BR0017013A2

BR0017013A2 - composição de antibiótico azalìdeo, método para obtenção e uso da mesma

Info

Publication number: BR0017013A2
Application number: BRPI0017013-5A
Authority: BR
Inventors: Wayne Alan Boettner
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2000-11-30
Publication date: 2010-07-13
Also published as: PT1250343E; US6514945B1; DE60003586D1; US20030013860A1; CA2398485A1; JP3893059B2; DE60003586T2; TWI318880B; PA8509801A1; MXPA02007305A; ATE243703T1; TNSN01017A1; WO2001055158A1; DK1250343T3; EP1250343A1; AR030045A1; AR039387A2; NZ518665A; BRPI0017013B1; AU779748C

Abstract

COMPOSIçãO DE ANTIBIóTICO AZALIDEO, METODO PARA OBTENçãO E USO DA MESMA. São descritas composições anti bióticas compreendendo uma mistura de equilíbrio de isómeros azalídeos, água e um ou mais ácidos, e métodos para a preparação de tais composições. As composições antibiáti- cas podem ser vantajosamente estabilizadas por adição de um ou mais co- solventes miscíveis em água. Em uma modalidade preferida, o um ou mais co-solventes é propilenoglicol

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÕES DE ANTIBIÓTICO AZALÍDEO".

Bases da Invenção

Esta invenção refere-se a composições farmacêuticas compre-endendo uma mistura de equilíbrio de isômeros de um composto antibióticoazalídeo e a métodos para a sua preparação. Esta invenção refere-se aindaa formas estabilizadas das composições supramencionadas e a métodos deas estabilizar. Esta invenção refere-se ainda a métodos para o tratamentode um mamífero compreendendo a administração a um mamífero necessita-do do de tal tratamento de uma composição farmacêutica da invenção.

Têm sido divulgados agentes antibióticos macrólidos ativoscontra uma vasta variedade de infecções bacterianas e protozoárias emmamíferos, peixe e aves (ver, por exemplo, as Publicações de Patentes In-ternacionais WO 98/56802 e WO 99/12552). Estes compostos têm geral-mente um anel de lactona macrocíclico de 12 a 22 átomos de carbono aqual estão ligadas uma ou mais porções de açúcar. Os antibióticos macróli-dos atuam na subunidade ribossomal 50S para inibirem a síntese de proteí-nas em microorganismos. Exemplos de antibióticos macrólidos incluem lin-comicina, azitromicina, que é um derivado da eritromicina A, e outros com-postos azaiídeos.

O desenvolvimento de composições farmacêuticas contendocompostos azalídeos como ingrediente ativo tem apresentado desafios si-gnificativos. Alguns azalídeos são capazes de isomerizarem em solução.

Conseqüentemente, a produção de uma composição antibiótica reprodutívelcompreendendo um só isômero ou uma razão fixa de isômeros tem sido difí-cil. Em segundo lugar, uma composição contendo uma quantidade fixa deum isômero azalídeo particular pode variar ao longo do tempo. Em terceirolugar, o anel de lactona e os açúcares de azalídeos são facilmente hidroli-zados mesmo em ambientes de pH moderadamente ácido ou básico, dimi-nuindo a potência e a durabilidade de armazenamento de uma composiçãoantibiótica.

Conseqüentemente, é um objetivo da presente invenção propor-cionar composições antibióticas, e métodos para as preparar, que ultrapas-sem as desvantagens anteriormente mencionadas.

A citação de qualquer referência não deve aqui ser interpretadacomo indicador de que tal referência é técnica prévia à presente invenção.

Sumário da Invenção

Em uma primeira modalidade, a presente invenção refere-se auma composição compreendendo: (a) o composto de fórmula I

e o composto de fórmula II:

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em uma razão de cerca de 90% ± 4% até cerca de 10% ± 4%, respectiva-mente; (b) água; e (c) um ou mais ácidos presentes em uma concentraçãototal desde cerca de 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por ml_ de composição.

A presente invenção refere-se a um método para obtenção deuma composição compreendendo: (a) o composto de fórmula I e o compostode fórmula II em uma razão de cerca de 90% + 4% até cerca de 10% ± 4%,respectivamente; (b) água; e (c) um ou mais ácidos presentes em uma con-centração total desde cerca de 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por ml_ decomposição, compreendendo a etapa de aquecimento até uma temperaturade cerca de 50°C até cerca de 90°C de uma mistura compreendendo: (a) ocomposto de fórmula (I), (b) água, e (c) um ou mais ácidos em uma quanti-dade total variando desde cerca de 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por ml_da mistura. Em uma modalidade preferida, o pH da mistura varia desde cer-ca de 5,0 até cerca de 8,0, e mais preferencialmente, desde cerca de 5,0até cerca de 6,0.

A presente invenção refere-se a um método para o tratamentode uma infecção bacteriana ou protozoária em um mamífero, compreenden-do a administração a um mamífero necessitado de tal tratamento de umaquantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo:(a) o composto de fórmula I e o composto de fórmula II em uma razão decerca de 90% ± 4% até cerca de 10% ± 4%, respectivamente; (b) água; e (c)um ou mais ácidos presentes em uma concentração total desde cerca de 0,2mmol até cerca de 1,0 mmol por ml_ de composição. Em uma modalidadepreferida, o pH da mistura varia desde cerca de 5,0 até cerca de 8,0, e maispreferencialmente, desde cerca de 5,0 até cerca de 6,0. Em uma outra mo-dalidade preferida, a infecção bacteriana ou protozoária é selecionada dogrupo constituído por doença respiratória bovina, doença respiratória suína,pneumonia, coccidiose, anaplasmose e queratinite infecciosa.

A presente invenção refere-se a uma composição compreen-dendo: (a) uma mistura compreendendo: (i) o composto de fórmula (I) e ocomposto de fórmula (II) em uma razão de cerca de 90% ± 4% até cerca de10% ± 4%, respectivamente; (ii) água; e (iii) um ou mais ácidos presentesem uma concentração total desde cerca de 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmolpor ml_ da mistura; e (b) um ou mais co-solventes miscíveis em água pre-sentes em uma quantidade total de desde cerca de 250 até cerca de 750 mgpor ml_ de composição.

A presente invenção refere-se a um método para obtenção deuma composição compreendendo: (a) uma mistura compreendendo: (i) ocomposto de fórmula (I) e o composto de fórmula (II) em uma razão de cercade 90% ± 4% até cerca de 10% ± 4%, respectivamente; (ii) água; e (iii) umou mais ácidos presentes em uma concentração total desde cerca de 0,2mmol até cerca de 1,0 mmol por mL da mistura; e (b) um ou mais co-solventes miscíveis em água presentes em uma quantidade total de desdecerca de 250 até cerca de 750 mg por mL de composição, compreendendoa etapa de adição à mistura de um ou mais co-solventes miscíveis em águaem uma quantidade total de desde cerca de 250 até cerca de 750 mg pormL de composição.

A presente invenção refere-se também a um método para ob-tenção de uma composição compreendendo (a) uma primeira mistura com-preendendo: (i) o composto de fórmula (I) e o composto de fórmula (II) emuma razão de cerca de 90% + 4% até cerca de 10% ± 4%, respectivamente;(ii) água; e (iii) um ou mais ácidos presentes em uma concentração totaldesde cerca de 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por mL da mistura; e (b) umou mais co-solventes miscíveis em água presentes em uma quantidade totalde desde cerca de 250 até cerca de 750 mg por mL de composição, com-preendendo a etapa de aquecimento até uma temperatura de cerca de 50°Caté cerca de 90°C de uma mistura compreendendo o composto de fórmula(I), água e um ou mais ácidos em uma quantidade variando desde cerca de0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por mL da mistura, em que um ou mais co-solventes miscíveis em água são adicionados antes, durante ou após a eta-pa de aquecimento, em uma quantidade desde cerca de 250 até cerca de750 mg por mL de composição.

A presente invenção refere-se a um método para preservaçãoda integridade estrutural do composto de fórmula I ou do composto de fór-mula II compreendendo a etapa de formação de uma composição por adiçãode um ou mais co-solventes miscíveis em água a uma mistura compreen-dendo: (a) o composto de fórmula (I) e o composto de fórmula (II); (b) água;e (c) um ou mais ácidos presentes em uma quantidade total de desde cercade 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por mL da mistura, sendo a quantidadeadicionada de co-solvente miscível em água cerca de 250 até cerca de 750mg por mL de composição.A presente invenção refere-se a um método para o tratamentode uma infecção bacteriana ou protozoária em um mamífero, compreenden-do a administração a um mamífero necessitado de tal tratamento de umaquantidade eficaz de uma composição compreendendo: (a) uma misturacompreendendo: (i) o composto de fórmula (I) e o composto de fórmula (II)em uma razão de cerca de 90% ± 4% até cerca de 10% ± 4%, respectiva-mente; (ii) água; e (iii) um ou mais ácidos presentes em uma concentraçãototal desde cerca de 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por ml_ da mistura; e(b) um ou mais co-solventes miscíveis em água presentes em uma quantida-de total de desde cerca de 250 até cerca de 750 mg por ml_ de composição.

Em uma modalidade das composições da invenção, o um oumais ácidos são selecionados do grupo constituído por ácido acético, ácidobenzenossulfônico, ácido cítrico, ácido bromídrico, ácido clorídrico, ácidoláctico-D e -L, ácido metanossulfônico, ácido fosfórico, ácido succínico, áci-do sulfúrico, ácido tartárico-D e -L, ácido p-toluenossulfônico, ácido adípico,ácido aspártico, áGido-eanforossulfônico, ácido 1,2-etanodissulfônico, ácidolaurilsulfúrico, ácido gluco-heptônico, ácido glucônico, ácido 3-hidróxi-2-naftóico, ácido 1-hidróxi-2-naftóico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácidomálico, ácido múcico, ácido nítrico, ácido naftalenossulfônico, ácido palmíti-co, ácido glucárico-D, ácido esteárico, ácido maléico, ácido malônico, ácidofumárico, ácido benzóico, ácido eólico, ácido etanossulfônico, ácido glu-curônico, ácido glutâmico, ácido hipúrico, ácido lactobiônico, ácido lisínico,ácido mandélico, ácido napadisílico, ácido nicotínico, ácido poligalacturôni-co, ácido salicílico, ácido sulfossalicílico, ácido triptofânico, e misturas dosmesmos.

Em uma modalidade preferida das mesmas, o um ou mais áci-dos é ácido cítrico. Em uma outra modalidade preferida das mesmas, o umou mais ácidos são ácido cítrico e ácido clorídrico. Em uma modalidademais preferida das mesmas, o ácido cítrico está presente em uma quantida-de desde cerca de 0,02 mmol até cerca de 0,3 mmol por ml_ de composiçãoe o ácido clorídrico está presente em uma quantidade suficiente para se al-cançar um pH da composição de cerca de 5 até cerca de 6.Em uma modalidade das composições da invenção, o um oumais co-solventes miscíveis em água são selecionados do grupo constituídopor etanol, isopropanol, éter monometílico de dietilenoglicol, éter butílico dedietilenoglicol, éter monoetílico de dietilenoglicol, éter dibutílico de dietile-noglicol, polietilenoglicol-300, polietilenoglicol-400, propilenoglicol, glicerina,2-pirrolidona, N-metil 2-pirrolidona, glicerol formal, sulfóxido de dimetila, se-becato de dibutila, polisorbato 80, e misturas dos mesmos.

Em uma modalidade das mesmas, o um ou mais co-solventesmiscíveis em água é propilenoglicol. Em uma modalidade preferida dasmesmas, o propilenoglicol está presente em uma quantidade desde cercade 450 até cerca de 550 mg por ml_ de composição.

Em uma modalidade das composições da invenção, a composi-ção compreende ainda um ou mais antioxidantes presentes em uma quanti-dade desde cerca de 0,01 mg até cerca de 10 mg por mL de composição.

Em uma modalidade preferida das mesmas, o um ou mais antioxidantes éselecionado do grupo constituído por bissulfito de sódio, sulfito de sódio,metabissulfito de sódio, tiossulfato de sódio, formaldeído sulfoxilato de só-dio, ácido ascórbico-L, ácido eritórbico, acetilcisteína, cisteína, monotiogli-cerol, ácido tioglicólico, ácido tioláctico, tiouréia, ditiotreitol, ditioeritreitol,glutationa, palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno bu-tilado, ácido nordihidroguaiarético, gaiato de propila, oc-tocoferol, e misturasdos mesmos. Em uma modalidade mais preferida das mesmas, o um oumais antioxidantes é monotioglicerol. Em uma modalidade especialmentepreferida das mesmas, o monotioglicerol está presente em uma quantidadedesde cerca de 4 mg/mL até cerca de 6 mg/mL da composição.

Em uma modalidade das composições da invenção a concentra-ção da primeira mistura (de composto I e composto II) na composição variadesde cerca de 50 mg/mL até cerca de 200 mg/mL. Em uma modalidadepreferida das mesmas, a concentração da primeira mistura na composiçãovaria desde cerca de 90 mg/mL até cerca de 110 mg/mL.

Em uma modalidade especialmente preferida da composiçãodesta invenção, o ácido cítrico está presente em uma quantidade desdecerca de 0,02 mmol até cerca de 0,3 mmol por ml_ de composição e o ácidoclorídrico está presente em uma quantidade suficiente para se alcançar umpH da composição de cerca de 5 até cerca de 6; em que o propilenoglicolestá presente em uma quantidade desde cerca de 450 até cerca de 550 mgpor ml_ de composição; e em que o monotiglicerol está presente em umaquantidade desde cerca de 4 mg/mL até cerca de 6 mg/mL da composição.Esta invenção refere-se também a um composto de fórmula:

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ou a um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

em que R1 é OH ou

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e em que R2 é H ou CH3.

A presente invenção pode ser compreendida mais integralmentepor referência à descrição detalhada e aos exemplos ilustrativos que sepretende que sirvam para exemplificar e não para limitar as modalidades dainvenção.

Descrição Detalhada da Invenção

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Isômero I Isômero IIA presente invenção refere-se a composições farmacêuticascompreendendo isômero I e isômero II (coletivamente os "isômeros azalí-deos") em uma razão de cerca de 90% ± 4% até cerca de 10% ± 4%. Onome químico do isômero I é (2R,3S,4R,5R,8R)10R,11 R,12S,13S,14R)-13-((2,6-dideóxi-3-C-metil-3-0-metil-4-C-((propilamino)-metil)-a-L-ribo-hexopi-ranosil)óxi-2-etil-3,4,10-trihidróxi-3,5,8,10,12,14-hexametil-11 -((3,4,6-trideóxi-3-(dimetilamino)-p-D-xilo-hexopiranosil)óxi)-1-oxa-6-azaciclopentadecan-15-ona. O nome químico do isômero II é (3R,6R,8R,9R,10S,11S,12R)-11-((2,6-dideóxi-3-C-metil-3-0-metil-4-C-((propilamino)-metil-a-L-ribo-hexopiranosil)óxi)-2-((1R,2R)-1,2-dihidróxi-1-metilbutil)-8-hidróxi-3,6,8,10,12-pentametil-9^((3,4,6-trideóxi-3-(dimetilamino)-p-D-xilo-hexopiranosil)óxi)-1-oxa-4-azaciclo-tridecan-13-ona. O isômero I pode ser formado a partir de uma reação detranslactonização do isômero II. Do mesmo modo, o isômero II pode serformado a partir de uma reação de translactonização do isômero I. Métodospara obtenção do isômero I são divulgados na Publicação Internacional n°WO 98/56802, aqui incorporada por referência. Métodos para obtenção doisômero II são revelados no Exemplo 1, abaixo. Os isômeros azalídeos sãoagentes antibióticos ativos. Sem estar limitada por qualquer teoria, a inven-ção baseia-se em parte na surpreendente descoberta dos Requerentes deque uma composição compreendendo o isômero I e o isômero II em umarazão de cerca de 90% ± 4% até cerca de 10% + 4% pode ser rapidamenteobtida utilizando-se os métodos aqui revelados independentemente da ra-zão de partida dos isômeros azalídeos. Embora não estando absolutamentecertos, os Requerentes crêem que a razão de cerca de 90% + 4% até cercade 10% ± 4% de isômero I e isômero II constitui uma mistura de equilíbriodos isômeros azalídeos. Por conseqüência, o termo "mistura de equilíbrio deisômeros" da forma como é aqui utilizado refere-se a uma mistura de isôme-ro I e isômero II em uma razão de cerca de 90% ± 4% até cerca de 10% ±4%, respectivamente. Uma composição antibiótica compreendendo a mistu-ra de equilíbrio de isômeros pode ser produzida consistentemente e propor-ciona um padrão para teste ou para uso do consumidor. Assim, uma composi-ção compreendendo a mistura de equilíbrio de isômeros é altamente desejável.A presente invenção refere-se ainda a um método para prepara-ção de uma composição compreendendo uma mistura de equilíbrio de isô-meros. Em uma modalidade, a mistura de equilíbrio de isômeros é obtida apartir de uma solução de isomero I substancialmente puro. Por "substanci-almente puro", da forma como é aqui utilizado, salvo indicação em contrário,quer-se dizer que tem uma pureza de pelo menos 97%. Em uma outra mo-dalidade, a mistura de equilíbrio de isômeros é obtida a partir de uma solu-ção compreendendo uma mistura de isomero I e isomero II. Em geral, umamistura de equilíbrio de isômeros é gerada por aquecimento de uma soluçãoem água de isomero I, preferencialmente isomero I substancialmente puro,ou uma mistura de isomero I e isomero II, na presença de um ou mais áci-dos. Em uma modalidade preferida, uma solução em água de isomero I eum ou mais ácidos é aquecida até uma temperatura entre cerca de 50°C ecerca de 90°C, preferencialmente cerca de 60°C até cerca de 80°C, durantecerca de 0,5 até cerca de 24 horas, preferencialmente cerca de 1 até cercade 10 horas, a um pH de cerca de 5,0 até cerca de 8,0, preferencialmentecerca de 6,0 até cerca de 8,0. Mais preferencialmente, uma solução de iso-mero I e isomero II é aquecida até uma temperatura entre cerca de 65°C ecerca de 75°C durante cerca de 1 até cerca de 8 horas a um pH de cerca de6,5 até cerca de 7,5 na presença de um ou mais ácidos. A concentração deisomero I ou da mistura de isomero I e isomero II a ser equilibrada pode va-riar desde cerca de 50 mg/mL até cerca de 500 mg/mL, mais preferencial-mente desde cerca de 100 mg/mL até cerca de 300 mg/mL, e o mais preferí-vel desde cerca de 225 mg/mL até cerca de 275 mg/mL de solução.

Ácidos adequados úteis para se obter a mistura de equilíbrio deisômeros incluem, mas não estão limitados a, ácido acético, ácido benze-nossulfônico, ácido cítrico, ácido bromídrico, ácido clorídrico, ácido láctico-De -L, ácido metanossulfônico, ácido fosfórico, ácido succínico, ácido sulfúri-co, ácido tartárico-D e -L, ácido p-toluenossulfônico, ácido adípico, ácidoaspártico, ácido canforossulfônico, ácido 1,2-etanodissulfônico, ácido lau-rilsulfúrico, ácido gluco-heptônico, ácido glucônico, ácido 3-hidróxi-2-naftóico,ácido 1-hidróxi-2-naftóico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácido málico, áci-do múcico, ácido nítrico, ácido naftalenossulfônico, ácido palmítico, ácidoglucárico-D, ácido esteárico, ácido maléico, ácido malônico, ácido fumárico,ácido benzóico, ácido eólico, ácido etanossulfônico, ácido glucurônico, áci-do glutâmico, ácido hipúrico, ácido lactobiônico, ácido lisínico, ácido man-délico, ácido napadisílico, ácido nicotínico, ácido poligalacturônico, ácidosalicílico, ácido sulfossalicílico, ácido triptofânico e misturas dos mesmos.

Preferencialmente, o um ou mais ácidos são ácido cítrico e clorídrico.Quando presente, o ácido cítrico está presente em uma concentração desdecerca de 0,02 mmol até cerca de 0,3 mmol por ml_ de solução. Em uma mo-dalidade, é utilizada uma concentração de ácido de desde cerca de 0,2mmol até cerca de 1,0 mmol por ml_ de solução. Sem estarem ligados porqualquer teoria, os Requerentes crêem que o sal formado da adição de umácido a uma solução de isômero I exerce um efeito tamponante, porque osisômeros azalídeos atuam eles próprios como uma base. Os versados natécnica reconhecerão que a quantidade de ácido requerida para um pH de-sejado variará de acordo com o ácido utilizado, e que, com o fim de semanter um pH dentro da faixa desejada, pode ser adicionado um ácido e/ouuma base adicional à solução de ácido e isômero I, ou mistura de isômero Ie isômero II. Bases adequadas incluem, mas não estão limitadas a, hidróxi-dos e carbonatos de metais alcalinos, bicarbonatos de metais alcalinos, ehidróxidos e carbonatos de metais alcalino-terrosos. Hidróxido de sódio ehidróxido de potássio são preferidos. Os ácidos e bases acima descritos sãoconvenientemente utilizados na forma das suas soluções aquosas.

Composições compreendendo a mistura de equilíbrio de isôme-ros (as "composições equilibradas") são úteis para o tratamento de uma in-fecção bacteriana ou protozoária em um mamífero. As composições equili-bradas são também úteis como intermediárias para a formação de composi-ções estabilizadas, equilibradas.

A presente invenção refere-se ainda a composições estabiliza-das, equilibradas e a métodos de as estabilizar compreendendo a diluiçãode composições equilibradas com um ou mais solventes orgânicos miscíveisem água ("co-solvente"). O co-solvente não afeta significativamente a razãode isômero I e isômero II nas composições equilibradas, e de fato preservaa sua integridade estrutural. "Preservação da integridade estrutural" do isô-mero I ou isômero II da forma como é aqui utilizada, inclui, mas não estálimitada a, retardação da sua taxa de hidrólise para, por exemplo, azalídeode descladinose, e retardação da sua taxa de formação de subproduto de,por exemplo, um produto de inserção de formaldeído e de acetaldeído, defi-nidos abaixo. Sem estarem ligados por qualquer teoria, os Requerentescrêem que a diluição com co-solvente melhora a estabilidade dos isomerosazalídeos. Além disso, devido à presença de co-solvente, qualquer dor ex-perimentada por injeção das composições estabilizadas, equilibradas podeser menor do que a experimentada pela injeção de uma composição equili-brada não tão estabilizada. Co-solventes úteis para estabilização das com-posições equilibradas incluem, mas não estão limitados a, álcoois tais comoetanol e isopropanol; éteres de glicol tais como éter monometílico de dietile-noglicol, éter butílico de dietilenoglicol, éter monoetílico de dietilenoglicol eéter dibutílico de dietilenoglicol;-polietilenoglieóis tais como polietilenoglicol-300 e polietilenoglicol-400; glicóis tais como propilenoglicol ("PG") e gliceri-na; pirrolidonas tais como 2-pirrolidona e N-metil 2-pirrolidona; glicerol for-mal; sulfóxido de dimetila; sebecato de dibutila; ésteres de polioxietilenosorbitan tal como polisorbato 80; e misturas dos mesmos. Preferencialmen-te, co-solventes úteis para estabilização das composições equilibradas emsoluções injetáveis incluem, mas não estão limitados a, etanol, polietileno-glicóis tais como polietilenoglicol-300 e polietilenoglicol-400, glicóis taiscomo propilenoglicol e glicerina, pirrolidonas tais como 2-pirrolidona e N-metil 2-pirrolidona, glicerol formal, sulfóxido de dimetila, ésteres de polioxie-tileno sorbitan tal como polisorbato 80, e misturas dos mesmos, mais prefe-rencialmente, glicerol formal, N-metil 2-pirrolidona e propilenoglicol, e omais preferível, propilenoglicol. Em uma modalidade, é utilizado o co-solvente em uma quantidade de cerca de 250 até cerca de 750 mg por ml_das composições farmacêuticas para as estabilizar. Em uma modalidadepreferida, são utilizadas cerca de 400 até cerca de 600 mg de co-solventepor ml_ das composições farmacêuticas. Em uma modalidade mais preferi-da, são utilizadas cerca de 450 até cerca de 550 mg de co-solvente por mLdas composições farmacêuticas.

Em uma modalidade, são adicionados um ou mais co-solventesao isômero I ou a uma mistura de isômero I e isômero II antes da equilibra-ção. Neste caso, a mistura resultante é aquecida até uma temperatura entrecerca de 50°C até cerca de 90°C, preferencialmente cerca de 60°C até cer-ca de 80°C, durante cerca de 0,5 até cerca de 24 horas, preferencialmentedurante cerca de 1 até cerca de 10 horas, a um pH de cerca de 5,0 até cer-ca de 8,0, preferencialmente a um pH de cerca de 6,0 até cerca de 8,0. Emuma modalidade preferida, o equilíbrio dos isômeros azalídeos é realizadona ausência de co-solvente, o qual é adicionado às composições equilibra-das após terem sido arrefecidas até cerca da temperatura ambiente.

Após adição do co-solvente, o pH da solução resultante podeser novamente ajustado para se melhorar ainda mais a estabilidade dacomposição. O pH é ajustado através de métodos conhecidos dos versadosna técniear tais como por exemplo por adição de uma quantidade de ácidoou base anteriormente descritos, por exemplo, como uma solução armaze-nada a 10% (p/p), e medindo-se o pH da solução resultante utilizando-se,por exemplo, um medidor de pH. Em uma modalidade, o pH da solução re-sultante, se necessário, é ajustado para cerca de 4,5 até cerca de 7,5, pre-ferencialmente cerca de 5,0 até cerca de 6,0, o mais preferível, cerca de 5,2até cerca de 5,6.

A presente invenção refere-se ainda a composições farmacêuti-cas compreendendo uma mistura de equilíbrio de isômeros, água, um oumais ácidos e um ou mais co-solventes miscíveis em água. A quantidade deisômeros azalídeos nas composições farmacêuticas varia desde cerca de 50mg de isômeros azalídeos por mL de composição farmacêutica até cerca de200 mg de isômeros azalídeos por mL de composição farmacêutica. Prefe-rencialmente, as composições farmacêuticas compreendem desde cerca de75 mg até cerca de 150 mg, mais preferencialmente, desde cerca de 90 atécerca de 110 mg, de isômeros azalídeos por mL de composição farmacêuti-ca.As composições farmacêuticas podem ainda compreender umou mais antioxidantes. Os antioxidantes retardam a taxa de ou previnem ocolapso oxidativo das composições farmacêuticas. Antioxidantes adequadosincluem, mas não estão limitados a, bissulfito de sódio, sulfito de sódio,metabissulfito de sódio, tiossulfato de sódio, formaldeído sulfoxilato de só-dio, ácido ascórbico-L, ácido eritórbico, acetilcisteína, cisteína, monotiogli-cerol ("MTG"), ácido tioglicólico, ácido tioláctico, tiouréia, ditiotreitol, ditioe-ritreitol, glutationa, palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolu-eno butilado, ácido nordihidroguaiarético, gaiato de propila, oc-tocoferol emisturas dos mesmos. Os versados na técnica reconhecerão que a quanti-dade de antioxidante variará de acordo com o antioxidante utilizado. Emuma modalidade preferida, o antioxidante, quando presente, está presenteem uma quantidade desde cerca de 0,01 mg até cerca de 10 mg por ml_ decomposição farmacêutica. Em uma modalidade mais preferida, o antioxi-dante é monotioglicerol e está presente em uma quantidade desde cerca de1 mg até cerca de 8 mg por ml_ de composição farmacêutica. Em uma mo-dalidade preferível, o antioxidante é monotioglicerol e está presente em umaquantidade desde cerca de 4 mg até cerca de 6 mg por ml_ de composiçãofarmacêutica.

As composições farmacêuticas compreendem opcionalmente umou mais conservantes. Os conservantes são úteis para retardarem a taxa deou prevenirem a proliferação de microorganismos, particularmente quandoas composições farmacêuticas são expostas ao ar. Conservantes úteis são:eficazes contra um largo espectro de microorganismos; fisicamente, quimi-camente e microbiologicamente estáveis durante o tempo de vida das com-posições farmacêuticas; não tóxicos; adequadamente solúveis; compatíveiscom outros componentes da composição; e aceitáveis com respeito ao pa-ladar e odor. Conservantes adequados incluem, mas não estão limitados a,cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, ácido benzóico, álcool benzí-lico, metilparaben, etilparaben, propilparaben, butilparaben, benzoato desódio, fenol e misturas dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o um oumais conservantes são selecionados do grupo constituído por álcool benzíli-co, metilparaben, propilparaben, uma combinação metilparaben/propilparabene fenol. Quando presentes, o um ou mais conservantes estão presentes emuma quantidade desde cerca de 0,01 até cerca de 10 mg por ml_ das com-posições farmacêuticas. Preferencialmente, o um ou mais conservantes éfenol e está presente em uma quantidade desde cerca de 2,0 até cerca de5,0 mg por ml_, mais preferencialmente, desde cerca de 2,0 até cerca de 3,0mg por ml_, das composições farmacêuticas. Um versado na técnica reco-nhecerá que a quantidade de conservante a ser utilizada nas presentescomposições dependerá do conservante escolhido, e que alguns conservantespodem ser utilizados a concentrações menores, até mesmo menores do quecerca de 0,01 mg por ml_ das composições farmacêuticas.

Em uma modalidade preferida, as composições farmacêuticasda invenção têm um pH desde cerca de 5,0 até cerca de 7,0 e compreen-dem: (1) uma mistura de equilíbrio de isômeros presente em uma quantida-de desde cerca de 50 mg até cerca de 200 mg por mL de composição far-macêutica; (2) ácido cítrico presente em uma concentração desde cerca de0,02 mmol até cerca de 0,3 mmol por mL de composição farmacêutica e,opcionalmente, uma quantidade de ácido clorídrico eficaz para se alcançara faixa de pH; (3) propilenoglicol, presente em uma quantidade desde cercade 250 até cerca de 750 mg por mL de composição farmacêutica; (4) mono-tioglicerol, presente em uma quantidade desde cerca de 1 mg até cerca de15 mg por mL de composição farmacêutica; e (5) água, presente em umaquantidade desde cerca de 100 até cerca de 750 mg por mL de composiçãofarmacêutica.

Em uma modalidade mais preferida, as composições farmacêu-ticas da invenção têm um pH desde cerca de 5,0 até cerca de 6,0 e compre-endem: (1) uma mistura de equilíbrio de isômeros presente em uma quanti-dade desde cerca de 75 mg até cerca de 150 mg por mL de composiçãofarmacêutica; (2) ácido cítrico presente em uma quantidade desde cerca de0,05 mmol até cerca de 0,15 mmol por mL de composição farmacêutica e,opcionalmente, uma quantidade de ácido clorídrico eficaz para se alcançara faixa de pH; (3) propilenoglicol, presente em uma quantidade desde cercade 400 até cerca de 600 mg por ml_ de composição farmacêutica; (4) mono-tioglicerol, presente em uma quantidade desde cerca de 1 mg até cerca de 8mg por ml_ de composição farmacêutica; e (5) água, presente em umaquantidade desde cerca de 250 até cerca de 550 mg por ml_ de composiçãofarmacêutica.

Em uma modalidade preferida, as composições farmacêuticasda invenção têm um pH desde cerca de 5,2 até cerca de 5,6 e compreen-dem: (1) uma mistura de equilíbrio de isômeros presente em uma quantida-de desde cerca de 90 mg até cerca de 110 mg por ml_ de composição far-macêutica; (2) ácido cítrico presente em uma quantidade desde cerca de0,075 mmol até cerca de 0,125 mmol por ml_ de composição farmacêutica, euma quantidade de ácido clorídrico eficaz para se alcançar a faixa de pH;(3) propilenoglicol, presente em uma quantidade desde cerca de 450 atécerca de 550 mg por ml_ de composição farmacêutica; (4) monotioglicerol,presente em uma quantidade desde cerca de 4 mg até cerca de 6 mg pormL de composição farmacêutica; e (5) água, presente em uma quantidadedesde cerca de 300 até cerca de 500 mg por mL de composição farmacêutica.

As composições farmacêuticas podem ser preparadas da formaque se segue. Os reagentes são adicionados em um vaso encamisado comrevestimento de aço inoxidável ou de vidro com cobertura de nitrogênio op-cional. É adicionada Água para Injeção ao vaso reacional e começa-se aagitação. Cada componente adicional é adicionado enquanto a mistura écontinuamente agitada. É adicionado ácido em uma concentração de cercade 0,02 mmol até cerca de 0,5 mmol por mL de água e deixa-se dissolver. Éopcionalmente adicionada uma solução aquosa de um ácido, por exemplo,uma solução aquosa a 10% (p/p) de ácido clorídrico, para se ajustar o pHpara uma faixa desejada e mistura-se a solução. Nesta altura, adiciona-selentamente o isômero I, ou uma mistura de isômero I e isômero II, à misturade água e ácido e em pequenas quantidades para se evitar o amontoar.

Deixa-se o isômero I, ou uma mistura de isômero I e isômero II, dissolver-see mede-se o pH da solução resultante. Em uma modalidade, a concentraçãode isômero I ou da mistura de isômero I e isômero II é desde cerca de 50 mgaté cerca de 500 mg por mL, preferencialmente desde cerca de 100 mg atécerca de 300 mg por mL, e o mais preferível desde cerca de 225 até cercade 275 mg por mL, da solução resultante. A solução é em seguida aquecidaaté uma temperatura de cerca de 70°C ± 10°C e é mantida a esta tempera-tura até se obter uma mistura de equilíbrio de isômeros. Métodos para adeterminação de ter sido obtida uma mistura de equilíbrio de isômeros in-cluem cromatografia gel, cromatografia em camada fina e cromatografia lí-quida de elevado desempenho. Geralmente, utilizando-se as condições aquidescritas, obtém-se uma mistura de equilíbrio de isômeros em aproximada-mente 1 até cerca de 8 horas. Uma vez a mistura de equilíbrio de isômerosobtida, a solução resultante é resfriada até cerca de 25°C ± 10°C. Esta so-lução pode ser utilizada como uma composição farmacêutica. Preferencial-mente, é adicionado co-solvente em uma quantidade desde cerca de 250até cerca de 750 mg por mL de composição farmacêutica. É opcionalmenteadicionado antioxidante em uma quantidade desde cerca de 0,01 mg atécerca de 10 mg por mL de composição farmacêutica. Se presente, o conser-vante é adicionado em uma quantidade desde cerca de 0,01 mg até cercade 10 mg por mL de composição farmacêutica, e o pH é ajustado para cercade 5,0 até cerca de 8,0, preferencialmente para cerca de 5,0 até cerca de6,0, por adição de ácido e/ou base, por exemplo, como uma solução aquosaa 10% (p/p) ou em forma sólida. A mistura resultante é diluída para um vo-lume desejado. Em uma modalidade, a concentração final da mistura deequilíbrio de isômeros é cerca de 50 mg até cerca de 200 mg, preferencial-mente cerca de 75 mg até cerca de 150 mg, e o mais preferível cerca de 90mg até cerca de 110 mg por mL de composição farmacêutica resultante.

As composições resultantes são preferencialmente esterilizadas,por exemplo, passando-se as composições através de um pré-filtro, porexemplo, um filtro de 5-10 mícrons e em seguida através de um filtro de es-terilização final de 0,2 mícron que tenha sido previamente esterilizado. Ofiltro de esterilização é esterilizado por autoclavagem com calor úmido du-rante 60 minutos a 121°C, e é testado quanto a sua integridade utilizando-se um método em que se mantém a pressão antes de esterilização e após afiltração do produto. A solução estéril é adicionada a recipientes adequados,por exemplo, frascos de vidro, que são esterilizados e depirogenados a250°C durante 240 minutos em um túnel de calor seco. O espaço no topo dorecipiente é limpo com um gás inerte, por exemplo, árgon ou preferencial-mente, nitrogênio. Os recipientes são encapsulados com tampas que sãodepirogenadas por lavagem e esterilizadas por autoclavagem com calorúmido durante 60 minutos a 121°C. Os recipientes são em seguida selados.Os versados na técnica reconhecerão que podem ser utilizadas modifica-ções menores às anteriores para se prepararem composições estéreis.

A presente invenção refere-se ainda a métodos para o trata-mento de um mamífero, compreendendo a administração a um mamíferonecessitado de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficazde uma composição farmacêutica da invenção. As composições farmacêuti-cas da invenção podem ser utilizadas para o tratamento de infecções porbactérias gram-positivas, bactérias gram-negativas, protozoários e mico-- plasma, incluindo^ mas não estando limitadas a, espécies Actinobacilluspleuropneumonia, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, H. para-suis, B. bronchiseptica, S. choleraesuis, S. pilo, Moraxella bovis, H. somnus,M. bovis, Eimeria zuernii, Eimeria bovis, A. marginale, M. hyopneumoniae,Lawsonia intracellularis, e espécies staphylococcus, salmonella, chlamydia,coccidia, cryptosporidia, E. coli, haemophilus, neospora e streptococcus.

O termo "tratamento", da forma como é aqui utilizado, salvo indi-cação em contrário, inclui o tratamento ou prevenção de uma infecção bac-teriana ou de uma infecção protozoária conforme estabelecido no métododa presente invenção.

Da forma como são aqui utilizados, salvo indicação em contrá-rio, os termos "infecção(ções) bacteriana(s)" e "infecção(ões) protozoária(s)"incluem infecções bacterianas e infecções protozoárias que ocorrem emmamíferos, peixes e aves bem como distúrbios relacionados com infecçõesbacterianas e infecções protozoárias que possam ser tratadas ou preveni-das por administração de antibióticos tais como os compostos da presenteinvenção. Tais infecções bacterianas e infecções protozoárias, e distúrbiosrelacionados com tais infecções, incluem as seguintes: pneumonia, otitemédia, sinusite, bronquite, tonsilite e mastoidite relacionadas com infecçãopor Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catar-rhalis, Staphlococcus aureus ou Peptostreptococcus spp.; faringite, febrereumática e glomérulo-nefrite relacionadas com infecção por Streptococcuspyogenes, estreptococos dos Grupos CeG, Clostridium diptheriae ou Acti-nobaciWus haemolyticum; infecções do trato respiratório relacionadas cominfecção por Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Strepto-coccus pneumoniae, Haemophilus influenzae ou Chlamydia pneumoniae;infecções não complicadas da pele e de tecido mole, abcessos e osteomie-lite, e febre puerperal relacionadas com infecção por Staphylococcus au-reus, estafilococos positivos à coagulase (isto é, S. epidermidis, S. hemolyti-cus, etc), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, grupos es-treptocócicos C-F (estreptococos colônia-minuto), estreptococos viridans,

Corynebacterium minutissimum, Clostridium spp. ou Bartonella henselae;infecções agudas não complicadas do trato urinário relacionadas com infec-ção por Staphylococcus saprophyticus ou Enterococcus spp.; uretrite e cer-vicite; e doenças transmitidas sexualmente relacionadas com infecção porChlamydia trachomatis, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, Urea-plasma urealyticum ou Neiserria gonorrheae; doenças de toxinas relaciona-das com infecção por S. aureus (intoxicação alimentar e síndrome de cho-que Tóxico), ou estreptococos dos Grupos A, B e C; úlceras relacionadascom infecção por Helicobacter pylori; síndromes febris sistêmicos relaciona-dos com infecção por Borrelia recurrentis; doença de Lyme relacionada cominfecção por Borrelia burgdorferi; conjuntivite, ceratite e dacrocistite relacio-nadas com infecção por Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, S.aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae ou Listeria spp.; doençadisseminada provocada pelo complexo Mycobacterium avium (MAC) relaci-onada com infecção por Mycobacterium avium ou Mycobacterium intrace-llulare; gastroenterite relacionada com infecção por Campylobacter jejuni;protozoários intestinais relacionados com infecção por Cryptosporidiumspp.; infecção odontogênica relacionada com infecção por estreptococosviridans; tosse persistente relacionada com infecção por Bordetella pertus-sis; gangrena gasosa relacionada com infecção por Clostridium perfringensou Bacteroides spp.; e aterosclerose relacionada com infecção por Helico-bacter pylori ou Chlamydia pneumoniae. Infecções bacterianas e infecçõesprotozoárias e distúrbios relacionados com tais infecções que podem sertratados ou prevenidos em animais incluem os seguintes: doença respirató-ria bovina relacionada com infecção por P. haem., P. multocida, Mycoplas-ma bovis ou Bordetella spp.; doença entérica da vaca relacionada com in-fecção por E. coli ou protozoários (isto é, coccidia, cryptosporidia, etc);mastite de vacas leiteiras relacionada com infecção por Staph. aureus,Strep. uberis, Strep. agalactiae, Strep. dysgalactiae, Klebsiella spp., Coryne-bacterium ou Enterococcus spp.; doença respiratória suína relacionada cominfecção por A. pleuro., P. multocida ou Mycoplasma spp.; doença entéricasuína relacionada com infecção por E. coli, Lawsonia intracellularis, Salmo-nella ou Serpulina hyodyisinteriae; peeira da vaca relacionada com infecçãopor Fusobacterium spp.; met-rite-da vaca relacionada com infecção por E.coli; decomposição do pé das vacas relacionadas com infecção por Fuso-bacterium necrophorum ou Bacteroides nodosus; conjuntivite aguda epidê-mica da vaca relacionado com infecção por Moraxella bovis; aborto prematu-ro da vaca relacionado com infecção por protozoários (isto é neosporium);infecção do trato urinário em cães e gatos relacionada com infecção por E.coli; infecções da pele e de tecido mole em cães e gatos relacionadas cominfecção por Staph. epidermidis, Staph. intermedius, coagulase neg. Staph.ou P. multocida; e infecções dentárias ou da boca em cães e gatos relacio-nadas com infecção por Alcaligenes spp., Bacteroides spp., Clostridium spp.,Enterobacter spp., Eubacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas ouPrevotella. Outras infecções bacterianas e infecções protozoárias e distúrbi-os relacionados com tais infecções que podem ser tratados ou prevenidosde acordo com o método da presente invenção são referidos em J. P. San-ford et ai, "The Sanford Guide To Antimicrobial Therapy", 26- Edição, (An-timicrobial Therapy, Inc., 1996).

A atividade antibacteriana e antiprotozoária dos compostos dapresente invenção contra agentes patogênicos bacterianos e protozoários édemonstrada pela capacidade dos compostos para inibirem o crescimentode cepas definidas de agentes patogênicos humanos ou animais.

Ensaio I

O Ensaio I, abaixo descrito, emprega metodologia e critérios deinterpretação convencionais e é planeado para proporcionar direção paramodificações químicas que possam conduzir a compostos que envolvam osmecanismos definidos de resistência a macrólido. No Ensaio I, é montadoum painel de cepas bacterianas para incluir uma variedade de espéciespatogênicas alvo, incluindo representativas de mecanismos de resistência amacrólido que têm sido caracterizadas. A utilização deste painel permite adeterminação da relação estrutura química/atividade relativamente à potên-cia, espectro de atividade e elementos ou modificações estruturais que pos-sam ser necessários para se obviarem os mecanismos de resistência. Osagentes patogênicos bacterianos que compreendem o painel de rastreioestão ilustrados na tabela abaixo. Em muitos casos, estão disponíveis acepa mãe susceptível de macrólido e a cepa resistente a macrólido derivadadaquela para se proporcionar uma avaliação mais precisa da capacidadedos compostos para envolverem o mecanismo de resistência. Cepas quecontenham o gene com a designação de ermA/ermB/ermC são resistentes aantibióticos macrólidos, lincosamidas e estreptogramina B devido a modifi-cações (metilação) de moléculas 23S rRNA por uma metilase Erm, preve-nindo assim geralmente a ligação de todas as três classes estruturais. Têmsido descritos dois tipos de efluxo de macrólido; msrA codifica um compo-nente de um sistema de efluxo em estafilococos que previne a entrada demacrólidos e estreptograminas enquanto mefA/E codifica uma proteína detransmembrana que parece efluir apenas macrólidos. A desativação de an-tibióticos macrólidos pode ocorrer e pode ser mediada quer por uma fosfo-rilação do 2N-hidroxila (mph), quer por clivagem da lactona macrocíclica(estearase). As cepas podem ser caracterizadas utilizando-se a tecnologiade reação de cadeia de polimerase convencional (PCR) e/ou por análise deseqüência da resistência determinante. O uso da tecnologia PCR nestaaplicação é descrito em J. Sutcliffe et a/., "Detection Of Erythromycin-Resistant Determinants By PCR", Antimicrobial Agents and Chemotherapy,40(11), 2562-2566 (1996). O ensaio é realizado em placas de microtitulaçãoe é interpretado em conformidade com Perfomance Standards for Antimicro-bial Disk Susceptibility Tests - Sexta Edição; Padrão Aprovado, publicadopelos princípios orientadores de The National Committee for Clinicai Labo-ratory Standards (NCCLS); a concentração inibitória mínima (MIC) é utiliza-da para se compararem cepas. A mistura de equilíbrio de isômeros azalí-deos é inicialmente dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO) como uma solu-ção de reserva a 40 mg/ml.

<table>table see original document page 22</column></row><table>O Ensaio II é utilizado para se testar a atividade contra Pasteu-rella multocida e o Ensaio III é utilizado para se testar a atividade contraPasteurella haemolytica.

Ensaio II

Este ensaio é baseado no método de diluição líquida em for-mato microlitro. Inocula-se uma só colônia de P. multocida (cepa 59A067)em 5 ml de caldo de infusão de cérebro-coração (BHI). A mistura de equilí-brio de isômeros azalídeos é preparada por solubilização de 1 mg da mistu-ra em 125 jllI de dimetilsulfóxido (DMSO). Preparam-se diluições da misturade equilíbrio de isômeros azalídeos utilizando-se caldo BHI não inoculado.As concentrações da mistura de equilíbrio de isômeros azalídeos utilizadasvariam desde 200 M-g/mL até 0,098 |ig/mL através de diluições duplas emsérie. A P. multocida inoculada em BHI é diluída com caldo de BHI não ino-culado para se obter uma suspensão de 104 células por 200 [\L. As suspen-soes de células em BHI são misturadas com as respectivas diluições emsérie da mistura de equilíbrio de isômeros azalídeos, e incubadas a 37°Cdurante 18 horas. A concentração inibitória mínima (MIC) é igual à concen-tração da mistura apresentando inibição de crescimento de P. multocida de100% conforme determinado por comparação com um controlo não inoculado.

Ensaio III

Este ensaio baseia-se no método de diluição de ágar utilizando-se um Steers Replicator. Inoculam-se duas a cinco colônias isoladas deuma placa de ágar em caldo BHI e incubam-se durante a noite a 37°C comagitação (200 rpm). Na manhã seguinte, inoculam-se 300 (xL da pré-culturaP. haemolytica completamente crescida em 3 ml de caldo de BHI fresco eincubam-se a 37°C com agitação (200 rpm). Dissolvem-se as quantidadesapropriadas da mistura de equilíbrio de isômeros azalídeos em etanol eprepara-se uma série de diluições de duas vezes em série. Misturam-sedois ml_ da respectiva diluição em série com 18 mL de ágar BHI fundido esolidifica-se. Quando a cultura inoculada de P. haemolytica atinge a densi-dade padrão de 0,5 McFarland, inocula-se cerca de 0,5 |xL da cultura de P.haemolytica em placas de ágar de BHI contendo as várias concentrações damistura de equilíbrio de isômeros azalídeos utilizando-se um Steers Repli-cator e incuba-se durante 18 horas a 37°C. As concentrações iniciais damistura variam desde 100-200 ja,g/mL. A MIC é igual à concentração damistura apresentando uma inibição de crescimento de P. haemolytica de100% conforme determinado por comparação com um controle não inoculado.

Muito mais preferencialmente, o ensaio de micro-diluição é rea-lizado utilizando-se um caldo Mueller-Hilton ajustado com catião de acordocom o princípio orientador de NCCLS M31-A, Vol. 19, N° 11, "Performancestandards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bactériaisolated from animais", Junho de 1999 (ISBN 1-56238-377-9), que é aquiincorporado por referência. Este ensaio pode ser utilizado para se determi-nar a MIC de um composto quer contra P. haemolytica, quer contra P. mul-tocida. Por exemplo, a mistura de equilíbrio de isômeros foi testada de acor-do com este padrão, contra P. haemolytica (ATCC 14003), e verificou-se teruma MIC de 1 (ig/mL. Quando a mistura de equilíbrio de isômeros foi testa-da de aeordo-com-este padrãor eontra-PT-/77£//fGe/Q'a (ATCC 43137), verificou-se que a MIC era de 1 ug/mL.

Ensaio IV

A atividade in vivo das composições farmacêuticas da presenteinvenção pode ser determinada através de estudos convencionais de prote-ção animal bem conhecidos dos versados na técnica, geralmente realizadosem camundongos.

Os camundongos são distribuídos em gaiolas (10 por gaiola) àsua chegada, e deixados aclimatizar durante um período mínimo de 48 ho-ras antes de serem utilizados. Os animais são inoculados intraversadoneal-mente com 0,5 ml de uma suspensão bacteriana de 3 x 103 CFU/ml (cepa P.multocida 59A006). Cada experiência tem pelo menos 3 grupos de controlenão medicados incluindo um infectado com 0,1X dose de provocação e doisinfectados com 1X dose de provocação; pode também ser utilizado um gru-po de dados com provocação de 10X. Geralmente, todos os camundongosem um dado estudo podem ser provocados no espaço de 30-90 minutos,especialmente se for utilizada uma seringa de repetição (tal como uma se-ringa Cornwall7) para se administrar a provocação. Trinta minutos depois daprovocação ter começado, é dado o primeiro tratamento de composiçãofarmacêutica. Pode ser necessário que uma segunda pessoa comece a do-sear a composição farmacêutica se todos os animais não tiverem sido pro-vocados no fim de 30 minutos. As vias de administração são doses subcu-tâneas ou orais. As doses subcutâneas são administradas na pele folgadana parte detrás do pescoço enquanto as doses orais são dadas através deuma agulha de alimentação. Em ambos os casos, é utilizado um volume de0,2 ml por camundongo. As composições são administradas 30 minutos, 4horas e 24 horas após a provocação. Em cada teste é incluída uma compo-sição de controle de eficácia conhecida administrada pela mesma via. Osanimais são observados diariamente e é registado o número de sobrevi-ventes em cada grupo. A monitorização do modelo P. multocida continuadurante 96 horas (quatro dias) pós provocação.

A PD50 é uma dose calculada à qual a composição farmacêuticatestada-protege 50% de um grupo de camundongos da mortalidade devida àinfecção bacteriana que seria letal na ausência de tratamento.

As composições farmacêuticas da presente invenção mostramatividade antibacteriana em um dos ensaios anteriormente descritos, parti-cularmente no Ensaio IV.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser utiliza-das para o tratamento de seres humanos, gado, cavalos, carneiros, porcos,cabras, coelhos, gatos, cães e outros mamíferos necessitados de tal trata-mento. Em particular, as composições farmacêuticas da invenção podem serutilizadas para o tratamento, inter alia, de doença respiratória bovina, doen-ça respiratória suína, pneumonia, pasteurelose, coccidiose, anaplasmose equeratinite infecciosa. As composições farmacêuticas podem ser adminis-tradas através de via oral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, intra-ocular, parentérica, tópica, intravaginal ou rectal. Para administração emgado, porcos ou outros animais domésticos, as composições farmacêuticaspodem ser administradas nos alimentos ou oralmente como uma composi-ção de remédio para animais. Preferencialmente, as composições farma-cêuticas são injectadas intramuscularmente, intravenosamente ou subcuta-neamente. Em uma modalidade preferida, as composições farmacêuticassão administradas em dosagens variando desde cerca de 0,5 mg da misturade equilíbrio de isômeros por kg de peso de corpo por dia (mg/kg/dia) atécerca de 20 mg/kg/dia. Em uma modalidade mais preferida, as composiçõesfarmacêuticas são administradas em dosagens variando desde cerca de 1mg/kg/dia até cerca de 10 mg/kg/dia. Em uma modalidade preferível, ascomposições farmacêuticas são administradas em dosagens variando desdecerca 1,25 mg/kg/dia até cerca de 5,0 mg/kg/dia. As composições farmacêu-ticas podem ser administradas até várias vezes por dia, durante cerca de 1até cerca de 15 dias, preferencialmente cerca de 1 até cerca de 5 dias, erepetidas quando apropriado. Os versados na técnica reconhecerão facil-mente que podem ocorrer variações nas dosagens dependendo das espéci-es, peso e condição do indivíduo a ser tratado, da sua resposta individual àscomposições farmacêuticas, e da via particular de administração escolhida.

Em algumas-eireunstâneiasrpodem-ser terapeuticamente eficazes níveis dedosagem abaixo do limite inferior das faixas sobreditas, enquanto em outroscasos podem ser empregues doses ainda maiores sem provocarem quais-quer efeitos colaterais nocivos, desde que tais doses maiores sejam primei-ramente divididas em várias doses pequenas para administração durantetodo o dia.

Os Exemplos seguintes ilustram adicionalmente as composiçõese métodos da presente invenção. Deve ser entendido que a presente inven-ção não está limitada aos pormenores específicos dos Exemplos fornecidosem baixo.

Exemplo 1

Síntese do isômero II. A um erlenmeyer de 2 L adicionou-sedesmetilazitromicina (190,5 g, 259,2 mmoles), cloreto de metileno (572 ml_)e sulfato de magnésio (38 g). A mistura foi agitada durante 10 min e em se-guida filtrada para um balão de fundo redondo de 5 L. Adicionou-se maiscloreto de metileno (2285 ml_) e arrefeceu-se a solução até 0 - 5°C. Depoisadicionou-se CBZ-CI (58,4 mL) (CBZ-CI = benzilcloroformato) durante 10min. Agitou-se a reação a = 0°C durante 6 horas e depois à temperaturaambiente durante a noite. Análise por HPLC indicou a presença de materialde partida residual de tal forma que a reação foi novamente arrefecida até ~0°C e mais CBZ-CI (19,5 ml_) adicionado em uma só porção. A reação foiagitada durante 5,5 horas a 0°C e em seguida 2,5 horas à temperatura am-biente. TLC indicou uma reação completa. A reação foi resfriada brusca-mente com bicarbonato de sódio aquoso saturado (953 ml_) e as fases se-paradas. A fase orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio, depois filtradae concentrada para proporcionar o composto de fórmula (III):

<formula>formula see original document page 27</formula>

A um balão de fundo redondo de 5 L contendo o composto defórmula (III) (225,3 g) em cloreto de metileno (901 ml_) e DMSO (450 ml_) a-65°C adicionou-se anidrido trifluoroacético (82,4 ml_). A temperatura foimantida a -60°C durante toda a adição que se completou em 9 min. A rea-ção foi agitada a -65 até -70°C durante 20 min. A reação foi temperada comtrietilamina (145 ml_) e depois agitada a -60g até -65°C durante 20 min. Àmistura reacional adicionou-se em seguida água (1127 ml_) durante 3 min,altura em que a temperatura aumentou para -2°C. A mistura reacional foiagitada durante 10 min e deixou-se que as fases se separassem. A fase or-gânica foi lavada com água (675 ml_) e depois com cloreto de sódio aquososaturado (675 ml_). A fase orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio e emseguida filtrada e os solventes orgânicos removidos por destilação. Adicio-nou-se MTBE e destilou-se para se removerem todos os vestígios de cloretode metileno e de DMSO. Adicionou-se mais MTBE até um volume total de3380 ml_. Adicionou-se ácido dibenzoil-tartárico-D monohidratado (87,8 g)em MTBE (1126 mL) para se formar uma pasta espessa. A mistura foi aque-cida até ao refluxo e agitada durante a noite. Após arrefecimento até a tem-peratura ambiente, os sólidos foram coletados em um funil de Buchner eenxaguados com MTBE. Os sólidos foram secos em um forno de secagem a40°C para proporcionarem 258,3 g do sal de tartarato de dibenzoíla docomposto de fórmula (IV):

A um balão de fundo redondo de 3 L adicionou-se cloreto demetileno (800 mL) e o sal de tartarato de dibenzoíla do composto de fórmula(IV) (188 g). Adicionou-se água (400 mL) e carbonato de potássio (45,5 g) eagitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 5 min. A fase orgânicafoi separada, em seguida lavada com água (250 mL) e seca sobre sulfato demagnésio. O agente de secagem foi removido por filtração e a solução re-sultante evaporada sob uma corrente de nitrogênio até um volume final de623 mL para originar uma cetona base livre.

A um balão de fundo redondo de 5 L adicionou-se THF (623 mL)e brometo de trimetilsulfônio (74,7 g). A pasta fluida resultante foi arrefecidaaté -10°C e adicionou-se terc-butóxido de potássio (54,4 g). A mistura reaci-onal foi agitada durante 10 min a -10°C e em seguida arrefecida até -70°Cdurante 5 min. Adicionou-se uma solução da cetona de base livre durante11 min, mantendo-se a temperatura entre -60 e -65°C. HPLC indicou que areação foi completa após 90 min. A reação foi temperada a -60°C utilizando-se uma solução de cloreto de amônio (315 g) em água (1800 ml_). A tempe-ratura aumentou para -5°C durante a tempera. A mistura reacional foi aque-cida até 5-10°C e as fases separadas. A fase orgânica foi seca sobre sulfatode sódio e depois filtrada e concentrada para proporcionar o composto defórmula (V), (117,4 g) como uma espuma amarela. HPLC indicou uma pure-za de 61,4% pela área do pico.

<formula>formula see original document page 29</formula>

A uma solução do composto de fórmula (V) (275 g, 312 mmoles)em metanol seco (2,75 L) adicionou-se iodeto de potássio (518 g, 3,12 mol)e n-propilamina (250 ml_, 3,04 mol). A mistura foi agitada durante a noite a45°C. TLC indicou uma reação completa. A reação foi concentrada em umevaporador rotativo e o resíduo dividido entre água (2,5 L) e cloreto de me-tileno (2,5 L). O pH da fase aquosa foi ajustado para 6,7 utilizando-se HCIaquoso 3N. Repetiu-se a extração mais uma vez. As fases aquosas combi-nadas foram combinadas com cloreto de metileno fresco (1,5 L) e o pH dafase aquosa ajustado para 8,5 utilizando-se carbonato de potássio sólido.

As fases foram separadas e a fase aquosa novamente extraída duas vezescom cloreto de metileno adicional. As fases orgânicas combinadas foramsecas sobre sulfato de sódio e em seguida filtradas. O filtrado foi concentra-do em um evaporador rotativo para proporcionar uma espuma bege (230 g).

A purificação da espuma foi realizada em uma coluna de gel de sílica comempacotamento em suspensão utilizando-se hexanos-dietilamina 19/3 (v/v)como fase móvel. Desta forma, 125 g de produto bruto proporcionaram 72 gde isômero I como uma espuma branca, amorfa.O isômero I foi dissolvido em acetonitrila (0,5 L) à temperaturaambiente. Depois adicionou-se água desionizada (1 L), o que provocou pre-cipitação. Em seguida adicionou-se mais acetonitrila (0,5 L) para originaruma solução homogênea que foi agitada à temperatura ambiente durante 30horas. Análise por HPLC indicou a formação de um novo componente quecompreendia ~ 20% da área total do pico.

O solvente orgânico foi removido em um evaporador rotativo. Aoresíduo aquoso adicionou-se carbonato de potássio (30 g) seguido de clo-reto de metileno (0,3 L). A mistura foi agitada e a fase orgânica inferior re-movida. Realizaram-se também duas extrações adicionais (2 x 0,3 L). Asfases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, depois fil-tradas e a solução resultante concentrada até uma espuma seca (= 10 g).

A mistura resultante de isômero I e isômero II foi dissolvida emuma mistura de cloreto de metileno e hexanos-dietilamina 19/3 (v/v), colo-cada em uma coluna de gel de sílica com empacotamento em suspensão eem seguida eluída com o sistema 19/3. O eluente foi alterado para hexanos-dietilamina 19/6 em fracção 56. As fracções 9-17 foram combinadas e con-centradas até uma espuma seca que continha apenas material de partidanão reagido. As frações 52-72 foram combinadas e concentradas, e conti-nham isômero II (79% de pureza por HPLC).

Exemplo 2

A Tabela 1 abaixo mostra o efeito do pH, da temperatura, dotipo de ácido e da concentração de isômero I na velocidade de reação deequilibração e nos níveis das principais impurezas após equilíbrio. A repeti-ção de ensaios (dados não indicados) demonstrou reprodutibilidade dosresultados. A razão de equilíbrio de isômeros I e II (cerca de 90% ± 4% atécerca de 10% ± 4%, respectivamente) foi consistente para todos os ensaios.A análise dos dados indica que o pH e a temperatura têm um efeito signifi-cativo no tempo requerido para se atingir o equilíbrio. Sem se estar limitadopor qualquer teoria, menores temperaturas de equilibração ou menores va-lores de pH resultam geralmente em tempos de equilíbrio substancialmentemais longos. O tempo de equilíbrio pode também depender, inter alia, daconcentração do material de partida e do tipo e concentração do ácido utili-zado. O isômero I em uma concentração de até cerca de 300 mg por ml_ decomposição foi aquecido até uma temperatura de cerca de 40°C até cercade 80°C na presença de um ou mais ácidos em uma concentração de cercade 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por ml_ de mistura e com uma quantida-de suficiente de ácido clorídrico para se atingir um pH de cerca de 6,5 atécerca de 7,5 durante até cerca de 20 horas para se produzir uma mistura deequilíbrio de isômeros que é aproximadamente 95%-98% pura. Os parâme-tros cinéticos de equilíbrio e os níveis de impurezas para se atingir o equilí-brio de isômeros I e II azalídeos foram determinados como função do pH,temperatura de equilibração, tipo de ácido e concentração de isômero I eestão indicados na Tabela 1. Para se identificarem as impurezas podem-seutilizar métodos conhecidos, incluindo cromatografia líquida de elevado de-sempenho ("HPLC"), espectroscopia de ressonância magnética nuclear("RMN"), cromatografia gasosa ("GC"), espectrometria de massa ("EM"),cromatografia líquida/espectrometria de massa ("LC/EM"), GC/EM e croma-tografia em camada fina ("TLC"). "DS" refere-se ao isômero I antes da equi-libração e é incluído para comparação.

As misturas de equilíbrio de isômeros foram preparadas e testa-das como se segue. Preparam-se 40 ml_ de solução em cada uma das expe-riências 1A-11A e cada solução foi dividida em alíquotas de 1 ml_ antes deser aquecida de forma a se monitorizar mais facilmente a equilibração a di-ferentes tempos. Preparam-se 20 ml_ de solução em cada uma das experi-ências 12B-24B e cada solução foi dividida em alíquotas de 0,7 ml_ antes deser aquecida. Preparam-se 100 ml_ de solução em cada uma das experiên-cias 25C-28C, preparam-se 200 mL de solução em cada uma das experiên-cias 29C-30C e monitorizou-se a equilibração a partir de alíquotas de 0,5mL removidas das soluções. Preparam-se 60 mL de solução em cada umadas experiências 31D-33D e 35D-41D, preparam-se 170 mL de solução naexperiência 34D e monitorizou-se a equilibração a partir de alíquotas de 0,5mL removidas das soluções. Preparam-se desde 7.200 mL até 54.000 mLde solução em cada uma das experiências 42E-46E e monitorizou-se aequilibração removendo-se alíquotas de 2 ml_ até 5 ml_ das soluções. Pre-param-se desde 35 ml_ até 50 ml_ de solução em cada uma das experiênci-as 47F-50G e cada solução foi dividida em alíquotas de 1 ml_ antes de seraquecida. Adicionou-se água ao recipiente apropriado, seguindo-se o tipo equantidade de ácido indicado na coluna 4 da Tabela 1. O termo "qs" prece-dendo o tipo de ácido refere uma quantidade do ácido suficiente para seatingir o pH indicado na coluna 2. Quando foi utilizado ácido cítrico ou tartá-rico 0,1 M, foi também adicionado ácido clorídrico em uma quantidade sufi-ciente para se obter o pH indicado na coluna 2. Quando na coluna 4 é es-pecifiçada uma concentração de ácido (por exemplo, "cítrico 0,1 M"), esta éa concentração de ácido em uma solução contendo uma mistura equilibradade isômero I e isômero II presente em uma concentração de 100 mg/mL. Amistura de água e ácido foi agitada até que todo o ácido se tivesse dissolvi-do (cerca de 5 minutos ou menos para menores volumes, e cerca de 20 mi-nutos para maiores volumes). Adicionou-se lentamente isômero I e em pe-quenas porções para se evitar o amontoar, e a mistura resultante foi agitadavigorosamente até se dissolver (menos do que 30 minutos para menoresvolumes, e cerca de 60-120 minutos para maiores volumes). Após dissolu-ção do isômero I, mediu-se o pH da solução resultante. Se o pH era inferiorao pH indicado na coluna 2, era aumentado até ao pH indicado na coluna 2com solução de hidróxido de sódio a 10%. Se o pH era superior ao pH indi-cado na coluna 2, era baixado com o(s) ácido(s) apropriado(s). Para cadaexperiência, a solução era aquecida à temperatura indicada na coluna 3 atése obter uma mistura de equilíbrio de isômeros, conforme determinado porum dos ensaios de HPLC abaixo descritos. Nalgumas experiências, as mis-turas foram aquecidas durante um período de tempo mais longo do que orequerido para a equilibração (percentagens superiores a 100% na coluna8) para se determinarem os efeitos do aquecimento prolongado no grau deimpureza.

Para se monitorizar a equilibração de isômeros azalídeos, anali-saram-se alíquotas de mistura reacional por HPLC a vários tempos durantea equilibração. Para a maior parte das experiências de equilibração ilustra-das na Tabela 1, diluíram-se alíquotas com tampão de fosfato de potássio40 mM (pH 6,0) até uma concentração de aproximadamente 0,5 mg de isô-meros azalídeos por mL de volume de amostra total e submeteram-se acromatografia utilizando-se uma coluna Asahipak ODP-50, 5 |im, 250 x 4,0mm (40% acetonitrila/35% metanol/25% fosfato de potássio 40 mM; pH 8,5fase móvel; caudal 0,7 mL/min; temperatura ambiente) em um CromatógrafoLíquido HP 1090 equipado com um Detector de Absorvância Programávelexterno Applied Biosystems 783A. Os picos foram detectados por monitori-zação da absorção ultravioleta a 210 nm. Para as restantes experiências deequilibração ilustradas na Tabela 1 (experiências 31D-46E), diluíram-se alí-quotas com 20% acetonitrila/50% metanol/30% fosfato de potássio 50 mM(pH 5,5) até uma concentração de 1,0 mg de isômeros azalídeos por mL devolume de amostra total e submeteram-se a cromatografia utilizando-se umacoluna YMC Pro-Pack Ci8, 3 um, 50 x 2,0 mm (20% acetonitrila/50% meta-nol/30% fosfato de potássio 50 mM; pH 7,0 fase móvel; caudal 0,5 mL/min;temperatura ambiente) em um Cromatógrafo Líquido HP 1090 com Detectorde UV interno. Os picos foram detectados por monitorização da absorçãoultravioleta a 210 nm. As quantidades relativas de isômero I e isômero IIforam determinadas calculando-se a razão das áreas relativas dos picos noscromatogramas. Nas condições anteriores de HPLC, o isômero I tem umtempo de retenção de aproximadamente 13-23 minutos e o isômero II temum tempo de retenção relativo ("RRT") de aproximadamente 0,8 a 0,9. Por"RRT" quer-se dizer um tempo de retenção relativo ao do isômero I nascondições de HPLC acima descritas.

A pureza das amostras equilibradas na Tabela 1 foi determinadautilizando-se HPLC de acordo com um de três procedimentos. Nas experi-ências 1A-24B, 48F e 50G, diluíram-se alíquotas com tampão de fosfato depotássio 25 mM (pH 5,5) até uma concentração de 1,25 mg de isômerosazalídeos por mL de volume de amostra total e analisaram-se usando-seuma coluna Eclipse XDB-C8, 5 um, 250 x 4,6 mm (22% acetonitrila/58%metanol/20% fosfato de potássio 25 mM; pH 8,0 fase móvel; caudal 0,6mL/min; temperatura ambiente) em um Módulo de Separação Waters Allian-ce 2690 com um Detector Amperometrico BAS CC-5/LC-4C. Os picos foramdetectados electroquimicamente com um eletrodo a +0,70 V, um segundoeletrodo a +0,88 V, e uma faixa de 0,5 uA Nas experiências 25C-41 D, diluí-ram-se alíquotas com ácido cítrico 50 mM (pH 5,5) até uma concentração de0,25 mg de isomeros azalídeos por ml_ de volume de amostra total e anali-saram-se usando-se uma coluna YMC Pro-Pack Ci8, 3 (xm, 150 x 4,6 mm(70% metanol/30% fosfato 50 mM; pH 7,0 fase móvel; caudal 1 mL/min;temperatura ambiente) no sistema Waters Alliance. Os picos foram detecta-dos electroquimicamente com um eletrodo a +0,90 V. Nas experiências 42E-43E, diluíram-se alíquotas com ácido cítrico 50 mM (pH 5,5) até uma con-centração de 0,25 mg de isomeros azalídeos por ml_ de volume de amostratotal e analisaram-se usando-se uma coluna YMC Pro-Pack Ci8, 3 um, 150 x4,6 mm (70% metanol/30% fosfato 50 mM; pH 7,0 fase móvel; caudal 1mL/min; temperatura ambiente) em um Cromatógrafo Líquido HP 1090 comDetector Amperometrico BAS CC-5/LC-4C. Os picos foram detectados elec-troquimicamente com apenas um eletrodo a +0,90 V. A percentagem damistura de equilíbrio de isomeros (coluna 9) e de impurezas (coluna 10) re-lativamente à amostra analisada foi determinada utilizando-se as áreas sobos picos nos cromatogramas. Algumas das impurezas detectadas foram: umazalídeo de descladinose (sendo o seu RRT aproximadamente 0,26 em umacoluna Eclipse XDB-C8), um produto de inserção de acetaldeído (sendo oseu RRT aproximadamente 1,75 em uma coluna Eclipse XDB-C8) e um pro-duto de inserção de formaldeído (sendo o seu RRT aproximadamente 1,6em uma coluna Eclipse XDB-C8).

O azalídeo de descladinose tem a estrutura:O produto de inserção de acetaldeído tem a estrutura:

O produto de inserção de formaldeído tem a estrutura:

O azalídeo de descladinose, o produto de inserção de acetal-deído e o produto de inserção de formaldeído, e sais farmaceuticamenteaceitáveis dos mesmos, têm propriedades antibióticas e são úteis comoagentes antibióticos.

As experiências dos grupos A e B (identificadas pela letra apóso número da experiência) na Tabela 1 foram realizadas para se determina-rem os efeitos do pH, da temperatura, do tipo de ácido, da concentração doácido e da concentração do isômero I na equilibração. As experiências dogrupo C na Tabela 1 ilustram os efeitos do pH e da temperatura na equili-bração. As experiências do grupo D na Tabela 1 ilustram os efeitos do pH,da temperatura e da concentração de ácido na equilibração. As experiênci-as do grupo E na Tabela 1 ilustram um método preferido de equilibração, ouseja, a um pH de cerca de 7,0, uma temperatura de equilibração de cerca de70°C e uma concentração de isômero I de cerca de 250 mg/mL. As experi-ências do grupo F testam os efeitos de ácidos e temperaturas de equilibra-ção alternativos, e a experiência G foi realizada na presença de 50% de co-solvente propilenoglicol.

Os resultados destas experiências indicam que, mesmo sobuma variedade de condições, o equilíbrio de isômeros azalídeos resultaconsistentemente na formação de pelo menos cerca de 90% ± 4% de isôme-ro I e cerca de 10% ± 4% de isômero II. A temperatura de equilibração e opH parecem ter os maiores efeitos na velocidade de equilibração, com tem-peraturas maiores conduzindo geralmente a velocidades mais rápidas,mesmo com maiores concentrações de isômero I. Na maior parte dos casos,contudo, maiores tempos de equilibração resultaram em maiores concentra-ções de impurezas e, portanto, as condições óptimas de equilibração sãoaquelas conduzindo a velocidades de equilibração relativamente elevadas,i.e., aquelas que formam a mistura de equilíbrio de isômeros em 1-3 horas.Tabela 1

Número da Experiência e Grupo

<table>table see original document page 37</column></row><table>Tabela 1 (Continuação)

<table>table see original document page 38</column></row><table>Tabela 1 (Continuação)

<table>table see original document page 39</column></row><table>Tabela 1 (Continuação)

<table>table see original document page 40</column></row><table>Tabela 1 (Continuação)

<table>table see original document page 41</column></row><table>Tabela 1 (Continuação)

<table>table see original document page 42</column></row><table>Tabela 1 (Continuação)

<table>table see original document page 43</column></row><table>Tabela 1 (Continuação)

<table>table see original document page 44</column></row><table>Tabela 1 (Continuação)

<table>table see original document page 45</column></row><table>Tabela 1 (Continuação)

<table>table see original document page 46</column></row><table>Exemplo 3

A estabilidade de composições equilibradas armazenadas a50°C durante 12 semanas e estabilizadas com co-solvente é ilustrada naTabela 2 abaixo. Os resultados indicam que as composições que não con-têm co-solvente são significativamente menos estáveis do que as composi-ções contendo co-solvente em uma quantidade desde cerca de 250 até cer-ca de 500 mg por mL de composição (experiências 1A-11 B). As composi-ções com um pH de cerca de 5,4 e contendo propilenoglicol ("PG") em umaquantidade desde cerca de 450 até cerca de 550 mg por mL de composiçãosão as mais estáveis. Podem-se utilizar outros co-solventes para se estabi-lizarem as composições (experiências 1E-2E); contudo, é preferido o propi-lenoglicol. Conforme ilustrado na Tabela 2, a estabilidade depende do pH, epode também depender do tipo e quantidade do ácido usado, e da concen-tração da mistura de isômeros equilibrada.

Estas composições foram preparadas da seguinte forma. Apósaquecimento até a temperatura desejada (coluna 2) e se deixar a mistura deágua, ácido e isômero I equilibrar durante o tempo indicado na coluna 3,deixaram-se as misturas de equilíbrio de isômeros arrefecer até a tempera-tura ambiente. Quando as misturas atingiram a temperatura ambiente, adici-onou-se a quantidade apropriada do co-solvente desejado (coluna 6). Apercentagem de co-solvente indicada na coluna 6 é uma percentagem pesoem volume (por exemplo, 50% PG significa 500 mg de propilenoglicol pormL de composição farmacêutica). Se foi utilizado um antioxidante ou umconservante, adicionaram-se as quantidades apropriadas (colunas 8 e 9). OpH da solução foi medido e ajustado ao valor na coluna 5 por adição de umou mais ácidos e/ou hidróxido de sódio a 10% p/p. Os volumes das soluçõesresultantes foram então ajustados por adição de água. As composições fo-ram filtradas através de um filtro de esterilização de 0,2 mícron. Encheram-se frascos em uma capela com fluxo laminar e o espaço da parte superiordo frasco foi limpo com a mistura gasosa apropriada (coluna 10) antes da-quele ser vedado.

A equilibração e a pureza foram monitorizadas utilizando-seHPLC conforme acima descrito no Exemplo 2. A estabilidade das composi-ções estabilizadas, equilibradas vedadas em frascos de vidro foi determina-da após armazenamento durante 12 semanas a 50°C. Foram monitorizadosos efeitos da concentração da mistura de equilíbrio de isômeros, do pH, daquantidade e tipo de co-solvente, do tipo e concentração de ácido, da expo-sição ao ar, da presença de conservantes e da presença de antioxidantes.Os resultados são ilustrados na Tabela 2.

As experiências 1A-3A foram realizadas para se registrar oefeito da concentração da mistura de equilíbrio na estabilidade. As experi-ências 2A, 6A e 7A foram realizadas para se registrar o efeito do pH na es-tabilidade. As experiências 2A, 4A e 5A mostram o efeito da quantidade deco-solvente na estabilidade e as experiências 3A e 8A mostram o efeito douso de ácido cítrico sozinho, contrariamente a misturas de ácido cítrico efosfórico, para se obter um pH ácido. As experiências 1B-11B mostram osefeitos do pH e do co-solvente propilenoglicol ("PG") na estabilidade. Asexperiências 1C e 2C mostram o efeito do uso de ácido tartárico sozinho,contrariamente a uma mistura de ácido tartárico e clorídrico, para se obterum pH ácido. As experiências 9B-11B e 3C mostram os efeitos de um con-servante na estabilidade da mistura, e as experiências 9B-11B, 4C e 5Cmostram os efeitos de um antioxidante na estabilidade da mistura. As expe-riências 6C e 7C mostram os efeitos do uso de uma mistura de ácido tartári-co e clorídrico ou de uma mistura de ácido cítrico e clorídrico na estabilida-de. As experiências 1D-12D mostram os efeitos de diferentes quantidadesde antioxidante monotioglicerol ("MTG") e de diferentes graus de exposiçãoao oxigênio na estabilidade. As experiências 4D-6D e 13D-18D demonstramos efeitos do pH da composição e da concentração de ácido na estabilidade.

Os resultados destas experiências indicam que após armaze-namento durante 12 semanas a 50°C, as composições equilibradas quecontêm pelo menos 50% de propilenoglicol e que têm um pH na faixa desdecerca de 5,2 até cerca de 5,5 retêm mais de 93% da concentração inicial damistura de equilíbrio de isômeros. O maior nível de impurezas foi encontra-do em uma composição sem co-solvente (experiência 4A). Por conseqüên-cia, a presença de co-solvente limita de forma surpreendente e inesperadaa quantidade de impurezas. Em composições com menos de 40% de co-solvente e com um pH inferior a 5,0 detectaram-se elevados níveis de impu-rezas após 12 semanas. A concentração do ácido também afeta a estabili-dade das composições farmacêuticas. As composições com concentraçõesde ácido relativamente baixas (cerca de 20 mM) e com um pH de cerca de5,4 mostram a maior estabilidade após armazenamento. Contudo, baixasconcentrações de ácido resultam em uma força tamponante baixa, o queprovoca flutuações do pH e pode conduzir a um nível de impureza relativa-mente elevado sob outras condições de tempo ou temperatura.Tabela 2

<table>table see original document page 50</column></row><table>Tabela 2 (Continuação)

<table>table see original document page 51</column></row><table>Tabela 2 (Continuação)

<table>table see original document page 52</column></row><table>Tabela 2 (Continuação)

<table>table see original document page 53</column></row><table>Tabela 2 (Continuação)

<table>table see original document page 54</column></row><table>Tabela 2 (Continuação)

<table>table see original document page 55</column></row><table>Tabela 2 (Continuação)

<table>table see original document page 56</column></row><table>Tabela 2 (Continuação)

<table>table see original document page 57</column></row><table>Tabela 2 (Continuação)

<table>table see original document page 58</column></row><table>Tabela 2 (Continuação)

<table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table>

Tabela 2 (Continuação)

<table>table see original document page 60</column></row><table>Exemplo 4

Prepararam-se cinqüenta e dois litros de uma composição far-macêutica injetável contendo 100 mg de mistura de equilíbrio de isômerospor mL de composição da forma que se segue. Adicionaram-se 16,584 kgde Água para Injeção (grau USP) aspergida com nitrogênio (grau NF) a umvaso de combinação de aço inoxidável e começou-se a agitação. Utilizou-setambém nitrogênio como uma cobertura para se reduzir a exposição da so-lução ao oxigênio no vaso de combinação durante a fabricação. Adicionou-se aproximadamente 1 kg de ácido cítrico anídrico (grau USP) à água eagitou-se a mistura resultante até o ácido se dissolver. Adicionou-se subse-qüentemente à mistura 1,511 kg de uma solução a 10% (p/p) de ácido clorí-drico (grau NF) em água (grau USP). Adicionou-se lentamente 5,357 kg deuma mistura contendo aproximadamente 97% de isômero I e isômero II (emuma razão de cerca de 99:1) e 3% de uma ou mais impurezas à mistura emagitação e deixou-se que se dissolvesse. O pH da solução resultante foiajustado a 7,0 ± 0,5 por adição de 0,224 kg de uma solução a 10% (p/p) deácido clorídrico em água. A equilibração dos isômeros I e II foi atingida poraquecimento da solução até 70°C ± 10°C durante 105 minutos. Uma vezcompletada a equilibração, como determinado utilizando-se HPLC, deixou-se arrefecer a solução até 25°C ± 10°C, e adicionaram-se 26,008 kg de pro-pilenoglicol (grau USP) à mistura em agitação. Depois do propilenoglicol tercompletamente misturado, adicionaram-se 0,26 kg de monotioglicerol (grauNF) à solução, e o pH foi novamente ajustado a 5,4 ± 0,3 por adição de2,349 kg de ácido clorídrico a 10% (p/p) em água. O volume final foi ajusta-do a 52,015 litros por adição de 1,843 kg de água. A composição resultantecontinha 100 mg da mistura de equilíbrio de isômeros por mL de composi-ção, 500 mg por mL de propilenoglicol, ácido cítrico em uma concentraçãode 0,1 Me monotioglicerol em uma concentração de 5 mg/mL de composição.

A composição foi filtrada através de um pré-filtro de 6 mícrons eem seguida através de um filtro de esterilização final de 0,2 mícron, o qualfoi esterilizado por autoclavagem com calor úmido durante 60 minutos a121°C e testado quanto à sua integridade utilizando-se o método em que semantém a pressão antes da esterilização e após filtração. Esterilizaram-se edepirogenaram-se frascos de cristal de soro do tipo I de 20 ml_ (WheatonScience Products, Millville, New Jersey) em um túnel de calor seco a 250°Cdurante 240 minutos. Despirogenaram-se tampas siliconizadas de clorobu-tila cinzentas de 20 mm 4432/50 (The West Company, Lionville, PA) por la-vagem e esterilizaram-se por autoclavagem com aquecimento úmido du-rante 60 minutos a 121°C. Cada um dos 2.525 frascos foi cheio sob condi-ções estéreis com 20 ml_ da composição resultante mais 0,6 mL de sobre-enchimento (20,6 mL/frasco corresponde a 2,06 g/frasco de unidade de po-tência da composição farmacêutica a 100 mg/mL de mistura de equilíbrio deisômeros baseada em uma potência real do lote da substância droga de97,1%), os espaços no topo dos frascos foram limpos com nitrogênio e osfrascos vedados com as tampas e outros vedantes (tampões de alumínio de20 mm, produto n° 5120-1125, The West Company, Lionville, PA).

A presente invenção não deve ser limitada no seu escopo pelasmodalidades específicas descritas nos Exemplos, que se pretende que se-jam ilustrações de alguns aspectos da invenção. Quaisquer modalidadesque sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta in-venção. De fato, para os versados na técnica tornar-se-ão aparentes váriasmodificações da invenção para além daquelas aqui ilustradas e descritas epretende-se que caiam dentro das reivindicações apensas.

Todas as referências aqui descritas são pela presente incorpo-radas por referência na sua totalidade.

Claims

1. Composição compreendendo:(a) o composto de fórmula Ie o composto de fórmula II:<formula>formula see original document page 63</formula>em uma razão de cerca de 90% ± 4% até cerca de 10% ± 4%, respectivamente;(b) água; e(c) um ou mais ácidos presentes em uma concentração totaldesde cerca de 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por mL de composição.

2. Método para obtenção da composição como definida na rei-vindicação 1, compreendendo a etapa de aquecimento até uma temperaturade cerca de 50°C até cerca de 90°C de uma mistura compreendendo:(a) o composto de fórmula (I),(b) água, e(c) um ou mais ácidos em uma quantidade que varia desde cer-ca de 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por mL da mistura;em que o pH da mistura varia desde cerca de 5,0 até cerca de 8,0.

3. Método para o tratamento de uma infecção bacteriana ouprotozoária em um mamífero, compreendendo a administração a um mamí-fero necessitado de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente efi-caz de uma composição como definida na reivindicação 1.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, no qual a infecçãobacteriana ou protozoária é selecionada do grupo constituído por doençarespiratória bovina, doença respiratória suína, pneumonia, coccidiose, ana-plasmose e queratinite infecciosa.

5. Composição compreendendo:(a) uma primeira mistura de:(i) composto de fórmula (I): <formula>formula see original document page 64</formula> composto de fórmula (II): <formula>formula see original document page 64</formula>em uma razão de cerca de 90% ± 4% até cerca de 10% ± 4%, respectiva-mente;(ii) água; e(iii) um ou mais ácidos presentes em uma concentração totaldesde cerca de 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por ml_ da primeira mistura;e(b) um ou mais co-solventes miscíveis em água presentes emuma quantidade desde cerca de 250 até cerca de 750 mg por ml_ de com-posição.

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, na qual o umou mais ácidos são selecionados do grupo constituído por ácido acético,ácido benzenossulfônico, ácido cítrico, ácido bromídrico, ácido clorídrico,ácido láctico-D e -L, ácido metanossulfônico, ácido fosfórico, ácido succíni-co, ácido sulfúrico, ácido D-tartárico e -L, ácido p-toluenossulfônico, ácidoadípico, ácido aspártico, ácido canforossulfônico, ácido 1,2-etanodissulfônico,ácido laurilsulfúrico, ácido gluco-heptônico, ácido glucônico, ácido 3-hidróxi- 2-naftóico, ácido 1-hidróxi-2-naftóico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácidomálico, ácido múcico, ácido nítrico, ácido naftalenossulfônico, ácido palmíti-co, ácido D-glucárico, ácido esteárico, ácido maléico, ácido malónico, ácidofumárico, ácido benzóico, ácido eólico, ácido etanossulfônico, ácido glicurô-nico, ácido glutâmico, ácido hipúrico, ácido lactobiônico, ácido lisínico, ácidomandélico, ácido napadisílico, ácido nicotínico, ácido poligalacturônico, áci-do salicílico, ácido sulfossalicílico, ácido triptofânico, e misturas dos mes-mos.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, na qual o umou mais ácidos é ácido cítrico.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, na qual o ácidocítrico está presente em uma quantidade desde cerca de 0,02 mmol até cer-ca de 0,3 mmol por ml_ de composição.

9. Composição de acordo com a reivindicação 6, na qual o umou mais ácidos são ácido cítrico e ácido clorídrico.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, na qual o áci-do cítrico está presente em uma quantidade desde cerca de 0,02 mmol atécerca de 0,3 mmol por ml_ de composição e o ácido clorídrico está presenteem uma quantidade suficiente para se alcançar um pH da composição decerca de 5 até cerca de 6.

11. Composição de acordo com a reivindicação 5, na qual o umou mais co-solventes miscíveis em água são selecionados do grupo consti-tuído por etanol, isopropanol, éter monometílico de dietilenoglicol, éter butí-lico de dietilenoglicol, éter monoetílico de dietilenoglicol, éter dibutílico dedietilenoglicol, polietilenoglicol-300, polietilenoglicol-400, propilenoglicol,glicerina, 2-pirrolidona, N-metil 2-pirrolidona, glicerol formal, sulfóxido dedimetila, sebecato de dibutila, polissorbato 80, e misturas dos mesmos.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, na qual o umou mais co-solventes miscíveis em água é propilenoglicol.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, na qual opropilenoglicol está presente em uma quantidade desde cerca de 450 atécerca de 550 mg por ml_ de composição.

14. Composição de acordo com a reivindicação 5, compreen-dendo ainda um ou mais antioxidantes presentes em uma quantidade desdecerca de 0,01 mg até cerca de 10 mg por ml_ de composição.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, na qual o umou mais antioxidantes é selecionado do grupo constituído por bissulfito desódio, sulfito de sódio, metabissulfito de sódio, tiossulfato de sódio, formal-deído sulfoxilato de sódio, ácido L-ascórbico, ácido eritórbico, acetilcisteína,cisteína, monotioglicerol, ácido tioglicólico, ácido tioláctico, tiouréia, ditio-treitol, ditioeritreitol, glutationa, palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado,hidroxitolueno butilado, ácido nordihidroguaiarético, gaiato de propila, a-tocoferol, e misturas dos mesmos.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15, na qual o umou mais antioxidantes é monotioglicerol.

17. Composição de acordo com a reivindicação 16, na qual omonotioglicerol está presente em uma quantidade desde cerca de 4 mg/mLaté cerca de 6 mg/mL da composição.

18. Composição de acordo com a reivindicação 5, na qual aconcentração da primeira mistura na composição varia desde cerca de 50mg/mL até cerca de 200 mg/mL.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, na qual aconcentração da primeira mistura na composição varia desde cerca de 90mg/mL até cerca de 110 mg/mL.

20. Composição de acordo com a reivindicação 19, na qual oácido cítrico está presente em uma quantidade desde cerca de 0,02 mmolaté cerca de 0,3 mmol por mL de composição e o ácido clorídrico está pre-sente em uma quantidade suficiente para se alcançar um pH da composiçãode cerca de 5 até cerca de 6; em que o propilenoglicol está presente emuma quantidade desde cerca de 450 até cerca de 550 mg por mL de com-posição; e em que o monotioglicerol está presente em uma quantidade des-de cerca de 4 mg/mL até cerca de 6 mg/mL da composição.

21. Método para se obter a composição como definida na reivin-dicação 5, compreendendo a etapa de aquecimento até uma temperatura decerca de 50°C até cerca de 90°C de uma mistura compreendendo:(a) o composto de fórmula (I);(b) água; e(c) um ou mais ácidos em uma quantidade que varia desde cer-ca de 0,2 mmol até cerca de 1,0 mmol por mL da mistura;em que um ou mais co-solventes miscíveis em água são adicionados antes,durante ou depois da etapa de aquecimento, em uma quantidade desdecerca de 250 até cerca de 750 mg por mL de composição.

22. Composto de fórmula:<formula>formula see original document page 67</formula>ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que R1 é OH ou<formula>formula see original document page 68</formula>em que R2 é H ou CH3.