получаване на колонии от

Формирования, Освен това изобретението включва и получаване нз

Ферментационни култури от споменатите микроорганизми и - и к летъчни ултури

Шигира .1 η о а и а к р и л а м и д с? н гел е л е ктр αФосезиран от додей,илс улФатен

S-метионин маркирах ни протеини, преципитирани с анти т-ПА имуноглобулин зкретиоан от меланомни клетки или без протеазен

BAD ORIGINAL

Jjj

I

Фигура 2 показба електрофореза на имунопреципитирани транслационни продукти от Фракции на матрична рибонуклеинова киселина (мР Η Е) , получени от меланомни клетки.

Фигура 3 показва хибридизацйонен модел на 96 бактериални колонии, трансформирани с кДНК, с помощта на 32 депото от Р-маркиран 14-тег като сонда, изготвена основно от б аминокиселинна секвенция на чобешки т-ПА.

Фигура 4 е карта на ендонуклеазна рестрикция на пълната дължина на човешка т-ПА кД Η К.

Фигури 5а, 56, и 56 показват нуклеотидната секвенция и извлечената аминокиселинна секбенция на пълната дължина на човешка т-ПА кДНК.

Фигура 6 е схематична конструкция на експресивния плазмид pdeltaRIPA

Фигура 7 показва резултатите от анализа на слои за Фибринолитична активност на клетки на

Фибринов

Е. coli.

pdeltaR I Р А

Фигура S

В Н (течна р ома тогр а фия с високо налягане) запис на пептидите на човешкия т-ПА от раносмилателния ензим трипсин показва конструкцията на плазмид кодиран за директна експресия на зрял човешки т-ПА в

Ешерихия к оли (Е . coli).

*

Фигура 10 показва резултатите от проба

Фибринов слои тествана за Фибринолитичната активност на човешк ият т-ПА, произведен от Е. coli

Фигура показва конструкцията на ДХФР (мутант/или неповлиян див кодиран плазмид, подходящ трансформиране върху клетъчна култура от тъкан от бозайник

-1.0Iiuryoa 12 е схематична диаграма на човешки тъканен пламиногенен активатор, получен чрез илюстрирания метод ο Е. 1 .

А. Дефиниции

Както е използбан тук,човешки тъканен плазминогенен активатор ” или човешки т--Пн или т-ПА означава неприсъщ човешки (тъканен тип) плазминогенен активатор, произведен от системи от микробиални или клетъчни култури в биоактивни форми, включващи протеазни части и кореспондиращи с тези тъканни плазминогенни активатори, в други случаи естествени за човешка тъкан. Човешкият тъканен плазминогенен активаторен протеин. получен в това изобретение, е бил определен посредством детерминиран ДНК ген и свързаната с това аминокиселинна секвенция. Разбираемо е, че природни алелни вариации съществуват и попадат от индивид на индивид. Тези ваоиации могат да бъдат демонстрирани посредством аминокиселинната/аминок: иселинните разлика/и във всеобщата секвенция или чрез делеции, замествания, инсерции, инверсии или прибавяне на аминокиселина/и в гореспоменатата секвенция. В допълнение локацията и степента на гликозилация ще зависят от природата на средата около клетката гостоприемник.

Потенциалът, които се крие 0 прилагането на

технология за рекомбинираяе на ДНК за	получаване на
пра и ос ни на □ as лични човешки тъканни	плаз м и н о г е н н и.
активатори, може да се видоизменя различно,	в резултат на
единични или множествени замествания с	а минок иселини.

делни,'.¹.¹., прибавяния или замествания, например.

посредством управлявана мчтагенеза на ДНк

Това може да бъде с ъ ще с т ено чрез приготвяне на производни,

на серии есенциален

k. rinqle участък или от участък

..: <5 н □ κ r ι.(ο η . а ρ а κ τе□ ис точен з а чобешк пя т-ПА. Вц и ч к;

‘Г водещи до десивати н ми нсг с?нен активатор са включени в

Н 3.

г η г плазминогенни а к ти. 6 а т·.. d и чи и ии.оаогични качества иовеня·. ^!.иЯ тък :<нен плазминогенен активатор е приготвен •J използва пьовата му а г 1 и н о ки селин метионинъ посресзством инсерция на стартов

• ΟΰϋΗ др зг протеин, вместо к на стр УКтурния нетионинът е интра- или екстрацелиларно е изπолзΰ а неговата първа аминок иселина , негов рактерен полипептид или конюгиран онвенциалния рактерен полипептид, като дният и конюгираният специфично се разграждат в интраили еι- τρ ?.целуарното пространсτво дирек тна експресия на от

[21 зряла Форма без разграждане на всеки несвойствен и ненужен π о л и η е π т и д .. Π о с л е д н и я епос о б особениважен, когато клетката го ефикасно да отстрани р а ι · т е ρ н и. я п е π т и д , когато е к с прес ив ни я носител е насочен и а активатор заесне секи случай така произведени-яТ очни Форми, е извлечен ¹ а приложение за лечение н

ПА притежава Форми, които с

1.-верига), и двзверижен гюотоин :Г!

π ροтеоаитично произлязъл от е д но β е ρ ι. ж н о съед и н ение

Gt теорията се знае, че двуверижният

BAD ОНКанчгч^ получен Фибрин и тази протеолитична конверсия от еднооерижен до овуверижен компонент се извършва rj конберсията на пламиногена до плазмин

Представяното изобретение изхожда от предположението за изпълнение от .1.-верижен протеин (in vivo), както бе описано иаи за изпълнение от 2-верижен протеин, както ое показано.че вь м < j к н о . 2 - в е р и ж н и я протеи н може да бъде получен ин витро от протеолитичн конвеосия, получаването 1-верижния протеинов _ продик т. Т. н. kгίп д1е ооласт е позиционирана

срещапосочно на частта на серин протеазата и се предполага че играе? важна роля в свързването на тъканния¹ плазминогенен

Фибииновата матрица; следователно наолюд а о а на т а пецифична активност на представяния.

тъканен е р еално съ щес т в а в а ща по отношение на тромби

Тъканният чазминогенен активатор съдържа ензимно активни к о р е с π о н д и р а щи към природния продукт и терминът тъканен плазминогенен активатор дефинира продукти.

такиса участъци или заедно с

допълнителни аминокиселинни секвенции по цялото протежение щеяо казано, представяният с това исзооретение

Функционална дефиниция: това е способност »>

лизира конверсията от плазминоген до плазмин, да

Фи Ьр и.н « и е квалифициран като т-ПА, основаваш се на г* ор епос очени те и м у нологич ни свойства

Есенциална чиста Форма се използва за да се опише това състояние получен по способи на изобретението протеин или вещества обикновено асоции.□ ани т-ПА. когато е продуциран от нерекомоинантни клетки, т.е неговата среда

BAD ORIGINAL $ протеин означава протеин (белтък).

притежаващ-свойства за активната асоциация с Ди-Хидро-Фолат

Редуктаза, и които се продуцира от клетки, способни да живеят в среда, дефицитна на Хипоксантим, Глицин и

Тимидин (—ХГТ среда). Най-общо, клетки изпитващи недостиг на да растат в такава среда к летк и, протеини дават растеж '' К летк и ч у в с т в ит е л н и на 1*1 Т X се отнася за клетк и, ;оито са неспособни да дават растеж в среда, съдържаща ДХФР

на 1*1 Т X са клетки, които.

). И така клетки чзвствителнЦ, освен генетично променените или други добавки,няма да прораснат в среда, подходяща за растеж, когато концентрацията

Някои клетки.

като чувствителност поради клетъчната мембрана, на Μ Т X бактерии, е 0,2 цд/п1 или не демонстрират непропускливостта си за М въпреки които би бил в други отношения

Най-общо, клетки, съдържащи подобен чувствителни към метотрексат зко са

Див тип

Д X Ф Р се повече през

Ф Р, чувствителен към него

Д X Φ Р протеин, ще са проницаеми за Μ Т X отнася за ДиХидроФолат

Реаактзза, която обикновено се среща в отделни организми

Дивият ниск и

Д X Φ Р протеин с нисък афинитет на свързване с има функционална дефиниция. Това е Д X Φ Р протеин.

к οϋτο когато е генериран в клетки дава възможност за растеж нз клетки чувствителни на 1*1ТХ , в среда съдържаща поне 0,2 pg/ml или повече от 1*1ТХ . Известно е, че такава Функционална дефиниция зависи от способността, с която организм®· продуцира

Д X Φ Р протеин нисък афинитет на свързване с Μ Т X

Но как то употребено в контекста на това изобретение.

к а то межач тези два механизма, няма да поражда безпокойство. Изобретението работи, като се съобразява с определените нива на и не е резултатно, когато е под влияние ng увеличената експресия, и в допълнение на вродената природа продуцирания Д X

К он β е н ци ални?

протеин, който е подходящ за тази дефиниция

U. S

Арр!

Ser. No 459

151, подадено на

1?

януари 1983, отбелязано в библиографията се отнася за векторите които са β състояние да експресupат секвенциите на Д Н

К, . където последните са

Фннк ционзлно свързани с други спосоони да изоират тяхната експресия

Предполага се въпреки, че не е установено точно, че тези експресионни вектори могат да репликират в организма гостоприемник също като епизомите или като интегрална част от хромозомната

ДНН

Ясна неспособност за репликабилност ще ги представя като

Накратко

I експресивен вектор

Функционална дефиниция и всяка

Д Η К секвенция, която е

способна експресия на точно определена Д Η К прилага конфигурация е включена в този термин, като се за секвенция

Най-общо казано, експресивните вектори при приложението на техниките за на ДНК са често под Формата на

II което се отнася за двойно спиралните структури на Д Η К които в техните векторни Форми не са свързани с ромозомата използвани прилагана спецификация, плазмид взаимозаменяемо, като плазмид по-често

Обаче, в изобретението се възнамерява да бъдат включени такива други Форми на прилагането на техник;

с, е шинира но, т-ПА е г•13ЛКи от к оли. чествата хазяи т-ПА

ПОЛУЧЕН от такива клетки може да бъде определен

като рекомбинантен

Б. Култури от

Векторите и клетки гостопри.емнии.и и вектори подходящи за използване 6 клетки азяи от широк кръг от прокариотни и енкариотни организми

HaCi-общо, прокариотите са за предпочитане.

клонирзне прилзгани (АТСС щамове поради.

на Д Η К секвенции 6 конструирането на векторите, в изобретението

Например, Е.

coli К12 щам 294

Να

I примери

31446) е специално прилаган

Други микробиални които могат да бъдат използвани включват Е. coli като Е coli В се, са

JI

Е. coli Х1776 (АТСС No предназначени по-скоро

1537). Тези да илюстрират.

отколкото да ограничават

Прокариотите също могат да бъдат и е π о л з в а н и за ек спресия

Гореупоменатите също така и. Е.

co 11 прототрофен,

Bacillus subtilus, и доуги ентеробактерии като salmonella typhimurium или Serratia marcestens и различни видове pseudomanas също могат да бъдат използвани

Плазмидите, наС.-общо, съдържат репликон и контролни структури, са извлечени от видове, съвместими, с клетката

BAD ORIGINAL

I. е зяи.н се ак нов ено носи.

н: ε. т парк праните стр у и: т ур и .

сито са епосоони а;

Фенотипната г_ трансформираните г.летк

Е. coli типично т□анс φормирана изπо/.зв а плазмид произлизаш, от

HOOT Η

Е. col

Gene 2 (1977.. pDR :ъдържа гени резистентни ампицилин обезпечавa способи 3 и денти и и,и р а не на трансформирани клетки азмидът pBR или друг микробиален плазмид, трябва също бива видоизменен да съдържа, промотори, които може да бъдат използвани от м и к р ο 5 и а. л н и я ек спресия на собствени протеини

Тези промотори най-често се използват при рекомбинантни

Д Η К секвенции, в люч в аши лак та ма за (пеницилазв) и лакто ни промоторни системи (Chang

198:1056 (1977); (Goeddel, et al *1

Nature 281: 544 (1979)) и три.птофананова (трп) промоторна система (Goeddel, et al,

No 0036776)

Докато тези с най-често прилаганите, други микробиални промотори са били открити и използвани, подрооностите относно те ните нуклеотидни структури са оили паблик увани «I на к: в а л и Ф и и, и р а н и т е специалисти да ги свържат функционално с плазмидните вектори (Siebert 1 ist

В допълнение, освен прокариотни и еукариотни. микроби.

също и култури от дрожди могат също да се използват най честите използвани обикновената мая за хляо са видове сред еакариотните микроорганизми въпреки, че голям брой други щамове са

BAD ORIGINAL

Nature, 2Θ обикновено на разположение

Sa експресия плазмидът YRp7 например .

( Stinehcomb, et al .

I et al , Gene, 10

4· .1 плазмид съдържа τρπΐ ген, които осигурява селекционен маркер за мутантен щам от дрожди, не притежаваш, способност а растеж в триптофан., например, АТСС No

44076 или РЕР4-1 на ле-зия на τρπΐ к а то зрактеристика на генома дрожди осигурява

ефективна среда откриване отсъствие на триптофан

Под промоторите

Biol .Chem., <одящи структури в за 3-фосфоглицерат

255

1207 (Hess, et al. J. Adv. i:

al, Biochemistry, 17 глицералдехид-З-фосФат ек сок-иназа, изомераза, 3 пируват дрождени вектори включват киназа (Hitzeman, et al., 3 (1980) или драги гликолитични ензими такива като енолаза.

ФосФоФруктокиназа, декорсоксилаза •I гликозо

- .Фосфат

Фосфоглицерат матаза пир уват киназа, триозаФосФат изомераза, Фосфоглюкозо изомераза, глюкокиназа

В създадените подходящи експресивни плазмиди,терминационните секвенции са асоциирани с тези гени, които са свързани в ек спресионен вектор от секвенцията за експресиране, за да осигури полиаденилация на мРНК и терминация

Др аги промотори, имащи допълнителни предимства от транскрипция.

контролираща условията на растеж, са промоторните региони за алкохол дехидрогеназа 2, ивоци.тохром

C, кисела Фосфатаза, разграждащи ензими, имащи отношение към азотния метаоолизъм.

и гореспоменатите глицералдехид

Фосфат дехидрогеназа, и ензими, отговорни за усвояването на малтозата и галактозата

....! ₈....

Всеки плазмиден вектор, съдържащ подходящ за дрожди промотор. локус секвенцията е подходящ за използване получени от многоклетъчни организми също могат азяин

По принцип, всяк а такава % летъчна е подходяща, в зависимост от това дали е вертебрална или инвертебрална култура. Обаче, би. бил наС-голям за вертебрвлнц клетки такива клетки

процедура в

Press, Kruse в култура (тъканна култура) последните години (Tissue е станала рутинна

Culture, Academic and Paterson, editors (1973))

Примери за такива използваеми линии от’клетки гостоприемници са VERD и

HeLa клетъчни амстер (СНО)

Експресйонните линии, клетъчни линии от яйчник от китайски и W138, ВНК, COS-7 и NDCK клетъчни линии вектори за такива клетки обикновено включват (ако е необходимо) локус за репликация, промотор локализиран срещу гена за експресиране, съответен риоозом, места полиаденилаи,йонен участък места за с ек в енции

За приложение 6

ФУНК ции на посредством промотори са

Siman Virus за привързване към транск рипционални клетки от бозайници «I по терминаторни контролните експресионните вектори често се вирусен материал

Например, често извлечени от polyoma (SV40)

Ранните вирус SV40 са специално използвани осигуряват прилаганите

Adenovirus Z и късните понеже се от вируса като Фрагмент, който също съдържа локус за репликация (Fiers, et al, Nature, 27 промотори от

SV40 вирусен

113 (1978)

По-малки или по-голепи фрагменти от SV40 също могат да бъдат използвани, получените сек вени, и и, удължени лок ализирани

.... | 9така включват приблизително от и желателно, да се промотор или контролна секвенция,

Ьр използва обикновено асоциирана с желаната генна секвенция, като получените така контролни секвенции са съвместими с клетъчните системи на

Локус за репликация може да бъде обезпечен също чрез конструкция на вектор с включване на екзогенен такъв може да бъде извлечен от SV40 или друг вир усен (Polyoma, Adeno VSV EpV и

т.н.) източник, или може да оъде получен от хромозомния репликационен механизъм на клетката азяин

Ако векторът интегриран в хромозома на клетката азяин, последният е често подходящ

При избора на предпочитана клетка азяин за трансФекция от векторите от изобретението,които обхващат ДНК секвенция, кодираща двата протеина на т-ПА и ДХФР, подходящо

е да се подбере хазяина според типа на използвания протеин

ДХФР. Ако	е	използван	див	тип Д X	Φ Р протеин, за
предпочитане е	да	се	избере	клетка гостоприемник	, к оято е
инснфициентна	по	отношение	на	Д X Ф Р,	к оето	позволява
използването на	Д	X Ф	Р кодова	секвенция	като	маркер за

б трансфекция успешна fl селективната среда която не притежава хипоксантин глицин и. тимидин. Под одящв клетка гостоприемник в тези линия от яйчник от китайски хамстер (С

Н 0) , дефицитна на Д направена и разпространена като описаната от Urlaub and Chasin (Proc

Natl . Sci.,

USA 77

4216 1980) , вмъкната в библиограФската спрабк а

От друга страна,ако ДХФР протеин с нисък аФинитет

МТХ онτρ о а на с ек б ени.и я не е неооходимо аа in

f.·

Поради това.

че нетотраксат, М като средство за че клетките а зяи си.

на метотрексат букариотни клетки, които са '3 състояние да абсорбират Μ Τ X , са сензитивни към тази на СНО, СНО-KJ АТСС No CCL 61.

Опити, които са посочени по-нататък, описват

използването	на Е. col	i , с лак и трп	промоторна	система	и
използването	на С	Н 0 клетки	като клетк	и хазяи	и.
експресионни	вектори	• , които включ	ват SV40	ЛОК УС	на
репликация к	ато промотор. Обаче,	добре би	било да	се
използват ана	ложни тех	ники за констр	уиране на	ек спресивни
вектори за	експресия	на желаните	протеинови	стр уктури	в

алтернативни прокариотни или букариотни култури на клетки хазаи.

Задоволителни количества от т-ПА са произведени от клетъчни култури, но по-късните подобрения, използващи вторични кодови секвенции, предлагат увеличение на нивата на производство. Вторичната кодова секвенция включва дихидрофолат редуктаза (Д X Ф F') , която е третирана с външен контролен параметър, като метотрексат, и. това позволява контрол на експресията посредством контролът на концентрацията на метотрексата (Μ Τ X).

В. Използвани методи

Ако използваните клетки хазаи са без труднопропаскливи клетъчни бариерни мембрани, трансфекцията се осъществява посредством метода на преципитация на калциев

21Фосфат, както е описан от

Graham и Van der Eb, Virology, 5

Но могат да бъдат прилагани и други методи за в клетки, като с нуклеарно инжектиране или чрез протопластна фузия се използват прокариотни клетки или клетки.

клетъчна стена, предпочитаният к али.иев както ;ι

За' конструиране третиране с калций.

е описано от Cohen, F на подходящи вектори посредством et al F’roc желания код и контролни секвенции, се използва стандартна т е х н и к а за л и г и р а н е

Изолирани плазмиди или Фрагменти от се разграждат, прикрепват и повторно лигират в

Форми к ъм формите, изисквани от плазмидите извършва с третиране с рее трик и,йонен ензим(и) 6 подходящ буфер

Около 1 рд плазмид или Фрагменти от Д Η К се прилагат с 1 единица от ензима около 20μ1 от буферния разтвор (Производителите предлагат подходящи

за специалните рестрикционни ензими) о инкубация да е 1час при 37 С

Слеа на инкубацията, протеинът се отстранява чрез екстракция с нуклеиновата киселина се от водната Фракция посредством пр еципита ция

Ако се изиск ват blunt о

II краища, препаратът се третира за минути при 15 С единици полимераза I лороФорм за екстракция и етзнол преципитация .

на разградените Фрагменти се осъществяват с 6 процентен полиакрилзмиден гел, описан от

Goeddel отбелязан а лигисане на приблизително еквимоларни количества желаните компоненти съвместими за обезпечаването на точно съответствие се третират с около 10 единици Т4

ДНК (Когато разцепените векторi се използват като компоненти, става възможно използването, за възпрепятствуване на вектори посредством повторното лигиране, на разцепените предварително третиране с бактериална

За анализа, за утвърждаване коректността на секвенцията на плазмидите, лигиращите микстури се прилагат за трансформация на Е. coli К12 щам 294 (АТСС 31446) и тр а нс Форманти подбрани за ampicillin или tetracycline резистентност където е подходящо

Получени са плазмиди от тр а нс Фор манти анализирани посредством рестрикция и/или съчетаване на

9:309 (1981) или чрез метода на Махат, et al, Methods ft (1990)

АмплиФикация на

Д X Ф Р протеинови кодови секвенции е осъществена от растящи клетъчни култури хазяи в среда приблизително на 20-500

000 пМ концентрация на метотрексат.

подходя щ и н хио итор на ζ

активността на Д X Ф Р. Ефективната област на концентрация е силно зависима, разбира се, от природата на гена на Д X

Ф Р, протеина и характеристиките на клетката азяин

Ясно е, че всеобщо дефинирани горни или долни лимити не могат да бъдат установени

Под орящи концентрации на други аналози на фолиева киселина или други съединения, които инхиоират също могат да се прилагат ,

МТХ обаче е удобна и ефективна за употреба

Общо описание на предпочитаните изпълнения на изобретението

Човешкият тъканен плазминогенен ак тиватоо беше получен, съгласно следния проток ол

Човешки меланомни клетки, активно продициращи тъканен плазминогенен ак тиватор □ яха к ултивирани д° сливане

Клетъчни гранули от такива клетъчни култури бяха екстрахирани 6 присъствието на рибонуклеазни инхибитори за изолиране на цялата цитоплазмена

Олиго -dT колона изолира цялата матрична (информационна) Ρ Η К (мР Η К) в полиаденилна Форма. Тази мР Η К беше размерно Фракционирана с електрофореза на гел от кисела урейна агораза

Фракцията, съдържаща специфична Р Н h за тъканния плазминогенен активатор оеше идентифициран по следния спосоо от всяка от гел Фракциите беше транслирана в заешки ретик улоцитен лизат in vitro с прибавяне на микрозоми от кучешки панкреас

Получените

транслационни продукти бяха имунопреципитирани суспецифично

IgG антитяло одящата Ρ Η К (21 до 245) беше конвертирана с кореспондиращата еднонишкова комплиментарна

Д Η К (кДНК) от която беше полнчена двоОнонишкова кД Η К

След поли -dC прибавяне, последният беше инсертиран във вектор, като плазмид носещ един или повече фенотипни маркери

6. Така получените вектори са използвани за трансформиране на бактериални клетки, обезпечаващи клонална кД Η К библиотека. Фонд от радиобелязан синтетичен дезокси олигонуклеотиди комплиментарни за кодони за известни

..иаминокиселинни секвенции 6 т-ПА.

1··!- ПИ?! s , като например йоноът от 8

А н С

5' -с! ТС( ,)СА( :< ϊ ι то (3 и I )ТСССА (комплиментарна за секвенции, кодиращи за известна виж infra аминокиселинна секвенция: триптофан- глутаминовз киселина

- тирозин - цистеин - аспзрагинова киселина (W-E-Y-C-D) беше получена и използвана да сондира библиотеката от колонии.

7От позитивни кД Η К клонове, беше изолиран и структуриран плазмид Д Η К.

8. Структурирана Д Η К, кодираща т-ПА след това беше прибавена in vitro за инсерция към подходящ експресионен носител, който беше използван да трансформира подходяща клетка хазяин, която да прорасне 6 клетъчна култура и произведе желания човешки тъканен плазминогенен активатор.

9. Така произведен, човешкия тъканен плазминогенен активатор има 251 аминокиселини 6 неговия ензимен серин протеаза участък и kringle съдържаща структура, за която се предполага, че има отношение към фибриновото свързване. Зрелият протеин плюс неговата сигнална пресеквенция, довежда до сумата от 562 аминокиселини.

Гореописаната процедура е ефективна за получаването на чист т - ПА. Методи от изобретението * използващи допълнителна кодова секвенция, чувствителна на метотраксат, позволяват продукцията в култури от клетки гостоприемници на т-ПА с антигеннз активност, в количества по-големи от 0,1 пикограма от клетка на ден. С подходяща апликация на усилващи условия, може да бъде достигнат добив по-голям от 20 рд на ден от клетка. Поставени в алтернативни условия,

генните експресионни нива постигат продукция от повече от

Р Е (Plough units) от една клетка за ден. а с -4 подходяща амплификация, повече от 18 на ден т-ПА може

Предимствата изобретяването на получени метотрексат, като

FE от к летка аспек т, са 6 препарат, к ойто нормално е Фатален за клетъчното усвояване, и прави възможен клетъчния растеж 6 среда на контролирани нива на Μ Т X, посредством ампфлификация на генът, кодиран за Д X Φ Р кодова

1051 (1972) стрзктзра (Schimke ; Chang. S. E

Важността на че амплиФикацията на а мплифика ция на протеини. Това се е хепатит В повър

Acad. Sci

Robert Т

Cell 7:

et al., Science 202:

Cancer Re

52: 153 този аспект на изобретението показва.

гена за Д X Φ Р може да причинява асоциирани секвенции, среща 6 случая, когато които кодират други асоциирания протеин ностен антиген(HBsAg) (Christman, J . et al.

79: 1815 (1982)); протеин от

Е. coli , J. I’lolec. and Appl. Gen

1: 165 (1981)); и ендогененни секвенции от Д X Ф P/SV40 плазмидна комбинация (Kafman, R et al., J. Molec. Biol

Други механизми, отнасящи се за резистентността на нетотрексата, включват намаляване на свързващия афинитет на протеина Д X

Φ Р, така, че той е по-малко възприемчив метотрексат (Flintoff, W.F. et al

Somat. Cell Genet

Беше установено че двата гена за дивия тип за протеин Д X Φ Р, който е резистентен към благодарение на своя собствен намален капацитет за (1976) свързване са аиплиФицирани от присъствието не; Μ Т X . По принцип, този аспект на отнася зг използването на амплификационното влиянието на у асоциираните протеинови за осигуряване на контролен механизъм, които позволява повишение на ек спресйонните нива на присъствието на

МТХ или благодарение на предшестващо третиране на г~

Е. Опити

Следващите опити са предназначени да не и да лимитират изобретението. В тези опити култури. от Е coli и С Н 0 клетъчни линии , под одящи за вида на протеина

ДХФР кодова секвенция, бяха използвани като клетъчни к алтури гостоприемници. Обаче, също и други еукариотни и прок ариотни клетки са под одящи за методите на изобретението

Е.1 Експресия на гена на човешкия т-ПА

Е. coli

Е.1.А Легенда авторадиограма на SDS F'AGE

107. (натриев додецилсулфатен полиакриламиден електроф изразен чрез имннопреи.ипитиран [ S]-метионин гел) маркирани(иι протеини(и), секретира(и) от човешки меланомни клетки продължение на 3 часа in vivo, в присъствието (полоса Ь) или при отсъствието (полоса а) на протеазния инхибитор

Ci апротинин

След имунопреципитация с тъканен плазминогенен активатор специфичен Ig G, бяха наблюдавани три ленти, (полоса а) имащи молекулни тегла приблизително около

65000.

63000 и 35000. В присъствието на протеазен инхибитор, обаче, видове с 35 000 молекулно тегло не бяха наблюдавани

Когато е използван преимунен серум (полоса с), продукти не ояха имннопоеципитирани лябо от тегла на маркирани с

Фигура 2 имуноФорезата на гел на им унопр еципитир а ни транс л а ци онни продукти от F Η К Фракции, изолирани от гел на кисела уреина агароза

Голяма лента беше наблюдавана във Фракции с номера! 7 и 8 след в присъствието на кучешки панкреаси и м и к ρ о з о м и , последвана от имннопреципитация тъканен плазминогенен активатор има молекулярно тегло прибл

630 ос>

далтона приблизително 21 до 248

Позициите на рибозомалните

Η I:

парк ери, които ояха детерминирани след електрофореза на

РНК уреа гел визуализирани посредством оцветяване с етаниден оромид, са □оозначени над съответната гел полоса

Фиг представя иоридизационният мооел на оактериални колонии с

.P-dTC(

А А )СА( )ТА(

G G индивидуални трансформанти

С ) ТСССА (W-E-Y-C-D) сонда.

Т прораснаха 6 микротитрово петри.

микроорганизмов препечатък .нитроцелулозна мембрана .Колониите ояха лизирани иоридизирани бактериалната ДНК Фиксирана и Филтрите бяха със сонди на F’-14-mer (W-E-Y-C-D). Филтрите

Л ояха промити за отстраняване на нехибридизираната сонда и експозирани върху рентгенов Филм

Тази авторадиограма е представителна за конфигурациите.

получени с 48 индивидуални,

Филтъра (4600 отделни колонии)

Като пример за положителен тъканен плазминогенен активаторен кДНК клон върху ' Филтър с номер 25, е обозначен като Е10 (стрелка)

Фигура 4 е карта на ендонуклеазната рестрикция на цяла дължина на т-ПА кДНК.

Броят на Фрагментите, получени, от от оазцепбането от ендону»: леазната установени посредством акриламиден гел елек троФореза

Позициите на участъците

рее трик и.ия	О Я ХЙ
през	6 проис-	?нтоб
бяха	потвъраеь	IIJ. от

Фиг секвенция на нуклеинова киселина (представена на

Кодиращият регион на най голямата отворена рам!

секвенцията на предполагаемия сигнален пептио α οιато гравираният

ПУНКтир район представя секвенцията на предполагаемия зрял тъканен плазминогенен

527

аминокиселини) краят на мРНК е вляво,

- краят е дясно

5а, 56, 56 илюстрират нуклеотидната извлечената аминокиселинна секвенция на пълната дължина на кД Η К

Фигури секвенция на човешки тъканен пламиногенен активатор е запис

Изобразен ката непрекъсната секвенция на 35 аминокиселини.

(-35 до -1), представящ тяхната зряла конфигурация се, че хидрофилна pro протеин, от около

Приема аминокиселинна секвенция се състои от секвенция, запис на серин (+1) на зрелия до 15 аминокиселини, по ред предшестван от конвенционален хидрофобен сигнал (простиращ се от 5' до

5). Този тип на пре- про структура на секретирани протеини е била описана предварително, т.е с препроалбзмин. Според тази теория, всички секретирани молензли на тъканен плазминогенен активатор ще стартират със серин (+1) като амино-терминал. Друга теория предполага, че хидрофилната секвенция може да бъде включена във функцията на тъканния плазминогенен активатор по аналогичен начин на този, наблюдаван при плавминогена, където пептид от 10000 далтона може да бъде разграден от амино терминална част на природен плазминоген (Глз-плазминоген), получен в по-малки молекули, ноб амино термина/ моделиран Лиз плазминоген.

Лив-плазминогена е по-лесно активиран до плазмин и също има по-голям афинитет за Фибрин, отколкото Гла-плазминогена. Плазминът бе показан да катализира конверсията на Глу - плазминоген до Лиз - плазминоген. Този тип контролен механизъм резултира б механизма на обратната положителна връзка Първите количества плазмин Формират освен деградиран

Фибрин също и 6 резултат на генерирането на плазминогенни молекули, които по-лесно се активират

към тяхната

Резултатът е пептид от суостанция

ПО оърза тъканния деградация природния плазминоген на Фибрин. Хидрофилния плазминогенен активатор може да бъде включен 6 подобен механизъм, неговото разграждане е резултат от модифицирано свързване на ензимът с Фибрин. Във всеки случаи 35 аминокиселинната секвенция се разглежда като пресеквенция на зрелия протеин.

Фигура 6 е схематична конструкция на експресивния плазмид pdeltaRIPA на тъканния плазминогенен активатор.

Стартиращия . плазмид рРА25Е10 беше първо разцепен с PstI да изолира 376 Ьр Фрагмент, които после бе разграден както е показано на Фигурата.

Фигура 7 показва резултатите от анализа на фибринов слои за Фибринолитична активност на експресивния продукт получен via pdeltaRIPA 6 трансформирани клетки.

Фигура 8 е ТХВН запис (течна хроматография с високо налягане) на пептидите на човешкия тъканен плазминогенен активатор от храносмилателния ензим трипсин (Абсорбция при 210 nm). Стрелката идентифицира пикът, кореспондираш, с пептида, използван за изграждане на нуклеотиднзта сонда, приложена от библиотеката от колонии. Пептидът, представян

4[ies този пик беше разгадан по отношение на цялзта ма секвенция: L-T-W-E Y-C D-V-F-S-C-S-T-C-G-L.

Последователностите на другите големи пикове съшо бяха секвенирани и беше установено, че се потвърждава коректността на аминосеквенциятв на човешкия тъканен плазминогенен активатор. Еднобуквеният пептиден код за аминокиселините е слеоният:

Asp.	D	Аспзрагинова к-на	11е	I	Изолевцин
Thr	Т	Треонин	Leu	L	Левцин
Ser	S	Серин	Ту г	Y	Тирозин
Glu	Е	Глутаминова'к-на	Phe	E	Фенилаланин
Pro	Р	Пролин	His	h	X истиаин
Gly	Б	Глицин	Lys	K	Лизин
Ala	А	Аланин	Arg	R	Аргинин
Cys	С	Цистеин	Trp	W	Триптофан
Vai	V	Валин	Gin	Q	Глутамин
Met	М	Метионин	Asn	N	Азпарагин
	Фигура	9 показва конструкцията	на пла	змид, кодиран
за директна	експресия на зрял	човешк	и т-ПА в Ешерихия
коли (Е.	coli)	. 50 рд от плазмид	pPA17	бяха	разградени с
Sau3A1,	Hine 11	и Hhal и електроФорезира	ни вър	ху 6 процентов
полиакриламиден гел.Приблизително	0,5 pg	от Фр	агментът 55 Ьр
Sau3AI-HhaI бя	ха възпроизведени.Подобно,	ок оло	3 цд от 263 Ьр

Hhal-NarL Фрагмент беше пречистен от 80 рд от клон оРА25Е10 к а то първо изолиран 300 bp PstI

Narl Фрагмент. Всички разграждания ояха извършени при температура поооължение на един час

Г · •j рС индик up а ни дес:· i Φ O C φ Ο P U Λ U □ 3 H !..!

Т4 пелин зк i:

ιϊ

ΐίϋ rip u

I.

.1 1 ή:

·{ ·· нително минати ’Ύ :hор uaиp а щият oлигомε·ρ комбинирани с 0,5 μα елкчвиран микрограма от bp Hhal-Narl

CjK

Е а ’-ί 3 AI - Н h a I Ф par м е н т и

Фрагмент

с. лес тсбг прециг.итирани с етанол

Тези Фрагменти. бяха лигирвни стайна температура за 4 часа в 60 μΐ

10mM MgCl 10 мМ дитиотреитол, единици от Т4 ДНК лигаза

Микстзрата час с 48 единици от Marl. 20 единици

П Pl.!

от 20 mN Tris-HCl беше разтваряна

1000

е. а 1

EcoRi и 40 единици от

Bglll (за да елиминира полимеризациятв чрез лигаиия на сцеплените Sau-3AI термина Ϊ и електроФооезиранг върху ά'Λ gel .

Ьр продчкт (приблизително 0,1 μς) беше възстановен чрез електроелюиране (аминокиселини 111-528) бяха изолирани на 1645 Ьр фрагмент посредством разграждащ плззмио pF'h25E10 с Narl и Bglll.

Плазмидът pLeIFAtrplO3 на плазмида в който участъкът EcoRi, диета лен-;

по отношение на гена LeiF

А е бил отстранен

Три цд от pL.e IFAtrplO3 разградени с 20 единици от EcoRI и единици от Bglll

о.

BAD ORIGINAL ft □

минати пои 37 С. електроФорезирани върху 6 процентов полиакриламиден гел и големият (»4200 Ьр) векторен Фрагмент беше възстановен чрез електрелюиране.

За окончателната констракиия, 80 ng от EcoRI-Bglll pLeIFAtrplO3 беше лигирзн с 100 ng от 1645 bp Narl E<q 11 I фрагмент и 20 ng 33’6 bp

EcoRI-Narl Фрагмент за 10 часа при стайна температура. Тази.

лигиационна микстура беше използвана за да трансформира Е coli К—12 щам 294

ДНК плазмид беше получен от 38 от тези трансформанти и □яха разграден

EcoRI

Десет от тези плазмиди съдържат желаните 600 Ьр и 472 bp EcoRI Фрагменти

Анализът на Д Н

К структури верифицира, че един от тези плазмиди съединението на trp промотор, синтетична ДНК и кДНЬ

Фигура 10 показва резултата от анализа на проба фибринов слои, тествана за Фиоринолитичната активност на тъканен плазминоген активаторен експресивен продукт

Престояла една нощ клетъчна култура от Е. coli W3110 (АТСС 2735), съдържаща т-ПА експресионен вектор в бульон -1 на Luria, съдържаш, 5 цд ml tetracycline беше разтворена 6 съотношение глюкоза, 0,5 tetracy с1ine процентова каз(еин)аминокиселини о

Клетките дали растеж при 37 С процентова -1 и 5 иа ml индолакрилова киселина добавени к ъм

А от 0,2

550 окончателната к онцентрация от 20 pg/ml центрифугиране при А = 0.5 - 0,6 (я

550 замразени

Пробите бяха селектирани чрез 8 -1 10 клетки ml ) и незабавно суспендирани в 61*1 гуанидинов хидрохлорид при 5 бяха

Клетъчните центрифугати

СУ клетки о

ml, разрушени с ултразвук за 10 sec, инк-убирани при 24 С за 30 минути и тогава диализирани за 4 часа през 25 mH TrisHCI pH 8,0, 250 mH NaCI, 0,25 ml*l EDTA и 0,01 процентов

ILt

Слеа

Li/ ·> it¢:. ηφ за

HUHУТЦ ι_ι по ак: тибност

ΟλPiperпо и

При ?на оеше измерен ясна л из lid ан

Π ЛО01Т зона може аа ксоелира п л а зми но генен

Източник на mF

ак тибатор

Използвани са чобешки

Melanoma) клетъчна линия, АТСС мелансмни клетки ( Bowes номер CRL 9607)

Меланомните клетки бяха култивирани върху конФлаентна монослоина култура в 100 ml Earles Minimal Essentia] Media c прибавен натриев бикарбонат глатамин и сер ум.

(0,12 процентова крайна концентоаи.ия) , мМ процентов топлинно инактивиран Фетален телешки.

За да се потвърди, че меланомните клетки активно прод уи(ират човешки тъканен плазминогенен ак тибатор, човешки меланомни клетки бяха култивирани до сливане в 24 гнездова микротитрова плака. В зависимост от наличието или отсъствието на 0,33 μΜ прстеазен инхибитор апротинин, клетките бяха промити веднъж с Фосфат буферен Физиологичен разтвор и 0,3 μΐ от серум от сяропречистен метионин. 75 uCi 35 от [ S]-метионин бяха прибавени, и клетките бяха белязани за о

часа при 37 С. В края на три часовия период на маркиране, средата беше отстранена от клетките и третирана, с или тъканен плазминогенен активаторен специфичен 1д Б, или пре - имунен серум за имчнопреи.ипитвция ·

Имунопреципитационните продукти бяха показани посредством електрофореза на 10 процентов SDS-aкоиламиоен рез а п

тът изсушен и подложен на Флуорогоафия.

Е.1.В Изолиране на информационна РНК и Фракциониране по размери.

екстрахирана според спосоо ояха утаени посредством с л eg тор а реснспендирани. в

Mg С) (1 процентна крайна концентрация) и ядрата бяха утаени чрез

Супернатантът съдържа цялата Р Н h която по-нататък оеше пречистена чрез многократно екстрахиране с

Фенол и хлороформ. Водната Фаза беше направена 0,2 М G NaCl и след това цялата оеше преципитирана чрез обема от етанол

Олиго роматограФия беше използвана за да пречисти мР Η К от цялата получена от култивираните

Р Η К (54)

Типичните добиви от 10 гоама меланомни клетки бяха от 5 до 10 милиграма а Р Η К и 50-200 микрограма от Poly(A) plus mP Η К. +

Фракционирането от PolyA мР Η К (200 рд) (56) беше осъществено посредством електрофореза през урея-агарозен гел

Пластът агарозен гел (57, 58) беше съставен от 1,75 процента агароза,

0,025 М натриев цитрат, pH

М арея

Електрофорезата беше проведена за 7 часа при 25 милиампера о

С. След това гелът беше Фракционира.ч с острие на бръснач о стопени при 70

Отаелните слоеве ояха □ 6 укоатно екстрахирани чрез

Фенол и еднократно чрез лороформ. След това Фракциите бяха преципитирани с етанол и в последствие, анализирани чрез in vitro транслация в заешки ретикулоцитни лизатни системи, Bethesda Research Lab. £59, 60^, смесени с i'ччешкu пзнкреасни микоозоми, извършени с помощта на 25 както следва: Транслациите рС1 ат [ £)--метионин и 500 нанограма от всеки гелоб слой

F' Η I·:

завършваш, обем от

мМ креатинин Фосфат.

всяка. 1,1 м!И зминокиселини 50

м а гнезиев хлοр ид , 16,6 мΙΊ ети ле нд и а минтеτр а оцетна к и с е ли н а

(Е Д Т А), 0,16 мМ дитиотреитсл,	□л 3 мМ	хемин, 16,6 μα/ml
креатинин киназа, 0,33 мМ калциев х	лорид, 0	, 66 мМ е б т а ,
23,3 мМ натриев хлорид.	Г»
ИнГк убирането беше проведено	L·.· пои 30	С зз 90 минути.

Кучешки пзнкреасни микрозомални мембрани, получени от сурови микрозоми с помощта Е Д Т А за отстраняването от рибозсмите [61] и третирани с никлеаза, както вече е описано £62j и поставени в транслационна микстура при крайна концентрация от 7 А единици/ml . Транслационните продукти от

260 имунопреципитираните транслационни продукти бяха анализирани

чрез електрофореза върху 10 процентов полиакриламиден гел с натриев додецил сулфат (SDS), както е вече описано . ОбеЗцветените гелови пластове бяха Фиксирани, изсушени и подложени на ФлуорограФия МПолучените транслационни продукти от всяка Фракция на гела бяха имунопреципитирани със заешки внти-човешки тъканен плазминогенен активатор специфичен Ig 5. Една глабна имунопреципитирана полипептидна връзка беше наблюдавана 6 транслацията на Ρ Η К Фракционни номера 7 и 8 (миграти от 21 до 24 S), имаща молекулно тегло от приблизително 63 000 далтсна. Тази връзка не беше наблюдавана, когато преимунен Ig G беше използван за имунопреципитиране, което подсказва че тези полипептиди бяха специфичен тъканен плазминогенен активатор не на. библиотека

ОТ I ?'лонии .

съдържащи тъканни плазминогенни актибатзрни екоемииц.

Пот μα от гел фракционирана mF' Η К и-ьлсл слои мР Η К) беше иеползбан за получаването на дваинонишкова кРНГ

52, 65

L.

I·' ο еше kF’ Н )·.

по r-i ·--¹ двойки (С) остатъци j пд от кР Η К б еше използването ра терминал

д е о к с и н у к л е ο т и д и л трансФераза от плазмида деокси (G) смес след (АТСС No дооити )0 по рВР

Μ' който по подобен начин е свързан с това беше трансформирана в

Е. coli К12 щам 294

1446)

Приблизително 4600

Е.1.Д. Получаване на сонда от Д Η К

Пречистен човешки тъканен плазминогенен активатор беше добит с помощта на процедурите, които са описани 6 приложената литературна справка (19, 20).

Молекулата беше сканирана за да се локализират регионите, най-подхождащи за направата на синтетични сонди.

както следва:

За да стане протеинът подходящ за разграждане от трипсин, той е бил. редуциран и карбоксиметилиран. 2 mg от тъканен плазминогенен активатор бяха първо диализипзни през

0,01 процентов	Tween 30, пре	з цялата	нощ	ПРС с	тайна
температура. ЯиоФилизираният	протеин	беше	след	това
разтворен 6 12	ml от 0,56 М	Tris-HCl	буфер	( pH 8.	6) . 8
моларен 6 уреа	и 5 мМ Е Д Т	А. ДисУлФ	идните	връзк и	бяха

редуцирани чрез прибавянето на 0,1 ml от β-меркаптоетзнол

Тази оеакция беше осъществена nog азот за 2 часа при 45 С.

Fog уцираните а л:; илиоанс.

дс к 3d6oiсимети дериват с добавянето на 1,0 ml от М йооооивтна киселина

N NaOH. След 20 минути пои стайна темпеоатура реакциятз беше преустановена чрез диализа през 0,01 процентов Tween 8 часа при стайна температура и лиофилизиоане.

Полученият лиоФилизиран к а рб ок с имети л up а н ηο отеин беше повторно разтворен Q

LI £·? С ( pH 7

?)

Беше

50) и разтворен пр и

Кратни количества ( 0,1 ml ) бя

на час , на ча на 12 чalа

Второ прибаояне на трипсин беше осъществено на

След 24 часа реакцията беше спряна чрез замразяване на пробата, докато можеше да бъде инжектирана на HF'LC, Напредването на разграждането беше детерминирано посредством SDS гел на кратните количества. Всички телове бяха празни, с изключение на слабо изразената лента на 3 часовата пропорция. Това индицира, че 24 часовото разграждане е завършило напълно и не са останали големи пептиди.

Проба (0.5 ml) беше инжектирана във притежаващата висока разделителна способност ALTEX С-8 нлтрасфера 5μ стълб с два пробега. Градиент от ацетонитрил беше приготвен в постепенен порядък (от 1 до 5 процента за 5 минути, 5 до 35 процента за 100 минути, 35 - 50 процента за 30 минати!. В единия от дв^та препаратни пробега, елюантът беше монитиран при две дължини на вълната (210 nm и 280 nm). Степента на абсорбция при двете дължини на вълната беше използвана за да се индикират триптофан съдържащите пептиди.

Пептидните пикове, най-вероятно заради. съдържанието им на триптофан, или поради използването им заради други причини,

8екбениоани пъсви детерминираното на секвенцията на на около вероятните пептидни пикове» всички данни за секвенции. конте обш, Фонд □ а се придобие предварителен модел на първичната тък гнен плазминогенен акти6а тор тези данни модел, множество възможни· сонди оя j .Е.

Идентифика ция на бактериални

к. лонове кД секвенции на тък анен плазминогенен активатор

Колониите бяха индивидуално инокулирани 6 гнездата на микротитърните плаки, тетрацик лин и съхранявани при

D 1*1 S до процента. Две копия от библиотеката за колонии ояха дали растеж върху нитроцелулозни

Филтри и Д Η К от всяка колония, Фиксирани на

Филтъра, според способа на

Ci runs

5S (67)

Сондата

обозначена

ТС(

А )СА(

Ci

С )ТА(

Т )ТСССА оеше получена (от синтетичен олигомер) (W

14-mer фонд, както е описано по-горе

Филтрите съдържащи

4600 трансформанти

ОЯ а прехибриаизирани за часа при стайна температура в mm натриев Фосфат рН 6 ,8

SSC (80), 150 цд разрушена ултразвук ДНЬ от сперма от сьомга

5Х разтвор на иоридизиран

Denhardt(85) процентов за мината от същия разтвор температура в

Формамид и след това обозначената сонда в

След инкубация от една нощ при стаСлна

SSC, 0,1 процентен .SDS за 30 минути, с>

веднъж в

SSC и след това експозирана на KODAK XR-5 рентгенов Филм с Dupont Lightning Plus усилващи екоани за 16 от всички колонии, показали положителна u 6 p u g u 3 a u,u опна реакция инсерти от тези клони бяха след това секвенирани след субклонираните Фрагменти в М13 вектор пр £73^ и според имическата процедура на Махат Gilbert [74^

Филтър номер 25, показваш, иоридизационнатз на положителен тъканен плазминогенен

активвторем д емонстр up а н зктиватор секвенция пречистен продук т, к лон инсертът в клон 25Е10 беше като кодиран от Д чрез сравняването на с пептидна секвени,ия за тъканен плазминогенен неговата аминокиселинна (виж по-горе) получена от тъканен плазминоген активатор и чрез експресивен продуциран от Е. coli, както по—долу е описано по-подробно кД Η К pF’A25E10) имаше отворена четяща рамка (MW 56 756)

Този кД секвенция като проба инсертът от клон 25Е10 (плазмид базови чифта в дължина с най-дългата кодираща протеин от 508 аминокиселини и съдържаща 772 Ьр 3' нетранслирани региона к лон

Бактериален от плазмиа

Type Culture Colection

Е. 1.Ж не притежава N терминална кодова клон Е. coli(pFA25A10), а също така и рРА25Е10, бяха депозирани в American и получиха номера 67587 и 40401 респ.

Директна експресия на човешки тъканен плазминогенен ак тцваторен клон в

Е. coli

Както при μα от рРА25Е10 (горе) бяха разградени с F’st I

Ьр фрагмент изолиран посредством прои.ентов разтвор на полиакриламиден

Приблизително рд от този фрагмент бяха изолирани от помощта на е к тр с е л ю u р а н е □

пои 37 С.

разградени екстрахирани ύ s ci и н и. ц и.

с Фенол и слсоооссм и пренипитцрани с етанол. Получените DDe е п 1.л β и.

ксаищз бяха разширени go blunt краища с прибавянето на (Фрагмент на Klenow) и 0,1 мМ '0 С dATF', dCiFu dGTF', dTTP до ирзне последващо ин ι с Фенол и уоиране о

при 4 С ороФорм, Д

Η К беше разграден;

с 15 часа и реакционната микстура оеше ел ектр с Фopesирана ър у ό процентов полиакриламиден гел

При о ли зител нο 0,5 μд от желания

125 bp blunt край Nar I

Фрагмент беше възстановен киселини

Този

Фрагмент кодира амино номера от 69 до 110 в зрялата пълна αължинз ма тъкai -мия плазминогенен активаторен протеин.

За изолирането на 1645 Ьр Nar I - Bgl II Фрагмент, цд от pF'A25E10 бяха разградени с 30 единици от Mar I и 35 о

единици от Bgl I I за 2 часа при 37 С и реакционната смес електрофорезирана върху 6 процентов полиакриламиден гел Приблизително 6 μα от желания 1645 bp Nar - Bgl II фрагмент бяха възстановени.

Плазмидът pdeltaRlSRC, които е дериватен на плазмида oSF;Cexl6 £/9^, в които Ecco R1 участък е прок сима лен по тношение на trp прсмотор и е дистален по отношение на SEC бил отстранен чрез репарация с Д < о м п л иментз рн и я н а еое си олигодеоксинзклеотид

ТТ-ЗАТ (синтезиран чрез фосфотриестерния метод) беше н в остатъчния Ecc HI участък, непосредствено стоящ

I участъг до лороформ преи.ипитираяи с етанол. След това плазмидът беше разграден

г

BAD ORIGINAL ο

100 едини	ци от нуклеазата 31 при	16	С, за	30 минути в 25
мМ натрие	в ацетат (pH	4,6) 1 mM ZnCl	и	0,3 14	NaCl, за да се
създаде	blunt край	с секвенция	л'.. ATG	, След	екстрахираме с
Фенол и	хлороформ и	преципитиране	с	етанол.	ι Д Η К беше

ч

Bam Н1 полизкрилзмиден ге извлечен посредством елек троелюиране

Експресивният плазмиа беше сглобен чрез лигиране pg Qer:тор.

0,06 цд от 125 bp

II blunt край

Nar I Фрагмент и pg OT

1645 bp Nar I

Bgl

Фрагмент с

ДНК и при използването за за 7 часа при стайна температчр трансформиране на E.coli

No 31446) зз змпицилинов резистентност получен от 26 от колониите и разграден с от тези плазмиди съдържат желания·· 415 Ьр bp Eco RI щам 294(АТСС плазмид оеше

Xba

Xba

I-Eco RI и 472

Фрагменти, ннализ на Д Η К секвенция верифицира това, че няколко от тези плазмиди имаха А Т G (АнтиТимоцитен

Глобулин) стимулационен код коректно поставен на аминокисединния номер 69 о

pdeltaRIF’A беше тестуван активатор (серин)

Един от тези и произведе желания старта на тъканен (Фигзра 7)

Бактериалният клон

ι.ιι; д епсзир а ни в American Type Culture Collection и придобиват *

номера 67585 и 40400, респективно дължина на тъканна плаоминогенна зк ти0 3торн кД Η К.

а) Получаване на библиотека от колонии, съдържащи

N - терминални тъканни плазминогенни активаторни секвенции:

0,4 рд	ат	синтетичния·	олигонуклеотид 5' TTCTGAGCACAG
GGCG 3'		използван за	прайминг 7,5 рд гел Фракция No

nF' Η Κ (rope) за получаване на двойноверижна кД Η К с помощта на стандартни процедури (65, 66). кД Η К беше размерна Фракционирана върху 6 процентов полиакриламидов беше електроелюирана. 5 nq кД Н h беше елонгирана с деокси (С) радикали при употребата на терминална деоксицитидил трансфераза (67) и ренатурация пд от плазмид pBR322 (68) , който е бил по подобен начин свързан с деокси (G) радикали на участък F'st I (67)

Р'енатурираната микстура след тов-а беше трансформирана в Е. coli К12 щам 294

Приблизително 1500 трансформанта бяха добити

δ) Southern хибридизация на човешка геномна

К:

Откакто кД

К прайминг реакция беше осъществена, използването на синтетичен Фрагмент, който хибридизира от

N - терминалът на клон рРА25Е10, не подходящ рее трик и,йонен Фрагмент стана достъпен в този този район с 29 базови чифта (който включва 16-mer секвенция) за скрийнинг

на кД Η К клонове. Следователно, беше необходимо да се изолира човешки тъканен плазминогенен активаторен геномен клон за да се идентифицират всички първично разширени кД Η К. клонове, съдържащи кодови секвенции на тъканен плазминогенен активатор с N - терминал.

Първата стъпка в този процес включва установяването на факта, че единствен хомоложен тъканен плазминогенен активаторен ген е налице в човешката геномна Д Η К. За да се детерминира това беше извършена Southern хибридизация. В тази процедура (77), 5 рд от човешка лимФоцитарна Д Η К с висока молекулно тегло (получена, както в 80), беше разградена напълно с различни рестрикционни ендонуклеази, електрофорезирана на

1,0 процентов агарозен гел (81) и изсушен на нитроцелулозен Филтър (77). Сонда от Р-маркирана

Д Η К беше приготвена (76) от 5' край на кД Η К инсерт от

ΡΡΑΣ5Α10 (.230 Ьр Нра II - Rsa I Фрагмент) и хибридизиран (82) с нитроцелулозен Филтър. 35 :< 10 за минута от сондата бяха хибридизирани за 40 часа и след това промити както . Две ендонуклеазни разградни структури осигурява мо ибридизиращ Д Η К Фрагмент

Bgl II (5,7 КЬр) и

F/u I I

Два хибридизиращи Д

Η К Фрагмента бяха наблюдавани с Hine д в н н и п с д г: к а з в а т за наличието на един единствен тъканен ген

Фаг зминогенен активаторен ген в човешкия геном, и че този съдържа поне една интервенираща

в) Скрийнинг на библиотека за тъканни плазминогенни активаторни

Стратегият секвенция от човешки ламбаа гени използвана за идентифицирането на ламбда рекомоинанти_ч носещи тъканни плазминогенни активаторни гени се състои в откриване на нуклеотидна хомология с радиоактивна сонда, приготвена от тъканния плазминогенен актибаторна кД Η К от рЕА25Е10. Един милион рекомбинантни ламбда фага бяха посята на Петри с DP 50 Sup F с плътност от cm, и нитроцелулозен р.Филтър беше приготвен с пс метода на Benton and Davis [7В]. По стандарти пр .eq

оа	зови	чифта Нр
ни	от	5' κ р а и
фи	.Λ тър	беше пр
НЙ	триев	Фосфат
н а	ултр	азвуково
р а	зтвог	на Den Ьа;

ибридизиран с 50

F’-мзркирана ДНК сонда беше получена от е

a 11

Rsa I фрагмент локализиращ 34 базови н а п л а з м и д ρ Р А 2 5 Е10 . о хибридизиран при 42 С

Вс ек и нитроцелулозен за ipH 4.5), 5

Д Η К ат rd t !34), 50 о

за минута от процентов

0,05 mq/ml подложен сперма от сьомга.

Формамид и след това маркираната сонда в — 44ъшия разтвор съдържаш.

сулФст £85j . След инкубация о

бяха промит и 4 пъти при 50 от процентов натриев декстраноб о една нощ при 42 С

Филтрите

=.,·

SSC, 0,1 процентов SDS а минути, еднократно в температура ц eg тсва експозирани с Kodak XR-5 рентгенов

Филм с Dupont

Crone усилващ ексан за една нощ

Всичка клона бяха доаити, които бяха хибридизирани със сондата

Фага ДНК беше рекомбинанта

Pvu II клон С беше селектиран за получаването на Фрагмент за

с Pvu

II процентов скрийнинг на колония. 30 mg от ДНК бяха разградени о за 1 час при 37 С, електрофорезирани на 1,0 агарозен гел. 4,2 килоЬр Фрагмент с вече доказано съдържание на секвенции на тъканен плазминогенен активатор

ч. j Z.

беше електроелюиран и пречистен. Сонда с Р маркер беше получена чрез стандартни процедури £s3J за хибридизация на колонии, както е описано по—долз.

6) Скрийнинг на библиотека от колонии за 5’ тъканни плазминогенни активаторни секвенции.

Колониите бяха трансФерирани от петрита и посяти нз нитроцелулозни Филтри, и Д Η К от всяка колония Фиксирана

Hogness (69) марк upана сонда оеше подготвена от телешки тимусен часа,

Филтрите

[S3] 4 kbp Pvu II актибаторен трансформанта

Фрагмент от изолиран ламода геномен клон

Филтри,

X.

χ 1 <3 геномен Pvu II Фрагмент. Хибридизацията беше за ползвайки условията, описани от Frisch et al. £82} бяха екстензивно промити и след това експозирани на рентгенов Филм със Dupont Lightninig intensifying екрани за 16 часа колонии отчетливо а с геномната сонда. Д Η К плазмид беше изолиран от всяка от

Lt беше свързан на нитроцелулозни ··.·» О

Р синтетичен о л. иго н у к л е ο т и д използван за оригинална прайминг pea κ Liu я .

От осемнадесетте клона, седем :ио рид изпраха с

Фрагменти в ml

От сек вени,ионния анализ след сзбклснираните вектор mp ^73^, един клон (рРА17) беше показано съдържа коректния 5' N терминален регион ст тъканен плазминогенен активатор, сигнална водеща секвенция и 94 Ьр

5' нетранслирзн регион □т двата клона рРА25Е10 пълната нуклеотидна секвенция (Фиг. 5) и рестрики,йонната конфигурация (Фиг. 4) на пълна дължина на клон на тъкания плазминогенен активатор бяха детерминирани.

Бактериалният клон Е. coli (рРА17), a също и проба от

Collection и получиха в

No 67586 и 40402 респ

Молекулата на природния тъканен плазминогенен активатор има потенциала да бъде стабилизирана СК17 дисулФидни моста.

омология С дрзги серин протеази

Съществ зват

четири потенциални глик осила U.UOHHLl участъка, три регионите и един потенциален участък региона на asn ,

117 на леката asn , asn

184 218 верига, на може ои

Вариациите 6 структурата на *

са отговорни за различните молекуларни форми олигозахаридните лиганди (65000 и 630ΌΌ

Е.1.3. Дирек тна експресия

Е. coli на кД Η К клон 6 цяла дължима пълната кодиращата секвенция беше рестрикционен ендонзклеазен участък, разделен от двата

0?

Рестрикционен Фрагмент 55

Ьр u3AI-Hha.I, кореспондираш, с а минок ис елини плазмиа pPA17.Sau3AI рестрикционен участък беше локализиран на кодон четири от предполагаемата с-зквенция приложен за да отстрани сигналният оеше също изолиран от плазмид рРА25Е.1О

Два синтетични деоксиолигонуклеотиди което кодоните за аминокиселини 1-4, и н к о р порир а ни на

ATG

стимулираш, термин. Тези к од он (антитимоцитарен глоб.) транслацйонен създаден на

EcoRl свързваш, три Фрагмента бяха след това лигирани заедно с

Ьр Фрагмент кодираш, за аминокиселини 1-110

Този Фрагмент и 1645 bp NarL-Bglll Фрагмент от рРА25Е10 бяха след това лигирани между EcoRl и

Bglll участъци от плазмидът за да даде експресионният плазмид pt

F'AtrplS. Клониоаният т-ПА ген нз

Ьр Фрагмент ot Е. coli транскриоиран под контрола trp оперон, който съдържа trp промотор, оператор the Snine

Delgarno секвенция от trp лидерен пептид, но липсва лидерния пептиден ATG стимулираш, от плазмидът pt-F'Atrp!2 е бил депозиран в

Culture Collection и придоби номер 40404.

С е к в е н и,и о н е н а на л и з

Сек вени,йонният анализ беше базиран на тетраметил

F’olybrene ТМ чаша от Beckman .1.

(поли N, N, N N N -триметиленхексаметиленов диамониев диацетат) беше модифициран със студен уловител и няколко програмни nDOtieHUj за да редуцира

Фоновите пикове. Реагентите бяха

Фенилизотиоцианат и к и:селина .

Селект	ораните
до 2-анилино-5	-тиазол
изсушен под	азот. С
беше прибавена	към 2-
за 10 минути	за да
(ФТХ дериват).	ФТХ -
разтворен в 50	процен

в течен

Всяка Φ Т

Едманови цикли 5я инонови деривати а ръчно конвертирани лороутанът оеше eg това 1,0 N солна киселина анилино-5-тиазолинон и загрети( rc конвертира 6

Фенил-2-тио във вода о до 70 С идантион аминокисединият остатък след това беше зцетонов роматограФ с високо аминокиселина беше сравнение стандартната нитрил и вода и инжектиран налягане, реверсивна Фаза след това идентифицирана ретени,йонните микстара от Φ Τ X бремена на аминокиселини, които бяха въведени в конверсионния Флакон и третирани по същият начин₍

Е.1.К. Анализи за откриване на експресия на тъканен плазминогенен активатор

а) Теория

Чавствителен анализ за тъканен плазминогенен активатор може да бъде получен посредством мониторинг на тъканния плазминогенен активатор катализиращ конверсията от плазминоген до плазмин. Плазминът е ензим* за които съществува субстрат за хроматограФски анализи. Тези анализи се основават на протзолитичното разграждане на трипептид от хромоФсрна група. Степента на разграждане директно зависи както от спецификата, така и от концентрацията на протеазата която = била тествана. Основата на анализът е детерминацията на количеството плазмин,Формиран от инкубацията на тъканния η л a s r 1 la н ο г ο не н активатоо съдържаш, разтвор с разтвос ат

Had-голямо количество плазмин

Плазминът се измеова на вомзтогения (набавен от Kabi Group, Int

С)П п

5) Процедура

Кратно на пробата количество е смесено с 0,10 ml от

0.7 mgs/ml плазминоген (в 0,051’1 Tris ),012 М

инкубира

NaCl) и о

при 37 С допълнен ооем разтвор продължение на 30 за 10 минути, в горния буфер) е добавен, о минути при 37 С (25 μΐ е прибавена центрифугирзт и се

405 пт за да терминирз мл д° о

НС1 ,

pH	7,4
15	ml .
от	S22

съдържащ ч

Сместа се (1,0 mH реакцията продължава в

Ледена оцетна киселина измерва абсорбцията

Количественото определяне на реакцията на дължина активността

Пробите се на вълната се постига посредством сравняването със стандартен урокиназен разтвор.

Активността беше записана в Plough единици, като 90000

Plough единици са еквивалентни на активността показана от 1 mg от пречистен тъканен плазминогенен активатор.

2. Индиректен анализ на плазминова Формация а; Теория

Беше предложен чувствителен анализ на активността на тъканния пламиногенен активатор (87). Анализът се базира на детеоминацията на плазминова Формация, посредством измерването на размера на плазминовото разграждане от Фибрин в агацовз плака, съдържаща Фибрин и плазминоген. Плазминът продуциоа открояваща се зона на лизис във фибриновата плака. Областта на тази зона на лизис може да корелира с количеството на тъканен плазминогенен активатор в пробата.

Слеаваикι

F'iperno и Reich [S?J ο инкубирани 3.5 часа при 37 С поои.еааоата на Granelli

ОЯ зоната н определяне поссеоством сравняването със стандартен

Е.1.Л. Установяване на ак тивността на тъканният ктиватор

Бактериално подготовка

Колония от

1, съдържаща

оеше инокзлирана епр уветка

1П дна нош при

Кратна съотношение pg ampicillin плазмидът

Клетките (pdeltaRIFA ) ml_ от LB бяха оставени част от тази култура оеше

1:100 в часа, и се получи абсорбция на 550 nm от 0,419 до концентрация 30 pg/ml. Клетките бяха инкубирани 90 минути с протичаща абсорбция на 550 nm от 0,628

Клетките бя отделени посредством центрифзгация и реезспендирани в 0.8 съдържаща 0,01 И ЕДТА. Получената сзспенсия беше разбъркана при стайна температура за 18 часа

Ппобзт беше центрифзгиоана и сапернатантът беше анализиран г

отношение на активността на тъканния плазминогенен

2. Установяване на активността

Т а б л и и, а 1 показва на

Е. coli. Генерираната активност от плазминоген.Тази активност не е повлияна от пре-имунен серум от заек, но е инхибирана от а:чтлсбсум. кзйтс е създаден срещу деривати на тъканния пА-.зминогенен активатор от мелзномни клетки. Това демонстрира

-< е :? н. е тI:; а к ти те от Е . col ι π р о д у ци □ а т плазминоген, πов л и я в а щ актс.внсстта. която е инхибирзна от антитела срещу тъканния пл азминогенен а к тив атср.

зя активност. Стандартно количества ат урокиназа бе прибавено в централната редица в концентрации от ляво н □ ясно

Долната редица е от проби от натурален тъканен п л азминогенен всяко гнездо.

плasмино ген е н горната активатор.

Гнездата ак тиватоо, със същото количество от ензима във съдържат, от ляво на дясно, тъканен знти-плазминогенен активатор плюс ктибаторни антитела редица съдържат 8 μΐ от р е к о м б и н а н т н и т ъ к а н н и плазминогенни активаторни екстракти гнездо е само екстракт, във второто серум, и в ак тиватоони въ

Р1ough от Е. coli

Е първото има прибавен преимунен третото има прибавени тъканни плазминогенни антитела

Очевидно е.

че преимунният серум не на натуралния или ак тибатор антитела единици със

Plough единици на рекомоинантния тъканен тък анните плазминогенни и н х и 5 ир а т активността на натурални.

co 1 i

Основавайки се

Това е олагоприятнио стойността^, получена в Таблица I от 1 за ml анализите, извършени по начина описан по-горе в Е.1.К.16

	Т	А Б Л И Ц А 1
Г1ЛАЗМИН0ГЕННА	АКТИВАЦИЯ ЧРЕЗ ЕКСТРАКТИ	ОТ Е. COLI
ОТ КУЛТУРИ,	СЪДЪРЖАЩИ рделтаР1РА
ПРОБА	405	АКТИВНОСТ	ИЗЧИСЛЕНИ Plough
	А	(7.)	ЕДИНИЦИ В ml
Екстракт	0,043	(0)
(без плззминоген)
Екстракт	0,451	(100)	1,3
Екстракт плюс	0,477	106	-
преимунен серум
Екстракт плюс	0,079	9	-
анти т-ПА антитела

Фигура 10 представя резултатите от анализа на проба фибринов слой, извършен с екстракти от 10 L

Ферментационни к ултзри от съдържащи тъканен плазминогенен активаторен експресивен плазмид

Фибринолитичната активност на тъканния плазминогенен активатор, съдържащ екстракт е представена на Фиг.10 (гнездо

А) .

Тази Фибринолитична активност е инхибирана от анти т-ПА

IgG (гнездо С) , но не и от преимунен IgG (гнездо В) или нти урокиназен

IgG (гнездо D) и не се виждат доказателства за активност от екстракта, получен от клетки.

съдържащи като левкоцитен интерФеронов плазмид (гнездо Н)

Е.2 Получаване на т-ПА с помощта на Д

Ф Р протеин с ниска активност на свързване по отношение на

МТХ

Е.2.А Векторна конструкция

Секвенцията кодираща човешки тъканен плазминогенен активатор (т

ПА) е инсертирана в експресивен плазмид, съдържащ мзтантна Д X Ф Р с ниска активност на свързване в компеноинг заявка, U.S

Ser. No. 458151 описана

подадена на	.19 я н
Арр 1 i cation	F'ubl
осъществена	със
Т □ и	Фрз.г:

мент зари 1983, кореспондираща с

No 117060 (отбелязана в

Eurapean Patent библ. справка), следната процедура (виж Фиг. 11):

от отчасти съвпадащите плазмиси □ PA.17 и ptPAtrpl2 (горе) бяха приготвени както сле-ов

Плазмид рРА17 беше разграден със

Dde I на Klenow Д Η К полимераза 1 и срязана с Pst

Беше изолиран, приблизително 200 Ьр Фрагментът, съдържащ терминал

ПА секвенция

Вторият беше получен чрез разграждането на pt-PAtrp!2 с Pst I и Nar

I и изолирайки приблизително 310 Ьр Фрагмент

Фрагмент беше добит чрез разграждането на рРА25Е10 с Nar I и Bel II и изолирайки приблизително 1645 Ьр Фрагмент, които съдържа допълнително повече от т-ПА кодовият регион, няколко 3’ не—транслирани секвенции.

Плазмид антиген (също

Levinson et al рЕ342, който експресира Η В V повърхностен упоменат като pHBs348-E) е бил описан от patent application Ser. No.326980, подадена

на 3 декември

1981 г., сега изоставена, заради продължението на application

Ser. No. 6ύ

528, подадена на 24 април 1988 г кореспондираща к пято упомената справка. (Накратко, ок зс ът на в ир зс Д

SV40 на Simian, оеше изолиран чрез

К с Hindlll конвертирайк и до

EcoRi краища чрез прибавяне на (ASCT8AATTC)

RI линкеоите бяха прибавени

Следвайки разцепване с EcoRi обхващащ локуса, беше изолиран посредством електрофореза и електроелюиране с полиакриламиден гел, и κ

Експресивният плазмид конструиран чрез клониране на Фрагмент·^ 1986

ОТ ?O о

*>·

V (хепатит Б вирус) (Animal

Acad

Fress, N.Y в плазмиди

1980) pML (1981) на участъците

EcoRi , (който (Lusk pBR322, който има делеция, елиминипаща •n инхибитори за плазмидна репликзция в майманскu клетки) беше линеаоизиран с EcoRi, и Фрагментът 348 Ьр, представяйки

локасния регион на

8940, беше въведен в EcoRi участък от pRI-BgI

Лов: усният

Фрагмент може да инсертира в друга ориентация гени могат и двата SV40 промотора късният с добавяне към локуса на репликзция. HBV да оъдат експресцрани под контрол на единия от промотерите, зависещ от тази ориентация (PHBS348-E представяш, HEs експресиран под контрола на ранния промотор) рЕ342 е модифициран чрез частично разцепване с Есо разцепвания участък с използването на

К1enow полимераза I, и лигирайки плазмидния гръо заедно

L_ к а то така отстранява Eco RI участъка,

Полученият плазмид, проектиращ pE342de 1 taR.1 , е разцепен с Eco RI, запълнен с ползването на

След електрофореза подложен на електроелюиране, екстрахиран с преципитиран с етанол акто

Така получениятр342Е 3500 Ьр вектор, както и пс-горе описаните т-ПА фрзгменти включващи приблизително 2160 Ьр бяха лигирани заедно с използването на стандартни техники.

Ί.- -.азмиз . съдържаш трите т - ПА кодиращи Фрагмента β собствената ориентация беше изолиран, охарактеризиран моделиран рЕ342-т-ПА- Този плазмид беше разцепен с Sac II и третиран с бакт. алкална фосфатаза (BRL). За да се постигне секбенцията на Д X Ф ?, приблизително 1700 Ьр Фрагмент беше генериран чрез Sac II рззцепбане от pEHER. (pEHER е плазмид

ек с прес:пра	щ мутант Д X	Ф F, описан	в U.S. Ser. No. 4591	51
(гоозJ.	Τозι. Φρа гмент	беше лигиран в	ρΕ342-τ·	-ПА плазмид	за
да създад	е pETF’AER400,	плазмид, к	οϋτο е	аналогичен	на
pEHEF: ·~	Ц 3 Κ Λ Ю 4 G Н U (5 н а	НЕзАд кодов	регион е	бил премест	е?н
чрез к:Д Н	К секвенции	от т - ПА.
Е.	2.Е Екс пр еси я	и амплифик а ция	на т-ПА	сек венция

рЕТРАЕЕДОО (pETF'ER ; беше трансфектиран в две dhtrDUX Ен 11 к л е τ κ и и

Трансформираните на dhf γTUMuquH. Трансформираните растеж под.··· оаяшс

DHER+ СН0-К1

Sraham and клетки όη дефицитна на

DHFR+ клетки (АТСС CCL.61) клетки

Van der Eb (supra).

глицин, хипоксантин и ◦яха селектирани чоез

Колониите, които израснаха в подбраната среда бяха изолирани с използването на пръс тени и ορопа гир а ни б същата среда за няколко среда държаща 5 тки от '5 ,

*3 , 5 ϊ~· клетка/среда) плътност 6 10 cm п о лучените κ οлони и оя ха изолирани

Е.2.3 Аналитични методи

Експресията на т-ПА в трансфек:тираните амплиФикиозни колонии може конвенционално да бъде анализирана посредством

(

BAD ORIGINAL

К OAOHULl .

150 mm изложени в Е. 1. К. 1. б ( supra )

HS

Д X Ф Р и т-ПА изолиране на Д Η К както следва на 5 ml от

0.4 М СаС1 се отделя, секвенции е от съеоинени съединени монослойно натрита са промити с 50 ml стерилен ^q,BS разтвор)и лизирани чрез прибавянето

SDS

След 5-10 минути, микстурата екстрахира се във Фенол и лороформ и се

преципитира в етанол. Д е ресуспендирана в 1 ml (за 150 mm петри) 10 mM Tris-HCl pH 3, 1 тМ Е

D Т А (ТЕ),

Rnase

добавени до 0,1 mg/ml о при 37 С. SDS след и разтворът се това се добавя до 0 (на Sigma) инк убиране с ъщо с е о

при 37 С, прибавя до 0,5 лороформ, рестрик ционни инкубира 30 минути процент и проназа мг/мл

След

Ιό часа разтворът отново се екстрахира с Фенол последователно и се преципитира с етанол ml вода и разцепен с ензими. Приблизително 5-10 цд от разцепената

ДНК е електрофорезирана в агарозен гел [1 процентна агароза в Тгis-ацетатен буФер (40 MMTris, ImM EDTA, доведена до pH 8,2 оцетна киселина)]; Crouse, et al, J

Biol . Chem

257:7887(1982)).След като бромфенолната синя боя от пътя надолу по гела, и оцветен етаниден визуализирането на

Η К се трансферира от гелът нитр си.ел улозн как то

1975))

Филтрите след това /и белязана тоанслационнз сонда , награбена от

I •4 а ч ен използван псе

ПА 6 съединение конструиран плазмида кодираща див тип

Д X Ф Р.

описана β пример тсв 3 че плазмида pEHER като източник на генна

Φ Ρ про еин оеше заместен с плазмидът описан в копендинг Genentech

Docket No

100/92 U.S. Ser. No.459152,

1983 г сага Pat

Publ

No 117058, упоменат в библиограФската справи

Плазмидът pE342.HBV.E400.D22 е същият като pEHER, c изключение на един единствено различен базов несъвпадение между дивия тип и мутанта Д X полученият плазмид □ETFFR е аналогичен на pETF’ER, c изключение на това , че ДНИ секвенцията, кодирана за дивия е заместена за тази на мутанта

Експресия на т-ПА секвенция pETPFR беше използван, за да трансфектира Д X Ф 9 □еФииитните С клетки (Urlaub and Chasin (supra)), с .f ването на преципитацията със калциев фосфат по метода

Van der Eb

Двадесет и една колонии, които поораснаха (-HGT), бяха подложени на анализ посредством детектиране на плазминови Формации, получаващи се при разграждането съдържаш. Фибрин

Четири и плазминоген, както е описано от Granelli

223 (1978) от най-силно позитивните клонове бяха след ^Г

BAD ORIGINAL 0Δ tots sH3.-.u3LU3aHU количествено за плазминова Формация.ма δ

ΓΊ ксличест5ено детер минир а не е установенс.

лона показа а същата или сравнима т-ПА 6 средата. изразена чое получени посредством чсФериоан инокзлат от два от клоновете в отделни, петрита

l.: ъ д t р; к а ши - Н G Т с р е д

Два от получените субклона, 18В и 1

Г5 я по-на татъшни я анализ

г.

Е. АмплиФикаиия и нива на секреция на т-ПА

Г о р е с π о м е н а т и т е к л о н о в е б я а посяти при - 2 ι::

...I етки в петрита от 100 ml

Μ Т X за да подпомогне а мпл и Ί' и к а и,и я т а . Пр е:к и 6 ел и те к летки, когато бяха анализирани по споменатия по-горе спосоо fl дадоха във всички случаи,около изразяващи активността на тъканния плазминогенен активатор

Два от тези клона, □ яха а по-нататъшна изследване и бяха наименувани

1-15 и 13В-?

По сзбклона 1-15 беше агчплиФициран чрез посетите 2 гЗ петрита от 100 ml, съдържащи 500

Анализът на так а а мплифицираните клетки показа пона собива (от около 3 обхвата) на т-ПА к о г а т о б е ш е и з 6 ъ р ш е н о количествено определяне, според метода нивата бяха в обхвата на 7 х 10 единици/клетка/ден.

част от тези амплифицирани клетки след това беше трансферupана и поддържаше присъствие от 10000 пМ

МТХ ояха π о д□ържа ни за бяха след това тествани, приблизително 1 слео при услобията показани в Таблица bad ORIGINAL др

ТАБЛ И Ц А

КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ	УСЛОВИЯ НА FACTEJK	η д т - П А / к л етк а /	1 ден
ί 1 ν;		500 ιίΙΊ МТХ	28.. 5	х 10	Ί
1-1 5		500 пМ Ι'ΊТХ	26, 0	х 10
50()
1-15	( -HGT	среда, без МТХ	8.3	х 10
500					-3
1-15	( -HGT	среда. без МТХ	18,0	х 10
5 0 0					... *
1 ·· 1 5		10 μΜΜΓΧ	29 ,,3	х 10
10000					••3
1 — 15		10 μΙΊ МТХ	49,0	х 10
18 В--		50 пМ МТХ	14.3	х 10	— J
18В-9		50 п 1’1 МТХ	14,4	х 10	—J
18В-9	( -HGT	среда, без МТХ	14,3	х 10
18В-9	(-HGT	среда, без МТХ	14.4	х 10
.1	(-HGT	среда, без МТХ	1,0	х 10
1	(-HGT	среда, без МТХ	0,7	х 10

* т-ПА 6 клетъчната среда беше анализиран количествено чрез радиои.мчнологичен метод, както следва: Пречистен т-ПА, и пречистен йодоб т-ПА маркер, получени от меланомни клетки, □яха разредени на серии за да включват концентрации от

12.5

400 ng/ml в буферен разтвор, съдържащ, солен буферен

Фосфат, pH серумен албумин, 0,01 процентов Tween 80 и 0,02 процентов

NaN

Към р а д иоа к тив ните ма рк up а ши протеини, за да бъдат анализирани, бяха прибавени подходящи разреждания на просите.

Антигените бяха оставени за инкубация за една нощ при стайна температура в присъствието на 1:10000 разреждане на IgG Фракция от заешки анти т—ПА антисерум. Ксмплексатантиген/антитяло беше преципитиран чрез аисорбция с анти-заешки IgG имуногранули (BioRad) от козел за два часа при стайна температура. Гранилите бяха гтозчистени с прибавянето на солен разредител, центрифугисани о за 10 минути при 2000 д при 4 С. Сапеснатантите бяха изхвърлени и радиоактивността на преципитатите беше измерена. Концентрациите бяха установени чрез сравняване к лона

II к пято клон от оригиналната е змплифициран суоклон а мплифици р а на и нициа лн о група на четирите от клетъчна линия в 50 пМ МТХ за да

ι даде

1-15 и след това трансферирана за по нататъшно който оил в 500 пМ МТХ. 1-15 е

10000 впоследствие а мплифициран субклон на 1-15

500 присъствието на пМ

МТХ

Клетъчна линия 19В-9 е субклон на оригиналната група на четир и.те к лона , която е била вмплифицирана с 50 пМ

МТХ

Пробата с депозирана

American клетъчна линия 1-15

500

Type Culture Collection е оила ползчи входящ, No CRL 9606

Всички от амплиФии.ираните клетки показаха увеличени

нива на секреция на т

ПА много над тези пок азали н е а мг; л и Ф и цираните к алтзр и . Ак о една неамплифицирана култзра ек се тис рд /к леткз/ден, амплиФик. аи.ията представяното изобретение могат да

Ф а ρ м а ι '.е 6 ти ч но при л ож и ми чсвешк. ия ра известните методи за к омпозиции, където тъканен плазминогенен активатор е получаване на продуктът на комбиниран 6 с Фармацевтично приемливо средство

- носител.

Подходящи носители и технологията за тяхното получаване.

г

BAD ORIGINAL οвключване на други човешки протеини, включително и човешки cep умен лоу мин, сз описани например в

Remington's

SCIENCE от

Martin упоменат инкорпорираната библиографска справка

Так ива стр УКТУри ще съдържат количестбо от протеин, заедно подходящо количество от носителя, за да бъдат произведени

Фармацевтично приемливи композиции подходящи за ефективно приложение в клетката хазяин

Например, човешкият тъканен плазминогенен активатор.

може да оъде прилаган параентерално на лица, страдащи от к ардиоваск уларни заболявания

Определянето на дозата и дозирането може да станат паралелно с тези 6 текуща употреба б клиничните изследвания на други кардиоваскуларни препарати тромболитични средства,

т.е. около 440 IU/kg телесно тегло, като интравенозната начална доза е последвана от продължителна интравенозна инфузия от около 440 IU/kg/час за часа, при пациенти, страдащи от пулмонарна емоолия

Катсз пример за подходящо определяне на дозата на есенциалният омогенен човешк и пла зминогенен

ак тиватор при параентерална апликация, флакон, съдържащ

25000 IU активност тъканен плазминогенен активатор, 25 mg и 45 mg NaCI могат да бъдат реконститюирани с 5 стерилна aqua destillata за инжектиране и смесени подходящ

Натриев лорид или процентова Dextrose Injection за интравенозно приложение

3. Подробно описание на рекомбинантна човешка т-ПА

Структурата на частичната реализация на човешкия т-ПА. получена в опитите, описани дотук, е оила подложена на изследване по отношение на някои детайли, осветяване на генната кодова .секвенция, така и чрез техники за анализ на белтъци,.

Тъбоеменнстс са-збисзне за структурата на белтъците охлк)С!Щ1оанс < ![щг. 1.2,

Oiae СоНел и сътр. £88] демонстрираха . че двойно верижният човг-шк и т - ПА е Формиран от протеолитичнстс разграждан? на едновери.-кна молекула б два полипептида. свързани з дисулфидна връзка. Съвременното ниво на познания ни позволява да заключим, че тежката верига (30882 мол.

Т'? Σ“* А Г) ¹ /2я17h е получена от NH терминална част и че мол· теглο) включ в a ССDН - терминална леката верига област. N термин уриран от двуверижна молек: зла , поаскззва

Форма генерирана чрез разцепването на е в и, ·. t н о в а в р ъзк а (Фиг

12;

Първичната структура на частта на тежк ия зер ц жен еч а ·- т ък □ т ч овешк и я т—П А ( Фиг . 12) »

степен на секбенцис-нна хомология с т.н. krinkle региони на п л a .a r I α н е г е н и протромбин £40 и 41]. Krinkle регион се отнася за характеристична триаднз дисулфидна структура, оригинално открита в пра - Фрагмент на протромбин, най-първо описана в детайли от Magnusson et al. (?1. 92]. От първичната секвенция на т-ПА, два т.н. krinkle региони, ст 32 анинс-к ..сс- ’ ими всеки, е очевидна високата степен на : ·: смолегия krinkle региони на плазминоген

М-тер:-«.'.нални 91 аминокиселини, разделят ниска степен на хомологоя с конвенционалния krinkle регион. Обаче някои, може да спекулира. че тази област може също да приема структура, съдъижаща мултипленни дисзлфидни връзки, чато 11 сопъ/.нителни цистеинови остатъци, намерени тук.

Каталитичният участък на леката верига на човешкия

BAD ORIGINAL d

Ίή. така насеченият серин протеазен участък, както б други сеоиноби ензими, е най·-вероятно Формиран чрез хистиаин зспазагин . и сеоин остатъци. Нещо повече, амино киселините секбениии, заобикалящи тези остатъци сз много хомоложни към кореспсндисашите части на драги серинови ое,тъ и,и , к аτο тр ипс ин, протромбин и плазминоген.

Въпреки това. не е направена справка с избрани реализации, следва да се разбира, че настоящето изобретение не се ограничава до тях . а по-скоро представлява обоснован

списък от приложените претенции.

Г JS

BAD ORIGINAL fa

ПР ЕТЕНЦИ И включва експресиране на Д Н

К секвенция

Li о а щ;

чобешки тъканен плазминогенен активатор гостоприемник, като упоменатата рекомоинантна клет>

сстоприемник е микроорганизъм или век тор съдържащ упоменатата Д Η К сек бенция

1, които допълнително вк лючва стъпката упоменатия човешки тъканен

ηл а еми ногенен

Процес според претенция 2 арактеризиращ се с това че

я. летката гостоприемния: е от клетъчна линия от бозайник арактеризиращ се това че клетъчната линия е от яйчник на китайски хамстер

5. Процес според претени.ия арактеризиращ се това че упоменатият микроорганизъм е coli

6. Процес според претенция арактеризиращ се това че упоменатият човешки тъканен плазминогенен активатор има аминокиселинна секвенция 1

527, показана на фиг. 5а,

5Ь и

7. Процес според претени.ия 4, характеризиращ се с това , че упоменатият човешки тъканен плазминогенен активатор ί и н о к и с е л и н н а с е я: б е н цц я 1

527, показана на Фиг. 5а, 5Ь и

8. Пропее за получаване на рекомбинантен човешки тъканен плазминогенен активатор, включващ:

а) растящи рекомбинантни клетки в хранителна среда.

г

BAD ORIGIN^—ο 4 експресивен вектор, съдържащ кодиоаща човешки тъканен плазминогенен б ,| еановременно експресиране на ак тнватор:

упоменатата Д при е получаоа човешки т ънан ен претенция d, характеризиращ се с това че кодира аминокиселинната секвенция

QT ф|_Л претенция 8, арактеризиращ се с това , че coli

Процес според претенция 8, арактеризиращ се с това че упоменатите клетки са от яйчник на китайски хамстер за получаване на рекомбинантен човешки тъканен култура активатор, включващ aj трансформиране на микроорганизъм или □епликиращ вектор, клетъчна съдържащ ДНК кодираща човешки тъка нен плазминогенен

5) кспресиоане на упоменатата ДНК в упоменатия трансформиран микроорганизъм или клетъчна култура

Пооцес според претенция 12, характеризираш, се с това. че упоменат аминокиселинната сек в енция

Фиг

5Ь

Claims (9)

арзктеризиращ се с упоменатите клетки са от Е. coli 15. Процес според претенция 12, арактеризираш, се с това, че упоменатите клетки са от яйчник .* ж ж ж ж Литература I. U.S. Pat No. 3355361.

1/% TLfie

iC

GTTCTGAGCACAGGGCTGGAGAGAAAACCT CTGCGAGGAAAGGGAAGGAGCAAGCCGTGA

-35 -30 net asp ala net lys arq giy 1 eu

ATT TAAG GGACi GCTG TGAAl SCAA TC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC cys cys val leu 1 eu 1 eu cys giy ala val phe val ser pro ser

TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC

-10 1 gin gl u lie his ala erg phe arg arg 9’У ala arg SER TYR GLN

CAS GAA ATC CAT GCC CGA TTC AGA AGA GGA GCC AGA TCT TAC CAA

VAI ILE CYS ARG ASP GLU 10 LYS THR GLN MET ILE TYR GLN GLN HIS

GTG ATC TGC AGA GAT GAA AAA ACG CAG ATG ATA TAC CAG CAA CAT

20 30

GLN SER TRP LEU ARG PRO VAL LEU ARG SER ASN ARG VAL GLU TYR

CAG TCA TGG CTG CGC CCT GTG CTC AGA AGC AAC CGG GTG GAA TAT

CYS TRP CYS ASN SER GLY ARG ALA GLN CYS HIS SER VAL PRO VAL

TGC TGG TGC AAC AGT GGC AGG GCA CAG TGC CAC TCA GTG CCT GTC $0 60

LYS SER CYS SER GLU PRO ARG CYS PHE ASN GLY GLY THR CYS GLN

AAA AGT TGC AGC GAG CCA AGG TGT TTC AAC GGG GGC ACC TGC CAG

GLN ALA LEU TYR PHE SER 70 ASP PHE VAL CYS GLN CYS PRO GLU GLY

CAG GCC CTG TAC TTC TCA GAT TTC GTG TGC CAG TGC CCC GAA GGA

80 90

PHE ALA GLY LYS CYS CYS GLU ILE ASP THR ARG ALA THR CYS TYR

TTT GCT GGG AAG TGC TGT GAA ATA 6AT ACC AGG GCC ACG TGC TAC

100

GLU ASP GLN GLY ILE SER TYR ARG GLY THR TRP SER THR ALA GLU

GAG GAC CAG GGC ATC AGC TAC AGG GGC ACG TGG AGC ACA GCG GAG

110 120

SER GLY ALA GLU CYS THR ASN TRP ASN SER SER ALA LEU ALA GLN

AGT GGC GCC GAG TGC ACC AAC TGG AAC A6C AGC GCG TTG GCC CAG

130

LYS PRO TYR SER GLY ARG ARG PRO ASP ALA ILE ARG LEU GLY LEU

AAG CCC TAC AGC GGG CGG AGG CCA GAC GCC ATC AGG CTG GGC CTG

140 150

GLY ASN HIS ASN TYR CYS ARG ASN PRO ASP ARG ASP SER LYS PRO

GGG AAC CAC AAC TAC TGC AGA AAC CCA GAT CGA GAC TCA AAG CCC

160

TRP CYS TYR VAL PHE LYS ALA GLY LYS TYR SER SER GLU PHE CYS

TGG TGC TAC GTC TTT AAG GCG GGG AAG TAC AGC TCA GAG TTC TGC

170 180

SER THR PRO ALA CYS SER GLU GLY ASN SER ASP CYS TYR PHE GL'.’

AGC ACC CCT GCC TGC TCT GAG GGA AAC AGT GAC TGC TAC TTT GGG

Fig. 5A.

ASN AAT GLY GGG SER TCA ALA GCC TYR TAC ARG CGT 190 GLY GGC THR ACG HIS CAC SER AGC LEU CTC THR ACC GLU GAG SER TCG GLY GGT

ALA 200 SER CYS LEU PRO TRP ASN SER MET ILE LEU 210 ILE GLY LYS VAL

GCC TCC TGC CTC CCG TGG AAT TCC ATG ATC CTG ATA GGC AAG GTT

TYR THR ALA GLN ASN PRO 220 SER ALA GLN ALA LEU GLY LEU GLY LYS

TAC ACA GCA CAG AAC CCC AGT GCC CAG GCA CTG GGC CTG GGC AAA

HIS 230 ASN TYR CYS ARG ASN PRO ASP GLY ASP ALA 240 LYS PRO TRP CYS

CAT AAT TAC TGC CGG AAT CCT GAT GGG GAT GCC AAG CCC TGG TGC

HIS VAL LEU LYS ASN ARG 250 ARG LEU THR TRP GLU TYR CYS ASP VAL

CAC GTG CTG AAG AAC CGC AGG CTG ACG TGG GAG TAC TGT GAT GTG

PRO 260 SER CYS SER THR CYS GLY LEU ARG GLN TYR 270 SER GLN PRO GLN

CCC TCC. • TGC TCC ACC TGC GGC CTG AGA CAG TAC AGC CAG CCT CAG

PHE ARG ILE LYS GLY GLY 280 LEU PHE ALA ASP ILE ALA SER HIS PRO

TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC GCC TCC CAC CCC

TRP 290 GLN ALA ALA ILE PHE ALA LYS HIS ARG ARG 300 SER PRO GLY GLU

TGG CAG •GCT GCC ATC TTT GCC AAG CAC AGG AGG TCG CCC GGA GAG

ARG PHE LEU CYS GLY GLY 310 ILE LEU ILE SER SER CYS TRP ILE LEU

CGG TTC CTG TGC GGG GGC ATA CTC ATC AGC TCC TGC TGG ATT CTC

SER 320 ALA ALA HIS CYS PHE GLN GLU ARG PHE PRO 330 PRO HIS HIS LEU

TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC CTG

THR VAL ILE LEU GLY ARG 340 THR TYR ARG VAL VAL PRO GLY GLU GLU

ACG GTG ATC TTG GGC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG

GLU 350 GLN LYS PHE GLU VAL GLU LYS TYR ILE VAL 360 HIS LYS GLU PHE

GAG CAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC

ASP ASP ASP THR TYR ASP 3 70 ASN ASP ILE ALA LEU LEU GLN LEU LYS

GAT GAT GAC ACT TAC GAC AAT GAC ATT GCG CTG CT6 CAG CTG AAA

SER 380 ASP SER SER ARG CYS ALA GLN GLU SER SER 390 VAL VAL ARG THR

TCG GAT TCG TCC CGC TGT GCC CAG GAG AGC AGC GTG GTC CGC ACT

VAI CYS LEU PRO PRO ALA 400 ASP LEU GLN LEU PRO ASP TRP THR GLU

GTG TGC CTT CCC CCG GCG GAC CTG CAG CTG CCG GAC TGG ACG GAG

CYS 410 GLU LEU SER GLY TYR GLY LYS his GLU ALA 420 LEU SER PRO PHE

TGT GAG CTC TCC GGC TAC GGC AAG CAT GAG GCC TTG TCT CCT TTC

Fig.5B.

TYR TAT SER TCG GLU ARG LEU CTG LYS AAG 430 GLU ALA HIS CAT VAL GTC ARG AGA LEU CTG TYR TAC PRO CCA SER TCC

GAG CGG GAG GCT

SER 440 ARG CYS THR SER GLN HIS LEU LEU ASN ARG 450 THR VAL THR ASP

A6C CGC TGC ACA TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC

ASN MET LEU CYS ALA GLY 4 60 ASP THR ARG SER GLY GLY PRO GLN ALA

AAC ATG CTG TGT 6CT GGA GAC ACT CG6 AGC GGC GGG CCC CAG GCA

ASN 470 LEU HIS ASP ALA CYS GLN GLY ASP SER GLY· 480 GLY PRO LEU VAL

AAC TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG

CYS LEU ASN ASP GLY ARG 4 90 MET THR LEU VAL GLY ILE ILE SER TRP

TGT CTG AAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG

GLY SOO LEU GLY CYS GLY GLN LYS ASP VAL PRO GLY S10 VAL TYR THR LYS

GGC CTG GGC TGT GGA CAG AAG 6AT GTC CCG GGT GTG TAC ACC AAG

VAL THR ASN TYR LEU ASP 5 20 TRP ILE ARG ASP ASN MET ARG 52 7 PRO OP

GTT ACC AAC TAC CTA GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA

CCAGGAACACCCGACTCCTCJUUtKGCAAATGAGATCCCGCCTCTTCTrCTTCAGAAGACA

CTGCAAAGGCGCAGTGCTTCTCTACAGACTTCTCCAGACCCACCACACCGCAGAAGCGGG acgagaccctacaggagagggaagagtgcattttcccagatacttcccattttggaagt TTTCAGGACTTGGTCTGATTTCAGGATACTCTGTCAGATGGGAAGACATGAATGCACACT AGCCTCTCCAGGAATGCCTCCTCCCTGGGCAGAAAGTGGCCATGCCACCCTGTTTTCAGCTA AAGCCCAACCTCCTGACCTGTCACCGTGAGCAGCTTTGGAAACAGGACCACAAAAATGAA AGCXTGTCTCAATAGTAAAAGATAACAAGATCTrTCAGGAAACACGGATTGCATTAGAA ATAGACAGTATATTTATAGTCACAAGAGCCCAGCAGGGCCTCAAAGTTGGGGCAGGCTGGC TGGCCCGTCATGTTCCTCAAAAGCACCCTTGACGTCAAGTCTCCTTCCCCTTTCCCCACT CCCTCWTrCTCAGAAGGTATTCCrmSTCTACAGTGTGTAAAGTGTAAATCCTTTTTCT TTATAAACTTTAGAGTAGGATGAGAGAATTGTATCATTTGAACAACTAGGCTTCAGCATA TTTATAGCAATCCATGTTA<nTrTTACrTTCTGTTGCCACAACCCTGTTTTATACTGTA СТТААТАААТТСАСАТАТЛТТГТТСЛСАСТТТГТССЛЛЛАЛАААААЛЛАЛ

Fig. 5C.

fcoRI ΛσΙ &oRI

g juaAios %

1/%-* i^w —

1 U.S. Pat.

No. 3926727.

• *3 ’

• а * 4 .· «* ф 4 · Ф It Ф*« f

ft · ФФФ !?<*··«·

цое^

ι/% — • —

Id 033 -*

3. U.S. Pat. No. 4029767.

4. U.S. Pat. No. 4258030.

5. U.S. Pat. No. 4271150.

6. European Patent Application Publn. No. 0037687.

7. Rijken, D. C., “Plasminogen Activator from Human Tissue,” Krips Repro Meppel, 1980.

8. U.S. Pat. No. 3555000.

9. U.S. Pat. No. 3998947.

10. U.S. PaL No. 4245051.

II. European Patent Application Publn. No. 0023860.

12. U.S. PaL No. 4083961.

13. U.S. Pat No. 4177262.

14. U.S. Pat No. 4082612.

15. Wallen, Ρ., Proa Serono Symp. 9, 91 (1977).

16. Thorsen, S., et al., Thrombos. Diathes. haemorrh. 28, 65 (1972).

17. Collen, Thrombos. Haemostas. 43, 77 (1980).

18. Wiman et al., Nature 272, 549 (1978).

19. European Patent Application Publn. No. 0041766.

20. Weimar, W., et al., The Lancet VoL II, No. 8254, p. 1018 (1981).

21. British Patent Application Publn. No. 2007676A.

22. Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).

23. Microbiology, 2d Ed., Harper and Row Publications, Inc., Hagerstown, Md. (1973), esp. pp. 1122 et seq.

24. Scientific American 245, 106 (1981).

25. British Patent Application Publn. No. 2055382A.

26. German Offenlegungsschrift No. 2644432.

27. Chang et al., Nature 275, 617 (1978).

28. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977).

29. Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980).

30. European Patent Application Publn. No. 0036776.

31. Siebenlist et al.. Cell 20, 269 (1980).

32. Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979).

33. Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979).

34. Tschumper et aL, Gene 10, 157 (1980).

35. Mortimer et al., Microbiological Reviews 44, 519 (1980).

36. Miozzari et al.. Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).

37. Jones, Genetics 85, 23 (1977).

38. Hitzeman, et al., J. Biol Chem. 255, 12073 (1980).

39. Hess et al., J. Adv. Enzyme Regul 7, 149 (1968).

40. Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978).

41. Bostian et al., Proc. NatL Acad. Sei (USA) 77,4504 (1980).

42. The Molecular Biology of Yeast (A,ug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

43. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975).

44. Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, (1973).

45. Gluzman. Cell 23, 175 (1981).

46. Bolivar et al„ Gene 2, 95 (1977).

47. Lusky et al., Nature 293, 79 (1981).

48. Gluzman et al., Cold Spring Harbor Symp. QuanL Biol. 44, 293 (1980).

49. Fiers et al.. Nature 273, 113 (1978).

50. Reddy et al., Science 200, 494 (1978).

51. Crea et aL, Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980).

52. Goeddel et aL, Nature 287, 411 (1980).

53. Gray et aL, Nature 295, 503 (1982).

54. Opperman et al., Virology 108, 47 (1981).

55. Ward et al., J. Virol. 9, 61 (1972).

56. Aviv et al., Proc. NatL Acad Sci (USA) 69, 1408 (1972).

57. Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743 (1977).

58. Lynch et al., Virology 98, 25! (1979).

59. Lodish. Ann. Rev. of Biochem. 45, 40 (1976).

60. Pelham et al., Eur. J. Biochem. 43, 247 (1974).

61. BlobeL et al., J. Cell Biology 67, 852 (1975).

62. Shields et al., J. BioL Chemistry 253, 3753 (1978).

63. Taemmli, Nature 227, 680 (1970).

64. Bonner et al., Eur. J. Biochem 46, 83 (1974).

65. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979).

66. Wickens et al., J. BioL Chem 253, 2483 (1978).

67. Chang et al., Nature 275, 617 (1978).

68. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977).

69. Grunstein et al., Broc. NatL Acad Sci USA. 72, 3961 (1975).

70. Hanahan et al., Gene 10, 63 (1980).

71. Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).

72. Smith, Methods EnzymoL65, 499 (1980).

73. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).

74. Maxam et al., Methods in EnzymoL 65, 499 (1980).

75. Crea et al„ Broc. NatL Acad Sci 75, 5765 (1978).

76. Lawn et al., Cell 15, 1157 (1978).

77. Southern, J. MoL BioL 98, 503 (1975).

78. Benton et al., Science 196, 180 (1977).

79. McGrath and Levinson, Nature 295, 423 (1982).

80. Blin et aL, Nucleic Add Res. 3, 2303 (1976).

81. Lawn et aL, Science 212, 1159 (1981).

82. Fritsch et al.. Cell 19, 959 (1980).

83. Taylor et al., Blochim Biophys. Acta 442, 324 (1976).

83b. Edman et al., European J. Biochem 1, 80 (1967).

84. Denhardt, Biochem Biophys. Res. Comm 23, 641 (1966).

85. Wahl et aL, Proc. NatL Acad Sci (USA) 76, 3683 (1979).

86. Davis et al.. Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1980).

87. Granelli-Piperno et al., J. Exp. Med. 148, 223 (1978).

88. Rijken et al., J. BioL Chem 256, 7035 (1981).

89. Sottrup-Jensen et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, Raven Press, N.Y. p. 191 (1978)

90. Sothrup-Jensen et al., Broc. NatL Acad Sd. (USA) 72, 2577 (1975).

91. Magnussen et al., Broteolysis and Physiological Regulation. Ribbons et aL, Eds., Academic Press, N.Y., p. 203 (1976).

92. Magnussen et al., Broteases and Biological Control Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y„ p. 123 (1975).

93. Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).

94. Reich, E, Broteases and Biological Control (Ibid) p. 333-341.

95. Matsuo, O., et al., Throrn Haemostasis 45 225 (1981).

96. Koringer, C., et al., Throm Haemostasis 46 561, 662 (1981).

97. Hoylaerts, M., et aL, J. Biol Chem 257 2912 (1982).

98. Koringer, C., et aL, Thromb. Haemostasis 46 685 (1981).

Издание на Патентното ведомство на Република България 1113 София, бул. Д-р Г. М. Димитров 52-Б

Експерт: Ст. Стефанова

Пор. 37288

Тираж: 40 ЗС

Fig. 2.

-18.4

9 S S «

Time (minutes} « Μ M — d d d β

UJUQIZ 33iroqjosqy

в·

pl-f*Aftpl2 ο<

LC

Fig. Ю.

a Δ

A I A A σ *· o

hi 8