BR102022012809A2

BR102022012809A2 - Método de imobilização de bactérias promotoras do crescimento de plantas em superfícies orgânicas

Info

Publication number: BR102022012809A2
Application number: BR102022012809-0A
Authority: BR
Inventors: André Luiz Martinez De Oliveira; Amanda Aleixo Moreira; Suzana Mali De Oliveira
Original assignee: Universidade Estadual De Londrina
Priority date: 2022-06-27
Filing date: 2022-06-27
Publication date: 2024-01-09

Abstract

método de imobilização de bactérias promotoras do crescimento de plantas em superfícies orgânicas. a presente invenção refere-se ao processo de imobilização de bactérias vivas em superfícies orgânicas, desde sementes e propágulos vegetais até materiais produzidos a partir de biomassa animal ou vegetal. o processo descrito proporciona a manutenção da viabilidade das células imobilizadas em uma superfície orgânica por períodos prolongados, e a liberação lenta e gradual das células imobilizadas a partir da hidratação da superfície orgânica tratada. a invenção está baseada na mistura de polímeros orgânicos (amido e gelatina) e compostos nutrientes com uma suspensão de células bacterianas vivas, como por exemplo, células de bactérias promotoras do crescimento de plantas. o processo descrito resulta em um material filmogênico passível de aplicação sobre diferentes superfícies orgânicas. o material filmogênico adicionado de células bacterianas vivas (bacterizado) pode ser acrescentado de outros compostos bioativos e nutrientes, sem prejuízo à viabilidade das células bacterianas adicionadas. materiais biodegradáveis utilizados em práticas agrícolas, sementes e outros propágulos vegetais podem ser submetidos ao processo de imobilização de bactérias descrito, em substituição aos produtos equivalentes convencionais que requerem aplicação no momento de plantio/uso dos insumos. o processo descrito diminui a manipulação destes insumos e os requerimentos de mão-de-obra, e aumenta a eficácia da ação promotora de crescimento exercida pela bactéria adicionada.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[01] Bactérias promotoras do crescimento de plantas constituem um grupo microbiano diversificado, com capacidade natural de desenvolver interações e associações de longo prazo com diferentes espécies de plantas, e que apresentam como característica principal a capacidade de estimular o crescimento, a nutrição, a produtividade e a tolerância contra estresses bióticos e abióticos (Zuluaga et al. 2021). Várias espécies de BPCP são exploradas comercialmente como bioinsumos voltados a diferentes espécies agrícolas, desde espécies arbóreas até grãos e cereais. De maneira geral, os insumos biológicos contendo BPCP são aplicados sobre as sementes, no momento do plantio, ou adicionados ao solo onde estas sementes serão dispostas (http://www.anpii.org.br/artigos/). Este processo é crítico para que a máxima eficácia da interação entre BPCP e a planta inoculada seja alcançada, uma vez que as BPCP são organismos vivos mantidos nas embalagens dos produtos comerciais estão em condições ambientais controladas, mas quando ocorre sua aplicação sobre sementes ou sobre o solo há exposição das BPCP às condições ambientais existentes no ambiente de uso. Sementes tratadas com agroquímicos, solos muito ácidos ou secos, exposição à temperaturas elevadas, entre outros fatores podem diminuir a viabilidade das células inoculantes e consequentemente, diminuir de sua capacidade de colonizar a planta inoculada, o que reduz ou elimina os efeitos benéficos pretendidos (Embrapa, 2017).

[02] A imobilização de células em matrizes poliméricas vem sendo utilizada como uma estratégia para garantir a manutenção da viabilidade dos microrganismos no ambiente, uma vez que oferecem proteção física, química e biológica e podem ainda proporcionar uma liberação lenta e gradual das células microbianas imobilizadas e fornece suporte nutricional aos microrganismos. Em comparação com formulações contendo BPCP não imobilizadas, as formulações contendo células imobilizadas em matrizes poliméricas apresentam maior vida útil de prateleira e maior eficácia de utilização devido à manutenção de elevadas populações microbianas por períodos prolongados e pela proteção contra condições ambientais desfavoráveis (Bayat; Hassanshahian; Cappello, 2015). Entretanto, não existe um método universal aplicado à imobilização de BPCP; é preciso considerar características relacionadas aos microrganismos utilizados e ao processo pretendido, bem como as características de transporte, armazenamento e aplicação para escolha de uma matriz polimérica adequada (Pilkington et al., 1998; Zur et al. 2016). Em adição, a aplicação pretendida possui influência no método de imobilização de células microbianas pois define a viabilidade econômica do processo (Wang et al., 2005). Os métodos tradicionais de imobilização de células compreendem técnicas baseadas em características naturais dos microrganismos imobilizados, que incluem formação de biofilmes e adesão ou adsorção em suporte sólido; técnicas artificiais de imobilização de células, que incluem encapsulação ou engaiolamento do microrganismo em uma matriz porosa com auxílio de agentes ligantes; e técnicas de agregação de células, como a floculação, que pode ser natural ou artificial (Covizzi et al., 2007).

[03] Técnicas de imobilização de células microbianas em suportes sólidos aparecem como uma opção importante para aplicações agrícolas que objetivam interações positivas entre plantas e microrganismos. Estas técnicas podem ser utilizadas para imobilização de células sobre sementes e outros materiais de propagação (estacas e mudas, por exemplo), recipientes de cultivo (vasos e outros recipientes), plantas jovens etc. Os materiais utilizados para a imobilização das células microbianas precisam ser atóxicos e biodegradáveis, apresentar eficiência e versatilidade para uso com diferentes tipos celulares, condições de solo e clima, e manter suas características durante o ciclo de vida do inoculante. Para aplicações agrícolas e ambientais, as técnicas de imobilização precisam fornecer abrigo temporário para as estirpes de BPCP selecionadas, garantir a manutenção da viabilidade das células imobilizadas durante o ciclo de vida dos bioprodutos e proporcionar sua liberação no ambiente em que se espera sua atividade promotora de crescimento de plantas (Bashan et al., 2014).

[04] A imobilização celular é uma abordagem biotecnológica ativamente utilizada na preparação e formulação de inoculantes com potencial parcialmente inexplorado. Após um período de 15 anos de pesquisa intensiva sobre vários modelos de células imobilizadas de BPCV, ainda há falta de processos inovadores para a formulação de produtos de fertilização do solo (Bashan et al., 2014; Vassilev et al., 2020). Neste contexto, métodos de imobilização que utilizem matrizes poliméricas de origem natural como o amido e a gelatina, em conjunto com polímeros de origem microbiana naturalmente produzidos durante o período de produção de biomassa celular (induzidos a uma elevada expressão por meio de formulações do meio de crescimento), permitem alcançar características desejáveis para imobilização de células em suportes sólidas. Estas características incluem o baixo custo das formulações, a facilidade de escalonamento dos processos de produção, atoxidade dos componentes utilizados, proteção dos microrganismos imobilizados contra condições ambientais adversas, manutenção da viabilidade celular por longos períodos. A imobilização de BPCP em suportes biodegradáveis capazes de modificar o perfil funcional e nutritivo do solo, durante o processo de mineralização (decomposição) destes materiais, pode levar ao menor requerimento de fertilizantes químicos industriais pelos cultivos agrícolas comerciais, e consequentemente, promover impactos positivos na sustentabilidade de ecossistemas e na segurança alimentar e econômica da população brasileira.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[05] WO2012055000A1 (27/10/2010); compreende imobilização de BPCV em fibra de coco com adição de nutrientes e fatores de crescimento microbiano, adjuvantes como carboximetilcelulose, goma arábica, alginato de sódio e de agentes osmóticos, reguladores e solução tampão. A patente utiliza o método de imobilização por adsorção, seguida de aplicação de materiais poliméricos sobre os biofilmes microbianos para reforço da imobilização. Esta patente difere do presente pedido de proteção intelectual, que não utiliza os adjuvantes nem os agentes. A composição da formulação é substancialmente diferente do pedido de proteção intelectual apresentado. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente.

[06] PI 1004766-2 (05/11/2010); utiliza o amido como substrato de transformação por células microbianas imobilizadas em suportes sólidos, com a imobilização de células microbianas realizada pela técnica de adsorção.

[07] BR 13 2012 029862 6 (23/11/2012); refere-se à imobilização de BPCV por adsorção, em espumas de biocompósito (amido, bagaço de cana-de açúcar e nutrientes) produzido por extrusão. A invenção descreve o suporte sólido que terá células microbianas imobilizadas pelo processo de adsorção. A composição da formulação é substancialmente diferente do pedido de proteção intelectual apresentado. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente.

[08] BR 10 2017 006046 2 A2 (23/03/2017); descreve uma matriz polimérica constituída por amido, gelatina e álcool polivinílico, glicerol e minerais de argila (montmorilonita). A matriz polimérica é definida para aplicação sobre sementes de importância agrícola. A composição da formulação é substancialmente diferente do pedido de proteção intelectual apresentado - o pedido de patente BR 10 2017 006046 2 A2 contém em sua composição álcool polivinílico (0,01 a 33%) e montmorilonita (nanoargila sódica não modificada a 0,2g/100g de polímero), que estão ausentes no pedido de proteção intelectual encaminhado por este formulário. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente (os polímeros componentes da formulação ref. à patente BR 10 2017 006046 2 A2 são preparados separadamente e misturados para formar a matriz polimérica final).

[09] BR 10 2019 013058 0 (24/06/2019); descreve um processo de imobilização de células microbianas em uma matriz polimérica formada por amido e alginato de potássio. A invenção não prevê aplicação para imobilização de células sobre suportes sólidos. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.

[010] BR 10 2020 012831 (A2) (04/01/2022); descreve um processo de imobilização de enzima (lipase) em base polimérica contendo os biopolímeros quitosana e amido. A invenção não prevê aplicação para imobilização de células sobre suportes sólidos. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.

[011] JPS63294783A (01/12/1988); descreve um processo de imobilização de células em duas etapas, com uma primeira etapa de mistura de uma cultura de células bacterianas e um agente gelificante, e uma segunda etapa onde um material solúvel também gelificante é adicionado. A invenção não prevê aplicação para imobilização de células sobre suportes sólidos. A composição da formulação é substancialmente diferente do pedido de proteção intelectual apresentado.

[012] JPH035401A (11/01/1991); descreve um método de imobilização de células microbianas em suporte sólido, utilizando gelatina e ágar como agentes imobilizantes. A invenção não utiliza amido na composição de sua formulação. O método de imobilização descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente. A formulação de imobilização de células microbianas descrita é substancialmente diferente da formulação descrita no pedido de patente.

[013] US5595893A (19/06/1992); descreve um suporte sólido formado por uma mistura de materiais poliméricos sintéticos e materiais naturais, para uso como suporte na imobilização de células microbianas. A invenção descreve o suporte sólido que terá células microbianas imobilizadas pelo processo de adsorção. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação. A invenção utiliza o amido como componente acessório da formulação. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente.

[014] RO123027B1 (30/07/2010); descreve um processo de imobilização de células microbianas em compósitos orgânicos (matriz biopolimérica) como suporte sólido, por adição de suspensão de células microbianas em uma matriz gelificante (amido, p. ex.). A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.

[015] US 2012/0270735 A1 (22/04/2011); trata da imobilização de BPCV utilizando quitina coloidal adicionada à suspensão de células bacterianas, talco (filossicato de magnésio), matéria orgânica mineralizada (vermicomposto, produzido por anelídeos) e esterco bovino. Esta patente difere do presente pedido de proteção intelectual, que não utiliza a quitina nem os materiais utilizados como suporte. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação. A invenção não utiliza amido na composição de sua formulação. A composição da formulação é substancialmente diferente do pedido de proteção intelectual apresentado. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente.

[016] CN106636060A (10/05/2017); descreve um processo de imobilização de células microbianas em uma matriz polimérica formada por álcool polivinílico, alginato de sódio, carvão ativado, casca de crustáceos em pó, kieselguhr e amido. A invenção não prevê aplicação para imobilização de células sobre suportes sólidos. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.

[017] WO2017114999A1 (06/07/2017); descreve um processo de imobilização de células microbianas em resíduos orgânicos (aparas de madeira) como suporte sólido, por adsorção seguida de cobertura por uma camada de amido gelificado. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação. A invenção é específica para aplicações na indústria de produção de vinhos.

[018] CN107821893A (23/03/2018); descreve um processo de imobilização de células microbianas em uma matriz polimérica formada por alginato de sódio. A invenção não prevê aplicação para imobilização de células sobre suportes sólidos. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.

[019] CN109439646A (08/03/2019); descreve um material orgânico para imobilização de microrganismos, cuja composição contém amido. A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação. A invenção utiliza o amido como componente acessório da formulação. O método de preparo descrito é substancialmente diferente do método descrito neste pedido de patente.

[020] JP2019103459A (27/06/2019); descreve um processo de imobilização de células microbianas em matriz orgânica (grafite) como suporte sólido, por adição de suspensão de células microbianas em uma matriz gelificante (amido) e uma resina (álcool polivinílico). A invenção não utiliza gelatina na composição de sua formulação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[021] A presente invenção descreve uma metodologia de imobilização de células vivas em suportes orgânicos sólidos, como sementes, péletes, suportes para o crescimento de plantas (vasos e tubetes), raízes de plantas, frutos e outros alimentos, e qualquer outra superfície orgânica de interesse. O processo descrito utiliza materiais poliméricos naturais e biodegradáveis, adicionados de substâncias nutrientes aos microrganismos imobilizados. Ocorre em duas etapas, onde uma solução adesiva contendo as células microbianas vivas garante a imobilização destas células sobre uma superfície orgânica, e uma segunda etapa onde um revestimento sacrificante de umidade com base em um filme de amido-gelatina que recobre a solução adesiva para garantir a viabilidade e sobrevivência das células microbianas imobilizadas na matriz orgânica, por longos períodos. Este revestimento sacrificante de umidade possui a função exclusiva de manter hidratadas a solução adesiva e as células imobilizadas por esta solução, de modo a garantir a funcionalidade deste biosistema por períodos prolongados de armazenamento em prateleira. Dentre as características positivas da tecnologia descrita, compreendem o uso de soluções poliméricas naturais, biodegradáveis e solúveis que possibilitam seu uso sobre qualquer superfície orgânica; a rapidez do processo de imobilização, a liberação continuada das células imobilizadas quando expostas à elevada umidade, a função protetora e nutricional da matriz polimérica adesiva que proporciona uma rápida ativação e multiplicação das células imobilizadas quando são mobilizadas para o ambiente.

[022] O micro-organismo utilizado para o processo de imobilização descrito a seguir constitui uma bactéria promotora do crescimento de plantas - BPCP, já de uso comercial consagrado no Brasil e registrada no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento para uso em diversas culturas agrícolas. Este microrganismo é identificado como pertencente à espécie Azospirillum brasilense, estirpe Ab-V5, e constitui uma bactéria Gram-negativa utilizada como modelo para a validação do processo de imobilização em superfície orgânica descrito neste pedido de proteção intelectual. O processo desenvolvido e descrito a seguir não se limita à imobilização da espécie bacteriana descrita, e pode ser aplicado para a imobilização de qualquer espécie bacteriana em qualquer superfície orgânica sólida.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[023] A biomassa celular de Azospirillum brasilense Ab-V5 utilizada no processo de imobilização foi obtida após seu cultivo em meio de cultura MCA4 por 72 h a 28°C e agitação orbital de 180 rpm. A cultura celular obtida foi utilizada para o preparo de uma suspensão adesiva na densidade de 1 x 10A9 células por mL. A composição da suspensão adesiva é produzida a partir da mistura dos seguintes componentes e respectivas quantidades:

Suspensão adesiva

[024] Solubilização de goma xantana (0,05 a 1%, p/v) em mistura de glicerol (10 a 30%, v/v) em água destilada a 70 °C sob agitação, por 10 a 60 min. Após a obtenção de uma solução homogênea, a solução é resfriada a 60 °C e ainda sob agitação, é adicionada dos seguintes nutrientes: K2HPO4 (0,5 a 2%, p/v), KH2PO4 (0,2 a 2%, p/v), sacarose/açúcar cristal (0,2 a 2%, p/v), maltose (0,2 a 2%, p/v), extrato de levedura (0,05 a 1%, p/v), NH4NO3 (0,05 a 1%, p/v), MgSO4 (0,05 a 1%, p/v), polivinil-pirrolidona (0,01 a 1%, p/v), NaCl (0,001 a 0,1%, p/v), EDTA férrico (0,5 a 5 mM, concentração final) e solução de micronutrientes* (0,5 a 5%, v/v). Após a incorporação dos nutrientes à suspensão adesiva e com a solução mantida sob agitação a 60 °C, é feita a adição de amido (obtido de qualquer fonte; 2 a 20%, p/v) gradualmente e o ajuste do pH da solução adesiva para o valor de pH = 6,8. A solução adesiva deve ser esterilizada por calor úmido (autoclave a 121° C e pressão de 1 atm por 15 min) e resfriada a temperatura ambiente. A solução adesiva preparada como indicado acima é adicionada de células vivas de microrganismos (1 x 10A3 a 1 x 10A10 células mL-1 solução adesiva).

[025] A imobilização de células microbianas vivas sobre superfície orgânica utilizando a solução adesiva descrita deve ser realizada como descrito a seguir. Sob condições assépticas (p. ex., em cabine de segurança biológica classe 1) e temperatura ambiente, faz-se a imersão do material na solução adesiva pelo período de 20 a 60 min, seguida de sua emersão e secagem por 30 a 90 min em temperatura ambiente. O material seco e contendo células microbianas imobilizadas vivas segue para uma etapa adicional de revestimento com um material sacrificante de umidade (revestimento secundário) para proteção das células imobilizadas contra a dessecação.

Revestimento secundário

[026] O revestimento secundário é obtido pela imersão do material sólido orgânico contendo as células imobilizadas por 20-60 min em solução de amido-gelatina, preparada a partir da mistura de amido obtido de qualquer fonte (2 a 20%, p/v), gelatina (2 a 20%, p/v) e glicerol (0,01 a 2%, p/v). A solução filmogênica sacrificante é produzida a partir da mistura de gelatina obtida de colágeno (2 a 20%), amido obtido de qualquer fonte (2 a 20%, p/v), glicerol (0,01 a 2%, p/v) e água. Estes componentes são mantidos sob agitação a 50-80°C por 30-90 min para a formação de uma solução homogênea, agora denominado de revestimento secundário. Este revestimento secundário sacrificante deve recobrir o material sólido orgânico contendo as células imobilizadas, onde esta etapa pode ser realizada por imersão do material sólido orgânico contendo as células imobilizadas por 20-60 min na solução de revestimento secundário. A aplicação do revestimento secundário sobre o material sólido orgânico contendo células microbianas imobilizadas não se limita ao procedimento de imersão descrito. Após a aplicação do revestimento secundário (por imersão, por exemplo), os materiais são removidos da solução e secos por 30 a 90 min sob temperatura ambiente. Após a secagem, os materiais contendo células microbianas vivas e imobilizadas em sua superfície orgânica são embalados e armazenados sob temperatura ambiente até o momento de seu uso.

[027] O presente pedido de proteção intelectual descreve um processo para a imobilização de células bacterianas vivas que pode ser aplicado sobre diferentes matrizes orgânicas sólidas. A técnica descrita é baseada no engaiolamento do microrganismo sobre uma matriz orgânica, com auxílio de uma solução adesiva cuja base da formulação compreende um biopolímero orgânico natural, o amido geleificado. Esta base adesiva é adicionada de compostos nutrientes e compostos de proteção celular, em adição à uma suspensão de células vivas contendo uma ou mais espécies microbianas em elevada densidade de população. Após a imobilização de células microbianas em uma superfície orgânica, o material contendo as células imobilizadas é adicionado de um segundo revestimento sacrificante, que proporciona proteção das células imobilizadas contra a dessecação, e assim garante a viabilidade dos microrganismos imobilizados por períodos prolongados de armazenamento em prateleira. Este processo foi utilizado para imobilização do microrganismo promotor do crescimento de plantas Azospirillum brasilense, uma bactéria Gram-negativa registrada no MAPA para uso como bioinsumo em diversas culturas agrícolas. O processo de imobilização deste microrganismo sobre uma superfície sólida orgânica foi realizado sobre um biocompósito moldado por injeção para exemplificar a eficiência e viabilidade do processo descrito, que não se limita à aplicação sobre este tipo de matriz sólida orgânica. O processo de imobilização descrito proporcionou a manutenção da viabilidade da bactéria promotora do crescimento de plantas Azospirilum brasilense estirpe Ab-V5, em elevadas densidades de população, por mais de 56 dias de armazenamento sob condição ambiente (condição de prateleira), como apresentado na Figura 1 e gráfico 1. A mobilização das células microbianas nestes suportes foi avaliada por meio de sua imersão em água pura e em um substrato úmido, formado por areia com 30% de umidade, onde a liberação gradual das células imobilizadas foi observada. Quando imersa em água, a matriz orgânica contendo células imobilizadas proporcionou a completa liberação das células imobilizadas em 3 horas de imersão do material bacterizado, e promoveu a multiplicação continuada dos microrganismos mobilizados após 6 horas de imersão, como resultado do consumo dos nutrientes componentes da solução ligante pelos microrganismos. Quando imersos em substrato úmido, a liberação de células foi mais gradual e continuada, com liberação parcial das células imobilizadas após 24 horas de contato com o substrato úmido, como observado na Tabela 1.

[028] Gráfico 1. Sobrevivência de Azospirillum brasilense Ab-V5 imobilizadas em matriz orgânica moldada por injeção (pedido de patente BR1020180072269, 10/04/2018) e mantidas em condições de bancada (70% UR; 28 °C). As contagens foram baseadas no crescimento de microrganismos em meio de cultivo, após tempos variados de armazenamento sob condições de bancada.

[029] Tabela 1. Mobilização de células de Azospirillum brasilense Ab-V5 após diferentes tempos de imersão em água ou substrato úmido (areia, 30% umidade). As células bacterianas foram imobilizadas em matriz orgânica moldada por injeção (pedido de patente BR1020180072269, 10/04/2018) na concentração de 1,0 x 109 células por grama de matriz orgânica. As contagens foram baseadas no crescimento de microrganismos em meio de cultivo nos diferentes tempos de imersão da matriz orgânica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

[030]Figura 1 – Micrografias de MEV da morfologia de A. brazilense Ab-V5 imobilizadas em matriz orgânica moldada por injeção (pedido de patente BR1020180072269, 10/04/2018) e mantidas em condições de bancada (70% UR; 28 °C). Após armazenamento de 7 dias (a - surperfície; b – fratura) e de 56 dias (a - surperfície; d – fratura).

Claims

1) MÉTODO DE IMOBILIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO DE PLANTAS EM SUPERFÍCIES ORGÂNICAS, caracterizado por ser um processo de imobilização de células vivas em suportes orgânicos sólidos, com utilização de materiais poliméricos naturais e biodegradáveis, adicionados de substâncias nutrientes aos microrganismos imobilizados, possuindo a utilização do microorganismo pertencente à espécie Azospirillum brasilense, estirpe Ab-V5;

2) MÉTODO DE IMOBILIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO DE PLANTAS EM SUPERFÍCIES ORGÂNICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela construção em duas etapas: Suspensão adesiva e Revestimento secundário; I. Suspensão adesiva: Solubilização de goma xantana (0,05 a 1%, p/v) em mistura de glicerol (10 a 30%, v/v) em água destilada a 70 °C sob agitação, por 10 a 60 min; Após a obtenção de uma solução homogênea, a solução é resfriada a 60 °C e ainda sob agitação, é adicionada dos seguintes nutrientes: K2HPO4 (0,5 a 2%, p/v), KH2PO4 (0,2 a 2%, p/v), sacarose/açúcar cristal (0,2 a 2%, p/v), maltose (0,2 a 2%, p/v), extrato de levedura (0,05 a 1%, p/v), NH4NO3 (0,05 a 1%, p/v), MgSO4 (0,05 a 1%, p/v), polivinil-pirrolidona (0,01 a 1%, p/v), NaCl (0,001 a 0,1%, p/v), EDTA férrico (0,5 a 5 mM, concentração final) e solução de micronutrientes* (0,5 a 5%, v/v); Após a incorporação dos nutrientes à suspensão adesiva e com a solução mantida sob agitação a 60 °C, é feita a adição de amido (obtido de qualquer fonte; 2 a 20%, p/v) gradualmente e o ajuste do pH da solução adesiva para o valor de pH = 6,8; A solução adesiva preparada como indicado acima é adicionada de células vivas de microrganismos (1 x 10A3 a 1 x 10A10 células mL-1 solução adesiva); O material seco e contendo células microbianas imobilizadas vivas segue para uma etapa adicional de revestimento com um material sacrificante de umidade (revestimento secundário) para proteção das células imobilizadas contra a dessecação; II. Revestimento secundário: obtido pela imersão do material sólido orgânico contendo as células imobilizadas por 20-60 min em solução de amido- gelatina, preparada a partir da mistura de amido obtido de qualquer fonte (2 a 20%, p/v), gelatina (2 a 20%, p/v) e glicerol (0,01 a 2%, p/v); A solução filmogênica sacrificante é produzida a partir da mistura de gelatina obtida de colágeno (2 a 20%), amido obtido de qualquer fonte (2 a 20%, p/v), glicerol (0,01 a 2%, p/v) e água; mantidos sob agitação a 50-80 °C por 30-90 min para a formação de uma solução homogênea;

3) MÉTODO DE IMOBILIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO DE PLANTAS EM SUPERFÍCIES ORGÂNICAS, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por ser um processo para a imobilização de células bacterianas vivas que pode ser aplicado sobre diferentes matrizes orgânicas sólidas; A técnica descrita é baseada no engaiolamento do microrganismo sobre uma matriz orgânica, com auxílio de uma solução adesiva cuja base da formulação compreende um biopolímero orgânico natural, o amido geleificado;