BG97604A

BG97604A - Метод за борба с нематоди по растенията

Info

Publication number: BG97604A
Application number: BG97604A
Authority: BG
Inventors: Sarah Gurr; Michael Mcpherson; Howard Atkiinson; Dianna Bowles
Original assignee: Advanced Technologies (Cambridge) Limited
Priority date: 1990-09-10
Filing date: 1993-04-05
Publication date: 1994-03-31
Also published as: DK0548197T3; JPH06503470A; EP0548197A1; HU218896B; ES2118089T3; ATE166923T1; CA2091450C; DE69129540D1; AU691020B2; RU2129373C1; AU8502391A; HU9300681D0; HUT65684A; DE69129540T2; BG60686B1; AU3170895A; WO1992004453A1; EP0548197B1; CA2091450A1; BR9106831A

Abstract

По метода се идентифицира генът, индуциран в растението в резултат на нематодна инфекция, който се модифицира, за да се създаде резистентност към нематоди. 16 претенции

Description

ЖОД ЗА БОРБА С ПАРАЗИТИРАЩА ПО

Изобретението се отнася до борба с паразитиращи по растенията нематоди, по-специално до метод за борба с коренови цис те образувани нематоди. Изобретението се отнася също така до въвеждане на резистс тност по отношение на нематоди в различни видове растения, чувствп:.' елни към коренови цистообразуващи нематоди, например картофи ( Solanum tuberosum) .

Цистообразуващите нематоди (главно Heterodera И Globodera spp) са ключови вредители за много културни растения. Те са причина за директни загуби от добиви, както и за недиректни загуби кси напримвр разходи за пестициди и неоптииалио използване на земята п· сеитбооборота. Картофените цистообразуващи нематоди ( Globodera ros chiensis и Globodera pallida) са КЛЮЧОВИ Вредители При картОЦ

те във Великобритания,	в много други части на Европа и в други pail·
ни където се отглеждат	Картофи. Ileterodera glycines (СОеБИЦИСТООб-
разуващи нематоди) има	икономически ефект при соято който само в (А

може да надхвърли 500 милиона долара годишно. Heterodera schachtii (цвеклови цистообразуващи нематоди) представлява огромен проблем з:

- 2 стопаните на захарно цвекло в Ввропа и САЩ. Hwterodbra avense (житни цистообразуваци нематоди) имат икономическо значение по цялия свят.

Значителни икономически плътности от цистообразуваци нематоди обикновено предизвикват закърняване на културните растения.. Кореновата им система е по-малка от тази на не заразени растения, което се отразява в появяване на симптоми на минерален дефицит в листата и повишен риск от засушаване и псвехване при сухи почвени-условия. Загубите в добива са свързани с плътността нз наличните в растенията цистообразуваци нематоди и при силна, зара за могат да бъдат чувствително над 50 ф при култури като картофи и соя.

Понастоящем борбата се води с химически средства, с културални техники и резистентни видове като всички тези начини могат да се използват интегрирано. Необходими са обаче по-ефективни начини на борба Нематицидите могат да се приемат само за ограничено приложение, не и за широка употреба. Така например алдикарб и продуктите му на разграж дане са високо токсични за топлокръвни организми и замръсяват подпочвените води. В резултат на това, правителствата на няколко щата в САЩ са поставили ограничения при прилагането на този нематоцид. В Холандия се води политика за намаляване прилагането на нематоциди за период от пет години, културалните техники също така не представлявай

ГО ГП ЦЩ ,iQ αΌ като сеитбообсрот крият скрити загуби, които са неприемливи за. селските стопани или тези които разполагат с малко икономически изгодни алтернативни култури.

Резистентност на едно растение към нематоди може да се получи чрез невъзможността на нематода да възпроизвежда един генотип върху видовете гостоприемни растителни видове и доминантни, нантни и рецесивен начин на онаследяване се появява на базата на един до няколко растителни гена₀ Тяхната търговска стойност е обаче ограничена за селскостопанския производител. Така например, при картофите се появяват различни източници на резистентност и създават в

- 3 Европа подраздели от популации, какъвто е случая на единичния доминантен ген Η 1, който придава резистентност срещу G. rostochiensis_f(Ео 1 и Ео 4) но не други форми от този вид (Ео 2, Ео 3 и Ео 5).

Култивариият сорт Марис Пайпер изразява Η 1 и широко се използва във Великобритания срещу б. rostochiensis, но използването му води в определено съотношение до[узеличаване превеса на g. pallida който има възможност ’да се възпроизвежда в присъствие на Н 1. Проблемът, поставен при нарушаващи резистентността патотппове, се появява и при други цистообразуващи нематоди и изтсчниците на резистентност са известни. В някой случай, източниците на резистентност са полигенни, като представляват повече затруднения за селскостопанския производител. В допълнения, резистентността при някой култиварни сор тове е по природа по-скора количествена отколкото качествена и така с времето, при често използване на такива култиварни сортове, може да се появи повишена мултипликатност.

Допирните точки между растението и патогена е местоположение от ключова важност при определяне на чувствителността или резистентност· та към инвазия. При по-раншното определяне на етапите на инвазионниг процес, допирните точки се ограничават до много малък брой растител-

ни клетки на	локалното местоположение на инфекция. По-късно, при от-
ново дибереш	миране на съществуващите растителни клетки, се образува
синцитиум (xi	•югоядрена маса от претоплазма получена в резултат ‘ на
кондензиране	иа клетки),от който се хранят животните. Синцитиумът сс

индуцира от ювенилни форми въз втори стадии развитие след като ct

Емигрирали в корените на гостоприемника, вероятно в резултат на секрецията, освободена от животното в първоначалната клетка от която с храни. Когато растението е чувствително, синцитиумът се увеличава п обем и се поддържа пре^реме на периода нз хранене на нематода. При женски, това може да продължи няколко седмици. Клетъчната биология на синцитиума е добре охарактеризирана.

- 4 Настоящето изобретение търси да открие метод за предаване на ненатодна резистентност в растение, която да бъде универсална срещу цистообразуващи нематоди и има продължителна устойчивост. Изобретението се различава от другите методи, които могат да включват използването на познат резистентен ген вместо използването на гени, които са специфична част от чувствителността към нематодното нападение.

Изобретението може да е свързано с идентифицирането на преди непознати гени експресирани специфично на местоположението на хранене на цистообразуващия нематод и като резултат на прикренрането на нематода„ Идентифицирането ка гените може да се постигне чрез използване на полимеразна верижна реакция (РСЕ). По-рано ограничените клетъчни допирни точки между растението и патогена ограничаваше разбирането на молекулярната биология на допирните точки, освен товаизобретенипзправляване ето се отнася до ново използване на такива гени за ;/трс?.т.:а, при напг дение, освобождаването на вещества, специфично на мястото на хранене, които са токсични както за растителните клетки, така и за нематодите. Специфичното освобождаване на такива вещества дава възможност за използване на съединения, които ако присъстват като съставна част на растението, биха повлияли неблагоприятно на негсвия растеж или биха представлявали неприемлив токсикологичен риск. Серия от такива съединения са вече известни, достъпни са и стандартни биологически техники за тяхното приложение съгласно изобретението.

Съответстващи нематодни специфични гени могат да се демонстрират при многобройни растения и е възможно да се защити всяко културно растение, което има възможност да бъде генетично манипулирано да експресира промотори на характерни гени на местоположението на хранене, които да са свързани с последователност която има способността да нарушава репродуктивната способност на нематодите. Няколко илюстративни, но не ограничаващи примери включват картофи, домати, захарно цвекло и тютюн.

- 5 Известно е, че проявяването на синцитиум е подобно за различни цистообразуващи нематоди. Използването на специфично подреден ген има поради това универсално приложение при всички цистообразуващи нематоди. Те са, без да се ограничава до тях: Giobodera pallida и Giobodera rostochiensis (картофен цистообразуващ нематод) Не(цистообразуващ нематод ПО СОяХНеьегобега shachtii/ ^f terodera g lycine ек ЛОВ ЦИСТООбразуваЩ пеиатод), Hetendera avenae (цистообразуващ нематод пс зърнените култури), Hsterodera огуzae (оризов цистообразуващ нематод) и Giobodera tabacum (тютюне; цистсобразуващ иемзтод).

В настоящето описание терминът ”ген^:? сс отнася до ДЕК пссйедователност ксято включва (и) нагоре nG течението (5*) регулиращи сигнали включително промотера, (2) кодиращ регион специфициращ продукта, протеин или РЕК на гена и (3) надолу пс течението (3’) региони включващи транскрибиращи терминационии и полиаденилационни сигнали (4) асоциирани последователности необходими за продуктивна и специфична експресия.

Терминът ’’прсмотор” се отнася до регион в ДЕК последователност .

ксйтс включва необходимите сигнали за продуктивната експресия на кодиращата последователност. Това може да включва последователности

1' които РЕК полииераза се свързва, се ограничава до такива последователности, и меле да включва r-ιχ v

Г* гп т

J. ·

Съгласно първия аспект на настоящето изобретение, осигурен е метод за борба с нематоди, метод включващ етапите «а идентифициране иа гена^шдуциран в заразеното растение чрез нематодната инфекция н; това растение и модифициране на гена за да предаде нематодна резистентност на растението.

Предпочитаните методи включват идентифициране на гените индуци- 6 рани на местоположението на хранене от нематодната инфекция в растението, като тези гени са характерни за нематодната инфекция.

Предпочитан метод за идентифициране на гените включва следните етапи:

изграждане на сДНК библиотека, при използване на полимеразна верижна реакция (РСЕ), сравняване иа тази библиотека със сДНК на инфектирани и неинфектира ни растения и идентифициране на сДНК клона представляващ ген експресиран на местоположението на хранене и използване на. сДНК клона за изолиране на кореспондиращ геномен клон.

Генът или част от него може да съдържа ДНК последователност състояща се главно от последователност подбрана от групата включваща:

TTGTAGTCTTTTACCTATCGAAG

GCCCAAACTTTCCGGTGTACTCCTTGTGCTTGTTTT

AAAAATTTCTCGCCAAAAAAGGGTTATAACACCGCGATAAAGCTCTTAAATAATG (формула 1) ' GA)

AACATCGGGTCCAAGJ&fGAAAAGGCACGAAGAATGGACAATTTTACCAAAAGCATTT

CCTTAGGCTGATAAAGCATTTTAAAGCGCGATGCTGTTGTTGTTTTGAAGG (формула 2)

GTATCGACGCCTCTGAATAGCACAGAAACAGAGTCTACAAGAAAAGCACACATATTTTTG

CAGTTGGAGAAATAACGAGCCATTGTAATTGNCGGTTCTAAGNETCGAAGCGATCAAAAT

TAAATTAAAGTTAGCAACGG (формула 3)

CATGACGATGGACAAAATCATTGAGGAACTGGATAACACCGNliCGGCTGCCGGGGCTGGC

GAATGTGTGGGTNGCGGCAATTGGTAAGCGTATCGATATGCTGTCAAGCGGGATTAAAA (формула 4)

CAGCATTACACTGGCCCAGGTGCAGTACAGCATGTGGGTGACGITGGAAANAmCCTGGT

ACTTTTCGGAACTATGCACACCGGCTGCTATCAAAGCCTGAAGGCCTGCATA (формула 5)

GTCGCTACCTTTCGGGACGCAATACCGTATTGCTGCGCTTCCAGAGACTCACCTACCGGT

- 7 TTGAATGAC (формула 6)

GCGCCGCGGCACATCGGGGGCTCC-GITC/IOTACGGCTACGGAGGTTGCACAACTTGCGGAC!

GCAAATAAACGCGCAACAACAATCGG (формула 7)

CGTGAGT

CAGTiGbGTSGTATTACAATTGAGTGGGCGTGGTTTTACAACGTGGTCGTGAGT

GGGAAACCC

В КОЯТО означава аденин означава тимин означава гуанин е неопределен нуклеотит

'.i’TTTf' .ЦАШ последователността спечената по-горе или по-иататъг в описаизобретението може да се състои по същество от всяка от горните последователности (формули 1 последователности, представляващи е квив ален тни нукле о т идни полиморфни варианти на тези гени

Съгласно втори аспект на настоящето изобретение, резистентно на нематоди растение съдържа един ген или част от него като гена включва

ДНК последователност състояща се по същество от последователност под брана ст групата включваща:

GCCCAAACTTTCCGGTGTACTGCTTGTCCTTGTTTTTTGTAGTCTTTTAGCTGTCCAAC

AAAAATTTCTCGCCAAAAAAGGGTTATAACACCGCGATAAAGCTCTTAAATAATG (формула 1)

AACATCGGGTGOAAGAGAGGAAAAGGGAGGAAGAATGGAGAATTTTACGAAAAGCATTT

CCTTAGGCTCATAAAGGATTTTAAACCCGGATGCTGTTGT.TGTTTTGAAGG (формула 2)

GTATCGAGGGGTGTGAATAGCACAGAAACAGAGTGTACAAGAAAAGCACACATATTTTTG

CAGTTGGAGAAATAACGAGCCATTGTAATTGUCGGTTaCAAGffiJTCGAAGGGATGAAAAT

CATGAGGATGGACAAAATCATTGAGGAACTGGATAACACCGimCGGCTGCGGGGGCTGGC

GAATGTGTGGGTKGCGCCAATTCGTAACCGTATCGATATGCTCTCAACCGGGATTAAAA (формула 4)

CAGCATTACACTGGCCGAGGTGCAGTACAGCATGTGGGTGACGKGGAAAUAliElTCCTGGT

ACTTTTCGGAACTATGCACACCGGCTATCAAAGCCTGAAGGCCTGCATA

- 8 (формула 5)

GTCGCTACCTTTCGGGACGCAATACCGTATTGCTGCGCTTCCAGAGAGTCACCTACCGCT

TTGAATGAC (формула 6)

GCGCCGCGGCACATCGGGGGCTCGGHGGGTACGGCTACGGAGGTTGCAGAACTTGCGGAC

GCAAATAAACGCGCAACAATCGG (формула 7)

CGTGAGTCAGTNAGTCGTATTACAATTCACTGGUCGTCGTTTTACAACGTCGTCGTGACT

GGGAAACCC	(ф(	зрмула 8)
в която	А	означава	аденин
	С	означава	цитозин
	Т	означава	тимин
	G	означава	гуанин
TJT	Т\Т	е неопределен нукл

Съгласно трети аспект на настоящето изобретение, осигурено е чрез метод от предишен аспект растението резистентност по отношение на коренова цистообразуваца методът може да включва етапите на убиващо растителна клетка която опитва редиференцияция по отношение

lipoLiOTopiia последователност на един генен клон, която е експресираиа в местоположението на хранене, може да се използва за да ироновира следните вещества:

а) токсичен протеин, пептид или ензим като за, ЕЛЕАза или протеиназа

б) мултигенен токсичен синдром, при което например, прошоторът номс ^га експресира протеин или пептид който е неактивен докато се ак

- 9 тивира чрез протеин, произведен от ген свързан с друга промоторна последователност, идентифициран като специфичен за местоположението на хранене. Продуктът на първия ген А кюже да е неактивен докато не се атакува от продукта, на втория ген В за да образува един нов А“, който представлява активен токсин или протеаза. Алтернативно, А може да бъде неактивен без В, така че само А-В молекулите са активни.

с) Антисензитивна РНК, включително един или повече антисензитивни РНК гена, които могат да са еднакви като геннааа последователност съгласно изобретението или с' ^АЖНийични.., гени от местоположението на хранене. По този начин проиоторът може да се ззползва за нада се използва да направлява експерсирането на античувст вителна РНК за общите клетъчни гени, като АТР синтетаза, съществена за жизнеспособността на клетките.

Резистентност по отношение на цистообразуваща нематсда може да се предаде на растение специфично на местоположението на хранене, методът включва етапите на модифициране или трансформиране на растението с промотори до гени от предишния аспект на настоящето изобретение във връзка с ген, чиито продукт има директен летален или изявен сублетален ефект върху нематода след поглъщане (т.е. антинематоден генен продукт). Примери на потенциално приложими гена, които могат да ое използват във връзка с настоящето изобретение са:

а. протеинов тсжсин от Bacillus ihuringiensis (или подобен на него организъм), притежаващ антинематодна активност.

б) ген за нелатодно токсичен протеин в съответствие с патент на Великобритания ie 9104617.7

с) антитело, което нарушава храненето чрез взаимодействие с поемането и храносмилането на храната, каквитосв антителата, описани за цистообразуващ ненатод при соята, включително това срещу дорсалната

- 10 фарингеална жлеза (Atkinson et al. 1988 Annals of'Applied Biology 112, 459 - 4б9), при използването на метода за трансгенна експреси: на антитела в растения, описан от Hiatt, a., Cafferkey,R.c. & Bowdi; 1. (1989 Production of Antibodies in Transgenic Plants,nature 342,7C

7S)

д) протеин или пептид, какъвто е невропептида, който би имал токсичен ефект при хранещи се цистообразуващи нематоди след поемане то на храната.

Трябва да се разбира че нивото на резистентност не трябва да абсолютно. Достатъчно то да бъде на степен на селскостопанската и икономическа целесъобразност за даден вид растение.

Т-

което е локализирано на на хранене на непатода или близко до него. Преодоляна е необходимостта растението да произвел^ анти-нематоден генен продукт (катс например от изброените в третия аспект на изобретението). Това ограничава всякакъв вреден ебект вън ху растението, който би могъл да се появи

Чрез това изобретение могат да се защитят от цистообразуващи нематоди и поради това ст конституционна експрес .шого културни растения могат да се генетично hsn пулират за да експресират промотори на синтициум-характерни гени свързани към последователности, които или разрушават редиберенциреш то иа растителни клетки з$ де образуват синтициуи или експресират анти-нематоден генен продукт в синтициума. Това се отнася до културни растения към които се прикрепят нематоди катс например Globodere pallida и Globodera rostochineneis(KapTCQeii цистообразуващ немат Heterodera glycines (цистообразуващ нематод при соята) , Heterodera shachtii (цве-клсв Ц1;стообразуващ нематод) , Heterodera avenae (цистообразуващ нематод пс житните култури), Heterodera ccrdtae (щл тообразуващи нематоди ПО морковите), Heterodera oryzae (оризов цистообразуващ нематод) и Globodera tabacum (тютюнев цистооб разуващ нематод. Няколко илюстриращи, но не огрзничиващи примери на

- 11 културни растения, които могат да се защитят съгласно настоящето из бретение от цистообразуваци нематоди са картофи, домати, соя, захарно цвекло, маслодайна рапица, пшеница, овес, ечемик, ориз, моркови, зелеви видове и тютюн.

Изобретението е илюстрирано по-нататък с примери, без те да го ограничават.

Първият пример описва методите които се използват за идентифиг ране, охарактеризиране и манипулиране нз картофени гени за да дадат резистентни трансгенни картофени растения.

ПРИШР 1

Този пример илюстрира използването на чувствителен култивзр от карТОфИ КЪМ Globoder-a rostochiensis патогенен тип Eg2, който поз лява идентифициране на гените експресирани на местоположението на хранене на нематода. Секциите 1 до 5 осигуряват елементи за произве ствотс на инфектираната коренова тъкан, нзд-дзлкотс количество ст тъкан осигурява количества co hl· дане нз сдпК библиотека чрез РСЕ начин нз увелн чзвзне (секции 7.1 клетките на хранене се сявзне с сДНК прйи ст

7.5). Позитивните сДНК постига чрез диференциално хибридиззционно с инфектирани и не-еДектирани тъкани (секция клони се анализират чрез ДНК поеДедователнос ти (секция 10) и включванията се използва·:

етапи. Изследване на преходните и спатиални експресии нз гените се извършва чрез анализ на Нортер (секция 8) като се използва обхват растителни тъкани в продължение на инфекцията. По-нататъшно локали· зиране на генната експресия се постига чрез in situ хибридизациошг лзеледвания (секция 12). Геисдни клони, отговарящи на специфичните сДНК клони от клетките на хранене, се изолират от геномна ДНК бнбил тека (секция 11). Промотерите се идентифицират чрез анализ на ДНК последователността (секция 11) за да се развият конструкции подход.

- 12 щи за получаване на трансгенна експресивна нематодна резистентност в картофените растения (секция 13) на мястото на което става хранен; то.

1. Растителни материали

Solanum tuberosum сорт марис Пайпер (шотландски семенни картофи, клас А) се оставят да пуснат израстъци в продължение на 24 де (Haamond-Kossck M.S·, Atkinson H.J·, Bowles D.J., 1990 Changes in abundance of translatable rnKh'A species in potato roots and leaves following root invasion by cyst - nematode Globodera rostochiensis pathotypes Physiol Mol Plant Pathol).

Отделните издънки се изрязват или цялите грудки се използват като растежен материал в сакции.

2о Нематоди

Популация от Globodera rostochiensis патотип Eel и Ео2 цисти се съхраняват като сух материал при 4°C. Цистите се накисват в чеши· на вода в продължение на 7 дни при 4°С. Прибавя се дифузат от карто фени корени (Shepherd А М 1986 In: Southey J_o P.,(ed) Laboratory methods for work with plant and soil nematodes; MAPF reference book 402, 6th edn) и излюпването става след 4-7 дни при стайна температура.

3. Инфекция материал от торбички: Отделни издънки се поддържат в готови торбички (Нортъп-Кинг, минезота). Вуотман SFA хартия се поставя под се 10 икл коренов дифузат в който връх на корен и отгоре се поставя

Ленти с размери 1 см х 0.5 см от всяки връх на издънка. Отпипетира се съдържат 50 червей върху всеки втора хартиена лента от горния т

След 24 часа СРА филтърната хартия се отстранява за да се синхронизира инфекцията след инокулацията. Базата се птрязва и торбичките с промиват с чешмена вода.

материал в саксии: прорасли грудки от картофи се засаждат в

- 13 25 см дълбоки саксии в пръс плюс значителен брой неизлюпени цисти за да се получи популация от 50 яйца на гргм почва.

Шам-инонулирани торбички и саксии се поставят при идентични условия, но без цисти.

4. Условия на растеж

Заразените картофи се поддържат при режим от 18 часа светлина при 22°С и б часа на тъмно при 18° 0.

5. Резултати и анализиране

Тъканта, израсла в торбичките се събира на 4, 7, 15 и 24-ия де след заразяването. Обезцветените, локално инфектирани корени се нарязват директно в пликчета от фолия в течен азот. Коренните тъкани.

непосредствено до мястото на заразата,също се изрязват и се замразяват отделно.

Тъканите израсли в сакциите също се събират 26 дни след инваз^тта. с Ео2. Появилите се женски и цисти се 0 Т 0 Т р 3 г± Я ь т с фина четчиц;

за рисуване локално заразените тъкани се изрязват директно теч<

азот в отделни опаковки от фолия.

6. Изолиране на обща РЕК

Фолиините опаковки внимателно се стриват с пестик за да се по: чи прах ст тъкани който прах се съхранява при -70° С до по-ната.тъш1необходимост от него. Прахообразната тъкан (12 мг) се прехвърля в предварително охладени 20 мллидитрови пластмасови Сарстедт епрувети в течен азот и се прибавя 0.5 мл фенсл/СН^И/изсамилов алкохол (25:24:1) и 0.5 мл НИ буфер (8 k гуапицин хидрохлорид, 20 мм то. (4-морфолино-етанол-сулфонова киселина), 20 мм ХХа^^ЩТА, нагласено ρΗ 7 с натриева основа и 2-меркаптоетанол cs прибавя до 50 нЕ, неш средствено преди употреба). След размразяването на епруветките, ί- Г1 .Ο л ка, Швейцария). Водната фаза се екстрахира три пъти с фенол преди се остави при -20°С една нощ да се утаи. След теза се прибавят 0.2

- 14 обема 1 М оцетна киселина и 0.7 обема студен 96 %-ен етанол» При цев трофугиране в микроцентрофуга с приблизително 13 000 оборота в нинута в продължение на 15 минути се получава РНК, промива се с 400 мкл 3 К натриев ацетатен разтвор (РН 5.5) при 4° С и след това със студ: 70 %-ен етанол и накрая се разтваря в 30 - 50 мкл обработенас $ЕРС вода и се съхранява при -70° С.

7. Конструкция на базирана на РСЕ сДНК библиотека

7.1« сДНК синтеза милиграм обща РНК от картофени корени се събира 26 дни след заразяването с G. rostochiensis патотип Ео2 и се денатурира в прод: жение на 5 минути при 70° С на водна баня и след това бързо се охла:. да върху лед. Тази проба сс прибавя към реакционна смес състояща се от 4 мкл 5 х Ar.iVET буфер (250 мК трис-HCI, pH 8.3, 250 мМ KCI, 50 и. магнезиев хлорид, 5 мм ДДТ, 5 мМ ЕДТА, 50 мкл/мл говежди серумен албумин), 2 мкл Олиго (<4 Τ^γ) (100 мкг/мл), 2 мкл d ΝΤΡ смес (10 мМ от всяки ATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 мкл 10 мМ спермидин хидрохлорл 1 мкл 80 мМ натриев пирофосфат и 125 единици човешки плацентен рибснуклеазен инхибитор (HPEKLI). 10 единици птичи миобластома вирус (А. реверсивна, транскриптаза се прибавят за да се получи краен обем на

Τ' реакционната смес 20 мкл след което се инкубира 1 час при 42 С. Рее цията се приключва като се прибавят 20 мкл 0.1 1й натриев хлорид, 40 мК ЕДТА. Дължината и качеството на продуктите се оценява като се проведе паралелна реакция съдържаща 50 нкС1 от ^²Р-белязан · dCTP (3000 Cl/ммола). Белязаните реакционни продукти се фракционират пре: алкален гел, който след това се авторадиограф-пра. Лс-голямата част белязаните продукти попада в размерите 200 до 2000 Ьр, като ясно се виждат и по-голями продукти.

Олиго dT примера се отстранява чрез селективно утаяване. Към реакционната смес се прибавя 0.5 мкг пели I. поли С (Фармация) и 3

- 15 мкл 10 % (т/о) СТАВ и след това се цетрофугира на шикроцентрофуга при стайна температура в продължение на 20 минути. Течността над утайката внимателно се отстранява и твърдата фаза се суспендира отп во в 14 мкл 1 м натриев хрорид към който се прибавят 25 мкл Н^О и 1 мкл 10 % СТАВ и пробата отново се центрофугира на микроцентрофуга, края утайката се суспендира в 10 мкл 1 й натриев хлорид и се утаява в 2.7 обема етанол в продължение на една нощ при -20°C. Утайката се промива с 70 % етанол и се разтваря в 7 мкл вода. тайлираща реам ция се провежда като към пробата се прибави: 4 мкл 5 х тайлиращ бу? (1 м калиев какодилат, 125 ма трие TCI, pH 7.2), 1 мкл 2 мб ДХГ, 2 мкл 5 мм кобалтов хлорид, 5 мкл 20 м 4Т1? и 25 единици Терминална трансфераза (Бьорингер). лнкубпра се 20 минути при 37° С и след тон се прибавят 4 мкл 100 мм ЕдТА и 2 мкл 1 ш натриев хлорид. Излишъкът от нуклеотиди се отстраняват чрез прибавяне на 1 мкл 10 % (т/о) СТ„ и след това се центрофугира в микроцентрофуга 20 минути при 4° С. Утайката се разтваря в 10 мкл 1ш натриев хлорид преди да се прибави 0.25 мкг глмкоген и 30 мкл студен етанол. Оставя се една нощ да се утаи при -20° С. Утайката се промива в 70 д етанол и се разтваря в 20 мкл 50 м,; натриева основа, 2 мм ЕДТА и се държи при 65 С в прс_:женпе на бо минути за да се хидролизира РНК. сДКК отново се утаяван с етанол, промиват се и утайката се разтваря в 20 мкл вода.

7.2. РСЕ рззработване

PCЕ разработването на хомополимерно тайлирап първи отрязък сд: при използване на аиплпмери:

‘А (олиго 4 T^^-Not I); gcggccgotttttttttttttttt ^ГВ (олиго dC^-ScO Е I); AAGGAATTCCCCCCCOGGCGCC

РСЕ реакцията съдържа 10 мкл 10 х РСЕ буфер (100 мм трие НС1, pH 8.3, 500 ма КС1, 40 Ма магнезиев хлорид, 0.1 % желатин), 10 мкл 10 х d NT? смес (по 5 пш от сЦТР, d СТР, dGTP, d TTP), 100 рме амплимел А, 100 рмола амплимер В, 2 единици Tacj полимераза и 1 олиго (4 о) тайлирани сДНК в общ реакционен обем 20 икл и се наслоява отгоре с 20 мкл минерално масло. След това се подлага на следния термален цикличен режим; 1 цикъл 96° С, 2 минути за денатурране на продуктите; (9б°С, 2 минути, 58°С, 2 минути, 72° С 3 гинути за да се позволи синтезата на втория отрязък, 1 цикъл (9б°С, 2 минути, 40° С 2 минути, 72°С, 2 минути) за да се осигури добро зареждан от олиго (с4 Т) края; 15 цикъла (96°С,

минути) за разработване на продуктите. Реакционната смес се фрак- ционира чрез електрофореза през Нц сито ΘΤΘ Ц.Р (ГмС Биопродъктс) гел при използване на 123 ЬР ДНК стълба катс жаркировач на гслем та и региони на гола отговарящи на размери от класите < 500, 500 д 1500, 1500 до 2000 и >2000 ЬР ^cs изрязват и се отделят от гела чре замразяване при -20^с С, след това се ценрофугира в микроцентрофуга минути в Спин-Х филтри (Костар). РСЕ продуктите се оцветяват със Саутерн и се хибридизират до 3· клона, за които е известно че са кон ституционно експресирани в корените на картофите. сДНК проучванията на дълги и къси, високи и ниски траискрипти, хибрпдизирани до РСЕ продукти отразяват представителството иа различни транскрипти в ои<

ипотеката.

7.3. Строеж на библиотеката

Възстановената ДНК (по-голяма ст 200 Ьр ) се разгражда с ЕсоЕ! и Νοί I и се свързва с по подобен начин разграден lambda-ZAP пред, опаковане in vitro при използване на Стратагеи Рига Плъс опаковки съгласно указанията на производителя. Определя co титъра иа библиот

Е. coliщам Хщ 1-свньо при използване на плочки 1В покр

7.4. Оценяване на библиотеката

Качеството на РСЕ,базирано на cJ|ha библиотека, се оценява по два начина 1) приблизително 96 Д плаки които се доказва че са реком бинати, както е показано чрез вътрешната инактивация на бетя-галакт1

- 17 зидазна алфа-комплементация; 2) плаки подбрани случайно, в РСЕ буфер и разработени при използване на комплементарни М 13 амплимери, . казват отделни вмъквания (включвания) от порядъка на 230 b^D - 1000 t като средния размер на включванията & 470 Ьр»

7.5. Диференциално отсяване

Библиотеката дава 3.5 х Кг рекомбинантни фаги от които 6 х 10 се отсяват с 4СТР-белязани проби, синтезирани като първи отряз сДНК от 10 мкл обща РНК, получена било от инфектирана коренова тъка 26 дни след Ео2 инвазията или от здрави корени на същата възраст (G S.J., McPherson M.J.1991, PCR-based cDHA library construction. In: McPherson M.J., Quirke p., Taylor G.R. (eds). Polymerase chain reaction: A practical approach. IRL Press at Oxford University Press, Oxford). Невключеният изотоп се отстранява чрез утаяване с амон ев ацетат и пробите се жустират за до имат еквивалентно на срм/мкг сДНК/мл хибпидизационна течност след което се преброяват течностно сцинтилационно. Разработването на плаките с^а извършва в повторение и те се денатурират в 0.5 М натриева основа, 1.5 У натриев хлорид и се неутрализират в 1.5, 0.5 У трие pH 7.2 и 1 мМ ЕДТА и се нагряват (80° С, 2 часа), Филтрите се прехибридизират в отделни ’’здрави” и ’’инфектирана” прехибридизационна течност съдържаща 5 X 55₽Е, 6% РЕ6 6000, 0.5 % Марвел (обезмаслено прахообразно мляко), 1 % 5$$ » 0.1 натриев пирофосфат и 250 мкг/мл обработен⁰ с ултразвук и денатуриос на херингова сперма ДНК при 65° С в продължение на .6 часа. Хибридизацията се извършва при 65° С 24 часа след което се прибавя съответ ната радиобелязана проба от 1-вия отрязък. След хибридизиране филп то се промиват последователно в 5 х 55 С, 0.1 % 53>5, след това в 1 35С, 0.1 % при 65° С, за 2 х 20 минути във всяки разтвор. Пе ната се излагат на рентгенов филм, с интензификационно отсяване пр

-70°С. Плаките се хибридизират към Ео 2 дни 26 проба и не съвсем зд вите 26 дневна проба и се пречистват до хомогенност чрез 2 допълни!

- 18 кръга на отсяване на плаките,

8, Нортерн и Саутерн хибридизация и получаване на пробите

РНК заредена 10 мцг на трак се разделя чрез 0.6 М формалдехиден _-ι агарозе'н гел при протичане с 7.5 V см ^х. Гелът се фотографира и рромива 2 х 20 мин в 10 х 55 С и се нанася върху Хайбонд-N мембрана (Амершам) с 10 х S5C. Филтрите се нагряват (80° С, 2 часа) и се пре хибризидират в продължение на 12 часа при 42° С в 50 % формамид, 5 х 5 ЬС, 1 х Денхардс, 100 мг/мл ДНК от сперма на херинг и 250 мМ фосфа тен буфер, (pH 6.5). Хибридизацията се извършва в пресен прехибридизиращ оуфео включително топлинно денатуширан Р-хексаприм-оелязан рР5 К 2-4 проба (25 нг) (Feinberg, А.Р. Зс Vogelstein, В., 1983 Nuc 2229 _Ω leic Acids Research 14,9' .при 42 C в продължение на 24 часа. Филтрит се промиват последователно в 5 х 550 0.1 % 52)5 ^ПР^ 42° С, след тов 2 х SSC 0.1 % при 42° С и накрая една последно промиване при

65°С в 2 х 55С 0.1 % 52)5. Петната се излагат на рентгенов филм, с интензифициращи отсявания пои 70° С. РМЕ 1 включване се получава кат се вземе една единствена пречистена плака в РСЕ буфер и се амплифициоа с компломентарен М13 амплимери съгласно gussow, d. & ciackson, Τα, (1989 Nucleic Acids Research 17, 4000).

Геномна ДНК се'получава от ядра изолирани от млади картофени листа (сорт Марио Пайпер), както е описано от jofuku, к. d. & Goldberg, Ro В. (1989, In Plant Molecular Biologyj A Practical Approach pp 37 - 66)o _

ДНК c високо молекулно тегло се фоакционира по размени през О.е % агарозен гел след което се разгражда с оестоиктиоащи ензими. За анализиране на генната експресия в цялото оястение, РНК се екстрахира от стеблата, от дръжките на листата, от листата, от цветовете и корените на инфектираните и от незаоазените растения. За да се аналг зира реакцията след откъсването (аарязването), корените или листата на растението се надробяват и РНК ое екстрахира от тоетиоаните тъкани в периоди от вре^ме (3, 6, 9 и 12 часа след надробяването). Проби- 19 се сравняват чрез Ноптеснова анализа с РНК, екстпахиоана от корени , оазени с нематоди. Теловете се онечистват, денатуриоат и се нанасят върху ХаЙбОНД-ΙΪ мембрана (Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T (1989 Molecular Cloning: A laboratory manual 2nd edn. Cold Spring Harbour Press). Филтърът се нагрява (80°C, 2 часа) и се ппе хибпидизипа в продължение на б часа ппи 65°С в поохибоидизационна те ност, както е описано no^w диференциалното отсяване на плаки. Описан, са условията на хомогенна, хибридизация и промиване за нортерно блот Филтри. Хетерологусна хибридизация се извършва при 56°С и напълнителите се промиват в 5 х SSC при 5б°С.

9. Изрязване на сБлустриптя от ламбда £АР и пречистване на плазмида рБлустпипт клона РМЕ1, нощесцвключението чиято последователност е показана в една от формулите 1 до 8, се изрязва от позитивно хибръ дизиращия ламбда ZAP клон и се освобождава съгласно указанията в Стрятагеновия наръчник. Плазмидът ДНК се пречиства чпез цезиев хлори ен ПЛЪТНОСТ»0 градиентно центрофугиране (Davis L., Dibner и. D«, ВаЪ J.F. 1986 Basic methods in molecular biology, Elsevier Science Publishers, Few York).

10. Анализ на последователността

Анализът на ДНК последователността се извършва върху алкално де натуриран плазмид ДНК, съгласно методите описани в протоколите на п^пизводителите за сиквеназа (вариант 2.0) реакциите (Юнайтет Оай^с Би к°микъл Корпопейшън). Данните от ДНК последователността се сравняват с базисните данни на EMBL и Генбзнк^дт^я (пилиз 23) при използване на QUICKN програма КОЯТО прилага алгоритмите на Lipman u Pearson (. man d.j.k., Pearson W.R. , 1985 Rapid and sensitive protein similari’ searches, Science 227: 1435 - 1441) протичащи на VAX 11/750 компютор VMs оперираща система.

11. Изолиране на геномния клон

Ламбда EMBL 3 геномна ДНК библиотека се създава като се из· ползва частично EcoEI разградена cv Марио Па^пеп геномна ДНК, съгласно методите описани ОТ Sambrook et al. (1989). ibid.

Библиотеката се отсява чрез покриване приблизително на 1,8 х 10 клона, като се приготвят дубликатни плочести л^г*фт филтри. Те се прелябридизират и след това хибридизипат и промиват по начина, както вече бешек описан в раздел 7.5, с изключение на това, че пробата се получава чрез хекса-прим белязано ДНК включение, РСЕ амплифицирано (Gussow D., Clackson Т., 1939 Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction, Nucleic Acids Research 17 : 10) от сДНК клоните, dW, pPME2 или р^МЕЗ.

Позитивни хибридизационни клона, получени след 3 пунда на хибда· дизационно отсяване, по-нататък се охарактеризират чрез рестрикционен анализ И ДНК посбедователност Sambrook et al., (1989 ibid), 38 A се локализират промоторните последователности.

12. Хибридизация in situ

Тъкани от запазени и незаразени корени се поставят във во съчни, секциониоани, прехибридизирани и след това хибридизирани до сенз и антизенз проби от pP^El, рРМЕ2 и рРОЗ, както е описано от Jackson D., (In Molecular Plant Pathology® A Practical Approach (ed. S. J. Gurr, n. J. McPherson and Do J. Bowles IRL Press, Oxford, 1991

13. Произвеждане и регенериране на трансгенни растения

Трансгенни картофи се получават съгласно иетсдито описани от

Harsh et al. (1985 Science 227,1229-1231) при използването НЗ Agroba terium щам GV 3101, съдържащ pGV 3850, носещ захранващи клетките специфични промотори споени със съответния-разграждащ ген, подбран с тези споменати във въведението на настоящето описание и малките растения се получават преди да се изследват за нематодна резистентност_о

ПРИМЕР 2

Присъствие на еквивалентни гени в други па^лтителни видове

- 21 Гени от един вид оас-тение могат да ^пе екппиепииат в коректен п воеме и пространство начин в друг вид растение, дори когато видовет принадлежат към различни растителни семейства. Благодарение на поде ното по физиология и патология установяване|на синцитиу™ в цивливе н. развитие на цис.тообпазуващите нематоди в растенията от много семейс· ства, генът екопреоипан в синтициума на едно растение, ще се екппре оа коректно и при въвеждането му в различни растителни видове.

Потвържение се получава при идентифициране на еквивалентни ген в други растителни видове. Гуномни ДНК разграждания при тютюн, домати и захарно цвекло се изследват чрез хибридизиране към pPMEl (като се следва метода от оаздел 8). Във всички случай се наблюдава кръст сана хибридизация което показва, че съществуват в тези растения екъ валентни гени. Конструкция, включваща промотора на гена представен чпез dP¥E1 в поради това спесобва, да направлява точното локализиран експоесипане на подходящ анти-нематоден ген в редица културни растения. Тези опити осигуряват пътя за изолиране на еквивалентен ген с други видове Растения за да се експресира анти-нематоден защитен механизъм в тях.

Claims

Патентни претенции

1. Мр.тод за бопба с нематоди, като метода включва етапите, на идентифициране на гена индуциоан в успешно заразеното с нематодна и фекция растение и модифициране на гена за да предаде нематодна рези тентност нн растението.
2. Метод за борба с нематоди, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва етапа на идентифициране на гените xanai. терни с TOua, че се индуцират от нематодната заоаза на местоположен ето на хранене в растението .
3. 'метод за борба с нематоди съгласно претенции 1 или 2, хяра теризиращ се е това, че включва етапите:

- 22 изграждане на сДНК библиотека пои използването' на полимеразна верижна реакция (РСЕ);

сравняване на тази библиотека е сДНК от заразени и незаразени растения и идентифициране на сДНК клона представляващ ген експресиран на местоположението на храненето и използване на сДНК клона за изолиране на съответен геномен клон.
4. Метод за борба с нематоди съгласно всяка от предишните претенции, характеризиращ се с това, че този ген или част от него включва ДНК последователност състояща се по същество от или еквивалентна на някоя от групите включващи:

GCCCAAACTTTCCGGTGTACTCCTTGTCCTTGTTTTTTGTAGTCTTTTACCTATCCAAO

АААААТТТ CTCGCCAAAAAAGGGTTATAACACCGCGATAAAGCT CTTAAATAATG (формула 1)

AACATCGGGTCCAAGAGAGGAAAAGGCACGAAGAATGGACAATTTTACCAAAAGCATTT CCTTAGGCTCATAAAGCATTTTAAACGCGGATGCTGTTGTTGTTTTGAAGG (формула 2)

GTATCCACGCCTCTGAATAGGACAGAAACAGAGTGTACAAGAAAAGCACACATATTTTTG CAGTTGGAGAAATAACGAGCCATTGTAATTGKCGGTTCTAAGEITTCGAAGCGATCAAAAT TAAATTAAAGTTAGCAACGG (формула Ъ)

CATGACGATGGACAAAATCATTGAGGAACTGGATAACACCGIIZICGGCTGCCGGGGCTGGC GAATCTGTGGGTIICCGCCAATTCGTAAOCGTATCGATATGCTCTCAAOCGGCATTAAAA (формула 4)

CAGCATTACACTGGCCCAGGTGCAGTACAGCATGTGGGTGACGITGGAAAHAinnTCCTGGT

АСТТТТ OGGAACTATGCACAOCGGCTGCTATCAAAG C CTGAAGG C CTG CATA (формула 5)

GTCGCTACCTTTCGGGACGCAATACCGTATTGCTGCGCTTCCAGAGAGTCACCTACCGCT

TTGAATGAC (формул- 6)

GCGCCGCGGGACATCGGGGGCTCGGNGGCTACGGCTACGGAGGTTGCACAACTTGCGGAC GCAAATAAACGCGCAACAATCGG (формул^л 7)

- 23 CGTGAGTCAGTNAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTCGTTTTACAACGTCGTCGTGACT

GGGAAACCC (формула 8)

в които А означава аденин С означава цитозин Т означава ТИМИН 6 означава гуанин и 1Ϊ означав⁰ неопределен нуклеотид
5. Метод з° борба c нематоди включващ етапа на съчетаване н° промоторен регион, получен от ген добит по метод от някоя от предишните претенции, с други региони кодио°ни з° продукти н° разграждане в резултат на нападението от нематоди.
6. Метод за борба с нематоди съгласно претенция 5, характеризиращ се е това, че включва етапа на комбиниране на промоторен регион на горния ген с регион, кодиран за средства адаптирани да унищожава клетка, която се залавя да редиференцира към местоположението на лененото.
7. Метод за борба с нематоди съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че средствата адаптирани да унищожат клетк ох подби ни от група включваща:

- ДНКазо, РНКаза или протеиназа, токсичен протеин ил?т токсичен пептид,

- му.^ти-генен токсичен синдром

- нечувствителна РНК към редиференцираните клетки
8« Метод за. борба с нематоди съгласно претенция 5, хорокторизипащ co с това, ч^₽ другите региони кодират продукт притежаващ леталн или добпе проявен; сублетален ефект пр” поемане от нематоди.
9. Метод за бооба с нематоди съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че продукта е подбран от група състояща ос:

- токсичен за нематода протеин

- антитела което действа вредно при поглъщането му от нематода

- 24 - токсичен за немятодите невропептид
10» Резистентно н^я нематоди растение съдържащ ген или модифициран ген получен по метод съгласно всяка от предишните претенции.
11. Метод за борба с нематоди съгласно всяка от предишните претенции, характеризиращ сс с това, че нематодите са цистообпазуващи нематоди.
12. Метод за борба с нематоди съгласно вс^стка от предишните претенции, характеризиращ се с това, че растенията са подбрани от рода Solarium.
13. Метод за борба с нематоди съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че растението е Soianum tuberosum.
14. Резистентно на нематоди Растение характеризиращо се с това, че съдържа модифициран ген създаден от ген включващ ДНК последовател ност, състояща се предимно от последователност подбрана от групата включваща:

GGCCAAAGTTTCCGGTGTACTCCTTGTGCTTGTTTT7TGTAGTCTTTTACCTATCCAAC

AAAAATTTCTCGCCAAAAAAGGGTTATAACACCGCGATAAAGCTCTTAAATAATG (фоо^лц 1)

AACATCGGGTCCAAGAGAGGAAAAGGCACGAAGAATGGACAATTTTA.CCAAAAGCATTT CCTTAGGCTCATAAAGCATTTTAAACOCCGATGCTGTTGTTGTTTTGAAGG (формула 2)

GTATCCACGCCTCTGAATAGCACAGAAACAGAGTCTACAAGAAAAGCACACATATTTTTG

CAGTTGGAGAAATAACGAGCCATTGTAATTGWGGGTTCTAAGNBTCGAAGOGATCAAAAT TAAATTAAAGTTAGCAACGG (формула 3)

CATGACGATGGACAAAATCATTGAGGAACTGGATAACACCGOCGGCTGCCGGGGCTGGC GAATCTGTGGGT1ICCGCCAATTCGTAACCGTATCGATATGCTCTCAACCGGCATTAAAA (формула 4)

CAGGATTACACTGGCCCAGGTGCAGTACAGCATGTGGGTGACGNGGAAAlTAiTK'NCCTGGT agtt.tHOggaactatggacaccggctgctatcaaagcctgaaggcctgcata (формула 5)

- 25 gtcgctacctttcgggacgcaataccgtattggtgcgcttccagagagtcacctaccgct

TTGAATGAC ' (формула 6)

GCGCCGCGGCACATCGGGGGCTCGGNGGCTACGGCTACGGAGGTTGCACAACTTGCGGAC

GCAAATAAACGCGCAACAATCGG (фОР”ула 7)

CGTGAGTCAGTNAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTCGTGACT

GGGAAACCC (формула 8)

които А означава аденин с означава цитозин Т означава тимин означава гуанин

и Ιί означава неопределен нуклеотит
15. Резистентно на нематоди пастение от рода soianum теризипащо се с това, чо съдьпжа генна последователност съгласно пп тенция 14.
16. Използване на растително генен промоторен регион идентифиц пан чпез метода на всяка от претенциите от 1 до 13 или в съответств. с претенция 14 за предаване на резистентност не растението по отнонк ние н~ цистообразуващи нематоди.