BR112019018593A2 - fagoterapia - Google Patents

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Abstract

a presente invenção se refere à terapia de bacteriófagos. mais particularmente, a presente invenção se refere a bacteriófagos inovadores que têm uma alta especificidade em relação a cepas de staphylococcus aureus, sua fabricação, componentes dos mesmos, composições que compreendem os mesmos e aos usos dos mesmos em fagoterapia e como diagnóstico adjunto.

Description

FAGOTERAP ΙΑ [0001] A presente invenção se refere a composições de bacteriófago inovadoras, sua fabricação e os usos das mesmas. A invenção é particularmente adequada para o tratamento de uma infecção em seres humanos e animais. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] Os bacteriófagos (ou fagos) são virus pequenos que têm a capacidade de infectar e exterminar bactérias ao mesmo tempo não afetam as células de outros organismos. Inicialmente descrito há um século por William Twort, e independentemente revelado brevemente desde então por Felix d'Herelle, mais de 6000 bacteriófagos diferentes foram expostos até agora e descritos morfologicamente, incluindo virus bacterianos e arqueais. A grande maioria desses virus tem cauda, enquanto uma pequena proporção é poliédrica, filamentosa ou pleomórfica. Os mesmos podem ser classificados de acordo com sua morfologia, seu conteúdo genético (DNA versus RNA), seu hospedeiro especifico, o local em que vivem (virus marinho versus outros habitats), e seu ciclo de vida. Como os parasitas intracelulares de células bacterianas, fagos exibem diferentes ciclos de vida dentro do hospedeiro bacteriano: litico, lisogênico e pseudolisogênico (Weinbauer, 2004; Drulis-Kawa, 2012). Os fagos liticos causam a lise da célula bacteriana hospedeira como uma parte normal de seus ciclos de vida. Os fagos lisogênicos (também denominados fagos temperados) podem se replicar por meio do ciclo de vida litico e causar a lise da bactéria hospedeira, ou podem incorporar seu DNA no DNA bacteriano hospedeiro e se tornar pró-fagos não
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2/53 infecciosos. A pseudolisogenia pode ser definida como o estágio de desenvolvimento paralisado de um bacteriófago em uma célula hospedeira sem a multiplicação ou replicação (M Los$$, 2012). Independentemente do tipo de ciclo de fago, a primeira etapa é a ligação aos receptores da parede celular bacteriana antes que o material genético de fago possa entrar nas bactérias. Esse processo especifico define o espectro das bactérias que um fago interage.
[0003] Os bacteriófagos são comumente usados como ferramentas de pesquisa para modificar as bactérias em experimentos de laboratório.
[0004] Devido a sua especificidade de célula-alvo hospedeira, considerou-se o uso de fagos como uma terapia para tratar infecções crônicas e agudas, particularmente em dermatologia, oftalmologia, urologia, estomatologia, pediatria, otorrinolaringologia ou cirurgia. Esse conceito de uso terapêutico de fagos para tratar infecções bacterianas foi, no entanto, altamente controverso desde o inicio e não amplamente aceito pelo público ou pela comunicada médica. Estudos precoces foram amplamente criticados por falta de controles apropriados e resultados inconsistentes. A falta de reprodutibilidade e muitos resultados discrepantes obtidos em vários estudos publicados levaram o Conselho de Farmácia e Química da Associação Médica Americana a concluir que a evidência para o valor terapêutico de filtrados de lítico era, na maioria das vezes, contraditória, pouco conveniente e recomendava pesquisas adicionais para confirmar seus supostos benefícios.
[0005] Desde a introdução de antibióticos nos anos 40,
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3/53 foi dada pouca atenção a esse campo de produtos terapêuticos, especialmente no mundo ocidental. Porém, o uso extensivo de antibióticos levou ao surgimento generalizado de bactérias resistentes a antibióticos em todo o mundo, causando problemas cada vez mais sérios. Portanto, tornou-se um grande desafio superar as opções terapêuticas limitadas restantes, que ainda estão disponíveis para tratar os principais micróbios resistentes a múltiplos fármacos.
[0006] Staphylococcus aureus (S. aureus) é uma bactéria do tipo cocos gram-positivos que é frequentemente encontrada no nariz, trato respiratório e na pele. S. aureus se distingue de outras espécies estafilocócicas com base na pigmentação dourada de colônias e resultados positivos de coagulase, fermentação de manitol e teste de desoxirribonuclease. S. aureus é um dos patógenos mais importantes mundialmente e emergiu como um organismo proeminente que infecta pessoas gravemente doentes.
[0007] S. aureus pode ser um patógeno comensal, mas também um patógeno perigoso. Aproximadamente 30 % da população humana é colonizada com S. aureus. A infecção por S. aureus é a principal causa de doença de pele, de tecido mole, respiratória, óssea, articulação e endovascular como, por exemplo, abscessos na pele, infecções de feridas, endocardite, osteomielite, pneumonia e sindrome do choque tóxico. S. aureus é particularmente hábil em infectar corpos estranhos dentro do hospedeiro humano. Nesses casos, S. aureus forma tipicamente um biofilme na superfície de um dispositivo estranho (como dispositivos cardíacos implantáveis, cateter intravascular, próteses, stents...),
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4/53 dificultando a erradicação da infecção sem remoção cirúrgica do dispositivo. S. aureus pode se aclimatar no interior das células, onde encontra proteção contra os mecanismos de defesa do hospedeiro e da maioria dos antibióticos.
[0008] 0 número de infecções estafilocócicas continua a aumentar enquanto o tratamento dessas infecções se torna ainda mais difícil devido ao surgimento de cepas estafilocócicas resistentes a múltiplos antibióticos,
incluindo meticilina ou vancomicina. Nos Estados Unidos e
no Reino Unido, 40 % a 60 % das cepas nosocomiais S. aureus
são resis tentes a múltiplos fármacos.
[0009] Portanto, há uma grande necessidade de novas
composições ou agentes antibacterianos que podem ser usados para destruir ou controlar as cepas S. aureus, adequadas para uso em terapia humana ou animal, bem como para descontaminação de materiais.
[0010] A terapia experimental com fago contra S. aureus foi testada em camundongos (Capparelli et al., 2007), sem desenvolvimento para uso humano. Portanto, tendo em vista a alta potência de aquisição de resistência de S. aureus, há uma necessidade de composições ou agentes antibacterianos inovadores que podem ser usados para exterminar cepas de S. aureus incluindo as cepas problemáticas resistentes à meticilina (MRSA).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0011] Os inventores isolaram e caracterizaram bacteriófagos inovadores que apresentam forte atividade litica contra cepas de Staphylococcus aureus (S. aureus). Esses bacteriófagos, em separado ou em combinações,
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5/53 fornecem efeito antibacteriano muito potente e podem ser usados como agentes ativos em preparações farmacêuticas ou veterinárias, particularmente para tratar infecções bacterianas de S. aureus.
[0012] Um objetivo da invenção consiste em fornecer composições antibacterianas que compreendem pelo menos um bacteriófago que tem atividade litica contra pelo menos uma cepa de Staphylococcus aureus (S. aureus) , em que o dito pelo menos um bacteriófago é selecionado a partir dos bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma.
[0013] Um objetivo adicional da invenção se refere a um bacteriófago que tem atividade litica para uma cepa S. aureus e que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma.
[0014] A invenção se refere adicionalmente a uma molécula de ácido nucleico isolado contida em um bacteriófago da invenção, de preferência, uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma, bem como um polipeptídeo isolado codificado pelo dito ácido nucleico.
[0015] Um outro objetivo da invenção consiste em uma composição que compreende um ácido nucleico ou polipeptídeo como definido acima.
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6/53 [0016] As composições da invenção compreendem adicional e tipicamente um excipiente ou carreador aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou veterinário. As mesmas podem ser liquidas, semiliquidas, sólidas ou liofilizadas.
[0017] Um outro objetivo da invenção se refere a um bacteriófago, ácido nucleico, polipeptídeo ou composição, como definido acima, para uso no tratamento de uma infecção em seres humanos e animais, para modificar a flora microbiana do humano ou animal, para descentaminar um material, para exterminar ou controlar uma bactéria S. aureus e/ou para comprometer a integridade de um biofilme bacteriano gerado por uma bactéria S. aureus e/ou para descontaminar alimentos e bebidas.
[0018] A invenção também se refere a um bacteriófago, ácido nucleico, polipeptídeo ou composição como definido acima, para uso para melhorar uma condição do indivíduo modificando-se a flora microbiana no dito indivíduo. A flora microbiana pode ser modificada pela correção, adaptação ou restauração de um equilíbrio apropriado de microrganismos na dita flora.
[0019] A invenção também se refere a um método para tratar uma infecção em seres humanos ou animais, que compreende a administração aos ditos humanos ou animais de pelo menos um bacteriófago, ácido nucleico, polipeptídeo ou composição como definido acima.
[0020] A invenção também se refere a um método para tratar uma superfície ou material suspeito de estar contaminado com uma bactéria S. aureus, que compreende aplicar à dita superfície ou material pelo menos um bacteriófago, ácido nucleico, polipeptídeo ou composição
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7/53 como definido acima. A superfície ou material pode ser uma superfície de qualquer dispositivo, vaso, material de laboratório, roupas, calçados, equipamentos militares, sistemas de resfriamento de ar, alojamentos, etc.
[0021] Um objetivo adicional da invenção se refere a um kit que compreende uma composição como definido acima e um meio para aplicar o mesmo a um indivíduo ou uma superfície. [0022] A invenção pode ser usada sobre e em qualquer ser humano ou animal, de preferência, seres humanos ou para tratar qualquer material, incluindo materiais de laboratório ou dispositivos médicos dentro ou fora de seres humanos ou animais.
[0023] Um outro objetivo da invenção se refere a um método para determinar um coquetel de bacteriófagos eficazes contra um alvo de cepa de S. aureus, que compreende:
a) colocar separadamente uma cepa de S. aureus alvejada, ou uma amostra que contém a dita cepa, em contato com (i) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e/ou (ii) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e/ou (iii) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e/ou (iv) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e (v)
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8/53 uma ou mais combinações dos mesmos;
b) selecionar bacteriófago (ou bacteriófagos) que exibe (ou exibem) atividade lítica na cepa,
c) opcionalmente, selecionar adicionalmente bacteriófagos ativos que, quando combinados juntos, exibem atividade sinérgica na cepa; e/ou
d) opcionalmente, selecionar adicionalmente bacteriófagos ativos que, quando combinados juntos, não exibem antagonismo; e/ou
e) selecionar opcionalmente bacteriófagos ativos que pertencem a diferentes gêneros; e
f) combinar os ditos bacteriófagos selecionados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0024] A presente invenção se refere a bacteriófagos inovadores, componentes dos mesmos, composições que compreendem os mesmos, sua fabricação, e os usos dos mesmos como agentes antibacterianos, particularmente para o tratamento de uma infecção em seres humanos ou animais ou para melhorar uma condição do indivíduo modificando-se a flora microbiana no dito indivíduo.
Definições [0025] Para facilitar o entendimento da invenção, vários termos são definidos abaixo.
[0026] Como usado no presente documento, o termo bacteriófago ou fago se refere a uma partícula de fago funcional que compreende um genoma de ácido nucleico aglomerado em um envelope ou capsídeo proteáceo. 0 termo também se refere a porções do bacteriófago, incluindo, por exemplo, uma porção de cabeça ou um conjunto de componentes de fago, que fornecem substancialmente a mesma atividade
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9/53 funcional.
[0027] 0 termo característica fenotípica designa, com mais preferência, a morfologia e/ou faixa de hospedeiro de um bacteriófago. Os métodos para fenotipar os bacteriófagos são bem conhecidos per se na técnica e incluem, por exemplo, determinar a faixa de hospedeiro bacteriano e/ou atividade contra o biofilme produzido por certas cepas bacterianas.
[0028] 0 termo atividade iítica como usado na invenção designa a propriedade de um bacteriófago causar a lise de uma célula bacteriana. A atividade iítica de um bacteriófago pode ser testada em cepas de S. aureus de acordo com as técnicas conhecidas per se na técnica (consulte também a seção experimental).
[0029] 0 termo variante de um bacteriófago de referência designa um bacteriófago que tem variação (ou variações) na sequência genômica e/ou polipeptídeo (ou polipeptídeos) codificado através da mesma como comparado ao dito bacteriófago de referência. As ditas variantes podem ter diferentes características fenotípicas como uma diferente faixa de hospedeiro bacteriano em comparação ao bacteriófago de referência. Em um aspecto particular, uma variante pode ser obtida por evolução direcionada (também chamada de treinamento de fago) que permite que a variante adquira uma atividade iítica em uma ou diversas cepas bacterianas. As variantes exibem tipicamente a mesma morfologia em comparação ao bacteriófago de referência. Tipicamente, o bacteriófago de referência tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das SEQ TD NOs: 1-4.
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As variantes compreendem tipicamente, por exemplo, mutações silenciosas, mutações conservadoras, deleções menores e/ou replicações menores de material genético. Em uma modalidade preferencial, as variantes de acordo com a invenção retêm qualquer propriedade ou característica observável que é dependente do genoma do bacteriófago da invenção, por exemplo, características fenotípicas do dito bacteriófago e/ou atividade lítica contra as cepas S. aureus. As variantes preferenciais têm menos que 5 % de variação de ácido nucleico como comparado ao genoma do bacteriófago de referência, ainda com mais preferência, menos que 4 %, com mais preferência, menos que 2 %. Alternativamente ou em combinação, as variantes têm, de preferência, menos que 5 % de variação de aminoácido em uma sequência de polipeptídeos codificada como comparado a um polipeptídeo do bacteriófago de referência.
[0030] 0 termo especifico ou especificidade em relação a um bacteriófago se refere ao tipo de hospedeiro que o dito bacteriófago tem capacidade de infectar. Um bacteriófago especifico para S. aureus, com mais preferência, designa um bacteriófago que pode infectar uma ou várias cepas de S. aureus e que não infecta essencialmente bactérias não S. aureus sob condições fisiológicas.
[0031] Como usado no presente documento, o termo polipeptídeo se refere a polipeptídeos de qualquer tamanho, incluindo peptídeos pequenos, por exemplo, de 5 a 20 aminoácidos, polipeptídeos mais longos, proteínas ou fragmentos dos mesmos.
[0032] No contexto do presente relatório descritivo
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11/53 específico, considera-se que o termo bacteriófago isolado significa um bacteriófago que é removido de seu ambiente natural e/ou separado de um componente de seu ambiente natural e/ou é concebido a partir da evolução direcionada. 0 termo designa, particularmente, um fago que é, por exemplo, cultivado in vitro, purificado e/ou formulado com qualquer produto adequado para formulação, como diluente (ou diluentes) ou excipiente (ou excipientes). Em relação a um ácido nucleico ou polipeptídeo, o termo isolado designa, por exemplo, um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico que é separado de pelo menos um componente de seu ambiente natural como, por exemplo, uma proteína, lipídio, carboidrato e/ou ácido nucleico.
[0033] Os termos aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou veterinário como usado no presente documento se refere a qualquer material (por exemplo, carreador, excipiente ou diluente) que é compatível para uso em um indivíduo humano ou animal. Tal inclui veículos ou soluções fisiologicamente aceitáveis que são inofensivos ou não causam qualquer reação imune não especifica ou específica significativa a um organismo ou não anulam a atividade biológica do composto ativo. Para a formulação da composição em uma preparação líquida, solução salina, água estéril, solução de Ringer, solução salina fisiológica tamponada, solução de infusão de albumina, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol, etanol e misturas dos mesmos podem ser usados como um excipiente ou carreador aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou veterinário. Se necessário, outros aditivos convencionais, como espessantes, diluentes, tampões, conservantes, agentes
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12/53 ativos de superfície, antioxidantes e agentes bacteriostáticos pode ser adicionados. Além disso, diluentes, dispersantes, tensoativos, aglutinantes e lubrificantes podem ser adicionalmente adicionados à composição para preparar formulações injetáveis, como soluções aguosas, suspensões e emulsões, formulações orais, como pílulas, cápsulas, grânulos ou comprimidos ou formulações em pó e formulações aerolisadas, como líquidos ou pós.
[0034] Como usado no presente documento, PFU significa unidade de formação de placa, como é bem definido na técnica. Os bacteriófagos líticos lisam a célula hospedeira, causando uma zona de clareamento (ou placa) em uma placa de cultura. Teoricamente, cada placa é formada por um fago e o número de placas multiplicado pelo fator de diluição é igual ao número total de fagos em uma preparação de teste.
[0035] Como usado no presente documento, CFU significa unidade de formação de colônia, como é bem definido na técnica para estimar o número de bactérias viáveis em uma amostra.
[0036] 0 termo tratamento ou terapia designa um tratamento curativo ou um tratamento profilático de uma doença. Um tratamento curativo é definido como um tratamento que resulta em uma cura de uma doença ou um tratamento que atenua, reduz, estabiliza ou elimina os sintomas de uma doença ou o sofrimento causado pela mesma, direta ou indiretamente, ou que melhora uma condição do indivíduo ou reduz a progressão de uma doença. Um tratamento profilático compreende um tratamento que resulta
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13/53 na prevenção de uma doença e/ou um tratamento que reduz e/ou retarda a incidência de uma doença ou o risco de sua ocorrência.
[0037] 0 termo bíofílme como usado no presente documento designa uma formação bacteriana heterogênea que cresce em várias superfícies; de preferência, uma comunidade bacteriana que cresce embutida em uma matriz de exopolissacarídeo aderida sobre superfícies sólidas biológicas ou não biológicas.
[0038] 0 termo comprometer como usado no presente documento se refere a qualquer alteração da integridade. Comprometer um bíofílme bacteriano se entende como uma
desnaturação e/ou uma penetração do bíofílme por
bacteriófago, uma infecção de bactérias associadas a
bíofílme e/ou uma lise das mesmas e/ou um clareamento
parcial ou tot ai do bíofílme (isto é, pela interrupção de
colonização e/ou ruptura de biofilmes).
[0039] 0 termo amostra, como usado no presente documento, significa qualquer amostra, como amostras biológicas, particularmente amostras contendo células. Os exemplos de amostras incluem fluidos corporais como sangue, plasma, saliva, fezes ou urina, bem como biópsias, órgãos, tecidos ou amostras celulares. A amostra pode ser tratada.
[0040] Como usado no presente documento, o termo indivíduo ou paciente se refere a um animal, de preferência, um humano, incluindo adulto e criança. 0 termo indivíduo também abrange animais como, e não limitado a, animais domésticos (por exemplo, cães, gatos), espécies de fazenda, como cavalos, vacas, cabras, porcos, ovelha, aves, primatas não humanos e peixes, conchas, camarões, etc.
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14/53 [0041] O termo eficácia de tratamento ou resposta a uma terapia de bacteriófago como usado no presente documento se refere a um tratamento que resulta em uma diminuição no número de cepas de S. aureus em um indivíduo após tratamento com bacteriófago quando se compara com o número de cepas de S. aureus antes do tratamento. Um indivíduo com boa responsividade se refere a um indivíduo que mostra ou mostrará uma recuperação clinicamente significativa quando tratado com uma terapia de bacteriófagos.
[0042] 0 termo coquetel de bacteriófagos designa uma combinação de diferentes bacteriófagos. Os bacteriófagos em um coquetel são, de preferência, formulados juntos em um mesmo vaso ou embalagem, embora possam ser usados como kits de partes em que alguns dos bacteriófagos são formulados ou embalados separadamente e combinados quando usados ou administrados.
[0043] 0 termo identidade de sequência como usado no presente documento é determinado pela comparação de duas sequências alinhadas de forma ideal por uma janela de comparação, em que o fragmento do polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (por exemplo, lacunas ou profusões) em comparação com a sequência de referência, que não compreende adições ou deleções, para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem de identidade de sequência é calculada pela determinação do número de posições nas quais o resíduo de
aminoácido ou base de ácido nucleico ocorre em ambas as
sequências para produzir o número de posições
correspondidas, dividindo o número de posições
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15/53 correspondidas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela busca por método de similaridade de Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988), por implementações computorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575
Science Dr., Madison, WI, EUA), ou por inspeção.
Descrição de modalidades [0044] A presente invenção está relacionada com terapias de bacteriófagos inovadoras de infecções por S. aureus. Mais particularmente, a presente invenção se refere a bacteriófagos inovadores que têm alta atividade litica contra cepas de S. aureus, sua fabricação, componentes dos mesmos, composições que compreendem as mesmas e usos das mesmas em fagoterapia.
Bacteriófagos [0045] Em um primeiro aspecto, a invenção revela o isolamento e a caracterização de bacteriófagos inovadores que têm atividade litica contra cepas de S. aureus e que exibem, em separado ou em combinação (ou combinações), espectro de faixa de hospedeiro notável de atividade litica. Esses bacteriófagos foram isolados, sequenciados e caracterizados. Os mesmos são, individualmente e em combinação (ou combinações), ativos contra cepas de S.
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16/53 aureus. Os mesmos são notavelmente eficazes contra cepas patogênicas de S. aureus, incluindo cepas de S. aureus resistentes a antibiótico como uma cepa de Staphylococcus resistente à meticilina (MRSA). Esses bacteriófagos podem ser combinados e formulados em condições adequadas para uso como agentes farmacêuticos ou veterinários para exibir efeito antibacteriano muito potente contra um espectro controlado de cepas de S. aureus.
[0046] Mais especificamente, os seguintes bacteriófagos foram isolados. Sua sequência de ácidos nucleicos correspondente é também indicada.
Tabela 1
Bacteriófago SEQ ID
PN1137 SEQ ID NO: 1
PN1493 SEQ ID NO: 2
PN1815 SEQ ID NO: 3
PN1957 SEQ ID NO: 4
[0047] 0 perfil litico desses bacteriófagos foi determinado em uma ampla faixa de cepas de S. aureus. Os resultados mostram um amplo espectro de atividade (especifica e total) para os quatro bacteriófagos da invenção. Esses quatro bacteriófagos são membros da ordem Caudovírales.
[0048] 0 bacteriófago PN1137 é um membro da família Podoviridae e tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 que compreende 17.213 nucleotideos. 0 mesmo exibe uma atividade especifica litica em 46 dentre 109 cepas de S. aureus testadas, o que representa 42,2 % das cepas. Adicionalmente, o bacteriófago PN1137 exibe uma atividade
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17/53 litica total em 81 das 109 cepas testadas, o que representa 74,31 % das cepas.
[0049] 0 bacteriófago PN1493 é um membro da família Myovírídae e tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2 que compreende 134.876 nucleotídeos. 0 mesmo exibe uma atividade específica lítica em 86 dentre 109 cepas de S. aureus testadas, o que representa 78,9 % das cepas. Adicionalmente, o bacteriófago PN1493 exibe uma atividade lítica total em 108 das 109 cepas testadas, o que representa 99,08 % das cepas.
[0050] 0 bacteriófago PN1815 é um membro da família Myovírídae e tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 3 que compreende 136.156 nucleotídeos. O mesmo exibe uma atividade específica lítica em 59 das 109 cepas de S. aureus testadas, o que representa 54,13 % das cepas. Adicionalmente, o bacteriófago PN1815 exibe uma atividade lítica total em 108 das 109 cepas testadas, o que representa 99,08 % das cepas.
[0051] 0 bacteriófago PN1957 é um membro da família Podovírídae e tem a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 4 que compreende 17.629 nucleotídeos. O mesmo exibe uma atividade específica lítica em 71 dentre 109 cepas de S. aureus testadas, o que representa 65,14 % das cepas. Além disso, o bacteriófago PN1957 exibe uma atividade lítica total em 95 das 109 cepas testadas, o que representa 87,16 % das cepas.
[0052] As combinações desses bacteriófagos têm uma atividade específica lítica que abrange pelo menos 74 das cepas (67 %). Particularmente, bacteriófagos PN1493 e PN1957 juntos têm uma atividade específica lítica que
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18/53 abrange 98 das cepas de S. aureus (89,9 %) e uma atividade lítica total que abrange 100 % das cepas de S. aureus.
[0053] Um objetivo particular da invenção reside, assim, em um bacteriófago que tem atividade lítica para uma cepa S. aureus e que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma, de preferência, pelo menos 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a mesma.
[0054] Os bacteriófagos da invenção podem ser preparados por métodos padrão de cultura, isolamento e purificação. Por exemplo, as bactérias produtoras de S. aureus são cultivadas, infectadas por uma amostra de um bacteriófago e, então, tratadas para remover resíduos e células bacterianas. A solução de bacteriófago enriquecida pode ser transferida para placas em um meio, por exemplo meio de ágar, com cepas de hospedeiro suscetíveis embebidas de S. aureus para obter as placas. Assim, a placa simples pode ser coletada para amplificação e purificação de bacteriófago subsequente. Um ou mais ciclos de amplificação seletiva de bacteriófagos da invenção podem ser realizados, por exemplo, pela mistura de bacteriófagos com S. aureus competente, seguido da adição de um meio de crescimento e incubação em condições de crescimento de teste selecionado. Após a centrifugação, o sobrenadante amplificado limpo é filtrado através do filtro e submetido a um outro ciclo de amplificação seletiva ou testado para a presença de atividade lítica.
[0055] A titulação de bacteriófagos em uma suspensão e a visualização de morfologia de placa de bacteriófagos da
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19/53 invenção pode, assim, ser avaliada pelos métodos conhecidos, por exemplo, por contagem de placa. Adicionalmente, o processamento de bacteriófagos da invenção em várias formas (líquida, liofilizada, etc.) para armazenamento curto, longo, por congelamento ou qualguer outro tipo de armazenamento pode ser executado por qualquer método adequado como é bem conhecido na técnica (consulte, por exemplo, Clark, 1962).
[0056] A atividade lítica dos bacteriófagos da invenção pode ser avaliada pelos métodos bem conhecidos na técnica, como ensaio de placa também conhecido como método de ágar duplo, com base no crescimento de bacteriófago com bactérias hospedeiras potenciais e seguido da avaliação de sua capacidade de exterminar a célula bacteriana hospedeira. No método de ensaio de placa, o bacteriófago inclui a Use de cepas-alvo de S. aureus após um período de incubação em meio de ágar mole, que resulta em zonas de clareamento na placa conhecida como placas.
[0057] Os bacteriófagos da invenção podem ser cultivados, expandidos, isolados, purificados e usados em, por exemplo, terapia com fago de transtornos mediados por S. aureus, como será revelado em mais detalhes abaixo. Além disso, as variantes desses bacteriófagos que têm um caráter fenotípico (por exemplo, atividade lítica) dos bacteriófagos podem ser produzidas e/ou isoladas por técnicas conhecidas per se na técnica.
Ácidos nucleicos e polipeptideos [0058] A invenção se refere a um ácido nucleico contido em um bacteriófago da invenção, ou qualquer fragmento de tal ácido nucleico. 0 termo fragmento designa, com mais
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20/53 preferência, um fragmento contendo (ou consistindo em) um quadro de leitura aberta. O ácido nucleico pode ser DNA ou RNA, com fita simples ou dupla.
[0059] 0 ácido nucleico pode ser isolado dos bacteriófagos depositados ou produzido usando tecnologia de DNA recombinante (por exemplo, amplificação de reação de cadeia de polimerase (PCR), clonagem), síntese enzimática ou química, ou combinações dos mesmos, de acordo com técnicas gerais conhecidas per se na técnica. Também são incluídos fragmentos ou sequências homólogas do mesmo incluindo, porém sem limitação, variantes alélicas naturais e sequências de ácidos nucleicos modificados em que os nucleotídeos foram inseridos, deletados, substituir e/ou invertidos.
[0060] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a um ácido nucleico que compreende uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4, ou uma sequência que tem pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4.
[0061] 0 ácido nucleico da invenção pode estar na forma livre, ou clonada em um vetor, como um plasmídeo, vetor viral, cassete de expressão, cosmídeo, etc.
[0062] Em um aspecto adicional, a invenção também se refere a um polipeptídeo isolado codificado por uma sequência de ácidos nucleicos como definido acima, de preferência, uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4. 0 polipeptídeo (ou polipeptídeos) pode ser produzido por técnicas conhecidas per se na técnica, como
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21/53 síntese, tecnologia recombinante ou combinações dos mesmos. Os polipeptídeos podem ser isolados ou purificados e usados como agentes antibacterianos ou como reagentes para análise in vitro.
Composições da invenção [0063] Um aspecto da invenção se refere às composições que compreendem pelo menos um bacteriófago como descrito acima, com mais preferência, pelo menos dois ou mais e, opcionalmente, um excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou veterinário. Como descrito, os bacteriófagos da invenção têm atividade lítica muito potente contra cepas de S. aureus. As combinações desses bacteriófagos podem ser produzidas para expandir o espectro de hospedeiro e produzir composições antibacterianas altamente eficazes.
[0064] Mais particularmente, a invenção se refere a uma composição antibacteriana que compreende pelo menos um bacteriófago que tem atividade lítica contra uma cepa de S. aureus, em que o dito pelo menos um bacteriófago é selecionado a partir dos bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, por exemplo pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a mesma.
[0065] Em um aspecto, um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 90 % de identidade para qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4, por exemplo, pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade a qualquer uma das
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SEQ ID NOs: 1 a 4 pode ter as mesmas características fenotipicas que o bacteriófago de referência que tem a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. Tipicamente, o dito bacteriófago tem a mesma faixa de hospedeiro de bactérias. Tal bacteriófago compreende tipicamente, por exemplo, mutações silenciosas, mutações conservadoras, deleções menores e/ou replicações menores de material genético.
[0066] Em um outro aspecto, um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 90 % de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4, por exemplo, pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4 pode resultar da evolução direcionada (treinamento de fago) e pode ter uma diferente faixa de hospedeiro de bactérias. Tipicamente, os ditos bacteriófago têm uma atividade em mais cepas bacterianas comparadas ao bacteriófago de referência que tem a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4.
[0067] Ainda com mais particularmente, a invenção se refere a uma composição antibacteriana que compreende pelo menos dois bacteriófagos que têm atividade lítica contra uma cepa de S. aureus, em que os ditos pelo menos dois bacteriófagos são selecionados a partir dos bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, por exemplo pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a mesma.
[0068] Em uma outra modalidade particular, as
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23/53 composições da invenção compreendem pelo menos três, ainda com mais preferência, pelo menos quatro bacteriófagos distintos selecionados a partir dos bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, por exemplo pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a mesma.
[0069] Os exemplos específicos de composições da invenção compreendem:
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência
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24/53 que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem
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25/53 pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma; ou
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma.
[0070] Em uma modalidade específica, as composições da invenção compreendem pelo menos:
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma;
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- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma; e
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma.
[0071] As composições da invenção podem compreender os coquetéis de bacteriófagos como apresentado na Tabela 2: Tabela 2: Coquetéis de bacteriófagos da invenção
Coquete 1 Bacteriófagos
1 PN1137 + PN1493
2 PN1137 + PN1815
3 PN1137 + PN1957
4 PN1493 + PN1815
5 PN1493 + PN1957
6 PN1815 + PN1957
7 PN1137 + PN1493 + PN1815
8 PN1137 + PN1493 + PN1957
9 PN1137 + PN1815+ PN1957
10 PN1493 + PN1815 + PN1957
11 PN1137 + PN1493 + PN1815 + PN1957
[0072] As composições da invenção podem compreender adicionalmente agentes antibacterianos adicionais, particularmente outros bacteriófagos que têm especificidade de hospedeiro distinta.
[0073] As composições mais preferenciais da invenção são líticas contra mais que 70 % de todas as 109 cepas bacterianas do painel determinado por Centre National de
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Reference des Staphylocoques de Lyon. Essa coleta contém um grande número e variedade de cepas S. aureus que são aquelas com a incidência mais alta na Europa e nos Estados Unidos da América.
[0074] As composições da invenção podem compreender quantidade eficaz do bacteriófago selecionado (ou bacteriófagos). De preferência, as mesmas podem compreender entre 10el e 10el2PFU/ml de cada um dos ditos bacteriófagos, de preferência, entre 10e4 e 10e11 PFU/ml. As quantidades relativas de cada tipo de bacteriófago em uma composição da invenção podem ser ajustadas por um técnico no assunto. Tipicamente, quando a composição antibacteriana compreende vários (n) bacteriófagos distintos como definido acima, a quantidade relativa total %A de cada bacteriófago na composição é, com mais preferência, %A= (100/ni)xV, em que n± representa o número de bacteriófagos distintos e V é um fator de variabilidade compreendido entre 0,2 e 5. Com máxima preferência, V é compreendido entre 0,3 e 3, ainda com mais preferência, entre 0,5 e 2, em geral, entre 0,8 e
1,5. Em uma modalidade típica preferencial, cada tipo de bacteriófago está presente em uma composição da invenção em quantidades relativas aproximadamente iguais.
[0075] As composições antibacterianas da invenção podem ser em várias formas, como formulações líquidas, semilíquidas, sólidas ou liofilizadas. As composições da invenção compreendem, de preferência, um diluente ou carreador adequado, como um excipiente ou carreador aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou veterinário. As composições de acordo com a presente invenção podem incluir qualquer excipiente ou carreador, como espessantes,
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28/53 diluentes, tampões, conservantes, agentes ativos de superfície e similares, além do bacteriófago (ou bacteriófagos) de escolha. Tais incluem veículos ou soluções fisiologicamente aceitáveis que são inofensivas ou não causam qualquer reação imune não especifica ou especifica significativa a um organismo ou não anulam a atividade biológica do bacteriófago. Para a formulação liquida, solução salina, água estéril, solução de Ringer, solução salina fisiológica tamponada, solução de infusão de albumina, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol, etanol e misturas dos mesmos podem ser usados como um excipiente ou carreador aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou veterinário. Se apropriado, outros aditivos convencionais, como espessantes, diluentes, tampões, conservantes, agentes ativos de superfície, antioxidantes e agentes bacteriostáticos pode ser adicionados. Além disso, diluentes, dispersantes, tensoativos, aglutinantes e lubrificantes podem ser adicionalmente adicionados à composição para preparar as formulações injetáveis, como soluções aquosas, suspensões e emulsões, formulações orais, como pílulas, cápsulas, grânulos ou comprimidos, formulações em pó com pós secos ou/e extrusados, formulações aerolisadas com aerossóis líquidos ou secos. As formulações para administração tópica podem incluir, bandagem, curativos, emplastros, filmes, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, aspersões, tampões, absorventes, líquidos e pós. As formulações para descontaminação ou para uso médico também podem incluir aerossóis ou aspersões.
[0076] As composições da invenção podem ser usadas no
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29/53 campo médico, incluindo as áreas médicas veterinárias ou humanas, para, por exemplo, o tratamento de uma infecção de indivíduo ou para melhorar a condição de um indivíduo. As composições podem ser usadas para reduzir ou exterminar as bactérias S. aureus em um organismo para tratar uma infecção. A composição também pode ser usada para melhorar a condição de um indivíduo modificando-se a flora microbiana no dito indivíduo. Em particular, as composições da invenção podem remover especificamente as cepas de S. aureus nas membranas mucosas ou da pele de um indivíduo, modificando, então, sua flora microbiana e restaurando um equilíbrio apropriado.
[0077] Em uma modalidade particular, a invenção também se refere a um método para tratar uma infecção em um indivíduo que compreende a administração ao dito indivíduo de uma composição ou bacteriófagos ou ácidos nucleicos ou polipeptídeos como definido acima.
[0078] A invenção também se refere ao uso de uma composição de bacteriófagos, ácidos nucleicos ou polipeptídeos como descrito para fabricar um medicamento para tratar uma infecção em um indivíduo, ou para restaurar a flora microbiana no dito indivíduo.
[0079] As composições da invenção podem ser usadas para tratar várias infecções mediadas por S. aureus, particularmente infecções de úlcera de pé não diabético ou diabético, ou osso, como e sem limitação, osteomielite, ou artrite séptica ou infecções de articulação, ou infecções de articulação profética, ou infecções de pele, como e sem limitação, dermatite atópica, acneia, impetigo, Síndrome da pele escaldada estafilocócica ou infecções do tecido mole,
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30/53 ou infecções pleuropulmonares, ou outras sindromes clinicas, como e sem limitação, meningite ou infecções do trato urinário ou septicemia ou endocardite ou otite.
[0080] As composições da invenção podem ser administradas por qualquer via conveniente, incluindo intravenosa, oral, transdérmica, subcutânea, mucosa, intramuscular, intrapulmonar, intranasal, parenteral, retal, vaginal e tópica. Os bacteriófagos ou composições também podem ser administradas por nebulização ou instilação intrapulmonar ou intranasal. As composições podem ser administradas direta ou indiretamente, por exemplo, através de um suporte ou um dispositivo (por exemplo, um nebulizador, uma bandagem...). Nesse sentido, as composições podem, por exemplo, ser aplicadas ou aspergidas para a área afetada. As composições da invenção também podem ser administradas por vias orais ou parenterais. A dosagem adequada para aplicar, aspergir ou administrar as composições da presente invenção pode ser ajustada pelo técnico no assunto dependendo de uma variedade de fatores incluindo formulação, modo de administração, idade, peso, sexo, condição, dieta do indivíduo gue é tratado no tempo de administração, via de administração e sensibilidade de reação. Um médico ou veterinário que tem habilidades comuns na técnica pode determinar e prescrever prontamente a quantidade eficaz da composição necessária.
[0081] A dosagem também pode ser ajustada pelo técnico no assunto de modo que uma atividade iítica contra cepas de S. aureus resistentes a antibiótico seja obtida. Uma dose eficaz para obter uma atividade iítica ín vivo inclui
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31/53 tipicamente uma concentração de pelo menos 10e4 PFU/ml, de preferência, de cerca de 10e2 a 10e12 PFU/ml, dependendo da via de administração.
[0082] Em uma modalidade particular, os bacteriófagos, composições e coquetéis da invenção são usados para tratar infecções de úlcera de pé não diabético ou diabético, infecções de articulação e osso, infecções de articulação profética ou infecções de trato respiratório.
[0083] No caso de úlceras de pé diabético infectadas, por exemplo, por S. aureus suscetível ou resistente à meticilina (MRSA ou MSSA), os pacientes podem receber curativos impregnados com uma solução de fago (ou fagos) em 104 a 1010 PFU/ml com uma frequência de aplicação compreendida entre a cada dia e a cada dez dias, por exemplo, entre a cada dois dias e a cada nove dias, de preferência, entre a cada três dias e a cada oito dias, com mais preferência, a cada sete dias, com ou sem antibiótico (ou antibióticos), até o fechamento da ferida. A eficácia do tratamento pode ser medida pela redução relativa em carga bacteriana.
[0084] No caso de infecções de articulação profética de S. aureus recorrente (MRSA ou MSSA) de, por exemplo, quadril ou joelho, os pacientes podem receber terapia com fago associada à cirurgia padrão, com e sem antibióticos. 0 teor de uma solução de fago (ou fagos) em 104 a 1010 PFU/ml pode ser disperso no campo operativo nos barris ósseos, no espaço articular e/ou nos tecidos musculares, no final do explante. Uma segunda preparação idêntica pode ser usada para uma segunda dispersão logo após a reimplantação e antes do fechamento de local cirúrgico. Podem ser feitas
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32/53 aplicações adicionais quando a ferida ainda está aberta, por exemplo, no momento do curativo. A administração de fago oral complementar em 104 a 1010 PFU/ml pode ser usada sustentar o tratamento local.
[0085] No caso de cirurgia plástica com osso infectado por S. aureus (MRSA ou MSSA), uma curetagem óssea pode ser seguida pela colocação de uma compressa embebida em 104 a 1010 PFU/ml de bacteriófago (ou bacteriófagos) no fundo do local cirúrgico, em contato com o osso com curetagem infectado. 0 restante da cavidade pode ser preenchido com outras compressas estéreis e o local cirúrgico obstruído por curativo à prova de água. Além disso, um sistema de Fechamento Auxiliado por Vácuo (VAC) pode ser usado, seguindo um ciclo de drenagem para remover fluido sanguíneo ou seroso do local de operação ou ferida, seguido de instilação de fago (104 a 1010 PFU/ml) com ou sem antibióticos. Os fagos permanecem durante várias horas antes de a drenagem ser reiniciada. 0 ciclo pode ser repetido várias vezes durante os dias que seguem a operação.
[0086] No caso de infecção no trato respiratório, uma solução de fago de 104 a 1010 PFU/ml pode ser aplicada usando um dispositivo de nebulização. A nebulização pode ser executada com um inalador portátil ou com um nebulizador adicional a um ventilador mecânico médico. Um volume de solução de fago que varia, por exemplo, de 1 a 20 ml pode ser nebulizado em vários intervalos de tempo e durante o período de tratamento. Antes de começar a primeira nebulização e de acordo com a patologia, lavagem de pulmão pode ser realizada com a mesma solução de fago.
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33/53 [0087] Como mostrado na seção experimental, os bacteriófagos e as composições da invenção têm capacidade para exterminar de modo eficaz uma ampla faixa de bactérias S. aureus. As composições podem destruir as misturas de diferentes bactérias S. aureus, mesmo em baixa dosagem. Além disso, as composições e os bacteriófagos da invenção são estritamente incapazes de afetar as células eucarióticas e são, portanto, específicos e desprovidos de efeitos colaterais quando aplicados em seres humanos e animais.
[0088] A invenção também se refere ao uso de uma composição, bacteriófago, ácido nucleico ou polipeptídeo da invenção para descontaminar um material. Devido a seu efeito antibacteriano potente e a sua capacidade de ainda comprometer a integridade de um biofilme bacteriano, as composições da invenção podem ser usadas como agente de descontaminação, para eliminar ou pelo menos causar uma redução em números bacterianos em um material. Tais métodos podem ser aplicados para o tratamento de uma variedade de superfícies biológicas ou não biológicas tanto no contexto médico quanto no contexto não médico, incluindo dispositivos ou materiais sólidos como, por exemplo, lentes de contato, superfícies de dispositivos a serem implantados no corpo, tubos, dutos, vasos de laboratório, tecidos, roupas, calçados, alojamento, equipamento militar, etc.
[0089] A invenção também se refere a um método para preparar uma composição da invenção, em que a composição compreende pelo menos dois bacteriófagos, em que o método compreende produzir separadamente os ditos pelo menos dois bacteriófagos, e combinar os ditos bacteriófagos com um
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34/53 carreador ou excipiente adequado.
[0090] A composição da invenção pode ser usada em combinação com pelo menos um antibiótico. Tal coadministração permite reduzir a quantidade de antibiótico usado, restaurar a eficácia de um antibiótico ou fazer com que uma bactéria embebida em um biofilme suscetível a um antibiótico.
Testes de diagnóstico/preditivos do diagnóstico adjunto da invenção:
[0091] A invenção também se refere a um método para prever ou determinar a eficácia de uma terapia de bacteriófago em um indivíduo, em que o método compreende uma etapa de determinar uma atividade lítica de um ou mais bacteriófagos da invenção para uma cepa de S. aureus de uma amostra do dito indivíduo, em que tal atividade lítica é indicativa de um tratamento eficaz. Em um aspecto preferencial, o método compreende adicional e opcionalmente uma etapa de tratar o dito indivíduo por um ou mais bacteriófagos que têm uma atividade lítica para uma cepa de S. aureus a partir de uma amostra do dito indivíduo.
[0092] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para selecionar um indivíduo ou determinar a possibilidade de um indivíduo ser suscetível de se beneficiar de uma terapia de bacteriófago, em que o método compreende a etapa de determinar uma atividade lítica de um ou mais bacteriófagos da invenção para uma cepa de S. aureus de uma amostra do dito indivíduo, uma atividade lítica de um ou mais bacteriófagos da invenção para pelo menos uma cepa de S. aureus gue indica um indivíduo responsive.
[0093] Um outro objetivo da invenção se refere a um
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35/53 método para prever a resposta de um indivíduo para uma terapia de bacteriófago, em que o método compreende a etapa de determinar uma atividade lítica de um ou mais bacteriófago da invenção para uma cepa de S. aureus a partir de uma amostra do dito indivíduo, uma atividade lítica de um ou mais bacteriófagos da invenção para pelo menos uma cepa de S. aureus que é indicativa de uma resposta satisfatória para a dita terapia.
[0094] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para avaliar a sensibilidade de uma cepa de S. aureus a um bacteriófago selecionado a partir dos bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma e/ou pelo menos um coquetel de bacteriófagos da Tabela 2, que compreende:
a) colocar a cepa de S. aureus em contato com o dito pelo menos um bacteriófago e/ou o dito pelo menos um coquetel de bacteriófagos, e
b) determinar a atividade lítica do bacteriófago e/ou do coquetel na cepa, avaliando, através disso, a sensibilidade da cepa ao bacteriófago e/ou ao coquetel. Etapa a) pode ser executada in vitro colocando em contato, expondo ou misturando uma cepa de S. aureus com o pelo menos um bacteriófago e/ou pelo menos um coquetel de bacteriófago em qualquer meio adaptado para tal etapa (por exemplo, um meio sólido ou um meio líquido).
[0095] Em uma modalidade preferencial, a determinação da atividade lítica do bacteriófago e/ou do coquetel compreende medir a amplificação do bacteriófago na cepa de S. aureus, em que um aumento da concentração de
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36/53 bacteriófago é indicativo da atividade lítica do bacteriófago e/ou do coquetel na cepa.
[0096] A concentração de bacteriófago pode ser medida por qualquer técnica bem conhecida a partir do técnico do assunto na técnica, como formação de placa, reação em cadeia de polimorfismo (PCR), bioluminescência, etc.
[0097] Adicional ou alternativamente, a determinação da atividade lítica do bacteriófago e/ou do coquetel compreende uma determinação do aparecimento de uma placa em um ensaio de placa.
[0098] No entanto, uma cepa bacteriana também pode ser considerada como sensível a um bacteriófago quando está em uma cultura de meio sólido das bactérias na presença do bacteriófago, sendo assim se observa a lise parcial ou completa de um tapete bacteriano.
[0099] Outras técnicas bem conhecidas a partir da pessoa versada na técnica podem ser usadas para avaliar a atividade lítica do bacteriófago e/ou do coquetel.
[0100] Um outro objetivo da invenção se refere a um método para determinar um coquetel de bacteriófagos eficazes contra uma cepa-alvo de S. aureus, que compreende:
a) colocar separadamente a cepa-alvo de S. aureus, ou uma amostra que contém a dita cepa, em contato com (i) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e/ou (ii) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e/ou (iii) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência
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37/53 de nucleotideos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e/ou (iv) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma, e/ou (v) uma ou mais combinações dos mesmos;
b) selecionar bacteriófagos que exibem atividade litica na cepa,
c) opcionalmente, selecionar adicionalmente bacteriófagos ativos que, quando combinados juntos, exibem atividade sinérgica na cepa; e/ou
d) opcionalmente, selecionar adicionalmente bacteriófagos ativos que, quando combinados juntos, não exibem antagonismo; e/ou
e) selecionar opcionalmente bacteriófagos ativos que pertencem a diferentes gêneros; e
f) combinar os ditos bacteriófagos selecionados.
[0101] Esse método pode ser usado como um fagograma a fim de determinar qual coquetel tem a melhor atividade litica em uma cepa de S. aureus particular.
[0102] Os aspectos e as vantagens adicionais da invenção serão revelados na seguinte seção experimental, que é apenas ilustrativa.
EXEMPLOS
MÉTODOS
Identificação taxonômica das famílias de fago.
[0103] Quatro fagos da invenção (PN1137, PN1493, PN1815 e PN1957) foram estudados usando microscopia de elétron. Os resultados mostram que os bacteriófagos pertencem à ordem Caudovirales e às famílias Podovirae e Myoviridae, como
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38/53 descrito doravante no presente documento:
- PN1137: Podovirae,
- PN1483: Myoviridae,
- PN1815: Myovírídae,
- PN1957: Podovirae.
Sequenciamento e análise de genomas de fago.
[0104] 0 DNA de fago foi isolado por extração com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1, V/V) , precipitação de etanol e resolução em água. Todo o sequenciamento de genoma foi feito e o algoritmo BLAST foi usado para determinar a similaridade aos genes descritos na base de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Os genomas foram varridos para cadeias abertas de leitura potenciais (ORFs). As sequências de ácidos nucleicos são mostradas como SEQ ID NOs: 1-4. Os alinhamentos de sequências usando as bases de dados levam às mesmas identificações taxonômicas que aquelas usando microscopia de elétron.
EXEMPLO 1: Caracterização in vitro: faixa de hospedeiro [0105] Dois tipos diferentes de lise bacteriana são possíveis. A lise bacteriana que resulta da hidrólise de parece celular de bactéria por enzimas do bacteriófago (denominadas lise não específica) e a lise bacteriana que resulta da amplificação de fago (denominada lise específica). Ambos os tipos de lise são relevantes para a utilidade dos fagos. Tanto a lise específica quanto a lise não específica foram determinadas para cada um dos bacteriófagos usando os dois métodos.
Amplificação de fago em um meio sólido [0106] Esse método permite avaliar a capacidade de um
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39/53 bacteriófago lisar as bactérias por amplificação.
[0107] 0 método consiste em depositar uma faixa de
diluição (razão 10) de uma suspensão de bacteriófago na
superfície de um ágar contendo bactérias. Esse ágar é,
então, incubado a 37 °C por 18 h para permitir o
desenvolvimento de um tapete bacteriano. As áreas de
deposição são analisadas. As seguintes situações são
possíveis:
- Caso 1: ausência de lise do tapete bacteriano na
área de deposição,
- Caso 2: lise completa do tapete bacteriano na área de deposição,
- Caso 3: lise parcial do tapete bacteriano na área de deposição, e
- Caso 4: observação de uma placa (unidade de formação de placa (PFU)) na área de deposição.
[0108] É apenas a formação de uma placa (Caso 4) que atesta a capacidade de um fago de amplificar a cepa bacteriana e de lisar de modo eficaz as bactérias.
[0109] Se os casos 1, 2 e/ou 3 forem observados na ausência do Caso 4, a cepa é testada em meio liquido.
Amplificação de fago em um meio líquido [0110] Esse método permite avaliar a capacidade de uma bactéria produzir um bacteriófago.
[0111] 0 método consiste em cultivar uma cepa bacteriana e um bacteriófago a 37 °C por 18 h. A concentração de bacteriófago no sobrenadante é, então, determinada. Se a concentração de bacteriófago após a cultura for superior à concentração de bacteriófago inicial, isso indica que o bacteriófago foi amplificado pela bactéria.
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40/53 [0112] A capacidade de uma bactéria produzir um bacteriófago depende, inter alia, da multiplicidade de infecção (MOI), isto é, a razão entre bacteriófago/bactérias. Várias MOI foram testadas.
[0113] A titulação de fago após a cultura é determinada usando um método análogo ao teste spot. Uma faixa de diluição (razão 10) do sobrenadante de cultura é depositada, por um lado, em uma superfície de ágar contendo a cepa de produção do bacteriófago e, por outro lado, em uma superfície de ágar contendo a cepa de um paciente. Esse ágar é, então, incubado a 37 °C por 18 h. 0 número de placas em uma área de deposição correlacionado ao fator de diluição permite a determinação de concentração de bacteriófago.
Atividade específica [0114] 0 espectro de atividade específica, isto é, a capacidade de cada bacteriófago realizar a lise por amplificação das cepas de um painel, foi avaliado. Considera-se que um bacteriófago seja amplificado por uma
cepa bacteriana quando:
- em teste de meio sólido, f ez- -se observação do Caso 4, e
- em teste de meio líquido! . a concentração < do bacteriófago
após a cultura foi 50 vezes maior em relação à concentração
inicial.
[0115] 0 painel de S. aureus foi determinado pelo Centre
National de Reference des Staphylocoques de Lyon. 0 mesmo compreende as 109 cepas de S. aureus que têm a incidência mais alta na Europa e nos Estados Unidos da América.
[0116] Na seguinte Tabela 3, a capacidade de os bacteriófagos da invenção serem amplificados por uma cepa
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41/53 bacteriana é representada por um + e a incapacidade de um bacteriófago ser amplificado por uma cepa bacteriana é representada por um
Tabela 3: Espectro de atividade específica de PN1137, PN1493, PN1815 e PN1957 em um painel de 109 cepas de S.
aureus.
N° Cepa de S. aureus PN1137 PN1493 PN1815 PN1957
1 HOCILOOl + + + +
2 HOCIL002 - + + -
3 HOCIL003 + + + +
4 HOCIL004 + + + +
5 HOCIL005 + + + +
6 HOCIL006 - + + +
7 HOCIL007 - + - +
8 HOCIL008 + + + +
9 HOCIL009 + - - +
10 HOCILOIO - - - +
11 HOCILOll - + + -
12 HOCIL012 + + + +
13 HOCIL013 - + + +
14 HOCIL014 + + + +
15 HOCIL015 + + + +
16 HOCIL016 + + - +
17 HOCIL017 + + + +
18 HOCIL018 + + + +
19 HOCIL020 - + + -
20 HOCIL022 + + + +
21 HOCIL093 - + - +
22 HOCIL095 + + + -
23 HOCIL099 + + + +
24 HOCIL106 - + - -
25 HOCIL117 - - - +
26 HOCIL118 - - - -
27 HOCIL124 - - - +
28 HOCIL129 - - - +
29 HOCIL137 - - - -
30 HOCIL139 - + + +
31 HOCIL140 - - - +
32 HOCIL145 + + + +
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42/53
N° Cepa de S. aureus PN1137 PN1493 PN1815 PN1957
33 HOCIL148 - + - -
34 HOCIL155 + + - +
35 HOCIL156 + + - +
36 H0CIL161 - + + -
37 HOCIL163 - - - -
38 HOCIL165 + + + +
39 HOCIL167 + - - +
40 HOCIL172 + + - +
41 HOCIL174 + + - +
42 HOCIL175 - - + +
43 HOCIL176 - - - -
44 HOCIL183 + + - +
45 HOCIL184 + + - +
46 HOCIL185 + + + +
47 HOCIL186 - + - +
48 HOCIL187 - + - -
49 HOCIL188 + + + +
50 HOCIL189 - + - -
51 HOCIL190 - + + +
52 H0CIL191 + + + +
53 HOCIL192 - - - +
54 HOCIL193 + + + +
55 HOCIL194 + + + +
56 HOCIL195 - - - -
57 HOCIL196 - - - -
58 HOCIL197 + + + +
59 HOCIL198 + + + +
60 HOCIL199 - + - +
61 HOCIL200 - + + +
62 HOCIL201 + + - -
63 HOCIL202 - - - -
64 HOCIL203 + + + +
65 HOCIL204 + + + +
66 HOCIL205 + + + +
67 HOCIL206 + + + -
68 HOCIL207 + + + +
69 HOCIL210 - + - -
70 H0CIL211 - + + +
71 HOCIL212 + + + +
72 HOCIL213 - + + +
73 HOCIL214 - + - +
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43/53
N° Cepa de S. aureus PN1137 PN1493 PN1815 PN1957
74 HOCIL215 - - - +
75 HOCIL216 - + + +
76 HOCIL217 - - - -
77 HOCIL218 - + - +
78 HOCIL219 + + + +
79 HOCIL220 - - - +
80 HOCIL221 - + + -
81 HOCIL222 - + + -
82 HOCIL223 - + + -
83 HOCIL224 - + - -
84 HOCIL225 - + + -
85 HOCIL226 + + + +
86 HOCIL227 - + + +
87 HOCIL228 - + + +
88 HOCIL229 + + + +
89 HOCIL230 - + + +
90 HOCIL231 - + - -
91 HOCIL232 - + + -
92 HOCIL233 - + - +
93 HOCIL234 - + - -
94 HOCIL235 - + - +
95 HOCIL236 - + + +
96 HOCIL237 + + - +
97 HOCIL238 + + + +
98 HOCIL239 - - - -
99 HOCIL240 + - - +
10 0 HOCIL241 - + + -
10 1 HOCIL242 - + + -
10 2 HOCIL243 - + - -
10 3 HOCIL244 - + - -
10 4 HOCIL245 - - - -
10 5 HOCIL246 - + + -
10 6 HOCIL248 - - - -
10 HOCIL249 + + - +
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N° Cepa de S. aureus PN1137 PN1493 PN1815 PN1957
7
10 8 HOCIL250 + + + -
10 9 HOCIL251 - + + -
[0117] PN1493 e PN1957 exibem uma atividade especifica respectivamente em 86 e 71 das 109 cepas de S. aureus, o que representa 78,9 % e 65,14 %, respectivamente.
[0118] PN1137 e PN1815 também apresentam uma ampla faixa de atividade especifica. Os mesmos exibem uma atividade especifica respectivamente em 46 e 59 das cepas, o que representa 42,2 % e 54,13 %, respectivamente.
Atividade lítica total [0119] 0 espectro de atividade litica total, isto é, a capacidade de cada bacteriófago lisar as cepas com ou sem produção de bacteriófago, foi examinado. 0 bacteriófago é considerado ativo na cepa de S. aureus quando:
- no teste de meio sólido, fazem-se observações dos casos 2, 3 ou 4, ou
- em teste de meio liquido, a concentração do bacteriófago após a cultura foi 50 vezes maior em relação à concentração inicial.
[0120] Na seguinte Tabela 5, a atividade litica positiva de um bacteriófago em uma cepa bacteriana é representada por um + e a ausência de atividade litica de um bacteriófago em uma cepa bacteriana é representada por um
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Tabela 5: Espectro de atividade total de PN1137, PN1493,
PN1815 e PN1957 em um painel de 109 cepas de S. aureus.
N° Cepa de S. aureus PN1137 PN1493 PN1815 PN1957
1 HOCILOOl + + + +
2 HOCIL002 + + + +
3 HOCIL003 + + + +
4 HOCIL004 + + + +
5 HOCIL005 + + + +
6 HOCIL006 + + + +
7 HOCIL007 + + + +
8 HOCIL008 + + + +
9 HOCIL009 + + + +
10 HOCIL010 + + + +
11 HOCIL011 + + + +
12 HOCIL012 + + + +
13 HOCIL013 + + + +
14 HOCIL014 + + + +
15 HOCIL015 + + + +
16 HOCIL016 + + + +
17 HOCIL017 + + + +
18 HOCIL018 + + + +
19 HOCIL020 + + + -
20 HOCIL022 + + + +
21 HOCIL093 + + + +
22 HOCIL095 + + + +
23 HOCIL099 + + + +
24 HOCIL106 + + + +
25 HOCIL117 + + + +
26 HOCIL118 + + + +
27 HOCIL124 + + + +
28 HOCIL129 + + + +
29 HOCIL137 + + + +
30 HOCIL139 + + + +
31 HOCIL140 + + + +
32 HOCIL145 + + + +
33 HOCIL148 + + + +
34 HOCIL155 + + + +
35 HOCIL156 + + + +
36 HOCIL161 + + + +
37 HOCIL163 + + + +
38 HOCIL165 + + + +
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N° Cepa de S. aureus PN1137 PN1493 PN1815 PN1957
39 HOCIL167 + + + +
40 HOCIL172 + + + +
41 HOCIL174 + + + +
42 HOCIL175 + + + +
43 HOCIL176 + + + +
44 HOCIL183 + + + +
45 HOCIL184 + + + +
46 HOCIL185 + + + +
47 HOCIL186 + + + +
48 HOCIL187 + + + +
49 HOCIL188 + + + +
50 HOCIL189 + + + +
51 HOCIL190 + + + +
52 H0CIL191 + + + +
53 HOCIL192 - - - +
54 HOCIL193 + + + +
55 HOCIL194 + + + +
56 HOCIL195 + + + +
57 HOCIL196 - + + +
58 HOCIL197 + + + +
59 HOCIL198 + + + +
60 HOCIL199 + + + +
61 HOCIL200 + + + +
62 HOCIL201 + + + +
63 HOCIL202 + + + +
64 HOCIL203 + + + +
65 HOCIL204 + + + +
66 HOCIL205 + + + +
67 HOCIL206 + + + +
68 HOCIL207 + + + +
69 HOCIL210 - + + -
70 H0CIL211 - + + +
71 HOCIL212 + + + +
72 HOCIL213 + + + +
73 HOCIL214 + + + +
74 HOCIL215 - + + +
75 HOCIL216 + + + +
76 HOCIL217 - + + +
77 HOCIL218 - + + +
78 HOCIL219 + + + +
79 HOCIL220 + + + +
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N° Cepa de S. aureus PN1137 PN1493 PN1815 PN1957
80 HOCIL221 - + + -
81 HOCIL222 - + + -
82 HOCIL223 - + + -
83 HOCIL224 + + + +
84 HOCIL225 - + + -
85 HOCIL226 + + + +
86 HOCIL227 - + + +
87 HOCIL228 - + + +
88 HOCIL229 + + + +
89 HOCIL230 - + + +
90 HOCIL231 - + + +
91 HOCIL232 + + + +
92 HOCIL233 - + + +
93 HOCIL234 - + + +
94 HOCIL235 - + + +
95 HOCIL236 - + + +
96 HOCIL237 + + + +
97 HOCIL238 + + + +
98 HOCIL239 - + + -
99 HOCIL240 + + + +
100 HOCIL241 - + + -
101 HOCIL242 - + + -
102 HOCIL243 - + + +
103 HOCIL244 - + + +
104 HOCIL245 - + + -
105 HOCIL246 - + + -
106 HOCIL248 - + + -
107 HOCIL249 + + + +
108 HOCIL250 + + + -
109 HOCIL251 - + + -
[0121] Esses resultados mostram um espectro de atividade muito amplo para os quatro bacteriófagos testados os quais todos apresentam uma atividade lítica em mais que 70 % das 109 cepas de S. aureus. Particularmente, os bacteriófagos PN1493 e PN1815 mostram resultados muito satisfatórios com uma atividade em 108 das 109 cepas de S.
aureus, o que representa mais que % das cepas do painel.
PN1137 e
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PN1957 também exibem uma ampla faixa de atividade lítica. Os mesmos são eficazes respectivamente em 81 e 95 das cepas do painel (74,31 % e 87,16 % respectivamente). Cada cepa de S. aureus do painel é lisada por pelo menos um dos bacteriófagos. Além disso, 79 das cepas são lisadas pelos quatro bacteriófagos.
EXEMPLO IE Produção de Coquetéis
Coquetel 5: PN1493 e PN1957
[0122] Aqueles dois bacteriófagos têm uma faixa
complementar de atividade lítica. De fato, j untos exibem
uma atividade específica em 98 das cepas de S. aureus
testadas o que representa 89,9 % das cepas. Ademais, sua
atividade lítica total abrange todas as cepas de S. aureus testadas. Um coquetel preferencial compreende esses dois bacteriófagos em uma razão 1:1.
Coquetel 6: PN1815 e PN1957 [0123] Como para o coquetel 5, aqueles dois bacteriófagos têm uma faixa complementar de atividade lítica. Juntos exibem uma atividade específica em 87 das cepas de S. aureus testadas (79,8 %). Ademais, sua atividade lítica total abrange todas as cepas de S. aureus testadas. Um coquetel preferencial compreende esses dois bacteriófagos em uma razão 1:1.
Coquetel 1 (PN1137 e PN1493) e coquetel 4 (PN1493 e PN1815) [0124] Aqueles dois coquetéis também apresentam uma ampla faixa de atividade lítica nas cepas bacterianas testadas. 0 coquetel 1 e 4 tem uma atividade específica lítica respectivamente em 89 e 87 das cepas (respectivamente 81,6 % e 79,8 %) . Ademais, ambos exibem uma atividade lítica total em 108 das cepas, o que
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49/53 representa uma atividade lítica em mais que 99 % das cepas de S. aureus testadas. Os coquetéis preferenciais compreendem os dois bacteriófagos em uma razão 1:1. Coquetéis 3, 5, 6, 8, 9, 10 e 11 [0125] Esses coquetéis exibem uma atividade lítica total em 100 % das cepas.
EXEMPLO II: Eficácia in vivo [0126] Dois modelos de camundongos são usados para avaliar a eficácia de coquetel de bacteriófagos da invenção.
[0127] 0 primeiro modelo reproduz infecções de S. aureus de uma úlcera de pé diabético ou não diabético. O mesmo tem
como base < a infecção da pata traseira com S. aureus de
camundongos virgens ou camundongos diabéticos.
[0128] 0 segundo modelo reproduz infecções de
articulação e osso com S. aureus (BJI) bem como infecção de
articulação profética (PJI).
Modelo de úlcera de pé diabético (DFU)
[0129] A diabete é induzida usando Estreptozotocina. O nível de diabete dos camundongos tem como base a glicose sanguínea em torno de 5 g/1 por sete dias após a indução e em um ensaio de extermínio sanguíneo de S. aureus debilitado.
Cepa de S. aureus [0130] Uma cepa clínica isolada da infecção profética é escolhida com base na capacidade de a cepa persistir e se multiplicar in sítu. 0 melhor inóculo é escolhido com base em uma carga bacteriana sustentada 14 dias pós-injeção em camundongos diabéticos com a taxa de sobrevivência mais alta.
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Projeto experimental [0131] A diabete é induzida por duas injeções de Estreptozotocina em 48 h de intervalo. Uma pata traseira é infectada 14 dias após a primeira injeção de Estreptozotocina. Quatro grupos são comparados:
• tratado com coquetel de bacteriófago. 0 coquetel é administrado localmente (injeção SC) 30 min pós-injeção em multiplicidade de infecção de 1 (MOI 1).
• tratado com coquetel de bacteriófago. O coquetel é administrado localmente (injeção SC) 30 min pós-injeção em MOI 10.
• tratado com antibiótico. Linezolida é administrada sistemicamente (injeção IP) 30 min pós-injeção em 25 mg/kg.
• Controle não tratado. PBS é administrado localmente (injeção SC) 30 min pós-injeção.
[0132] Trinta camundongos por grupo são estudados.
[0133] Em seis pontos no tempo pós-injeção, os camundongos são submetidos à eutanásia, o número de unidade de formação de colônia (CFU) e unidade de formação de placa (PFU) é numerada no tecido mole e osso da pata traseira infectada. A observação macroscópica do edema e da lesão é classificada como mencionado em Chhibber et al. O nível de mieloperoxidase (MPO) é determinado para seguir a reação inflamatória e a histologia da pata traseira é realizada no dia 5 para avaliar as diferenças de reação inflamatória entre os 4 grupos.
[0134] Esse modelo permite avaliar a eficácia de um bacteriófago ou um coquetel de bacteriófagos da invenção em uma infecção de S. aureus de uma úlcera de pé diabético.
Modelo de úlcera de pé não diabético
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Cepa de S. aureus [0135] A cepa usada no modelo de úlcera de pé diabético também é usada no modelo de úlcera de pé não diabético. O mesmo inóculo é usado.
Projeto experimental [0136] Uma pata traseira é infectada em camundongos virgens. Os grupos comparados no modelo de úlcera de pé diabético também são estudados no modelo de úlcera de pé não diabético. Os mesmos critérios foram estudados.
[0137] Esse modelo permite avaliar a eficácia de um bacteriófago ou um coquetel de bacteriófagos da invenção em uma infecção com S. aureus de uma úlcera de pé não diabético.
Modelo de infecção de articulação e osso
Cepa de S. aureus [0138] Uma cepa clínica isolada da infecção profética é escolhida com base na capacidade de a cepa persistir e se multiplicar in situ. 0 melhor inóculo é escolhido com base em uma carga bacteriana sustentada 7 dias pós-injeção com a taxa de sobrevivência mais alta.
Projeto experimental [0139] Os camundongos virgens são infectados através do joelho. Sete grupos são comparados:
• tratado com coquetel de bacteriófago. 0 coquetel é
administrado sistemicamente 30 min pós-injeção em uma dose
alta.
• tratado com coquetel de bacteriófago. 0 coquetel é
administrado sistemicamente 30 min pós-injeção em uma dose
baixa.
• tratado com coquetel de bacteriófago. 0 coquetel é
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52/53 administrado localmente 30 min pós-injeção em uma dose alta.
• tratado com coquetel de bacteriófago. 0 coquetel é administrado localmente 30 min pós-injeção em uma dose baixa.
• tratado com antibiótico.
• tratado com antibiótico + bacteriófago.
• controle não tratado.
[0140] Trinta camundongos por grupo são estudados.
[0141] A caga bacteriana e carga de fago, a situação clinica dos camundongos, como peso, consumo de ração e água, são seguidas ao longo do curso da infecção.
[0142] Esse modelo permite avaliar a eficácia de um bacteriófago ou um coquetel de bacteriófagos da invenção em uma infecção de articulação e osso com S. aureus.
Modelo de infecção de articulação protética
Cepa de S. aureus [0143] A cepa é similar ao modelo BJI bem como o inóculo.
Projeto experimental [0144] Um K-fio é inserido na cavidade femoral de um camundongo virgem. Os camundongos são, então, infectados através do joelho próximo ao K-fio. A comparação de grupos e as leituras são similares ao modelo de infecção de articulação e osso.
[0145] Esse modelo permite avaliar a eficácia de um bacteriófago ou um coquetel de bacteriófagos da invenção em uma infecção de articulação protética com S. aureus.
REFERÊNCIAS [0146]
Petição 870190088262, de 06/09/2019, pág. 57/66
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Claims (4)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição antibacteriana caracterizada por compreender pelo menos um bacteriófago que tem atividade lítica contra pelo menos uma cepa de Staphylococcus aureus (S. aureus), em que o dito pelo menos um bacteriófago é selecionado a partir dos bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma.
2/4 que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma; e
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por compreender adicionalmente um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por ser uma formulação líquida, semilíquida, sólida ou liofilizada.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por compreender entre 101 e 1012 PFU/ml de cada bacteriófago.
8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por ser para uso no tratamento de uma infecção em seres humanos ou animais.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por ser para uso para melhorar a condição de seres humanos ou animais modificando-se a flora microbiana nos ditos seres humanos ou animais.
10. Uso da composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 caracterizado por ser para descontaminar um material.
11. Método para preparar uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 caracterizado pelo fato de que a composição compreende pelo menos dois bacteriófagos, em que o dito método compreende produzir separadamente os ditos pelo menos dois
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2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender pelo menos dois, ainda com mais preferência, pelo menos três bacteriófagos distintos selecionados a partir dos bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 4 ou uma sequência que tem 95 % de identidade com a mesma.
3/4 bacteriófagos, e combinar os ditos bacteriófagos com um carreador ou excipiente adequado.
12. Bacteriófago caracterizado por ter atividade lítica contra uma cepa de S. aureus e que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma.
13. Ácido nucleico isolado caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada a
partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 4 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma. 14 . Polipeptídeo isolado caracterizado por ser codificado por um bacteriófago conforme definido na
reivindicação 12 ou por um ácido nucleico conforme definido na reivindicação 13.
15. Bacteriófago, ácido nucleico ou polipeptídeo
conforme definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 14 caracterizado por ser para uso no tratamento de uma infecção em um humano ou animal. 16. Método para determinar um coquetel de
bacteriófagos eficazes contra uma cepa-alvo de S. aureus caracterizado por compreender:
a) colocar separadamente a cepa-alvo de S. aureus, ou uma amostra que contém a dita cepa, em contato com (i) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma, e/ou (ii) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência
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3. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por compreender qualquer um dos coquetéis de bacteriófagos da Tabela 1.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender:
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma;
- um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência
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4/4 de nucleotideos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma, e/ou (iii) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma, e/ou (iv) um bacteriófago que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com a mesma, e (v) uma ou mais combinações dos mesmos;
b) selecionar bacteriófagos que exibem atividade lítica na cepa,
c) opcionalmente, selecionar adicionalmente bacteriófagos ativos que, quando combinados juntos, exibem atividade sinérgica na cepa; e/ou
d) opcionalmente, selecionar adicionalmente bacteriófagos ativos que, quando combinados juntos, não exibem antagonismo; e/ou
e) selecionar opcionalmente bacteriófagos ativos que pertencem a diferentes gêneros; e
f) combinar os ditos bacteriófagos selecionados.
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