BR122025009902A2 - Polipeptídeo ipd073 isolado, polinucleotídeo recombinante, célula hospedeira microbiana, método de obtenção de uma célula hospedeira transgênica, construto de dna, composição, método para controlar uma população de praga de inseto, método de inibição de crescimento ou de extermínio de uma praga de inseto, método de controle de uma infestação de insetos, uso do polipeptídeo ipd073, método de obtenção de uma planta transgênica, e método de obtenção de uma célula de planta transgênica - Google Patents

Abstract

Trata-se de composições e métodos para controlar pragas. Os métodos envolvem transformar organismos com uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma proteína inseticida. Em particular, as sequências de ácido nucleico são úteis para preparar plantas e micro-organismos que têm atividade inseticida. Portanto, bactérias, plantas, células de plantas, tecidos de planta e sementes transformados são fornecidos. Composições são proteínas e ácidos nucleicos inseticidas de espécies bacterianas. As sequências encontram uso na construção de vetores de expressão para transformação subsequente em organismos de interesse o que inclui plantas, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos). As proteínas pesticidas encontram uso no controle, inibição de crescimento e extermínio de populações de praga de Lepidópteros, Coleópteros, Diptera, fungos, Hemiptera e nemátodos e para produzir composições com atividade inseticida.

Description

[0001] Dividido do pedido de patente BR 11 2017 024948 0 depositado em 13 de maio de 2016.

[0002] A cópia oficial da listagem de sequência é apresentada eletronicamente por meio de EFS-Web como uma listagem de sequência formatada em ASCII com um arquivo nomeado "5354-WO-PCT_SequenceListing” criado em 12 de abril de 2016 e que tem um tamanho de 1.381 quilobites e é depositada concomitantemente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contidas nesse documento ASCII formatado é parte do relatório descritivo e é incorporada na sua totalidade nesse documento para referência.

APOIO GOVERNAMENTAL

[0003] O governo tem determinados direitos sobre a invenção de acordo com o Acordo n°LB09005376.

CAMPO

[0004] Esta revelação refere-se ao campo de biologia molecular. São fornecidos genes inovadores que codificam proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas e as sequências de ácido nucleico que codificam as mesmas são úteis no preparo de formulações pesticidas e na produção de plantas resistentes à praga transgênica.

ANTECEDENTES

[0005] O controle biológico de pragas de inseto de significância agrícola com o uso de um agente microbiano, como fungos, bactérias ou outras espécies de inseto, fornece uma alternativa ecologicamente correta e comercialmente atrativa aos pesticidas químicos sintéticos. De modo geral, o uso de biopesticidas apresenta um risco mais baixo de poluição e riscos ambientais e biopesticidas fornecem especificidade alvo maior do que é característico de inseticidas químicos de amplo espectro tradicionais. Além disso, os biopesticidas normalmente custam menos para produzir e melhoram, desse modo, rendimento econômico para uma variedade ampla de culturas.

[0006] Certas espécies de micro-organismos do gênero Bacillussão conhecidas por terem atividade pesticida contra uma faixa de pragas de insetos incluindo Lepidóptera, Diptera, Coleóptera, Hemiptera e outras. Bacillus thuringiensis (Bt) e Bacillus popilliaeestão dentre os agentes de biocontrole mais bem-sucedidos descobertos até hoje. A patogenicidade de inseto sempre foi atribuída a cepas de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus e B. cereus. Os inseticidas microbianos, particularmente aqueles obtidos a partir de cepas de Bacillus, tiveram uma função importante na agricultura como alternativas a controle químico de pragas.

[0007] As plantas de culturas foram desenvolvidas com a resistência a insetos aprimorada modificando-se geneticamente as plantas de cultura para produzir proteínas pesticidas a partir de Bacillus. Por exemplo, as plantas de milho e de algodão foram geneticamente modificadas para produzir proteínas pesticidas isoladas das cepas de Bt. Essas culturas geneticamente modificadas são agora amplamente usadas na agricultura e dotaram o agricultor de uma alternativa ecologicamente correta para os métodos tradicionais de controle de insetos. Embora tenham demonstrado ser muito bem-sucedidas comercialmente, essas plantas de cultura resistentes a insetos geneticamente modificadas fornecem resistência a apenas uma faixa estreita das pragas de inseto economicamente importantes. Em alguns casos, os insetos podem desenvolver resistência a compostos inseticidas diferentes, o que gera a necessidade de identificar agentes de controle biológico alternativos para controle de pragas.

[0008] Consequentemente, há uma necessidade de novas proteínas pesticidas modos de ação e/ou gamas de atividade inseticida diferentes contra pragas de inseto, por exemplo, proteínas inseticidas que são ativas contra uma variedade de insetos na ordem Lepidoptera e na ordem Coleoptera incluindo, mas sem limitação, pragas de inseto que desenvolveram resistência a bioinseticidas existentes.

SUMÁRIO

[0009] As composições e os métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células de plantas, tecidos e sementes são fornecidos. As composições incluem moléculas de ácido nucleico codificadoras de sequências para polipeptídeos pesticidas e inseticidas, vetores que compreendem essas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que compreendem os vetores. As composições também incluem as sequências de polipeptídeos pesticidas e anticorpos para esses polipeptídeos. As sequências de ácido nucleico podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo micro-organismos e plantas. As sequências de nucleotídeo ou aminoácidos podem ser sequências sintéticas que foram projetadas para expressão em um organismo que inclui, mas sem limitação, um micro-organismo ou uma planta. As composições também compreendem bactérias transformadas, plantas, células de plantas, tecidos e sementes.

[0010] Em particular, as moléculas de ácido nucleico isolado ou recombinante são fornecidas codificando polipeptídeos IPD073 incluindo substituições, deleções, inserções de aminoácidos e fragmentos dos mesmos. Adicionalmente, as sequências de aminoácidos que correspondem aos polipeptídeos IPD073 são abrangidas. São fornecidas moléculas de ácido nucleico isolado ou recombinante com capacidade para codificar polipeptídeos IPD073 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, e SEQ ID NO: 571 assim como substituições, deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos. As sequências de ácido nucleico que são complementares a uma sequência de ácido nucleico das modalidades ou que hibridizam a uma sequência das modalidades também são abrangidas. Também são fornecidos polipeptídeos IPD073 isolados ou recombinantes de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, e SEQ ID NO: 571 assim como substituições, deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos.

[0011] São fornecidos métodos para produzir os polipeptídeos da revelação e para usar esses polipeptídeos para controlar ou exterminar pragas Lepidópteras, Coleópteras, nemátodas, fúngicas e/ou Dípteras. As plantas transgênicas das modalidades expressam uma ou mais dentre as sequências pesticidas reveladas no presente documento. Em várias modalidades, a planta transgênica compreende adicionalmente um ou mais genes adicionais para resistência a inseto, por exemplo, um ou mais genes adicionais para controlar pragas de Coleópteros, Lepidópteros, Hemiptera ou nemátodos. Será entendido por uma pessoa versada na técnica que a planta transgênica pode compreender qualquer gene que confere um traço agronômico de interesse.

[0012] Os métodos para detectar os ácidos nucleicos e polipeptídeos das modalidades em uma amostra também são incluídos. Fornece-se um kit para detectar a presença de um polipeptídeo IPD073 ou detectar a presença de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo IPD073 em uma amostra. O kit pode ser fornecido juntamente com todos os reagentes e amostras de controle necessários para executar um método para detectar o agente destinado, assim como instruções para uso.

[0013] As composições e os métodos das modalidades são úteis para a produção de organismos com resistência ou tolerância a pragas aprimorada. Esses organismos e composições que compreendem os organismos são desejáveis para propósitos agrícolas. As composições das modalidades também são úteis para gerar proteínas alteradas ou melhoradas que têm atividade pesticida ou para detectar a presença de polipeptídeos IPD073.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0014] As Figuras 1A a 1B mostram um alinhamento AlignX das sequências de aminoácidos de IPD073Aa (SEQ ID NO: 4), IPD073Ab (SEQ ID NO: 6), IPD073Ca (SEQ ID NO: 6), IPD073Cb (SEQ ID NO: 8), IPD073Cc (SEQ ID NO: 10), IPD073Cd (SEQ ID NO: 12) e IPD073Ea (SEQ ID NO: 14). A diversidade de sequência é realçada. Os aminoácidos conservadores são indicados com sombreamento claro e os aminoácidos não conservadores são indicados com sombreamento escuro.

[0015] A Figura 2 mostra o número de nós de raízes prejudicadas por lagarta-da-raiz do milho (CRWNIS = pontuação de danos ao nó de lagarta-da-raiz do milho) para eventos de PHP61755 individuais transformados com o polinucleotídeo IPD073Aa (SEQ ID NO: 569) e para um vetor de controle negativo sem o gene de IPD073Aa. Cada asterisco representa um único evento.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0016] A presente revelação é direcionada a composições e métodos para controlar pragas. Os métodos envolvem transformar organismos com sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos IPD073. Em particular, as sequências de ácido nucleico das modalidades são úteis para preparar plantas e micro-organismos que têm atividade pesticida. Desse modo, bactérias, plantas, células de plantas, tecidos de planta e sementes transformados são fornecidos. As composições são ácidos nucleicos pesticidas e proteínas de espécies bacterianas. As sequências de ácido nucleico encontram uso na construção de vetores de expressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos) e para a geração de polipeptídeos IPD073 alterados através de métodos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio-dirigida, permuta de domínio ou embaralhamento de DNA. Os polipeptídeos IPD073 encontram uso no controle ou extermínio de populações da praga Lepidóptera, Coleóptera, Díptera, fúngica, Hemíptera e nemátoda e para produzir composições com atividade pesticida. As pragas de inseto de interesse incluem, mas sem limitação, espécies de Lepidóptera que incluem, mas sem limitação: Lagarta da espiga, (CEW) (Helicoverpa zea), Broca europeia do milho (ECB) (Ostrinia nubilalis), traça das crucíferas,por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; falsa-medideira, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker; e lagarta da soja, por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hübnere espécies de Coleóptera que incluem, mas sem limitação, Larva da lagarta-da-raiz do milho do oeste (Diabrotica virgifera) - WCRW, Lagarta de raiz de milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi) - SCRW e Lagarta de raiz de milho do norte (Diabrotica barberi) - NCRW.

[0017] Por "toxina pesticida" ou "proteína pesticida” é usada no presente documento para se referir a uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas sem limitação, membros das ordens Lepidótera, Díptera, Hemiptera e Coleóptera ou do filo Nemátodo ou uma proteína que tem homologia com tal proteína. As proteínas pesticidas foram isoladas dos organismos incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popilliae. As proteínas pesticidas incluem, mas sem limitação: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp. como PSEEN3174 (Monalysin; (2011) PLoS Pathogens 7:1 a 13); de cepa de Pseudomonas protegens CHA0 e Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2.368 a 2.386; n° de Acesso GenBank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem., 58:12.343 a 12.349) e de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45 a 50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159 a 168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxicology Journal 3:101 a 118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2.062 a 2.069); Patente número US 6.048.838 e Patente número US 6.379.946; um polipeptídeo PIP-1 da Publicação de Patente no US20140007292; um polipeptídeo AfIP-1A e/ou AfIP-1B da Publicação de Patente no US20140033361; um polipeptídeo PHI- 4 das Publicações de Patente no US20140274885 e no US20160040184; um polipeptídeo PIP-47 da Publicação Número PCT WO2015/023846, um polipeptídeo PIP-72 da Publicação Número PCT WO2015/038734; um polipeptídeo PtIP-50 e um polipeptídeo PtIP-65 da Publicação Número PCT WO2015/120270; um polipeptídeo PtIP-83 da Publicação Número PCT WO2015/120276; um polipeptídeo PtIP-96 da PCT de Número de Série PCT/US15/55502; um polipeptídeo IPD079 do documento Número de Série US 62/201977; um polipeptídeo IPD082 do documento Número de Série US 62/269482; e d-endotoxinas incluindo, mas sem limitação, as classes Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry50, Cry51, Cry52, Cry53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70, Cry71 e Cry 72 de genes de d-endotoxina e os genes cyt1 e cyt2 citolíticos de B. thuringiensis. Membros dessas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis bem conhecidas pelo versado na técnica (consulte, Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www").

[0018] Os exemplos de d-endotoxinas também incluem, mas sem limitação, proteínas Cry1A das Patentes Número US 5.880.275 e 7.858.849; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (Deleção de terminal N de variantes de a-hélice 1 e/ou a-hélice 2 de proteínas cry como Cry1A, Cry3A) das Patentes Número US 8.304.604, 8.304.605 e 8.476.226; Cry1B do Pedido de Patente Número de Série US 10/525.318; Cry1C da Patente número US 6.033.874; Cry1F das Patentes Número US 5.188.960 e 6.218.188; quimeras de Cry1A/F das Patentes Número US 7.070.982; 6.962.705 e 6.713.063); uma proteína Cry2 como a proteína Cry2Ab da Patente número US 7.064.249); uma proteína Cry3A incluindo, mas sem limitação, uma proteína inseticida híbrida manipulada (eHIP) criada fundindo-se combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (Publicação de Pedido de Patente Número US 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 das Patente Número US 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 e 7.462.760; uma proteína Cry9 como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F; uma proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology, 74:7.145 a 7.151; uma proteína Cry22, uma proteína Cry34Ab1 das Patentes Número US 6.127.180, 6.624.145 e 6.340.593; uma proteína CryET33 e cryET34 das Patentes Número US 6.248.535, 6.326.351, 6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 e 7.504.229; um homólogo de CryET33 e de CryET34 das Publicações de Patente número US 2006/0191034, 2012/0278954 e da Publicação PCT Número WO 2012/139004; uma proteína Cry35Ab1 das Patentes Número US 6.083.499, 6.548.291 e 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; uma toxina TIC901 ou relacionada; TIC807 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 de PCT US 2006/033867; AXMI-027, AXMI- 036 e AXMI-038 da Patente número US 8.236.757; AXMI-031, AXMI- 039, AXMI-040, AXMI-049 da Patente número US 7.923.602; AXMI- 018, AXMI-020 e AXMI-021 do documento no WO 2006/083891; AXMI- 010 do documento no WO 2005/038032; AXMI-003 do documento no WO 2005/021585; AXMI-008 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2004/0250311; AXMI-006 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2004/0216186; AXMI-007 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2004/0210965; AXMI-009 do Pedido de Patente Número US 2004/0210964; AXMI-014 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2004/0197917; AXMI-004 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 do documento no WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 do documento no WO 2004/074462; AXMI-150 da Patente número US 8.084.416; AXMI-205 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 e AXMI-064 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2011/0263488; AXMI-R1 e proteínas relacionadas da Publicação de Pedido de Patente Número US 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z de WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 de WO 2011/103247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI- 163 e AXMI-184 da Patente número US 8.334.431; AXMI-001, AXMI- 002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI-045 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 da Patente número US 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2010/0005543, proteínas cry como Cry1A e Cry3A que têm sítios proteolíticos modificados da Patente número US 8.319.019; um proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca da cepa de Bacillus thuringiensis VBTS 2528 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2011/0064710. A atividade inseticida de proteínas Cry é bem conhecida por um versado na técnica (para análise, consultar van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1 a 16). O uso de proteínas Cry como traços de planta transgênica é bem conhecido por um versado na técnica e plantas transgênicas Cry que incluem, mas sem limitação, plantas que expressam Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI- Bt receberam a aprovação regulatória (consultar Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283 a 300 e CERA. (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera- gmc.org/index.php?action=gm_crop_database que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por uma pessoa versada na técnica também pode ser expressa em plantas, como Vip3Ab & CrylFa (documento n° US2012/0317682); CrylBE &CrylF (documento n° US2012/0311746); CrylCA & CrylAB (documento n° US2012/0311745); CrylF & CryCa (documento n° US2012/0317681); CrylDA & CrylBE (documento n° US2012/0331590); CrylDA & CrylFa (documento n° US2012/0331589); CrylAB & CrylBE (documento n° US2012/0324606); CrylFa & Cry2Aa e CrylI & CrylE (documento n° US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab e Cry6Aa (documento n° US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab & Cry3Aa (documento n° US20130167268); e Cry3A e CrylAb ou Vip3Aa (documento n° US20l30ll6l70). Proteínas inseticidas também incluem lipases inseticidas que incluem lipídeo acil-hidrolases da Patente no US 7,49l,869, e colesterol oxidases tais como de Streptomyces (Purcell et al. (l993) Biochem Biophys Res Commun l5:l.406 a l.4l3). As proteínas pesticidas também incluem toxinas de VIP (proteínas inseticidas vegetativas) das Patentes nos U.S. 5.877.0l2, 6.l07.279, 6.l37.033, 7.244.820, 7.6l5.686 e 8.237.020 e semelhantes. Outras proteínas VIP são bem conhecidas para um indivíduo versado na técnica (consultar, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser acessado pela rede mundial de computadores on com o uso do prefixo "www"). As proteínas pesticidas também incluem proteínas de complexo de toxina (TC), obteníveis a partir de organismos, tal como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consultar as Patentes números US 7.49l.698 e 8.084.4l8). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida "autônoma" e outras proteínas TC melhoram a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC "autônoma" (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser melhorada por um ou mais "potenciadores" de proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme referido no presente documento, as proteínas de Classe A ("Proteína A") são toxinas autônomas. As proteínas de Classe B ("Proteína B") e as proteínas de Classe C ("Proteína C") melhoram a toxicidade das proteínas de Classe A. Os exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Os exemplos de proteínas de Classe B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi. Os exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1Wi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente n° U.S. 8.334.366).

[0019] Em algumas modalidades, os polipeptídeos IPD073 incluem sequências de aminoácidos deduzidas das sequências de ácido nucleico de comprimento completo reveladas no presente documento e sequeências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências de comprimento completo, devido ao uso de um local de início a jusante alternativo ou devido ao processamento que produz uma proteína mais curta que tem atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo em que a proteína é expressa ou na praga após a ingestão da proteína.

[0020] Desse modo, são fornecidas no presente documento as sequências de ácido nucleico isolado ou recombinante inovadoras que conferem atividade pesticida. Também são fornecidas sequências de aminoácidos de polipeptídeos IPD073. A proteína que resulta da tradução desses genes de polipeptídeo IPD073 permite que células controlem ou exterminem pragas que ingerem a mesma.

Moléculas de Ácido Nucleico e Variantes e Fragmentos das mesmas

[0021] Um aspecto se refere a moléculas de ácido nucleico isolado ou recombinante que compreendem sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos IPD073 ou porções biologicamente ativas das mesmas, assim como moléculas de ácido nucleico suficientes para o uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas com regiões de homologia de sequência. Conforme usado no presente documento, o termo "molécula de ácido nucleico" se refere a moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA, DNA genômico, DNA plastídeo, DNA mitocondrial) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerado com o uso de análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla.

[0022] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" (ou DNA) é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro. Uma molécula de ácido nucleico “recombinante” (ou DNA) é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que está em uma célula hospedeira de planta ou bacteriana recombinante. Em algumas modalidades, um ácido nucleico "isolado" ou "recombinante"está livre de sequências (preferencialmente sequências codificadoras de proteína) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5‘ e 3‘ do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Com propósitos da revelação, "isolado" ou "recombinante" quando usado se refere a moléculas de ácido nucleico que excluem cromossomos isolados. Por exemplo, em várias modalidades, a molécula de ácido nucleico recombinante que codifica os polipeptídeos IPD073 pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de ácido nucleico que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado.

[0023] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica polipeptídeos IPD073 tem uma ou mais alterações na sequência de ácido nucleico em comparação com a sequência de ácido nucleico nativa ou genômica. Em algumas modalidades, a mudança na sequência de ácido nucleico nativo ou genômico inclui, mas sem limitação: mudanças na sequência de ácido nucleico devido à degeneração do código genético; mudanças na sequência de ácido nucleico devido à substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácido em comparação à sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais íntrons; deleção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante; e deleção da região não traduzida 5' e/ou 3' associada à sequência de ácido nucleico genômico. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD073 é uma sequência não genômica.

[0024] Uma variedade de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD073 ou proteínas relacionadas é contemplada. Tais polinucleotídeos são úteis para a produção de polipeptídeos IPD073 em células hospedeiras quando operacionalmente ligados às sequências promotoras, de terminação de transcrição e/ou de poliadenilação adequadas. Tais polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam polipeptídeos IPD073 ou proteínas relacionadas.

Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD073

[0025] Uma fonte de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD073 ou proteínas relacionadas é uma espécie de Pseudomonas, Enterobacter, Cedecea ou Stigmatella que contém um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo IPD073. Os polinucleotídeos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 15 a 291, SEQ ID NO: 569 ou SEQ ID NO: 570 podem ser usados para expressar polipeptídeos IPD073 em hospedeiros bacterianos que incluem, mas sem limitação, células hospedeiras bacterianas de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas e Rhizobium. Os polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam polipeptídeos IPD073 ou proteínas relacionadas. Tais sondas podem ser usadas para identificar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos derivados de espécies de bactéria.

[0026] Os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD073 também podem ser sintetizados de novo a partir de uma sequência de polipeptídeos IPD073. A sequência do gene de polinucleotídeo pode ser deduzida a partir de uma sequência de polipeptídeos IPD073 através do uso do código genético. Os programas de computador, como "BackTranslate" (GCG™ Package, Acclerys, Inc. San Diego, Califórnia) podem ser usados para converter uma sequência de peptídeos na sequência de nucleotídeo correspondente codificadora do peptídeo. Os exemplos de sequências de polipeptídeos IPD073 que podem ser usadas para obter sequências de codificação de nucleotídeos correspondentes incluem, mas sem limitação, as sequências de polipeptídeos IPD073 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, e SEQ ID NO: 571. Ademais, as sequências de polinucleotídeos IPD073 sintéticos da revelação podem ser projetadas de modo que as mesmas sejam expressas em plantas. A Patente n° U.S. 5.500.365 descreve um método para sintetizar genes de planta para intensificar o nível de expressão da proteína codificada pelo gene sintetizado. Esse método se refere à modificação das sequências genéticas estruturais do transgene exógeno para fazer com que os mesmos sejam eficientemente transcritos, processados, traduzidos e expressos pela planta. Os recursos de genes que são expressos de modo satisfatório em plantas incluem eliminação de sequências que podem causar a união de íntron indesejável ou poliadenilação na região de codificação de um transcrito de gene enquanto é retida substancialmente a sequência de aminoácidos da porção tóxica da proteína inseticida. Um método similar para obter expressão aprimorada de transgenes em plantas monocotiledôneas é revelado na Patente n° U.S. 5.689.052.

[0027] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo IPD073 é um polinucleotídeo que tem a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 15 a 291, SEQ ID NO: 569 ou SEQ ID NO: 570; e variantes, fragmentos e complementos das mesmas. "Complemento"é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico que é suficientemente complementar a uma dada sequência de ácido nucleico, de modo que possa hibridizar a dada sequência de ácido nucleico para formar, assim, um duplex estável. “Variantes de sequência de polinucleotídeo" é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico que, exceto pela degeneração do código genético, codifica o mesmo polipeptídeo.

[0028] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IPD073 é uma sequência de ácido nucleico não genômico. Conforme usado no presente documento, uma "sequência de ácido nucleico não genômico"ou "molécula de ácido nucleico não genômico"ou "polinucleotídeo não genômico"se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem uma ou mais mudanças na sequência de ácido nucleico em comparação a uma sequência de ácido nucleico nativo ou genômico. Em algumas modalidades a mudança para uma molécula de ácido nucleico nativa ou genômica inclui mas não está limitada a: alterações na sequência de ácido nucleico devido à degenerescência do código genético; otimização de códons da sequência de ácido nucleico para a expressão em plantas; mudanças na sequência de ácido nucleico para introduzir pelo menos uma substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácidos em comparação com a sequência nativa ou genômica; a remoção de um ou mais íntrons associados com a sequência de ácido nucleico genômica; inserção de um ou mais íntrons heterólogos; deleção de uma ou mais regiões reguladoras a montante ou a jusante associadas com a sequência de ácido nucleico genômica; inserção de uma ou mais regiões reguladoras heterólogas a montante ou a jusante; deleção da região 5' e/ou 3'não traduzida associada à sequência de ácido nucleico genômica; inserção de uma região heteróloga 5' e/ou 3'não traduzida; e modificação de um sítio de poliadenilação. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não genômico é um cDNA. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não genômico é uma sequência de ácido nucleico sintético.

[0029] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD073 é um polinucleotídeo não genômico que tem uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, em relação à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 15 a 291, SEQ ID NO: 569 ou SEQ ID NO: 570, em que o polipeptídeo IPD073 tem atividade inseticida.

[0030] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo IPD073 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571, que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 ou mais substituições, deleções e/ou adições de aminoácido em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, ou SEQ ID NO: 571.

[0031] Também são fornecidas moléculas de ácido nucleico que codificam produtos de transcrição e/ou tradução que são subsequentemente unidos para produzir finalmente polipeptídeos IPD073 funcionais. A união pode ser alcançada in vitro ou in vivo, e pode envolver unir cis ou trans. O substrato para unir pode ser polinucleotídeos (por exemplo, transcritos de RNA) ou polipeptídeos. Um exemplo de união cis de um polinucleotídeo é quando um íntron inserido em uma sequência de codificação é removido e as duas regiões de éxon de flanqueamento são unidas para gerar uma sequência de codificação de polipeptídeo IPD073. Um exemplo de união trans seria quando um polinucleotídeo é encriptado separando-se a sequência de codificação em dois ou mais fragmentos que podem ser separadamente transcritos e, então, submetidos à união para formar a sequência de codificação pesticida de comprimento completo. O uso de uma sequência de aprimoramento de união, a qual pode ser introduzida em um construto, pode facilitar a união na união em cis ou trans de polipeptídeos (Patentes nos U.S. 6.365.377 e 6.531.316). Desse modo, em algumas modalidades, os polinucleotídeos não codificam diretamente um polipeptídeo IPD073 de comprimento total, mas, ao invés disso, codificam um fragmento ou fragmentos de um polipeptídeo IPD073. Esses polinucleotídeos podem ser usados para expressar um polipeptídeo IPD073 funcional através de um mecanismo que envolve união, em que a união pode ocorrer no nível do polinucleotídeo (por exemplo, íntron/éxon) e/ou do polipeptídeo (por exemplo, inteína/exteína). Isso pode ser útil, por exemplo, no controle de expressão de atividade pesticida, visto que um polipeptídeo pesticida funcional será apenas expresso se todos os fragmentos exigidos forem expressos em um ambiente que permite os processos de união para gerar o produto funcional. Em outro exemplo, a introdução de uma ou mais sequências de inserção em um polinucleotídeo pode facilitar a recombinação com um polinucleotídeo de homologia baixa; o uso de um íntron ou inteína para a sequência de inserção facilita a remoção da sequência interveniente, restaurando, assim, a função da variante codificada.

[0032] As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos dessas sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos IPD073 também são abrangidas pelas modalidades. “Fragmento", conforme usado no presente documento, se refere a uma porção da sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD073. Um fragmento de uma sequência de ácido nucleico pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo IPD073 ou o mesmo pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador PCR com o uso de métodos revelados abaixo. As moléculas de ácido nucleico são fragmentos de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD073 compreendem pelo menos cerca de 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 ou 360, nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de ácido nucleico de comprimento total que codifica um polipeptídeo IPD073 revelado no presente documento, dependendo do uso pretendido. "Nucleotídeos contíguos" é usado no presente documento para se referir a resíduos de nucleotídeo que são imediatamente adjacentes um ao outro. Os fragmentos das sequências de ácido nucleico das modalidades codificarão fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica do polipeptídeo IPD073 e, por isso, retêm a atividade inseticida. “Retém atividade inseticida"é usado no presente documento para se referir a um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade inseticida do polipeptídeo IPD073Aa de comprimento total (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a atividade inseticida é atividade de Lepidópteros. Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra uma espécie de Coleópteros. Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra uma espécie de Diabrotica.

[0033] Em algumas modalidades, a atividade inseticida é contra uma ou mais pragas de inseto do complexo de lagarta-da-raiz do milho: lagarta-da-raiz do milho ocidental, Diabrotica virgifera; lagarta-da-raiz do milho do norte, D. barberi; lagarta-da-raiz do milho do sul ou besouro do pepino manchado, Diabrotica undecimpunctata howardi; e a lagarta-da- raiz do milho mexicana, D. virgifera zeae.

[0034] Em algumas modalidades, um fragmento de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD073 que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína codificará pelo menos cerca de 15, 20, 30, 50, 75, 100, 125 aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo IPD073 de comprimento total das modalidades. Em algumas modalidades, o fragmento é um truncamento do terminal N e/ou um terminal C de pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou mais aminoácidos do terminal N e/ou terminal C em relação à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, SEQ ID NO: 571 ou variantes das mesmas, por exemplo, por meio de proteólise, inserção de um códon inicial, deleção dos códons que codificam os aminoácidos deletados com a inserção concomitante de um códon final ou por inserção de um códon final na sequência de codificação.

[0035] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD073 é codificado por uma sequência de ácido nucleico suficientemente homóloga à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 15 a 291, SEQ ID NO: 569 ou SEQ ID NO: 570. “Suficientemente homólogo" é usado no presente documento para se referir a uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos que tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou homologia de sequência maior em comparação a uma sequência de referência com o uso de um dos programas de alinhamento descritos no presente documento com o uso de parâmetros padrão. Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar homologia correspondente de proteínas codificadas pelas duas sequências de ácido nucleico levando-se em consideração a degeneracidade de códon, similaridade de aminoácido, posicionamento de quadro de leitura e similares. Em algumas modalidades, a homologia de sequência é contra a sequência de comprimento total do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo IPD073 ou contra a sequência de comprimento total de um polipeptídeo IPD073. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD073 é selecionado dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 15 a 291, SEQ ID NO: 569 ou SEQ ID NO: 570.

[0036] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um polipeptídeo IPD073 que tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade de sequência maior em comparação com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, ou SEQ ID NO: 571. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é calculada com o uso de algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® do Pacote de Programa Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é pelo comprimento completo do polipeptídeo calculado com o uso de algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX do Pacote de Programa Vector NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão.

[0037] Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou das duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas aos propósitos de comparação ideais. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade percentual = número de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posições em sobreposição)x100). Em algumas modalidades, as duas sequências têm o mesmo comprimento. Em outra modalidade, a comparação é por toda a totalidade da sequência de referência (por exemplo, pela totalidade da SEQ ID NO: 1). A identidade percentual entre duas sequências pode ser determinada com o uso de técnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sem permitir vãos. Ao calcular a identidade percentual, geralmente combinações exatas são contadas.

[0038] Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443 a 453, usou software GAP Versão 10 para determinar a identidade de sequência ou similaridade com o uso dos seguintes parâmetros padrão: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de ácido nucleico com o uso de GAP Peso de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação de nwsgapdna.cmpii; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos com o uso de Peso de GAP de 8 e peso de comprimento de 2 e o programa de pontuação BLOSUM62. Os programas equivalentes podem também ser usados. "Programa equivalente " é usado no presente documento para se referir a qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem combinações de resíduo de nucleotídeo idênticas e uma identidade de sequência percentual idêntica quando em comparação com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.

[0039] As modalidades também abrangem moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de polipeptídeo IPD073. “Variantes" das sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeo IPD073 incluem aquelas sequências que codificam os polipeptídeos IPD073 revelados no presente documento, mas que diferem conservadoramente devido à degenerescência do código genético assim como aquelas que são suficientemente idênticas conforme discutido acima. As variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular conhecidas, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização conforme delineado acima. As sequências de ácido nucleico variantes também incluem sequências de ácido nucleico sinteticamente derivadas que foram geradas, por exemplo, com o uso de mutagênese sítio-dirigida, mas que ainda codificam os polipeptídeos IPD073 revelados conforme discutido abaixo.

[0040] A presente revelação fornece polinucleotídeos isolados ou recombinantes que codificam qualquer um dos polipeptídeos IPD073 revelados no presente documento. Aqueles indivíduos que têm habilidade comum na técnica irão observar prontamente que, devido à degenerescência do código genético, existe uma multiplicidade de sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD073 da presente revelação.

[0041] O versado na técnica irá observar adicionalmente que alterações podem ser introduzidas por meio de mutação das sequências de ácido nucleico levando, desse modo, às alterações na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos IPD073 codificados e mantendo a atividade biológica das proteínas. Portanto, as moléculas de ácido nucleico variantes podem ser criadas introduzindo-se uma ou mais substituições, adições e/ou exclusões de nucleotídeo nas sequências de ácido nucleico correspondentes reveladas no presente documento, de modo que uma ou mais substituições, adições ou exclusões de aminoácido sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de ácido nucleico variante são também englobadas pela presente revelação.

[0042] Alternativamente, as sequências de ácido nucleico variante podem ser feitas introduzindo-se mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados para a habilidade para conferir atividade pesticida para identificar mutantes que retêm atividade. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de modo recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada com o uso de técnicas de ensaio padrão.

[0043] Os polinucleotídeos da revelação e fragmentos dos mesmos são opcionalmente usados como substratos para uma variedade de reações de recombinação e recombinação recursiva, além de métodos de clonagem padrão, conforme estabelecido em, por exemplo, Ausubel, Berger e Sambrook, isto é, para produzir homólogos de polipeptídeo pesticida adicionais e fragmentos dos mesmos com propriedades desejadas. Uma variedade de tais reações é conhecida, incluindo aquelas desenvolvidas pelos inventores e seus colegas de trabalho. Os métodos para produzir uma variante de qualquer ácido nucleico listados no presente documento que compreendem recombinar de modo recursivo tal polinucleotídeo com um segundo (ou mais) polinucleotídeo, formando, desse modo, uma biblioteca de polinucleotídeos variantes, também são modalidades da revelação, assim como as bibliotecas produzidas, as células que compreendem as bibliotecas e qualquer polinucleotídeo recombinante produzido por tais métodos. Adicionalmente, tais métodos compreendem opcionalmente selecionar um polinucleotídeo variante de tais bibliotecas com base na atividade pesticida, em que tal combinação recursiva é feita in vitro ou in vivo.

[0044] Uma variedade de protocolos geradores de diversidade, incluindo protocolos de recombinação recursiva de ácido nucleico, estão disponíveis e completamente descritos na técnica. Os procedimentos podem ser usados separadamente, e/ou em combinação para produzir uma ou mais variantes de um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, assim como variantes de proteínas codificadas. Individual e coletivamente, esses procedimentos fornecem maneiras amplamente aplicáveis e robustas para gerar ácidos nucleicos diversificados e conjuntos de ácidos nucleicos (incluindo, por exemplo, bibliotecas de ácido nucleico) úteis, por exemplo, para a projeção ou evolução rápida de ácidos nucleicos, proteínas, vias, células e/ou organismos com características novas e/ou melhoradas.

[0045] Embora distinções e classificações sejam feitas no decorrer da discussão por clareza, será notado que as técnicas normalmente não são mutuamente exclusivas. Certamente, os vários métodos podem ser usados unicamente ou em combinação, em paralelo ou em série, para acessar diversas variantes de sequência.

[0046] O resultado de qualquer um dos procedimentos de geração de diversidade descritos no presente documento pode ser a geração de um ou mais ácidos nucleicos, os quais podem ser selecionados ou triados para ácidos nucleicos com ou que conferem propriedades desejáveis ou que codificam proteínas com ou que conferem propriedades desejáveis. Após a diversificação por um ou mais dos métodos no presente documento ou disponíveis de outro modo para uma pessoa versada na técnica, quaisquer ácidos nucleicos que são produzidos podem ser selecionados para uma atividade ou propriedade desejada, por exemplo, atividade pesticida ou tal atividade a um pH desejado, etc. Isso pode incluir identificar qualquer atividade que pode ser detectada, por exemplo, em um formato automatizado ou automatizável, por qualquer um dentre os ensaios da técnica, consultar, por exemplo, a discussão de triagem de atividade inseticida, infra. Uma variedade de propriedades relacionadas (ou até mesmo não relacionadas) pode ser avaliada, em série ou em paralelo, a critério do praticante.

[0047] As descrições de uma variedade de procedimentos de geração de diversidade para gerar sequências de ácido nucleico modificado, por exemplo, aquelas que codificam polipeptídeos que têm atividade pesticida ou fragmentos dos mesmos, são encontradas nas publicações a seguir e nas referências citadas nas mesmas: Soong, et al., (2000) Nat Genet 25(4):436 a 439; Stemmer, et al., (1999) Tumor Targeting 4:1 a 4; Ness, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:893 a 896; Chang, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:793 a 797; Minshull e Stemmer, (1999) Curr Opin Chem Biol 3:284 a 290; Christians, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:259 a 264; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288 a 291; Crameri, et al., (1997) Nat Biotechnol 15:436 a 438; Zhang, et al., (1997) PNAS USA 94:4504 a 4509; Patten, et al., (1997) Curr Opin Biotechnol 8:724 a 733; Crameri, et al., (1996) Nat Med 2:100 a 103; Crameri, et al., (1996) Nat Biotechnol 14:315 a 319; Gates, et al., (1996) J Mol Biol 255:373 a 386; Stemmer, (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" em: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nova Iorque. páginas 447 a 457; Crameri e Stemmer, (1995) BioTechniques 18:194 a 195; Stemmer, et al., (1995) Gene, 164:49 a 53; Stemmer, (1995) Science 270: 1510; Stemmer, (1995) Bio/Technology 13:549 a 553; Stemmer, (1994) Nature 370:389 a 391 e Stemmer, (1994) PNAS USA 91:10747 a 10751.

[0048] Os métodos mutacionais de geração de diversidade incluem, por exemplo, mutagênese direcionada a local (Ling, et al., (1997) Anal Biochem 254(2):157 a 178; Dale, et al., (1996) Methods Mol Biol 57:369 a 374; Smith, (1985) Ann Rev Genet 19:423 a 462; Botstein and Shortle, (1985) Science 229:1.193 a 1201; Carter, (1986) Biochem J 237:1 a 7 e Kunkel, (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" em Nucleic Acids&Molecular Biology (Eckstein and Lilley, eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagênese com o uso de modelos que contêm uracil (Kunkel, (1985) PNAS EUA 82:488 a 492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol 154:367 a 382 e Bass, et al., (1988) Science 242:240 a 245); mutagênese direcionada a oligonucleotídeo (Zoller e Smith, (1983) Methods Enzymol 100:468 a 500; Zoller e Smith, (1987) Methods Enzymol 154:329 a 350 (1987); Zoller e Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6.487 a 6.500), mutagênese de DNA modificada por fosforotioato (Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8.749 a 8.764; Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8.765 a 8.787 (1985); Nakamaye e Eckstein, (1986) Nucl Acids Res 14:9.679 a 9.698; Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:791 a 802 e Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:803 a 814); mutagênese com o uso de DNA dúplex incompleto (Kramer, et al., (1984) Nucl Acids Res 12:9.441 a 9.456; Kramer e Fritz, (1987) Methods Enzymol 154:350 a 367; Kramer, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:7.207 e Fritz, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:6.987 a 6.999).

[0049] Os métodos adequados adicionais incluem reparo de ponto de emparelhamento errôneo (Kramer, et al., (1984) Cell 38:879 a 887), mutagênese com o uso de cepas hospedeiras deficientes de reparo (Carter, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:4431 a 4443 e Carter, (1987) Methods in Enzymol 154:382 a 403), mutagênese por deleção (Eghtedarzadeh e Henikoff, (1986) Nucl Acids Res 14:5115), seleção de restrição e purificação de restrição (Wells, et al., (1986) Phil Trans R Soc Lond A 317:415 a 423), mutagênese por síntese de gene total (Nambiar, et al., (1984) Science 223:1.299 a 1.301; Sakamar e Khorana, (1988) Nucl Acids Res 14:6.361 a 6.372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315 a 323 e Grundstrom, et al. , (1985) Nucl Acids Res 13:3.305 a 3.316), reparo de quebra em fita dupla (Mandecki, (1986) PNAS USA, 83:7.177 a 7.181 e Arnold, (1993) Curr Opin Biotech 4:450 a 455). Os detalhes adicionais de muitos dentre os métodos acima podem ser encontrados em Methods Enzymol Volume 154, que também descreve os controles úteis para a resolução de problemas com vários métodos de mutagênese.

[0050] Os detalhes adicionais em relação a vários métodos geradores de diversidade podem ser encontrados nas Patentes U.S., Pedidos e publicações PCT e publicações EPO a seguir: Patente n° U.S. 5.723.323, Patente n° U.S. 5.763.192, Patente n° U.S. 5.814.476, Patente n° U.S. 5.817.483, Patente n° U.S. 5.824.514, Patente n° U.S. 5.976.862, Patente n° U.S. 5.605.793, Patente n° U.S. 5.811.238, Patente n° U.S. 5.830.721, Patente n° U.S. 5.834.252, Patente n° U.S. 5.837.458, documento n° WO 1995/22625, documento n° WO 1996/33207 , documento n° WO 1997/20078, documento n° WO 1997/35966, documento n° WO 1999/41402, documento n° WO 1999/41383, documento n° WO 1999/41369, documento n° WO 1999/41368, documento n° EP 752008, documento n° EP 0932670, documento n° WO 1999/23107, documento n° WO 1999/21979, documento n° WO 1998/31837 , documento n° WO 1998/27230, documento n° WO 1998/27230, documento n° WO 2000/00632, documento n° WO 2000/09679, documento n° WO 1998/42832, documento n° WO 1999/29902, documento n° WO 1998/41653, documento n° WO 1998/41622, documento n° WO 1998/42727, documento n° WO 2000/18906, documento n° WO 2000/04190, documento n° WO 2000/42561, documento n° WO 2000/42559, documento n° WO 2000/42560, documento n° WO 2001/23401 e documento n ° PCT/US01/06775.

[0051] As sequências de nucleotídeos das modalidades também podem ser usadas para isolar sequências correspondentes de outros organismos incluindo, mas sem limitação, bactéria que inclui espécies de Pseudomonas, Enterobacter, Cedecea ou Stigmatella. Dessa maneira, os métodos, como PCR, hibridização e semelhantes podem ser usados para identificar tais sequências com base em sua homologia de sequência às sequências estabelecidas no presente documento. As sequências que são selecionadas com base em sua identidade de sequência com as sequências inteiras estabelecidas no presente documento ou com os fragmentos das mesmas são abrangidas pelas modalidades. Tais sequências incluem sequências que são ortólogas das sequências reveladas. O termo "ortólogos"se refere a genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em espécies diferentes como resultado da especiação. Os genes encontrados em espécies diferentes são considerados ortólogos quando suas sequências de nucleotídeo e/ou suas sequências de proteínas codificadas compartilham identidade substancial, conforme definido em outra parte no presente documento. As funções de ortólogos são muitas vezes altamente conservadas dentre as espécies.

[0052] Em uma abordagem de PCR, os iniciadores de oligonucleotídeo podem ser projetados para o uso em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes a partir de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque), mais adiante no presente documento, "Sambrook". Também consultar Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque). Os métodos conhecidos de PCR incluem, mas sem limitação, métodos que usam iniciadores emparelhados, iniciadores encaixados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de gene, iniciadores específicos de vetor, iniciadores com emparelhamento parcialmente errôneo e semelhantes.

[0053] Para identificar os polipeptídeos IPD073 potenciais a partir de bactéria, os lisatos celulares podem ser triados com anticorpos gerados contra um polipeptídeo IPD073 e/ou polipeptídeos IPD073 com o uso de métodos Western blotting e/ou ELISA. Esses tipos de ensaios podem ser realizados de uma maneira de produtividade alta. As amostras positivas podem ser adicionalmente analisadas por várias técnicas, como purificação e identificação de proteína com base em anticorpos. Os métodos para gerar anticorpos são bem conhecidos na técnica, conforme discutido abaixo.

[0054] Alternativamente, o método de identificação de proteína baseado em espectrometria de massa pode ser usado para identificar homólogos de polipeptídeos IPD073 com o uso de protocolos nas literaturas (Scott Patterson, (1998), 10.22, 1 a 24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc.). Especificamente, o método de identificação de proteína baseado em LC-MS/MS é usado para associar os dados de MS de determinado lisato celular ou amostras enriquecidas de peso molecular desejadas (retiradas de gel SDS-PAGE de faixas de peso molecular relevantes para polipeptídeos IPD073) com informações de sequência de polipeptídeos IPD073 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, SEQ ID NO: 571, e seus homólogos. Qualquer correspondência em sequências de peptídeos indica o potencial para ter as proteínas homólogas nas amostras. As técnicas adicionais (purificação de proteína e biologia molecular) podem ser usadas para isolar a proteína e identificar as sequências dos homólogos.

[0055] Em métodos de hibridização, toda ou parte da sequência de ácido nucleico pesticida pode ser usada para triar cDNA ou bibliotecas genômicas. Métodos para construção de tais bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra. As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser identificadas com um grupo detectável, como 32P ou qualquer outro marcador detectável, como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático. As sondas para hibridização podem ser produzidas por meio de identificação de oligonucleotídeos sintéticos com base na sequência de ácido nucleico de codificação de polipeptídeos IPD073 revelada no presente documento. Iniciadores de degeneração projetados com base em nucleotídeos conservados ou resíduos de aminoácido nas sequências de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos codificada podem adicionalmente ser usados. A sonda compreende tipicamente uma região de sequência de ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos consecutivos de sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD073 da revelação ou um fragmento ou variante do mesmo. Os métodos para a preparação de sondas para hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra, incorporado no presente documento a título de referência.

[0056] Por exemplo, toda uma sequência de ácido nucleico, que codifica um polipeptídeo IPD073, revelada no presente documento ou uma ou mais porções da mesma podem ser usadas como uma sonda com capacidade para hibridizar especificamente as sequências de ácido nucleico correspondentes que codificam sequências do tipo polipeptídeo IPD073 e RNAs mensageiros. Para alcançar a hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e têm preferencialmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos em comprimento ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências pesticidas correspondentes a partir de um organismo escolhido por PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências de codificação adicionais a partir de um organismo desejado ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de sequências de codificação em um organismo. As técnicas de hibridização incluem triagem por hibridização de bibliotecas de DNA plaqueadas (placas ou colônias; consultar, por exemplo, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

[0057] A hibridização de tais sequências pode ser executada sob condições estringentes. "Condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes"é usado no presente documento para se referir a condições sob as quais uma sonda hibridizará a sua sequência direcionada a um grau maior de modo detectável do que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). As condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando-se a estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, as sequências direcionadas que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum desajuste nas sequências de modo que graus menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos de cerca de 1.000 nucleotídeos em comprimento, preferencialmente menos de 500 nucleotídeos em comprimento. Proteínas e Variantes e Fragmentos Dos Mesmos

[0058] Os polipeptídeos IPD073 também são abrangidos pela revelação. "Polipeptídeo IPD073" e "proteína IPD073" conforme usados no presente documento se referem intercambiavelmente a um polipeptídeo que tem atividade inseticida incluindo, mas sem limitação, atividade inseticida contra uma ou mais pragas de inseto das ordens Lepidóptera e/ou Coleóptera, e é suficientemente homólogo à proteína da SEQ ID NO: 2. Contempla-se uma variedade de polipeptídeos IPD073. As fontes de polipeptídeos IPD073 ou proteínas relacionadas são espécies de bactéria selecionadas dentre, mas sem limitação, espécies de Pseudomonas, Enterobacter, Cedecea e Stigmatella.

[0059] "Suficientemente homólogo” é usado no presente documento para se referir a uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou homologia de sequência maior em comparação com uma sequência de referência que usa um dos programas de alinhamento descritos no presente documento com o uso de parâmetros padrão. Em algumas modalidades, a homologia de sequência é contra a sequência de comprimento total de um polipeptídeo IPD073. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD073 tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade de sequência maior em comparação com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar homologia correspondente de proteínas levando em consideração a similaridade de aminoácidos e semelhantes. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é calculada com o uso de algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® do Pacote de Programa Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é pelo comprimento inteiro do polipeptídeo calculado com o uso de algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® do Pacote de Programa Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão.

[0060] Conforme usado no presente documento, os termos "proteína", "molécula de peptídeo"ou "polipeptídeo"incluem qualquer molécula que compreende cinco ou mais aminoácidos. Sabe-se bem na técnica que as moléculas de proteína, peptídeo ou polipeptídeo podem ser submetidas à modificação, incluindo modificações pós-tradução como, mas sem limitação, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, fosforilação ou oligomerização. Desse modo, conforme usado no presente documento, os termos "proteína", "molécula de peptídeo"ou "polipeptídeo"incluem qualquer proteína que é modificada por qualquer processo biológico ou não biológico. Os termos "aminoácido"e "aminoácidos"se referem a todos os L-aminoácidos de ocorrência natural.

[0061] Uma "proteína recombinante"é usada no presente documento para se referir a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira de planta ou bacteriana recombinante. Um polipeptídeo IPD073 que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de proteína que têm menos do que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína não pesticida (também denominada no presente documento como uma "proteína contaminante").

[0062] “Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas a um polipeptídeo IPD073 e que exibem atividade inseticida. “Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" de polipeptídeos IPD073 inclui fragmentos que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, ou SEQ ID NO: 571, em que o polipeptídeo IPD073 tem atividade inseticida. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas em relação à atividade inseticida. Em algumas modalidades, o fragmento de polipeptídeo IPD073 é um truncamento do terminal N e/ou um terminal C de pelo menos cerca de 1, , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou mais aminoácidos do terminal N e/ou terminal C em relação à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, ou SEQ ID NO: 571, por exemplo, por proteólise, por inserção de um códon inicial, por exclusão dos códons que codificam os aminoácidos excluídos e inserção concomitante de um códon inicial, e/ou inserção de um códon final.

[0063] "Variantes" conforme usado no presente documento se refere a proteínas ou polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos parental. Polipeptídeos IPD073

[0064] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD073 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571, em que o polipeptídeo IPD073 tem atividade inseticida.

[0065] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD073 compreende uma sequência de aminoácidos que tem mais de 80%, pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade através de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571, em que o polipeptídeo IPD073 tem atividade inseticida.

[0066] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD073 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, e SEQ ID NO: 571 que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 ou mais substituições, deleções e/ou adições de aminoácido em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571, em que o polipeptídeo IPD073 tem atividade inseticida.

[0067] Em algumas modalidades, a identidade de sequência é pelo comprimento inteiro do polipeptídeo calculada com o uso de algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® do Pacote de Programa Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia) com todos os parâmetros padrão.

[0068] Em algumas modalidades, a identidade de sequência é pelo comprimento inteiro do polipeptídeo calculada com o uso de BLAST (Basic Local Alignment 20 Search Tool; Altschul, et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403 a 410) com todos os parâmetros padrão.

[0069] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD073 compreende uma sequência de aminoácidos que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ou 38 substituições, deleções e/ou adições de aminoácido em qualquer combinação, em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571, em que o polipeptídeo IPD073 tem atividade inseticida.

[0070] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD073 compreende uma sequência de aminoácidos que tem 12, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 substituições, deleções e/ou adições de aminoácido em qualquer combinação, em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571, em que o polipeptídeo IPD073 tem atividade inseticida.

[0071] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD073 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571, em que o polipeptídeo IPD073 tem atividade inseticida. Filogenética, motivo da sequência e análise estrutural para famílias de proteína inseticida

[0072] Um método de análise de sequência e estrutura pode ser empregado, o qual é composto de quatro componentes: construção de árvore filogenética, achado de motivos de sequência de proteínas, previsão de estrutura secundária e alinhamento de sequências de proteína e estruturas secundárias. Os detalhes sobre cada componente são ilustrados abaixo. 1) Construção de árvore filogenética

[0073] A análise filogenética pode ser realizada com o uso do software MEGA5. As sequências de proteína foram submetidas à análise por ClustalW versão 2 (Larkin M.A et al (2007) Bioinformatics 23(21): 2.947 a 2.948) para múltiplos alinhamentos de sequências. A história evolutiva é, então, inferida pelo método de Máxima Verossimilhança com base no modelo baseado em matriz de JTT. A árvore com a maior verossimilhança de log é obtida, exportada em formato Newick e, adicionalmente, processada para extrair as IDs de sequência na mesma ordem em que apareceram na árvore. Alguns clados que representam subfamílias podem ser manualmente identificados para cada família de proteína inseticida. 2) Achado de motivos de sequência de proteínas

[0074] As sequências de proteína são reordenadas de acordo com a árvore filogenética construída anteriormente, e fornecidas à ferramenta de análise de MOTIVO MEME (Múltiplos EM para Elicitação de MOTIVO) (Bailey T.L., e Elkan C., Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, páginas 28 a 36, AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, 1994.) para identificação de motivos-chave de sequência. MEME é configurado conforme segue: Número mínimo de sítios 2, Largura mínima de motivo 5 e Número máximo de motivos 30. Os motivos de sequência únicos para cada subfamília foram identificados por meio de observação visual. A distribuição de MOTIVOS por toda a família do gene pode ser visualizada na página da Web HTML. Os MOTIVOS são numerados em relação à classificação do valor E para cada MOTIVO. 3) Previsão de estrutura secundária

[0075] PSIPRED, método de previsão de estrutura secundária de alta classificação (Jones DT. (1999) J. Mol. Biol. 292: 195 a 202), pode ser instalado em um servidor Linux local, e usado para a previsão de estrutura secundária de proteína. A ferramenta fornece previsão de estrutura exata com o uso de duas redes neurais de alimentação direta com base no produto PSI- BLAST. A base de dados de PSI-BLAST é criada removendo-se as regiões de baixa complexidade, transmembranares e de bobina espiralada em Uniref100. Os resultados de PSIPRED contêm as estruturas secundárias (Alfa-hélice: H, filamento Beta: E, e Bobina: C) e as classificações de confidência correspondentes para cada aminoácido em uma dada sequência de proteínas. 4) Alinhamento de sequências de proteína e estruturas secundárias

[0076] Um roteiro personalizado pode ser desenvolvido para gerar alinhamento de estrutura secundária com lacunas de acordo com o múltiplo alinhamento de sequência de proteínas da etapa 1 para todas as proteínas. Todas as sequências de proteína alinhadas e estruturas são concatenadas em um único arquivo FASTA e, então, importadas para MEGA para visualização e identificação de estruturas conservadas.

[0077] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD073 tem um peso molecular calculado entre cerca de 35 kD e cerca de 50 kD e entre cerca de 40 kD e cerca de 45 kD e entre cerca de 42 kD e cerca de 44 kD.

[0078] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD073 tem uma propriedade física modificada. Conforme usado no presente documento, o termo "propriedade física"se refere a qualquer parâmetro adequado para descrever as características físico-químicas de uma proteína. Conforme usado no presente documento, "propriedade física de interesse" e "propriedade de interesse"são usados de modo intercambiável para se referir a propriedades físicas de proteínas que estão sob investigação e/ou modificação. Exemplos de propriedades físicas incluem, mas sem limitação, carga de superfície de rede e distribuição de carga na superfície de proteína, hidrofobicidade de rede e distribuição de resíduo hidrofóbico na superfície de superfície de proteína, densidade de carga de superfície, densidade de hidrofobicidade de superfície, contagem total de grupos de ionizáveis em superfície, tensão de superfície, tamanho de proteína e sua distribuição na solução, temperatura de derretimento, capacidade de transporte térmica e segundo coeficiente virial. Exemplos de propriedades físicas também incluem, mas sem limitação, solubilidade, dobra, estabilidade e digestibilidade. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD073 tem digestibilidade aumentada de fragmentos proteolíticos em um estômago de inseto. Modelos para digestão por fluidos gástricos simulados são conhecidos por um indivíduo versado na técnica (Fuchs, R.L. e J.D. Astwood. Food Technology 50: 83 a 88, 1996; Astwood, J.D., et al Nature Biotechnology 14: 1269 a 1273, 1996; Fu TJ et al J. Agric Food Chem. 50: 7154 a 7160, 2002).

[0079] Em algumas modalidades, as variantes incluem polipeptídeos que diferem em sequência de aminoácidos devido à mutagênese. As proteínas variantes abrangidas pela revelação são biologicamente ativas, isto é, continuam a ter a atividade biológica desejada (isto é, atividade pesticida) da proteína nativa. Em alguma modalidade, a variante terá pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou mais da atividade inseticida da proteína nativa. Em algumas modalidades, as variantes podem ter atividade melhorada sobre a proteína nativa.

[0080] Os genes bacterianos têm frequentemente vários códons iniciais de metionina em proximidade ao início do quadro de leitura aberta. Normalmente, a iniciação de tradução em um ou mais dentre esses códons iniciais levará à geração de uma proteína funcional. Esses códons iniciais podem incluir códons ATG. Entretanto, as bactérias, como Bacillus sp., também reconhecem o códon GTG como um códon inicial, e proteínas que iniciam a tradução em códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em ocasiões raras, a tradução em sistemas bacterianos pode iniciar em um códon TTG, embora, nesse caso, o TTG codifique uma metionina. Adicionalmente, não é normalmente determinado a priori qual desses códons é usado naturalmente na bactéria. Desse modo, é entendido que o uso de um dentre os códons de metionina alternativos também pode levar à geração de proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas são abrangidas na presente revelação e podem ser usadas nos métodos da presente revelação. Será entendido que, quando expressas em plantas, será necessário alterar o códon inicial alternado para ATG para tradução apropriada.

[0081] Em outro aspecto, o polipeptídeo IPD073 pode ser expresso como uma proteína precursora com uma sequência interveniente que catalisa a união de proteína pós-tradução em múltiplas etapas. A união de proteína envolve a remoção de uma sequência interveniente de um polipeptídeo com a união concomitante das sequências de flanqueamento para render um polipeptídeo novo (Chong, et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:22159 a 22168). Essa sequência interveniente ou elemento de união de proteína, denominada inteínas, que catalisam sua própria excisão através das três reações coordenadas nas junções de união do terminal N e do terminal C: uma disposição acil da cisteína ou serina do terminal N; uma reação de transesterficação entre os dois terminais para formar um intermediário de tioéster ou éster ramificado e clivagem de ligação de peptídeo acoplada à ciclização da asparagina de terminal C de inteína para libertar a inteína (Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem., 275:9.091 a 9.094. A elucidação do mecanismo de união de proteína levou a várias aplicações com base em inteína (Comb, et al., Patente n° U.S. 5.496.714; Comb, et al. , Patente n° U.S. 5.834.247; Camarero e Muir, (1999) J. Amer. Chem. Soc. 121:5597 a 5598; Chong, et al., (1997) Gene 192:271 a 281, Chong, et al., (1998) Nucleic Acids Res. 26:5109 a 5115; Chong, et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:10567 a 10577; Cotton, et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:1100 a 1101; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:18359 a 18363; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:3923 a 3926; Evans, et al., (1998) Protein Sci. 7:2256 a 2264; Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem. 275:9091 a 9094; Iwai e Pluckthun, (1999) FEBS Lett. 459:166 a 172; Mathys, et al., (1999) Gene 231:1 a 13; Mills, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543 a 3548; Muir, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705 a 6710; Otomo, et al., (1999) Biochemistry 38:16040 a 16044; Otomo, et al., (1999) J. Biolmol. RMN 14:105 a 114; Scott, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13.638 a 13.643; Severinov e Muir, (1998) J. Biol. Chem. 273:16.205 a 16.209; Shingledecker, et al., (1998) Gene 207:187 a 195; Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918 a 926; Southworth, et al., (1999) Biotechniques 27:110 a 120; Wood, et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17:889 a 892; Wu, et al., (1998a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9.226 a 9.231; Wu, et al., (1998b) Biochim Biophys Acta 1387:422 a 432; Xu, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388 a 393; Yamazaki, et al., (1998) J. Am. Chem. Soc., 120:5.591 a 5.592). Para a aplicação de inteínas em transgenes de planta, consultar Yang, et al., (Transgene Res 15:583 a 593 (2006)) e Evans, et al., (Annu. Rev. Plant Biol. 56:375 a 392 (2005)).

[0082] Em outro aspecto, o polipeptídeo IPD073 pode ser codificado por dois genes separados em que a inteína da proteína precursora é proveniente dos dois genes, denominada inteína de separação, e as duas porções do precursor são unidas por uma formação de ligação de peptídeo. Essa formação de ligação peptídica é alcançada por união trans mediada por inteína. Com esse propósito, um primeiro e um segundo cassete de expressão que compreendem os dois genes separados codificam adicionalmente as inteínas com capacidade para mediar união trans de proteína. Por união trans, as proteínas e os polipeptídeos codificados pelo primeiro e segundo fragmentos podem ser ligados por formação de ligação peptídica. As inteínas de união trans podem ser selecionadas a partir dos genomas de nucléolo e de organela de organismos diferentes, incluindo eucariotas, arcabactérias e eubactérias. As inteínas que podem ser usadas são listadas em neb.com/neb/inteins.html, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). A sequência de nucleotídeo que codifica uma inteína pode ser dividida em uma parte 5‘ e uma parte 3‘ que codificam a parte 5‘ e a parte 3‘ da inteína, respectivamente. As porções de sequência não necessárias para a união de inteína (por exemplo, domínio de endonuclease de migração) podem ser deletadas. A sequência de codificação de inteína é dividida de modo que as partes 5‘ e 3‘ tenham capacidade para união trans. Para selecionar um sítio de divisão adequado da sequência de codificação de inteína, as considerações publicadas por Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918 a 926 podem ser seguidas. Na construção do primeiro e do segundo cassete de expressão, a sequência de codificação de inteína 5‘ é ligada à extremidade 3‘ do primeiro fragmento que codifica a parte de terminal N do polipeptídeo IPD073 e a sequência de codificação de inteína 3‘ é ligada à extremidade 5‘ do segundo fragmento que codifica a parte de terminal C do polipeptídeo IPD073.

[0083] Em geral, os parceiros de união trans podem ser projetados com o uso de qualquer inteína dividida, incluindo qualquer inteína artificialmente dividida ou de ocorrência natural. Diversas inteínas divididas de ocorrência natural são conhecidas, por exemplo: a inteína dividida do gene DnaE de Synechocystis sp. PCC6803 (consultar Wu, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95(16):9226 a 9231 e Evans, et al., (2000) J Biol Chem. 275(13):9091 a 9094 e do gene DnaE de Nostoc punctiforme (consultar Iwai, et al., (2006) FEBS Lett. 580(7):1853 a 1858). As inteínas não divididas foram artificialmente divididas no laboratório para criar inteínas divididas novas, por exemplo: a inteína DnaB Ssp artificialmente dividida (consultar, Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422 a 232) e inteína Sce VMA dividida (consultar, Brenzel, et al., (2006) Biochemistry. 45(6):1.571 a 1.578) e uma mini- inteína fúngica artificialmente dividida (consultar, Elleuche, et al., (2007) Biochem Biophys Res Commun. 355(3):830 a 834). Também há bancos de dados de inteína disponíveis que catalogam inteínas conhecidas (consultar, por exemplo, o banco de dados online disponível em: bioinformatics.weizmann.ac.il/~pietro/inteins/Inteinstable.htm l, que pode ser acessado pela world-wide web com o uso do prefixo "www").

[0084] As inteínas não divididas de ocorrência natural podem ter endonuclease ou outras atividades enzimáticas que podem ser tipicamente removidas durante a projeção de uma inteína artificialmente dividida. Tais mini-inteínas ou inteínas divididas minimizadas são bem conhecidas na técnica e têm tipicamente menos de 200 resíduos de aminoácido de comprimento (consultar, Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422 a 432). As inteínas divididas adequadas podem ter outros elementos de polipeptídeo que habilitam purificação adicionados à sua estrutura, visto que tais elementos não inibem a união da inteína dividida ou são adicionados de maneira que permita que os mesmos sejam removidos antes da união. A união de proteína foi relatada com o uso de proteínas que compreendem domínios semelhantes à inteína bacteriana (BIL) (consultar Amitai, et al., (2003) Mol Microbiol. 47:61 a 73) e domínios de autoprocessamento de porco- espinho (porco) (o posterior é combinado com inteínas quando em referência à superfamília porco/inteína ou família HINT (consultar Dassa, et al., (2004) J Biol Chem. 279:32001 a 32007) e domínios como esses também podem ser usados para preparar inteínas artificialmente divididas. Em particular, os membros de não união de tais famílias podem ser modificados por metodologias de biologia molecular para introduzir ou restaurar a atividade de união em tais espécies relacionadas. Os estudos recentes demonstram que a união pode ser observada quando é permitido que um componente de inteína dividida terminal N reaja com um componente de inteína dividida terminal C não encontrado na natureza para ser seu "parceiro"; por exemplo, a união foi observada com a utilização de parceiros que têm de 30 a 50% de homologia com o parceiro de união "natural" (consultar, Dassa, et al., (2007) Biochemistry. 46(1):322 a 330). Outras tais misturas de parceiros de inteína dividida divergentes se demonstraram não reativos entre si (consultar, Brenzel, et al., (2006) Biochemistry. 45(6):1571 a 1578). Entretanto, está dentro da habilidade de uma pessoa versada na técnica relevante determinar a possibilidade de um par particular de polipeptídeos se poder associar um ao outro para fornecer uma inteína funcional com o uso de métodos de rotina e sem o exercício da técnica inventiva.

[0085] Em outro aspecto, o polipeptídeo IPD073 é uma variante permutada circular. Em certas modalidades, o polipeptídeo IPD073 é uma variante permutada circular do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma das SEQ ID NOs; 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571.

[0086] O desenvolvimento de métodos de DNA recombinante tornou possível estudar os efeitos de transposição de sequência em enovelamento, estrutura e função de proteína. A abordagem usada na criação de sequências novas lembra aquela de pares de ocorrência natural de proteínas que são relacionados por reorganização linear de suas sequências de aminoácidos (Cunningham, et al.,(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:3218 a 3222; Teather e Erfle, (1990) J. Bacteriol. 172:3837 a 3841; Schimming, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 204:13 a 19; Yamiuchi e Minamikawa, (1991) FEBS Lett. 260:127 a 130; MacGregor, et al., (1996) FEBS Lett. 378:263 a 266). A primeira aplicação in vitro de tipo de disposição para proteínas foi descrita por Goldenberg and Creighton (J. Mol. Biol. 165:407 a 413, 1983). Na criação de uma variante permutada circular, um terminal N novo é selecionado em um sítio interno (interrupção) da sequência original, a sequência nova que tem a mesma ordem de aminoácidos que a original da interrupção até alcançar um aminoácido que está em ou próximo do terminal C original. Nesse ponto, a sequência nova é unida, diretamente ou através de uma porção adicional de sequência (ligante), a um aminoácido que está em ou próximo do terminal N original e a sequência nova continua com a mesma sequência que a original até alcançar um ponto em que está em ou próxima do aminoácido que foi terminal N ao sítio de interrupção da sequência original, em que esse resíduo forma o terminal C novos da cadeia. O comprimento da sequência de aminoácidos do ligante pode ser selecionado empiricamente ou com orientação a partir de informações estruturais ou usando-se uma combinação das duas abordagens. Quando nenhuma informação estrutural está disponível, uma pequena série de ligantes pode ser preparada para testar com o uso de um projeto cujo comprimento é variado a fim de percorrer uma faixa de 0 a 50 Â e cuja sequência é escolhida a fim de ser consistente com a exposição de superfície (hydrophilicity, Hopp e Woods, (1983) Mol. Immunol. 20:483 a 489; Kyte e Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157:105 a 132; área de superfície exposta a solvente, Lee e Richards, (1971) J. Mol. Biol. 55:379 a 400) e a habilidade para adotar a conformação necessária sem desorganizar a configuração do polipeptídeo pesticida (conformacionalmente flexível; Karplus e Schulz, (1985) Naturwissenschaften 72:212 a 213). Considerando-se uma média de tradução de 2,0 a 3,8 Â por resíduo, isso significaria o comprimento para testar seria entre 0 a 30 resíduos, sendo que 0 a 15 resíduos é a faixa preferencial. Uma exemplificativa de tal série empírica seria construir ligantes com o uso de uma sequência de cassete, como Gly-Gly- Gly-Ser repetida n vezes, em que n é 1, 2, 3 ou 4. Aqueles versados na técnica reconhecerão que há muitas tais sequências que variam em comprimento ou composição que podem servir como ligantes com a consideração primária de que não são excessivamente longas ou curtas (cf., Sandhu, (1992) Critical Rev. Biotech. 12:437 a 462); se foram muito longas, os efeitos de entropia provavelmente desestabilizarão o enovelamento tridimensional e também tornarão o enovelamento cineticamente impraticável, e se forem muito curtas, as mesmas provavelmente desestabilizarão a molécula devido à deformação torcional ou estérica. Aqueles versados na análise de informações estruturais de proteína reconhecerão que o uso da distância entre as extremidades de cadeia, definida como a distância entre carbonos c-alfa, pode ser usado para definir o comprimento da sequência a ser usada ou pelo menos limitar o número de possibilidades que devem ser testadas em uma seleção empírica de ligantes. Os mesmos também reconhecerão que é algumas vezes o caso em que as posições das extremidades da cadeia polipeptídica são mal definidas em modelos estruturais derivados de difração de raio X ou dados de espectroscopia por ressonância magnética nuclear e que, quando verdadeira, essa situação precisará ser, portanto, levada em consideração a fim de estimar apropriadamente o comprimento do ligante exigido. A partir desses resíduos cujas posições são bem definidas, são selecionados dois resíduos que estão próximos em sequência às extremidades de cadeia, e a distância entre seus carbonos c-alfa é usada para calcular um comprimento aproximado para um ligante entre os mesmos. Com o uso do comprimento calculado como um guia, ligantes com uma faixa de número de resíduos (calculada com o uso de 2 a 3,8 Â por resíduo) são então selecionados. Esses ligantes podem ser compostos da sequência original, encurtada ou alongada conforme necessário, e quando alongados, os resíduos adicionais podem ser escolhidos para serem flexíveis e hidrofílicos conforme descrito acima; ou opcionalmente a sequência original pode ser substituída para uso de uma série de ligantes, em que um exemplo é a abordagem de cassete Gly-Gly-Gly-Ser mencionada acima; ou, opcionalmente, uma combinação da sequência original e da sequência nova que tem o comprimento total apropriado pode ser usada. As sequências de polipeptídeos pesticidas com capacidade para enovelar estados biologicamente ativos podem ser preparadas por seleção apropriada das posições de começo (terminal amino) e fim (terminal carboxila) de dentro da cadeia de polipeptídeo original com o uso da sequência ligante, conforme descrito acima. Os terminais amino e carboxila são selecionados de dentro de um estiramento comum de sequência, chamado de região de interrupção, com o uso das diretrizes descritas abaixo. Uma sequência de aminoácidos inovadora é gerada desse modo selecionando-se terminais amino e carboxila dentre a mesma região de interrupção. Em muitos casos, a seleção dos terminais novos será realizada de modo que a posição original do terminal carboxila preceda imediatamente aquela do terminal amino. Entretanto, as pessoas versadas na técnica reconhecerão que as seleções de terminais em qualquer local na região podem funcionar e que as mesmas levarão de modo eficaz a quaisquer deleções ou adições às porções amino ou carboxila da sequência nova. É um princípio central da biologia molecular que a sequência de aminoácidos primária de uma proteína dite o enovelamento para a estrutura tridimensional necessária para a expressão de sua função biológica. Os métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica para obter e interpretar informações estruturais tridimensionais com o uso de difração de raio X de cristais de proteína únicos ou espectroscopia por ressonância magnética nuclear de soluções de proteína. Os exemplos de informações estruturais que são relevantes para a identificação de regiões de interrupção incluem a localização e o tipo de estrutura secundária de proteína (alfa hélices e 3-10, folhas beta paralelas e antiparalelas, inversões e voltas de cadeia, e laços; Kabsch e Sander, (1983) Biopolymers 22:2.577 a 2.637; o grau de exposição a solvente de resíduos de aminoácido, a extensão e o tipo de interações de resíduos entre si (Chothia, (1984) Ann. Rev. Biochem. 53:537 a 572) e a distribuição estática e dinâmica de conformações ao longo da cadeia polipeptídica (Alber e Mathews, (1987) Methods Enzymol. 154:511 a 533). Em alguns casos, as informações adicionais sobre a exposição de solvente de resíduos são conhecidas; um exemplo é um sítio de ligação pós-tradução de carboidrato que está necessariamente na superfície da proteína. Quando as informações estruturais experimentais não estão disponíveis ou não são praticáveis para obter, os métodos também estão disponíveis para analisar a sequência de aminoácidos primária a fim de fazer previsões de estrutura terciária e secundária de proteína, acessibilidade de solvente e a ocorrência de voltas e laços. Os métodos bioquímicos também são algumas vezes aplicáveis para determinar empiricamente a exposição de superfície quando métodos estruturais diretos não são praticáveis; por exemplo, com o uso da identificação de sítios de cisão de cadeia que segue a proteólise limitada a fim de inferir exposição de superfície (Gentile e Salvatore, (1993) Eur. J. Biochem. 218:603 a 621). Portanto, com o uso das informações estruturais experimentalmente derivadas ou métodos preditivos (por exemplo, Srinivisan e Rose, (1995) Proteins: Struct., Funct. & Genetics 22:81 a 99), a sequência de aminoácidos parentais é inspecionada para classificar regiões de acordo com a possibilidade de serem ou não integrais à manutenção de estrutura secundária e terciária. A ocorrência de sequências dentro de regiões que são conhecidas por serem envolvidas na estrutura secundária periódica (alfa hélices e 3-10, folhas beta paralelas e antiparalelas) são regiões que devem ser evitadas. De modo similar, as regiões de sequência de aminoácidos que são observadas ou previstas por ter um grau baixo de exposição a solvente são mais propensas a serem parte do chamado núcleo hidrofóbico da proteína e também devem ser evitadas para seleção de terminais amino e carboxila. Em contraste, aquelas regiões que são conhecidas ou previstas por estarem em voltas ou laços de superfície, e especialmente aquelas regiões que são conhecidas por não serem exigidas para atividade biológica, são os sítios preferidos para localização dos extremos da cadeia polipeptídica. Os estiramentos contínuos de sequência de aminoácidos que são preferidos com base nos critérios acima são chamados de região de interrupção. Os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD073 permutados circulares com novos terminal N/terminal C que contêm uma região de ligante que separa o terminal C e terminal N originais podem ser produzidos essencialmente seguindo o método descrito em Mullins, et al., (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:5.529 a 5.533. As múltiplas etapas de amplificações de reação em cadeia de polimerase (PCR) são usadas para reorganizar a sequência de DNA codificadora da sequência de aminoácidos primária da proteína. Os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD073 permutados circulares com novos terminal N/terminal C que contêm uma região ligante que separa o terminal C e terminal N originais podem ser produzidos com base no método de duplicação em tandem descrito em Horlick, et al., (1992) Protein Eng. 5:427 a 431. A amplificação de reação em cadeia da polimerase (PCR) dos genes de terminal N/terminal C novos é realizada com o uso de DNA modelo duplicado de modo consecutivo.

[0087] Em outro aspecto, proteínas de fusão são fornecidas as quais incluem em sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos que compreende um polipeptídeo IPD073 que inclui, mas sem limitação, o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma das SEQ ID NOs; 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571, e fragmentos ativos das mesmas.

[0088] Os métodos para projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos codificadores das mesmas) são conhecidos por aqueles versados na técnica. Os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo IPD073 podem ser fundidos às sequências de sinal que irão direcionar a localização do polipeptídeo IPD073 para os compartimentos específicos de uma célula procariótica ou eucariótica e/ou direcionar a secreção do polipeptídeo IPD073 das modalidades de uma célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, em E. coli, pode ser desejado o direcionamento da expressão da proteína para o espaço periplásmico. Os exemplos de sequências de sinal ou proteínas (ou fragmentos das mesmas) às quais o polipeptídeo IPD073 pode ser fundido a fim de direcionar a expressão do polipeptídeo para o espaço periplásmico de bactéria incluem, mas sem limitação, a sequência de sinal pelB, a sequência de sinal de proteína de ligação de maltose (MBP), MBP, a sequência de sinal ompA, a sequência de sinal da subunidade B de enterotoxina termolábil de E. coliperiplásmica e a sequência de sinal de fosfatase alcalina. Diversos vetores estão comercialmente disponíveis para a construção de proteínas de fusão que direcionarão a localização de uma proteína, como a série pMAL de vetores (particularmente a série pMAL-p) disponível a partir de New England Biolabs®. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo IPD073 pode ser fundido à sequência de sinal de pectato liase pelB para aumentar a eficiência de expressão e purificação de tais polipeptídeos nas bactérias Gram-negativas (consultar, documentos de Patente no US 5.576.195 e 5.846.818). Fusões de polipeptídeo/peptídeo de transição de plastídeo de planta são bem conhecidas na técnica (consultar, o documento de Patente no US 7.193.133). Os peptídeos de transição de apoplasto, como sinal de secreção de alfa-amilase de arroz ou cevada também são bem conhecidos na técnica. O peptídeo de transição de plastídeo é geralmente fundido no terminal N ao polipeptídeo a ser direcionado (por exemplo, o parceiro de fusão). Em uma modalidade, a proteína de fusão consiste essencialmente no peptídeo de transição de plastídeo e no polipeptídeo IPD073 a serem direcionados. Em outra modalidade, a proteína de fusão compreende o peptídeo de transição de plastídeo e o polipeptídeo a ser direcionado. Em tais modalidades, o peptídeo de transição de plastídeo está preferencialmente no terminal N da proteína de fusão. Entretanto, os resíduos de aminoácido adicionais podem ser N- terminais ao peptídeo de transição de plastídeo, visto que a proteína de fusão é pelo menos parcialmente direcionada a um plastídeo. Em uma modalidade específica, o peptídeo de transição de plastídeo está na metade terminal N, no terço terminal N ou no quarto terminal N da proteína de fusão. A maior parte ou todos os peptídeos de transição de plastídeo geralmente são clivados a partir da proteína de fusão com a inserção no plastídeo. A posição de clivagem pode variar levemente entre espécies de planta em estágios de desenvolvimento de planta diferentes, como resultado de condições intercelulares específicas ou da combinação particular de peptídeo de transição/parceiro de fusão usado. Em uma modalidade, a clivagem de peptídeo de transição de plastídeo é homogênea, de modo que o sítio de clivagem seja idêntico em uma população de proteínas de fusão. Em outra modalidade, o peptídeo de transição de plastídeo não é homogêneo, de modo que o sítio de clivagem varie em 1 a 10 aminoácidos em uma população de proteínas de fusão. O peptídeo de transição de plastídeo pode ser fundido de modo recombinante a uma segunda proteína em uma de diversas maneiras. Por exemplo, um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição pode ser introduzido na sequência de nucleotídeo do peptídeo de transição em uma posição correspondente à sua extremidade terminal C e o mesmo ou um sítio compatível pode ser projetado na sequência de nucleotídeo da proteína a ser direcionada em sua extremidade terminal N. Deve-se tomar cuidado na projeção desses sítios para garantir que as sequências de codificação do peptídeo de transição e a segunda proteína sejam mantidas "em quadro" para permitir a síntese da proteína de fusão desejada. Em alguns casos, pode ser preferencial remover o códon de metionina iniciador da segunda proteína quanto o sítio de restrição novo é introduzido. A introdução de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição em ambas as moléculas parentes e sua união subsequente através de técnicas de DNA recombinante podem resultar na adição de um ou mais aminoácidos extras entre o peptídeo de transição e a segunda proteína. Isso geralmente não afeta a atividade de direcionamento enquanto o sítio de clivagem de peptídeo de transição permanecer acessível e a função da segunda proteína não for alterada pela adição desses aminoácidos extras em seu terminal N. Alternativamente, a pessoa versada na técnica pode criar um sítio de clivagem preciso entre o peptídeo de transição e a segunda proteína (com ou sem sua metionina iniciadora) com o uso de síntese de gene (Stemmer, et al., (1995) Gene 164:49 a 53) ou métodos similares. Além disso, a fusão de peptídeo de transição pode incluir intencionalmente os aminoácidos a jusante do sítio de clivagem. Os aminoácidos no terminal N da proteína madura podem afetar a habilidade do peptídeo de transição para direcionar proteínas a plastídeos e/ou a eficácia de clivagem que segue a importação de proteína. Isso pode ser dependente da proteína a ser direcionada. Consultar, por exemplo, Comai, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(29):15104 a 15109.

[0089] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão são fornecidas compreendendo um polipeptídeo IPD073 e um polipeptídeo inseticida unidos por um ligante de aminoácido. Em algumas modalidades, as proteínas de fusão são fornecidas representadas por uma formula selecionada a partir do grupo que consiste em:

[0090] em que R1é um polipeptídeo IPD073, R2é uma proteína de interesse. O polipeptídeo R1é fundido diretamente ou através de um segmento ligante (L) ao polipeptídeo R2. O termo "diretamente" define fusões nas quais os polipeptídeos são unidos sem um peptídeo ligante. Desse modo, "L" representa uma ligação química ou segmento polipeptídico ao qual tanto R1 quanto R2são fundidos em quadro, mais comumente L é um peptídeo linear ao qual R1 e R2são ligados por ligações amida que ligam o terminal carbóxi de R1 ao terminal amino de L e o terminal carbóxi de L ao terminal amino de R2. Por "fundido em quadro", significa que não há terminação ou interrupção de tradução entre os quadros de leitura de R1 e R2. O grupo ligante (L) é geralmente um polipeptídeo com entre 1 e 500 aminoácidos em comprimento. Os ligantes que unem as duas moléculas são preferencialmente projetados para (1) permitir que as duas moléculas se enovelem e atuem independentemente entre si, (2) não tenham uma propensão para desenvolver uma estrutura secundária ordenada, o que pode interferir nos domínios funcionais das duas proteínas, (3) ter característica hidrofóbica ou carregada mínima que pode interagir com os domínios de proteína funcionais e (4) fornecer separação estérica de R1 e R2, de modo que R1 e R2 possam interagir simultaneamente com seus receptores correspondentes em uma célula única. Tipicamente, os aminoácidos de superfície em regiões de proteína flexíveis incluem Gly, Asn e Ser. Seria esperado que virtualmente qualquer permutação de sequências de aminoácidos que contém Gly, Asn e Ser satisfaça os critérios acima para uma sequência ligante. Outros aminoácidos neutros, como Thr e Ala, também podem ser usados na sequência ligante. Os aminoácidos adicionais também podem ser incluídos nos ligantes devido à adição de sítios de restrição únicos na sequência ligante para facilitar a construção das fusões.

[0091] Em algumas modalidades, os ligantes compreendem sequências selecionadas a partir do grupo de fórmulas: (Gly3Ser)n, (Gly4Ser)n, (Gly5Ser)n, (GlynSer)n ou (AlaGlySer)n em que né um número inteiro. Um exemplo de um ligante altamente flexível é a região espaçadora rica em (GlySer) presente dentro da proteína pIII dos bacteriófagos filamentosos, por exemplo, bacteriófagos M13 ou fd (Schaller, et al., 1975). Essa região fornece uma região espaçadora flexível longa entre dois domínios da proteína de superfície pIII. Também são incluídos os ligantes nos quais uma sequência de reconhecimento de endopeptidase é incluída. Tal sítio de clivagem pode ser valioso para separar os componentes individuais da fusão para determinar se são apropriadamente enovelados e ativos in vitro. Os exemplos de várias endopeptidases incluem, mas sem limitação, Plasmin, Enteroquinase, Calicreína, Uroquinase, Ativador do plasminogênio tecidual, clostripaína, Quimosina, Colagenase, Protease de Veneno de Víbora de Russell, Enzima de clivagem pós- prolina, protease V8, Trombina e fator Xa. Em algumas modalidades, o ligante compreende os aminoácidos EEKKN (SEQ ID NO: 578) a partir do veículo de expressão de múltiplos genes (MGEV), os quais são clivados por proteases vacuolares, conforme revelado na Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2007/0277263. Em outras modalidades, os segmentos de peptídeo ligante da região de articulação de imunoglobulinas de cadeia pesada IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE fornecem uma relação angular entre os polipeptídeos ligados. São especialmente úteis aquelas regiões de articulação em que as cisteínas são substituídas por serinas. Ligantes da presente revelação incluem sequências derivadas da região de articulação gama 2b de IgG de murino em que as cisteínas foram mudadas para serinas. As proteínas de fusão não são limitadas pela forma, tamanho ou número de sequências ligantes empregadas e a única exigência do ligante é que não interfere de modo funcional e adverso no enovelamento e função das moléculas individuais da fusão.

[0092] Em um outro aspecto, os polipeptídeos IPD073 quiméricos são fornecidos os quais são criados através da união de duas ou mais porções de genes de IPD073 que originalmente codificaram as proteínas IPD073 separadas para criar um gene quimérico. A tradução do gene quimérico resulta em um único polipeptídeo IPD073 quimérico com regiões, motivos ou domínios derivados de cada um dos polipeptídeos originais. Em determinadas modalidades, a proteína quimérica compreende porções, motivos ou domínios de polipeptídeos IPD073 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma das SEQ ID NOs; 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571 em qualquer combinação.

[0093] É reconhecido que as sequências de DNA podem ser alteradas por vários métodos, e que essas alterações podem resultar em sequências de DNA codificadoras de proteínas com sequências de aminoácidos diferentes das codificadas pela proteína pesticida do tipo selvagem (ou nativo). Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD073 pode ser alterado de vários modos, incluindo substituições, deleções, truncamentos e inserções de aminoácido de um ou mais aminoácidos, incluindo até 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 ou mais substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido ou combinações dos mesmos em comparação a qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, qualquer uma das SEQ ID NOs; 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571.

[0094] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo IPD073 é selecionada dentre, mas sem limitação, qualquer uma das SEQ ID NOs; 292 a 568 ou SEQ ID NO: 571.

[0095] Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo IPD073 podem ser preparadas por meio de mutações no DNA. Isso também pode ser alcançado por uma dentre diversas formas de mutagênese e/ou em evolução direcionada. Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes terão a atividade pesticida desejada. No entanto, compreende-se que a habilidade de um polipeptídeo IPD073 para conferir atividade pesticida pode ser aprimorada pelo uso de tais técnicas nas composições desta revelação.

[0096] Por exemplo, as substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não essenciais. Um resíduo de aminoácido "não essencial"é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência do tipo selvagem de um polipeptídeo IPD073 sem alterar a atividade biológica. Uma "substituição de aminoácido conservativa"é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem: aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina); cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico); resíduos negativamente carregados polares e suas amidas (por exemplo, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina; cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína); resíduos alifáticos pequenos, não polares ou levemente polares (por exemplo, Alanina, serina, treonina, prolina, glicina); cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano); resíduos não polares alifáticos grandes (por exemplo, metionina, leucina, isoleucina, valina, cisteína); cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina); cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina); cadeias laterais aromáticas grandes (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano).

[0097] As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm função. Em geral, tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácido conservados ou para resíduos de aminoácido que residem em um motivo conservado, em que tais resíduos são essenciais para atividade de proteína. Os exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade de proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas às sequências das modalidades (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas). Os exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições de aminoácido conservadoras e ainda podem reter atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservadoras entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas às sequências das modalidades (por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservadoras entre todas as proteínas contidas no alinhamento das proteínas homólogas). Entretanto, a pessoa versada na técnica entenderia que as variantes funcionais podem ter alterações conservadas ou não conservadas menores nos resíduos conservados. As diretrizes a respeito de substituições de aminoácido apropriadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado ao presente documento a título de referência.

[0098] Na realização de tais mudanças, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice de aminoácido hidropático ao conferir a função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendida na técnica (Kyte e Doolittle, (1982) J Mol Biol. 157(1):105 a 132). É aceito que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribua para a estrutura secundária da proteína resultante, que define, por sua vez, a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e semelhantes.

[0099] Sabe-se na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm índice ou escore hidropático similar e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína equivalente funcionalmente biológica. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, ibid). Os mesmos são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) e arginina (-4,5). Na realização de tais mudanças, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de +2 é preferida, aquelas das quais estão dentro de +1 são particularmente preferidas, e aquelas dentro de +0,5 são ainda mais particularmente preferidas.

[0100] Compreende-se também que na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita efetivamente com base na hidrofilicidade. A Patente n° U.S. 4.554.101 declara que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme manipulado pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona a uma propriedade biológica da proteína.

[0101] Conforme detalhado na Patente n° U.S. 4.554.101, os valores de hidrofilicidade a seguir foram atribuídos a resíduos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0,+0,1); glutamato (+3,0,+0,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5,+0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).

[0102] Alternativamente, alterações podem ser feitas à sequência de proteína de muitas proteínas no terminal amino ou carbóxi sem afetar substancialmente a atividade. Isso pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, como PCR, incluindo amplificações de PCR que alteram ou estendem a sequência de codificação de proteína em virtude da inclusão de sequências codificadoras de aminoácido nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação de PCR. Alternativamente, as sequências de proteína adicionadas podem incluir sequências de codificação de proteína inteiras, tais como aquelas usadas comumente na técnica para gerar fusões de proteína. Tais proteínas de fusão são frequentemente usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar a purificação de proteína, a detecção de proteína ou outros usos experimentais conhecidos na técnica (3) direcionar a secreção ou tradução de uma proteína a uma organela subcelular, como o espaço periplásmico de bactérias Gram negativas, mitocôndrias ou cloroplastos de plantas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, sendo que o último resulta frequentemente em glicosilação da proteína.

[0103] As sequências de nucleotídeo e de aminoácidos variantes da revelação também abrangem as sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais regiões de codificação de polipeptídeo IPD073 diferentes podem ser usadas para criar um novo polipeptídeo IPD073 que possui as propriedades desejadas. Dessa maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência relacionada que compreendem regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas de modo homólogo in vitro ou in vivo. Por exemplo, com o uso dessa abordagem, os motivos de sequência codificadores de um domínio de interesse podem ser embaralhados entre um gene pesticida e outros genes pesticidas conhecidos para obter um gene novo que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, como uma atividade inseticida aumentada. As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747 a 10751; Stemmer, (1994) Nature 370:389 a 391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436 a 438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336 a 347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4.504 a 4.509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288 a 291; e as Patentes nos U.S. 5.605.793 e 5.837.458.

[0104] A permuta ou o embaralhamento de domínio é um outro mecanismo para gerar polipeptídeos IPD073 alterados. Os domínios podem ser comutados entre polipeptídeos IPD073, o que resulta em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade inseticida ou espectro-alvo aprimorado. Os métodos para gerar proteínas recombinantes e testar as mesmas por atividade pesticida são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Naimov, et al., (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328 a 5330; de Maagd, et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537 a 1543; Ge, et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:17954 a 17958; Schnepf, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:20923 a 20930; Rang, et al., 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918 a 2925).

[0105] O alinhamento de homólogos de IPD073 (Figura 1) permite a identificação de resíduos que são altamente conservados dentre os homólogos nessa família.

Composições

[0106] As composições que compreendem um polipeptídeo IPD073 da revelação também estão incluídas. Em algumas modalidades, a composição compreende um polipeptídeo IPD073 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma das SEQ ID NOs; 292 a 568, SEQ ID NO: 571 ou variantes das mesmas. Em algumas modalidades, a composição compreende uma proteína de fusão IPD073.

Anticorpos

[0107] Os anticorpos para um polipeptídeo IPD073 das modalidades ou para variantes ou fragmentos do mesmo também são abrangidos. Os anticorpos da revelação incluem anticorpos policlonais e monoclonais assim como fragmentos dos mesmos que retêm sua habilidade de se ligar ao polipeptídeo IPD073 encontrado no estômago de insetos. Um anticorpo, anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo é dito como tendo capacidade para se ligar a uma molécula se tiver capacidade para reagir especificamente com a molécula para ligar, assim, a molécula ao anticorpo, anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo. O termo "anticorpo" (Ab) ou "anticorpo monoclonal" (Mab) é destinado a incluir as moléculas intatas, assim como fragmentos ou regiões ligantes ou domínios das mesmas (como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab).sub.2) que têm capacidade para ligar hapteno. Tais fragmentos são tipicamente produzidos por clivagem proteolítica, como papaína ou pepsina. Alternativamente, os fragmentos de ligação de hapteno podem ser produzidos através da aplicação de tecnologia de DNA recombinante ou através de química sintética. Os métodos para a preparação dos anticorpos da presente revelação são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, consultar Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow e David Lane (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988), assim como as referências citadas no mesmo. Os trabalhos de referência padrão que estabelecem os princípios gerais de imunologia incluem: Klein, J. Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, N.Y. (1982); Dennett, et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N.Y. (1980) e Campbell, "Monoclonal Antibody Technology," In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Burdon, et al., (eds.), Elsevier, Amsterdã (1984). Também consultar as Patentes nos U.S. 4.196.265; 4.609.893; 4.713.325; 4.714.681; 4.716.111; 4.716.117 e 4.720.459. Os anticorpos de polipeptídeo IPD073 ou porções de ligação de antígeno dos mesmos podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, o que inclui metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein, (1975) Nature 256:495. As outras técnicas para produzir anticorpo monoclonal também podem ser empregadas, como transformação viral ou oncogênica de linfócitos B. Um sistema animal para preparar hibridomas é um sistema murino. Os protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murinas) e procedimentos de fusão também são conhecidos. O anticorpo e anticorpos monoclonais da revelação podem ser preparados utilizando-se um polipeptídeo IPD073 como antígenos.

[0108] Fornece-se um kit para detectar a presença de um polipeptídeo IPD073 ou detectar a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo IPD073, em uma amostra. Em uma modalidade, o kit fornece reagentes à base de anticorpo para detectar a presença de um polipeptídeo IPD073 em uma amostra de tecido. Em outra modalidade, o kit fornece sondas de ácido nucleico identificadas úteis para detectar a presença de um ou mais polinucleotídeos que codificam polipeptídeo IPD073. O kit é fornecido juntamente com reagentes e controles apropriados para executar um método de detecção, assim como instruções para uso do kit.

Identificação e isolamento de receptor

[0109] Os receptores para o polipeptídeo IPD073 das modalidades ou para variantes ou fragmentos dos mesmos também são abrangidos. Os métodos para identificar receptores são bem conhecidos na técnica (consultar Hofmann, et. al., (1988) Eur. J. Biochem. 173:85 a 91; Gill, et al., (1995) J. Biol. Chem. 27.277 a 27.282) e podem ser empregados para identificar e isolar o receptor que reconhece o polipeptídeo IPD073 com o uso das vesículas de membrana de borda em escova de insetos suscetíveis. Além do método de identificação radioativa listado nas literaturas citadas, o polipeptídeo IPD073 pode ser identificado com corante fluorescente e outras identificações comuns, como estreptavidina. As vesículas de membrana de borda em escova (BBMV) de insetos suscetíveis, como lagarta falsa-medideira e percevejos, podem ser preparadas de acordo com os protocolos listados nas referências e separadas em gel de SDS-PAGE e transferidos em membrana adequada. O polipeptídeo IPD073 identificado pode ser incubado com a membrana engarrafada de BBMV e o polipeptídeo IPD073 identificado pode ser identificado com os repórteres identificados. A identificação de banda (ou bandas) de proteína que interage com o polipeptídeo IPD073 pode ser detectada por meio de sequenciamento de fase gasosa de aminoácido de terminal N ou método de identificação de proteína baseado em espectrometria de massa (Patterson, (1998) 10.22, 1 a 24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc). Uma vez que a proteína é identificada, o gene correspondente pode ser clonado a partir de biblioteca de DNA ou cDNA genômico dos insetos suscetíveis e a afinidade de ligação pode ser medida diretamente com o polipeptídeo IPD073. A função de receptor para atividade inseticida pelo polipeptídeo IPD073 pode ser verificada, obtida, por meio do tipo de RNAi do método de knock-out de gene (Rajagopal, et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:46.849 a 46.851).

Construtos de Nucleotídeo, Cassetes de Expressão e Vetores

[0110] O uso do termo "construtos de nucleotídeo" no presente documento não é destinado a limitar as modalidades aos construtos de nucleotídeo que compreendem DNA. Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que os construtos de nucleotídeo, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos compostos de ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, também podem ser empregados nos métodos revelados no presente documento. Os construtos de nucleotídeo, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeo das modalidades abrangem adicionalmente todas as formas complementares de tais construtos, moléculas e sequências. Adicionalmente, os construtos de nucleotídeo, moléculas de nucleotídeo e sequências de nucleotídeo das modalidades abrangem todos os construtos de nucleotídeo, moléculas e sequências que podem ser empregadas nos métodos das modalidades para transformar plantas que incluem, mas sem limitação, aqueles compreendidos de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e combinações dos mesmos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto as moléculas de ocorrência natural quanto os análogos sintéticos. Os construtos de nucleotídeo, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeo das modalidades também abrangem todas as formas de construtos de nucleotídeo incluindo, mas sem limitação, formas de fita única, formas de fita dupla, grampos, estruturas de haste e alça e semelhantes.

[0111] Uma modalidade adicional se refere a um organismo transformado, como um organismo selecionado dentre células de planta e inseto, bactérias, levedura, baculovírus, protozoários, nemátodos e algas. O organismo transformado compreende uma molécula de DNA das modalidades, um cassete de expressão que compreende a molécula de DNA ou um vetor que compreende o cassete de expressão, o qual pode ser incorporado de modo estável ao genoma do organismo transformado.

[0112] As sequências das modalidades são fornecidas em construtos de DNA para expressão no organismo de interesse. O construto incluirá sequências regulatórias 5' e 3' ligadas de modo operacional a uma sequência das modalidades. O termo "ligado de modo operacional", conforme usado no presente documento, se refere a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. De modo geral, ligado de modo operacional significa que as sequências de ácido nucleico em ligação são contíguas e onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína no mesmo quadro de leitura. O construto pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o gene (genes) adicional (ais) pode(m) ser fornecido(s) em múltiplos construtos de DNA.

[0113] Tal construto de DNA é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da sequência genética de polipeptídeo IPD073 para estar sob regulação transcricional das regiões regulatórias. O construto de DNA pode adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis.

[0114] O construto de DNA incluirá geralmente na direção de 5' a 3' de transcrição: uma região de iniciação de transcrição e tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA das modalidades, e uma região de terminação de transcrição e de tradução (isto é, região de terminação) funcional no organismo que serve como um hospedeiro. A região de iniciação de transcrição (isto é, o promotor) pode ser nativa, análoga, estranha ou heteróloga ao organismo hospedeiro e/ou à sequência das modalidades. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. O termo "estranho" conforme usado no presente documento indica que o promotor não é encontrado no organismo nativo no qual o promotor é introduzido. Quando o promotor é "estranho" ou "heterólogo" à sequência das modalidades, é pretendido que o promotor não seja nativo ou promotor de ocorrência natural para a sequência ligada de modo operacional das modalidades. Conforme usado no presente documento, um gene quimérico compreende uma sequência de codificação ligada de modo operacional a uma região de iniciação de transcrição que é heteróloga à sequência de codificação. Quando o promotor é uma sequência nativa ou natural, a expressão da sequência operacionalmente ligada é alterada a partir da expressão do tipo selvagem que resulta em uma alteração no fenótipo.

[0115] Em algumas modalidades, o construto de DNA também pode incluir uma sequência de aprimoramento de transcrição. Conforme usado no presente documento, o termo um "aprimorador" se refere a uma sequência de DNA que pode estimular a atividade de promotor e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para acentuar o nível ou a especificidade para tecido de um promotor. Vários intensificadores são conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, íntrons com propriedades de intensificação de expressão de gene em plantas (Publicação de Pedido de Patente Número US 2009/0144863, o íntron de ubiquitina (isto é, o íntron de ubiquitina de maís 1 (consulte, por exemplo, sequência de NCBI S94464)), o intensificador de ômega ou o intensificador de iniciador de ômega (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA ed. Cech (Liss, Nova York) 237 a 256 e Gallie, et al., (1987) Gene 60:217 a 225), o intensificador de CaMV 35S (consulte, por exemplo, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9:1.685 a 1.696) e os intensificadores de Patente número US 7.803.992 também podem ser usados, cada um dos quais é incorporado a título de referência. A lista acima de aprimoradores de transcrição não é destinada a ser limitante. Qualquer aprimorador de transcrição apropriado pode ser usado nas modalidades.

[0116] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operacional, pode ser nativa com o hospedeiro de planta ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, a sequência de interesse, o hospedeiro de planta ou qualquer combinação dos mesmos).

[0117] As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo de Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Também consultar Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 a 144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671 a 674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261 a 1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151 a 158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 a 7903 e Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627 a 9639.

[0118] Quando apropriado, um ácido nucleico pode ser otimizado para a expressão aumentada no organismo hospedeiro. Desse modo, quando o organismo hospedeiro for uma planta, os ácidos nucleicos sintéticos podem ser sintetizados com o uso de códons preferidos de plantas para expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11 para uma discussão de uso de códon preferido de hospedeiro. Por exemplo, embora as sequências de ácido nucleico das modalidades possam ser expressas nas espécies de planta monocotiledônea e dicotiledônea, as sequências podem ser modificadas para considerar preferências de códon específico e preferências de teor de GC de monocotiledôneas ou dicotiledôneas visto que essas preferências foram mostradas como deferentes (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a 498). Desse modo, o códon preferido de maís para um aminoácido particular pode ser derivado de sequências de gene conhecidas de maís. O uso de códon de maís para 28 genes de plantas de maís é listado na Tabela 4 de Murray, et al., supra. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para plantas. Consultar, por exemplo, as Patentes nos U.S. 5.380.831 e 5.436.391 e Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a 498, e Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677 a 684, 2010, incorporados ao presente documento a título de referência. Uma tabela de uso de códon de Zea maystambém pode ser encontrada em kazusa.ou.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4577, que pode ser acessado com o uso do prefixo www. Uma tabela de uso de códon máximo de Glycine max pode ser encontrada em kazusa.or.jp/codon/cgi- bin/showcodon.cgi?species=3847&aa=1&style=N, que pode ser acessado com o uso do prefixo www.

[0119] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo IPD073 tem códons otimizados de milho.

[0120] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por intensificar a expressão genética em um hospedeiro celular. As mesmas incluem a eliminação de sequências codificadoras de sinais de poliadenilação espúria, sinais de sítio de união de éxon-íntron, repetições semelhantes a transposons e outras sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão de gene. O teor de GC da sequência pode ser ajustado aos níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado em referência a genes conhecidos expressados na célula hospedeira. O termo "célula hospedeira", conforme usado no presente documento, se refere a uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor de expressão pretendida. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, como E. coli, ou células eucarióticas, como células de levedura, inseto, anfíbio ou mamífero ou células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de uma célula hospedeira monocotiledônea é uma célula hospedeira de maís. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em grampo previstas.

[0121] Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências líder 5'. Tais sequências líder podem atuar para aprimorar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder EMCV (região de não codificação 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6.126 a 6.130); líderes de potivírus, por exemplo, líder TEV (Vírus Gravado do Tabaco) (Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233 a 238), líder MDMV (Vírus Mosaico Anão de Maís), proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90 a 94); líder não traduzido da proteína mRNA de revestimento de vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622 a 625); líder de vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nova Iorque), páginas 237 a 256) e líder de vírus de mancha clorótica do maís (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382 a 385). Também consultar Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965 a 968. Tais construtos também contêm uma "sequência de sinal" ou "sequência líder"para facilitar o transporte de cotradução ou pós-tradução do peptídeo determinadas estruturas intracelulares, como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi.

[0122] “Sequência de sinal", conforme usado no presente documento, se refere a uma sequência que é conhecida ou que há suspeitas de resultar em transporte de peptídeo de cotradução ou pós-tradução através da membrana de célula. Em eucariotas, isso envolve tipicamente a secreção no aparelho de Golgi com parte resultando em glicosilação. Toxinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como pró-toxinas que são proteoliticamente ativadas no estômago da praga alvo (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência das modalidades. "Sequência líder", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para acionar o transporte de cotradução da cadeia peptídica a uma organela subcelular. Desse modo, isso inclui sequências líderes que direcionam o transporte e/ou glicosilação pela passagem no retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes. As proteínas codificadas nucleares direcionadas ao compartimento de lúmen de tilacoide de cloroplasto têm um peptídeo de transição bipartido característico, composto por um peptídeo sinal de direcionamento estromal e um peptídeo sinal de direcionamento de lúmen. As informações de direcionamento estromal estão na porção aminoproximal do peptídeo de transição. O peptídeo sinal de direcionamento de lúmen está na porção carboxila-proximal do peptídeo de transição e contém todas as informações para direcionamento ao lúmen. A pesquisa recente em proteômica do cloroplasto de planta superior alcançou a identificação de várias proteínas de lúmen codificadas nucleares (Kieselbach et al. FEBS LETT 480:271 a 276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12:319 a 341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys Acta 1503:350 a 356, 2001), cujo peptídeo sinal de direcionamento de lúmen pode ser potencialmente usado de acordo com a presente revelação. Cerca de 80 proteínas de Arabidopsis, assim como proteínas homólogas de espinafre e ervilha, são relatadas por Kieselbach et al., Photosynthesis Research, 78:249 a 264, 2003. Em particular, a Tabela 2 dessa publicação, a qual está incorporada à descrição do presente documento a título de referência, revela 85 proteínas do lúmen do cloroplasto, identificadas por seu número de acesso (também consultar a Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2009/09044298). Além disso, a versão de rascunho recentemente publicada do genoma de arroz (Goff et al, Science 296:92 a 100, 2002) é uma fonte adequada para peptídeo sinal de direcionamento de lúmen, a qual pode ser usada de acordo com a presente revelação.

[0123] Peptídeos de transição de cloroplasto (CTP) adequados são bastante conhecidos para um indivíduo versado na técnica também incluem CTPs quiméricos que compreendem, mas sem limitação, um domínio de terminal N, um domínio central ou um domínio de terminal C de um CTP a partir de Oryza sativa 1- deóxi-D xiulose-5-Fosfato Sintase, Superóxido de Oryza sativa dismutase, amido solúvel em Oryza sativa sintase, Enzima de ácido málico dependente de NADP-Oryza sativa, Oryza sativa-Fosfo-2- dehidro-3-deoxiheptonato Aldolase 2, Oryza sativa-L-Ascorbato peroxidase 5, Oryza sativa-Fosfoglucan água diquinase, Zea Mays ssRUBISCO, Zea Mays-beta-glucosidase, Zea Mays-Malate dehidrogenase, Zea Mays Tioredoxina tipo M Documento de Patente no US 2012/0304336.

[0124] O gene de polipeptídeo IPD073 a ser direcionado ao cloroplasto pode ser otimizado para a expressão no cloroplasto para contabilizar as diferenças em uso de códon entre o núcleo de planta e essa organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados com o uso dos códons preferidos de cloroplasto. Consultar, por exemplo, a Patente n° U.S. 5.380.831, incorporada ao presente documento a título de referência.

[0125] No preparo do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a fornecer as sequências de DNA na orientação apropriada e, conforme apropriado, no quadro de leitura apropriado. Para esse fim, os adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou semelhantes. Com esse propósito, a mutagênese in vitro, o reparo de iniciador, restrição, anelamento, ressubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem ser envolvidos.

[0126] Vários promotores podem ser usados na prática das modalidades. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais de tecido, induzíveis ou outros promotores para a expressão no organismo hospedeiro. Os promotores constitutivos adequados para uso em uma célula hospedeira de planta incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados no documento n° WO 1999/43838 e na Patente n° U.S. 6.072.050; o promotor CaMV 35S de núcleo (Odell, et al., (1985) Nature 313:810 a 812); actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163 a 171); ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619 a 632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675 a 689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581 a 588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2.723 a 2.730); promotor ALS (Patente n° U.S. 5.659.026) e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes nos U.S. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611.

[0127] Dependendo do resultado desejado, pode ser benéfico expressar o gene a partir de um promotor induzível. Os promotores induzíveis por ferimento são de interesse particular para regular a expressão das sequências de nucleotídeo das modalidades em plantas. Tais promotores induzíveis por ferimento podem responder ao dano causado por alimentação de insetos e incluir o gene de inibidor de proteinase de batata (pin II) (Ryan, (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425 a 449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494 a 498); wun1 e wun2, Patente n° U.S. 5.428.148; win1 e win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200 a 208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570 a 1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783 a 792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS Letters 323:73 a 76); gene MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141 a 150) e semelhantes incorporados ao presente documento a título de referência.

[0128] Adicionalmente, os promotores induzíveis por patógenos podem ser empregados nos métodos e construtos de nucleotídeo das modalidades. Tais promotores induzíveis por patógeno incluem aqueles de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidas em seguida à infecção por um patógeno; por exemplo,proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3- glucanase, quitinase, etc. Consultar, por exemplo, Redolfi, et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245 a 254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4: 645 a 656 e Van Loon, (1985) Plant Mol. Virol. 4:111 a 116. Também consultar o documento n° WO 1999/43819 incorporado ao presente documento a título de referência.

[0129] São de interesse os promotores que são expressos no local ou próximos ao sítio de infecção de patógeno. Consultar, por exemplo, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335 a 342; Matton, et al., (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325 a 331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427 a 2430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93 a 98 e Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972 a 14977. Também consultar Chen, et al., (1996) Plant J. 10:955 a 966; Zhang, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507 a 2511; Warner, et al., (1993) Plant J. 3:191 a 201; Siebertz, et al., (1989) Plant Cell 1:961 a 968; Patente n° U.S. 5.750.386 (induzível por nemátodo) e as referências citadas nos mesmos. É de interesse particular o promotor induzível para o gene PRms de maís, cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (consultar, por exemplo, Cordero, et al., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189 a 200).

[0130] Os promotores regulados quimicamente podem ser utilizados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor quimicamente induzível, em que a aplicação da substância química induz a expressão genética ou um promotor quimicamente repressível, em que a aplicação da substância química reprime a expressão genética. Os promotores induzíveis por substância química são conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitação, o promotor In2-2 de milho, que é ativado por protetores herbicidas de benzenosulfonamida, sendo que o promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-1a de tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores regulados por produtos químicos de interesse incluem promotores responsivos a esteroides (consultar, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoides em Schena, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10.421 a 10.425 e McNellis, et al., (1998) Plant J. 14(2):247 a 257) e promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (consultar, por exemplo, Gatz, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229 a 237 e Patentes nos U.S. 5.814.618 e 5.789.156), incorporados ao presente documento a título de referência.

[0131] Os promotores preferenciais de tecido podem ser utilizado para direcionar a expressão de polipeptídeo IPD073 intensificada em um tecido de planta específico. Os promotores preferidos para tecidos incluem aqueles discutidos em Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2)255 a 265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792 a 803; Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337 a 343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157 a 168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1331 a 1341; Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525 a 535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513 a 524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773 a 778; Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181 a 196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129 a 1138; Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586 a 9590 e Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495 a 505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.

[0132] Promotores preferenciais de folha são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255 a 265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 105:357 a 367; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773 a 778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509 a 518; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129 a 1138 e Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586 a 9590.

[0133] Os promotores preferidos para raiz ou específicos de raiz são conhecidos e podem ser selecionados a partir dos muitos disponíveis a partir da literatura ou isolados de novo das várias espécies compatíveis. Consultar, por exemplo, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207 a 218 (gene de glutamina sintetase específico de raiz de soja); Keller e Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10):1051 a 1061 (elemento de controle específico de raiz no gene GRP 1.8 de Vagem); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433 a 443 (promotor específico de raiz do gene de manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) e Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1):11 a 22 (glutamina sintetase (GS) citosólica codificadora de clone de cDNA de comprimento completo, a qual é expressa em raízes e nódulos de raiz de soja). Também consultar Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7):633 a 641, em que dois promotores específicos de raiz isolados de genes de hemoglobina da não leguminosa de fixação de nitrogênio Parasponia andersonii e a não leguminosa de não fixação de nitrogênio Trema tomentosasão descritos. Os promotores desses genes foram ligados a um gene repórter ß-glucuronidase e introduzidos tanto na não leguminosa Nicotiana tabacum quanto na leguminosa Lotus corniculatus, e em ambos os casos a atividade de promotor específico de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes indutores de raízes de rolC e rolD altamente expressos de Agrobacterium rhizogenes (consultar, Plant Science (Limerick) 79(1):69 a 76). Os mesmos concluíram que o intensificador e os determinantes de DNA preferíveis de tecido são dissociados naqueles promotores. Teeri, et al., (1989) usaram fusão de gene para lacZ para mostrar que o gene de T-DNA de Agrobacterium gene codificador de octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta de raiz e que o gene de TR2' é específico de raiz na planta intata e estimulado por ferimento no tecido de folha, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene inseticida ou larvicida (consultar, EMBO J. 8(2):343 a 350). O gene TR1' fundido para nptII (neomicina fosfotransferase II) mostrou características similares. Os promotores preferidos para raiz adicionais incluem o promotor de gene de VfENOD-GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759 a 772) e o promotor rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681 a 691. Também consultar as Patentes nos U.S. 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 e 5.023.179. As sequências regulatórias preferenciais para raiz de Arabidopsis thalianasão reveladas no documento no US20130117883.

[0134] Promotores "preferenciais de semente" incluem tanto promotores "específicos de semente" (aqueles promotores ativos durante o desenvolvimento de semente tal como promotores de proteínas de armazenamento de semente) assim como promotores de "germinação de semente" (aqueles promotores ativos durante a germinação de semente). Consultar Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108, incorporado ao presente documento a título de referência. Tais promotores preferidos para semente incluem, mas sem limitação, Cim1 (mensagem induzida por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maís); e milps (mio- inositol-1-fosfato sintase) (consultar a Patente n° U.S. 6.225.529 incorporada ao presente documento a título de referência). Gama-zeína e Glb-1 são promotores específicos de endosperma. Para dicotiledôneas, promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, inibidor de tripsina Kunitz 3 (KTi3) (Jofuku e Goldberg, (1989) Plant Cell 1:1.079 a 1.093), ß-faseolina de feijão, napina, ß-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja, cruciferina e similares. Para monocotiledôneas, promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa de milho, g-zeína, ceroso, murcho 1, murcho 2, globulina 1, etc. Consultar também, documento no WO 2000/12733, em que promotores preferenciais de semente de genes de extremidade1 e extremidade2 são revelados; no presente documento incorporados a título de referência. Em dicotiledôneas, os promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, promotor de revestimento de semente de Arabidopsis, pBAN; e os promotores de semente iniciais de Arabidopsis, p26, p63 e p63tr (Patentes nos U.S. 7.294.760 e 7.847.153). Um promotor que tem expressão "preferida" em um tecido particular é expresso nesse tecido até um grau maior do que pelo menos um outro tecido de planta. Alguns promotores preferidos para tecido mostram a expressão quase exclusivamente no tecido particular.

[0135] Quando a expressão de nível baixo for desejada, os promotores fracos serão usados. Geralmente, o termo "promotor fraco", conforme usado no presente documento, se refere a um promotor que aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível baixo. Por expressão de nível baixo, níveis entre cerca de 1/1.000 transcrições a cerca de 1/100.000 transcrições a cerca de 1/500.000 transcrições são pretendidos. Alternativamente, é reconhecido que o termo "promotores fracos"também abrange os promotores que acionam a expressão apenas em algumas células e não em outras para gerar um nível baixo total de expressão. Quando um promotor aciona a expressão em níveis altos de modo inaceitável, as porções da sequência promotora podem ser deletadas ou modificadas para diminuir os níveis de expressão.

[0136] Tais promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 (documento n° WO 1999/43838 e Patente n° U.S. 6.072.050), o promotor CaMV 35S de núcleo e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles revelados nas Patentes nos U.S. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611, incorporado ao presente documento a título de referência.

[0137] A lista acima de promotores não é destinada a ser limitante. Qualquer promotor apropriado pode ser usado nas modalidades.

[0138] Geralmente, o cassete de expressão compreenderá um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem os genes que codificam a resistência antibiótica, como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência aos compostos herbicidas, como glufosinato amônio, bromoxinila, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Os exemplos adicionais de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas sem limitação, resistência de codificação de gene a cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987 a 992); metotrexato (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209 a 213 e Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807 a 820); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86 a 91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5:131 a 137); bleomicina (Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171 a 176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127 a 136); bromoxinila (Stalker, et al., (1988) Science 242:419 a 423); glifosato (Shaw, et al., (1986) Science 233:478 a 481 e Pedidos de Patente n° U.S.10/004.357 e 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2513 a 2518). Consultar, de modo geral, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506 a 511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314 a 6318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63 a 72; Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol. 6:2419 a 2422; Barkley, et al., (1980) em The Operon, páginas 177 a 220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555 a 566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603 a 612; Figge, et al., (1988) Cell 52:713 a 722; Deuschle, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400 a 5404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549 a 2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480 a 483; Gossen, (1993) Tese de Ph.D., University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917 a 1921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343 a 3356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952 a 3956; Baim, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072 a 5076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647 a 4653; Hillenand-Wissman, (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143 a 162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591 a 1595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1094 a 1104; Bonin, (1993) Tese de Ph.D., University of Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547 a 5551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913 a 919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlim) e Gill, et al., (1988) Nature 334:721 a 724. Tais revelações são incorporadas ao presente documento a título de referência.

[0139] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é destinada a ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado nas modalidades. Transformação de Planta

[0140] Os métodos das modalidades envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. "Introduzir" significa, conforme usado no presente documento, apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo de tal maneira que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos das modalidades não dependem de um método particular para introduzir um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptídeos ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introduzir polinucleotídeo ou polipeptídeos em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.

[0141] "Transformação estável"significa, conforme usado no presente documento, que o construto de nucleotídeo introduzido em uma planta se integra no genoma da planta e tem capacidade para ser herdado pela descendência do mesmo. "Transformação transiente" significa, conforme usado no presente documento, que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta. "Planta" se refere, conforme usado no presente documento, a plantas inteiras, planta órgãos (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de plantas, propágulos, embriões e descendência dos mesmos. As células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura de suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de floema e pólen).

[0142] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeo em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionado para transformação. Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células de planta e subsequente inserção no genoma de planta incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320 a 334), eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:5.602 a 5.606), Transformação de mediada por Agrobacterium(Patentes no US 5.563.055 e 5.981.840), transferência de gene direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2.717 a 2.722) e aceleração de partícula de balística (consultar, por exemplo, Patente no US 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244 e 5.932.782; Tomes, et al., (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips, (Springer-Verlag, Berlim) e McCabe, et al., (1988) Biotechnology6:923 a 926) e transformação Lecl (documento n° WO 00/28058). Para transformação de batata, consultar Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829 a 838 e Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71 a 78. Os procedimentos de transformação adicionais podem ser encontrados em Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (soja); Finer e McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4.305 a 4.309 (maís); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (maís); Patentes nos U.S. 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (maís); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (maís); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (Londres) 311:763 a 764; Patente n° U.S. 5.736.369 (cereais); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5.345 a 5.349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, Nova Iorque), páginas 197 a 209 (pólen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por fibras); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1.495 a 1.505 (eletroporação); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford, (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (maís por meio de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência.

[0143] Em modalidades específicas, as sequências das modalidades podem ser fornecidas a uma planta com o uso de uma variedade de métodos de transformação transiente. Tais métodos de transformação transitória incluem, mas sem limitação, a introdução do polipeptídeo IPD073 ou variantes e fragmentos das mesmas diretamente na planta ou a introdução da transcrição de polipeptídeo IPD073 na planta. Tais métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeamento de partículas. Consultar, por exemplo, Crossway, et al., (1986) Mol Gen. Genet. 202:179 a 185; Nomura, et al., (1986) Plant Sci. 44:53 a 58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2176 a 2180 e Hush, et al., (1994) The Journal of Cell Science 107:775 a 784, todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência. Alternativamente, o polinucleotídeo de polipeptídeo IPD073 pode ser transitoriamente transformado na planta com o uso de técnicas conhecidas na arte. Tais técnicas incluem sistema de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de um modo que impede subsequente liberação do DNA. Portanto, a transcrição a partir do DNA ligado à partícula pode ocorrer, mas a frequência com que a mesma é liberada para se integrar ao genoma é muito reduzida. Tais métodos incluem a utilização de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma #P3143).

[0144] São conhecidos na técnica métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado é alcançada com o uso de um sistema de recombinação específico de local. Consultar, por exemplo, os documentos n° WO 1999/25821, n° WO 1999/25854, n° WO 1999/25840, n° WO 1999/25855 e n° WO 1999/25853, todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência. Brevemente, o polinucleotídeo das modalidades pode ser contido em cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que incorporou de modo estável em seu genoma um sítio direcionado que é flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase apropriada é fornecida e o cassete de transferência é integrado no sítio direcionado. O polinucleotídeo de interesse é, assim, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma de planta.

[0145] Os vetores de transformação de planta podem ser compreendidos de um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar a transformação de planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar os vetores de transformação de planta que são compreendidos de mais de um segmento de DNA contíguo. Esses vetores são frequentemente chamados na técnica de "vetores binários". Os vetores binários, assim como vetores com plasmídeos auxiliares, são mais frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacterium, em que o tamanho e complexidade dos segmentos de DNA necessários para alcançar transformação eficiente são bem maiores, e isso é vantajoso para separar funções em moléculas de DNA separadas. Os vetores binários contêm tipicamente um vetor plasmídeo que contém as sequências de atuação cis exigidas para a transferência de T- DNA (como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é modificado geneticamente para ter capacidade para expressão em uma célula de planta e um "gene de interesse" (um gene modificado geneticamente para ter capacidade para expressão em uma célula de planta para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também estão presentes nesse vetor plasmídeo as sequências exigidas para replicação bacteriana. As sequências de atuação cis são dispostas de maneira a permitir a transferência eficaz para células de plantas e expressão nas mesmas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida são localizados entre as bordas esquerda e direita. Frequentemente, um segundo vetor plasmídeo contém os fatores de atuação trans que medeiam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para células de plantas. Esse plasmídeo contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células de plantas por Agrobacterium, e transferência de DNA por clivagem em sequências de borda e transferência de DNA mediada por Vir, conforme é entendido na técnica (Hellens e Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5:446 a 451). Diversos tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usados para transformação de planta. O segundo vetor plasmídeo não é necessário para transformar as plantas por outros métodos, como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.

[0146] Em geral, os métodos de transformação de planta envolvem transferir o DNA heterólogo para células de plantas direcionadas (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas de suspensão, calo não diferenciado, protoplastos, etc.), seguidos pela aplicação de um nível de limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células de plantas transformadas a partir de um grupo de massa de célula não transformada. Após a integração de DNA estranho heterólogo em células de plantas, é aplicado um nível de limiar máximo de seleção apropriada no meio para exterminar as células não transformadas e separar e proliferar as células transformadas de modo putativo que sobrevivem a partir desse tratamento de seleção transferindo-se as mesmas de modo regular para um meio novo. Pela passagem contínua e o desafio com seleção apropriada, são identificadas e proliferadas as células que são transformadas com o vetor plasmídeo. Os métodos moleculares e bioquímicos podem, então, ser usados para confirmar a presença do gene de interesse heterólogo integrado no genoma da planta transgênica.

[0147] Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após colocação em meio de regeneração suplementado com um nível de limiar máximo de agente de seleção. Os brotos são, então, transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperar o broto ou plântula enraizado. A plântula transgênica cresce, então, para uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6:271 a 282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750). Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas são encontrados em Ayres e Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219 a 239 e Bommineni e Jauhar, (1997) Maydica 42:107 a 120. Visto que o material transformado contém muitas células, tanto as células transformadas quanto não transformadas estão presentes em qualquer parte de calo direcionado submetido ou tecido ou grupo de células. A habilidade para exterminar as células não transformadas e permitir que as células transformadas proliferem resulta em culturas de planta transformadas. Frequentemente, a habilidade para remover células não transformadas é uma limitação à recuperação rápida de células de plantas transformadas e geração bem-sucedida de plantas transgênicas.

[0148] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas, de acordo com maneiras convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas e ser polinizadas com a mesma cepa transformada ou cepas diferentes, e o híbrido resultante que tem expressão constitutiva ou induzível da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida de modo estável e herdada e, então, as sementes cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido alcançada.

[0149] As sequências de nucleotídeo das modalidades podem ser fornecidas à planta colocando-se a planta em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar o construto de nucleotídeo de interesse em uma molécula de RNA ou DNA viral. Reconhece-se que as proteínas recombinantes das modalidades podem ser inicialmente sintetizadas como parte de uma poliproteína viral, que posteriormente pode ser processada por meio de proteólise in vivo ou in vitro para produzir o polipeptídeo IPD073 desejado. Reconhece-se também que tal poliproteína viral, que compreende pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos de um IPD073 das modalidades, pode ter a atividade pesticida desejada. Tais poliproteínas virais e as sequências de nucleotídeo que codificam as mesmas são englobadas pelas modalidades. Os métodos para dotar plantas de construtos de nucleotídeo e produzir as proteínas codificadas nas plantas que envolvem moléculas de RNA ou DNA viral são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Patentes nos U.S. 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785; 5.589.367 e 5.316.931; incorporado ao presente documento a título de referência.

[0150] Os métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Svab, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526 a 8530; Svab e Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913 a 917; Svab e Maliga, (1993) EMBO J. 12:601 a 606. O método depende da entrega de canhão de partículas de DNA que contém um marcador selecionável e direcionamento do DNA ao genoma plastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação de plastídeo pode ser realizada pela transativação de um transgene originado por plastídeo silenciado por expressão preferida de tecido de uma RNA polimerase codificada nuclear e direcionada por plastídeo. Tal sistema foi relatado em McBride, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301 a 7305.

[0151] As modalidades se referem adicionalmente a material de propagação de planta de uma planta transformada das modalidades o que inclui, mas sem limitação, sementes, tubérculos, cormo, bulbos, folhas e cortes de raízes e brotos.

[0152] As modalidades podem ser usadas para transformação de quaisquer espécies de planta, incluindo, mas sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Os exemplos de plantas de interesse incluem, mas sem limitação, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassicaúteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milhete (por exemplo, milhete-pérola (Pennisetum glaucum), milho miúdo (Panicum miliaceum), milho painço (Setaria italica), capim-pé-de-galinha-gigante (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figueira (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliveira (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana- de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, plantas ornamentais e coníferas.

[0153] Os vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijões-de-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) e melão (C. melo). As plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo. As coníferas que podem ser empregadas na prática das modalidades incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro (Pinus taeda), pinheiro-americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro de lodgepole (Pinus contorta) e pinheiro-de-Monterey (Pinus radiata); pinheiro-do- oregon (Pseudotsuga menziesii); cicuta ocidental (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); sequoia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, como abeto (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis). As plantas das modalidades incluem plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milhete, tabaco, etc.), como plantas de milho e soja.

[0154] Os gramados incluem, mas sem limitação: poa- anual (Poa annua); azevém anual (Lolium multiflorum); poa canadiana (Poa compressa); festuca-encarnada (Festuca rubra); Agrostide-ténue (Agrostis tenuis); erva-fina (Agrostis palustris); grama de trigo do deserto (crested wheatgrass) (Agropyron desertorum); capim-mombaça (Agropyron cristatum); festuca rígida (hard fescue) (Festuca longifolia); erva-de-febra (Poa pratensis); panasco (Dactylis glomerata); azevém perene (Lolium perenne); festuca-encarnada (Festuca rubra); germínia rubra (Agrostis alba); poa-comum (Poa trivialis); festuca ovina (Festuca ovina); bromo (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); rabo-de-gato (Phleum pratense); Agrostis-de-cão (velvet bentgrass) (Agrostis canina); weeping alkaligrass (Puccinellia distans); erva-trigo ocidental (Agropyron smithii); grama Bermuda (Cynodon spp.); grama Santo Agostinho (Stenotaphrum secundatum); Grama Zoysia (Zoysia spp.); grama- bahia (Paspalum notatum); grama tapete (Axonopus affinis); grama centipede (Eremochloa ophiuroides); grama Kikuio (Pennisetum clandesinum); capim-arame-da-praia (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gracilis); grama americana (Buchloe dactyloids); sideoats gramma (Bouteloua curtipendula).

[0155] As plantas de interesse incluem plantas de grãos que fornecem sementes de interesse, plantas de semente de óleo e leguminosas. Sementes de interesse incluem sementes de grão, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, milheto, etc. Plantas com semente oleosa incluem algodão, soja, açafrão-bastardo, girassol, Brassica, milho, alfalfa, palma, coco, linho, rícino, azeitona, etc. Plantas leguminosas incluem feijoes e ervilhas. Os feijões incluem guar, feijão de alfarroba, feno-grego, soja, feijão de jardim, caupi, feijão mungo, feijão- de-lima, feijão-fava, lentilhas, grão-de-bico, etc. Avaliação de Transformação de Planta

[0156] Após a introdução de DNA estranho heterólogo em células de plantas, a transformação ou integração de gene heterólogo no genoma de planta é confirmada por vários métodos, como análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados ao gene integrado.

[0157] A análise de PCR é um método rápido para triar células transformadas, tecido ou brotos para a presença de gene incorporado no estágio inicial antes de transplante para o solo (Sambrook e Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). É executada PCR com o uso de iniciadores de oligonucleotídeo específicos para o gene de interesse ou fundo de vetor de Agrobacterium, etc.

[0158] A transformação de planta pode ser confirmada por análise de transferência de Southern de DNA genômico (Sambrook e Russell, (2001) supra). Em geral, o DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, fracionadas em um gel de agarose e transferidas para uma nitrocelulose ou membrana de náilon. A membrana ou "transferência" é então sondada com, por exemplo, fragmento de DNA direcionado 32P radiomarcado para confirmar a integração de gene introduzido no genoma de planta, de acordo com técnicas padrão (Sambrook e Russell, (2001) supra).

[0159] Na análise de transferência de Northern, RNA é isolado de tecidos específicos de transformantes, fracionado em um gel de agarose de formaldeído e transferido para um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrões que são usados de modo rotineiro na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra). A expressão de RNA codificada pelo gene pesticida é, então, testada hibridizando-se o filtro para uma sonda radioativa derivada de um gene pesticida por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra).

[0160] Western blot, ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser realizados nas plantas transgênicas para confirmar a presença de proteína codificada pelo gene pesticida por meio de procedimentos padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra) com o uso de anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes no polipeptídeo IPD073.

Empilhamento de traços em planta transgênica

[0161] As plantas transgênicas podem compreender uma pilha de um ou mais polinucleotídeos inseticidas revelados no presente documento com um ou mais polinucleotídeos adicionais que resultam na produção ou supressão de múltiplas sequências de polipeptídeos. As plantas transgênicas que compreendem pilhas de sequências de polinucleotídeo podem ser obtidas por qualquer um ou ambos os métodos de reprodução tradicionais ou através de métodos de manipulação genética. Esses métodos incluem, mas sem limitação, linhas individuais de cultivo sendo que cada uma compreende um polinucleotídeo de interesse, transformando uma planta transgênica que compreende um gene revelado no presente documento com um gene subsequente e a cotransformação de genes em uma célula de planta única. Conforme usado no presente documento, o termo "empilhado" inclui ter os múltiplos traços presentes na mesma planta (isto é, ambos os traços são incorporados no genoma nuclear, um traço é incorporado no genoma nuclear e um traço é incorporado no genoma de um plastídeo ou ambos os traços são incorporados no genoma de um plastídeo). Em um exemplo não limitante, "traços empilhados" compreendem uma pilha molecular em que as sequências são fisicamente adjacentes entre si. Um traço, conforme usado no presente documento, refere- se ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências. A cotransformação de genes pode ser executada com o uso de vetores de transformação únicos que compreendem múltiplos genes ou genes portados separadamente em múltiplos vetores. Se as sequências forem empilhadas transformando-se geneticamente as plantas, as sequências de polinucleotídeo de interesse podem ser combinadas em qualquer momento e em qualquer ordem. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequências podem ser contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser acionada pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que suprima a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de traços na planta. É adicionalmente reconhecido que as sequências de polinucleotídeo podem ser empilhadas em uma localização genômica desejada com o uso de um sistema de recombinação específica de sítio. Consultar, por exemplo, os documentos n° WO 1999/25821, n° WO 1999/25854, n° WO 1999/25840, n° WO 1999/25855 e n° WO 1999/25853, todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência.

[0162] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo IPD073revelados no presente documento, sozinhos ou empilhados com um ou mais traços de resistência a inseto adicionais podem ser empilhados com um ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicida, resistência fúngica, resistência a vírus, tolerância à tensão, resistência a doenças, esterilidade do macho, força da haste e semelhantes) ou traços de saída (por exemplo, rendimento aumentado, amidos modificados, perfil de óleo aprimorado, aminoácidos equilibrados, lisina ou metionina alta, digestibilidade aumentada, qualidade de fibra aprimorada, resistência à seca e semelhantes). Portanto, as modalidades de polinucleotídeo podem ser usadas para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade de cultivo aprimorada com a habilidade de controlar de modo flexível e rentável quaisquer pragas agronômicas.

[0163] Os transgenes úteis para empilhamento incluem, mas sem limitação:

1.Transgenes que Conferem Resistência a Insetos ou Doença e que Codificam:

[0164] (A) Genes de resistência a doença de plantas. Defesas de planta são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência a doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para modificar geneticamente plantas que são resistentes a cepas de patógenos específicos. Consultar, por exemplo, Jones, et al., (1994) Science 266:789 (cloning of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1432 (tomato Pto gene for resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato encodes a protein kinase); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089 (Arabidopsis RSP2 gene for resistanceto Pseudomonas syringae), McDowell and Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178 a 83 e Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11(6):567 a 582. Uma planta resistente a uma doença é uma mais resistente a um patógeno em comparação à planta do tipo selvagem.

[0165] (B) Genes codificadores de uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma. Consultar, por exemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que revela a clonagem e sequência de nucleotídeos de um gene de delta-endotoxina Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes delta-endotoxina podem ser comprados junto a American Type Culture Collection (Rockville, Md.), por exemplo, com número de acesso ATCC® 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos não limitantes de transgenes de Bacillus thuringiensis geneticamente modificados são dados nas patentes a seguir e nos pedidos de patente e são incorporados ao presente documento a título de referência com esse propósito: Patentes nos U.S. 5.188.960; 5.689.052; 5.880.275; 5.986.177; 6.023.013, 6.060.594, 6.063.597, 6.077.824, 6.620.988, 6.642.030, 6.713.259, 6.893.826, 7.105.332; 7.179.965, 7.208.474; 7.227.056, 7.288.643, 7.323.556, 7.329.736, 7.449.552, 7.468.278, 7.510.878, 7.521.235, 7.544.862, 7.605.304, 7.696.412, 7.629.504, 7.705.216, 7.772.465, 7.790.846, 7.858.849 e documento n° WO 1991/14778; documento n° WO 1999/31248; documento n° WO 2001/12731; documento n° WO 1999/24581 e documento n° WO 1997/40162.

[0166] Genes que codificam proteínas pesticidas podem também ser empilhados o que inclui, mas sem limitação: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp. tal como PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), de Pseudomonas protegens cepas CHA0 e Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy- Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368 a 2386: n° de Acesso GenBank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12343 a 12349) e de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45 a 50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159 a 168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101 a 118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2.062 a 2.069); Patente número US 6.048.838, e Patente número US 6.379.946; um polipeptídeo PIP-1 da Publicação de Patente no US20140007292; um polipeptídeo AfIP-1A e/ou AfIP-1B da Publicação de Patente no US20140033361; um polipeptídeo PHI-4 da Publicação de Patente no US20140274885 e da US20160040184; um polipeptídeo PIP-47 da Publicação PCT no WO2015/023846, um polipeptídeo PIP-72 da Publicação PCT noWO2015/038734; um polipeptídeo PtIP-50 e um polipeptídeo PtIP- 65 da Publicação PCT no WO2015/120270; um polipeptídeo PtIP-83 da Publicação PCT no WO2015/120276; um polipeptídeo PtIP-96 de PCT de Número de Série PCT/US15/55502; um polipeptídeo IPD079 do documento Número de Série US 62/201977; um polipeptídeo IPD082 do documento Número de Série US 62/269482; e d-endotoxinas incluindo, mas sem limitação, as classes Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry50, Cry51, Cry52, Cry53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70, Cry71 e Cry 72 de genes de d-endotoxina e os genes Cyt1 e Cyt2 citolíticos de B. thuringiensis. Os membros dessas de proteínas inseticidas de B. thuringiensis bem conhecidas pelo versado na técnica (consulte, Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www").

[0167] Os exemplos de d-endotoxinas também incluem, mas sem limitação, proteínas CrylA das Patentes no US 5.880.275 e no 7.858.849; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (Deleção de terminal N de variante de a-hélice 1 e/ou a-hélice 2 de proteínas Cry como Cry1A) das Patentes no US 8.304.604 e no 8.304,605; Cry1B do Pedido de Patente Número de Série US 10/525.318; Cry1C da Patente número US 6.033.874; Cry1F das Patentes no US 5.188.960, no 6.218.188; quimeras de Cry1A/F das Patentes no US 7.070.982; no 6.962.705 e no 6.713.063); uma proteína Cry2 como proteína Cry2Ab da Patente número US 7.064.249); uma proteína Cry3A incluindo, mas sem limitação, uma proteína inseticida híbrida manipulada (eHIP) criada fundindo-se combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas Proteínas cry diferentes (Publicação de Pedido de Patente Número US 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 das Patentes no US 7.329.736, no 7.449.552, no 7.803.943, no 7.476.781, no 7.105.332, no 7.378.499 e no 7.462.760; uma proteína Cry9 como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F; uma proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology, 74:7.145a 7.151; um proteína Cry22, uma proteína Cry34Ab1 das Patentes no US 6.127.180, no 6.624.145 e no 6.340.593; uma proteína CryET33 e CryET34 das Patentes no US 6.248.535, no 6.326.351, no 6.399.330, no 6.949.626, no 7.385.107 e no 7.504.229; um homólogo de CryET33 e de CryET34 da Publicação de Patente número US 2006/0191034, 2012/0278954 e Publicação PCT Número WO 2012/139004; uma proteína Cry35Ab1 das Patentes no US 6.083.499, no 6.548.291 e no 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; uma toxina TIC901 ou relacionada; TIC807 do documento no US 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 do documento no PCT US 2006/033867; AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da Patente número US 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 do documento no US 7.923.602; AXMI-018, AXMI—020 e AXMI-021 do documento no WO 2006/083891; AXMI-010 do documento no WO 2005/038032; AXMI- 003 do documento no WO 2005/021585; AXMI-008 do documento no US 2004/0250311; AXMI-006 do documento no US 2004/0216186; AXMI-007 do documento no US 2004/0210965; AXMI-009 do documento no US 2004/0210964; AXMI-014 do documento no US 2004/0197917; AXMI-004 do documento no US 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 do documento no WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 do documento no WO 2004/074462; AXMI-150 da Patente número US 8.084.416; AXMI-205 do documento no US 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 e AXMI-064 do documento no US 2011/0263488; AXMI-R1 e proteínas relacionadas do documento no US 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z do documento no WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 do documento no WO11/103247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI- 163 e AXMI-184 da Patente número US 8.334.431; AXMI-001, AXMI- 002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI-045 do documento no US 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 do documento no US 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 do documento no US 2010/0005543 e proteínas Cry como CrylA e Cry3A que tem sítios proteolíticos modificados da Patente número US 8.319.019; e uma proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca da cepa de Bacillus thuringiensis VBTS 2528 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2011/0064710. Outras proteínas Cry também são bem conhecidas por um indivíduo versado na técnica (consultar, Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). A atividade inseticida de proteínas Cry é bem conhecida por um versado na técnica (para análise, consultar van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1 a 16). O uso de proteínas Cry como traços de planta transgênica é bem conhecido por um versado na técnica e plantas transgênicas Cry incluindo, mas sem limitação, Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam a aprovação regulatória (consultar Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283 a 300 e CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera- gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um versado na técnica também pode ser expressas em plantas como Vip3Ab e Cry1Fa (documento no US2012/0317682), Cry1BE e Cry1F (documento no US2012/0311746), Cry1CA e Cry1AB (documento no US2012/0311745), Cry1F e CryCa (documento no US2012/0317681), CrylDA e CrylBE (documento no US2012/0331590), CrylDA e CrylFa (documento no US2012/0331589), CrylAB e CrylBE (documento no US2012/0324606) e CrylFa e Cry2Aa, Cryll ou CrylE (documento no US20l2/0324605). Proteínas inseticidas também incluem lipases inseticidas que incluem lipídeo acil-hidrolases da Patente no US 7,49l,869, e colesterol oxidases tais como de Streptomyces (Purcell et al. (l993) Biochem Biophys Res Commun l5:l.406 a l.4l3). . As proteínas pesticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas) da Patente no US 5,877,012, 6,l07,279, 6,l37,033, 7,244,820, 7,6l5,686 e 8,237,020 e similares. Outras proteínas VIP são bem conhecidas para um indivíduo versado na técnica (consultar, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser acessado pela rede mundial de computadores on com o uso do prefixo "www"). As proteínas pesticidas também incluem proteínas de complexo de toxina (TC), obteníveis a partir de organismos, tal como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consultar as Patentes números US 7.49l.698 e 8.084.4l8). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida "autônoma" e outras proteínas TC melhoram a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC "autônoma" (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser melhorada por um ou mais "potenciadores" de proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme referido no presente documento, as proteínas de Classe A ("Proteína A") são toxinas autônomas. As proteínas de Classe B ("Proteína B") e as proteínas de Classe C ("Proteína C") melhoram a toxicidade das proteínas de Classe A. Os exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptAl e XptA2. Os exemplos de proteínas de Classe B são TcaC, TcdB, XptBlXb e XptClWi. Os exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptClXb e XptBlWi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião.

Exemplos de peptídeos de venom de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente no US 8,334,366).

[0168] (C) um polinucleotídeo que codifica um hormônio ou feromônio específico para inseto, tal como um ecdisteroide e hormônio juvenil, uma variante do mesmo, um mimético à base do mesmo ou um antagonista ou agonista do mesmo. Consultar, por exemplo, a revelação por Hammock, et al., (1990) Nature 344:458, de expressão de baculovírus de esterase de hormônio juvenil clonado, um desativador de hormônio juvenil.

[0169] (D) Um polinucleotídeo codificador de um peptídeo específico de inseto que, mediante expressão, afeta a fisiologia da praga afetada. Por exemplo, consultar as revelações de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (clonagem de expressão rende DNA que codifica receptor de hormônio diurético de inseto); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (uma alostatina é identificada em Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33 a 54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300 a 310; Carlini e Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1515 a 1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847 a 853 e Vasconcelos e Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385 a 403. Também consultar a Patente n° U.S. 5.266.317 para Tomalski, et al., a qual revela genes codificadores de toxinas específicas de inseto.

[0170] (E) Um polinucleotídeo que codifica uma enzima responsável por um hiperacúmulo de um monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula de não proteína com atividade inseticida.

[0171] (F) Um polinucleotídeo que codifica uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós- traducional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, um polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Consultar o Pedido PCT WO 1993/02197 no nome de Scott, et al., o qual revela a sequência de nucleotídeo de um gene de calase. As moléculas de DNA que contêm as sequências codificadoras de quitinase podem ser obtidas, por exemplo, a partir de ATCC® sob os Números de Acesso 39637 e 67152. Também consultar Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que ensina a sequência de nucleotídeo de um cDNA codificador de quitinase de ancilóstomo de tabaco e Kawalleck, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que fornece a sequência de nucleotídeo do gene de poliubiquitina ubi4-2 de salsa, e as Patentes nos U.S. 6.563.020; 7.145.060 e 7.087.810.

[0172] (G) Um polinucleotídeo codificador de uma molécula que estimula a transdução de sinal. Por exemplo, consultar a revelação por Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757 de sequências de nucleotídeo para clones de cDNA de calmodulina de feijão-mungo, e Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, que fornece a sequência de nucleotídeo de um clone de cDNA de calmodulina de maís.

[0173] (H) Um polinucleotídeo codificador de um peptídeo de momento hidrofóbico. Consultar o Pedido PCT n° WO 1995/16776 e a revelação de Patente n° U.S. 5.580.852 de derivados de peptídeo de taquiplesina que inibem os patógenos de planta fúngicos e o Pedido PCT n° WO 1995/18855 e a Patente n° U.S. 5.607.914 (ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doenças).

[0174] (I) Um polinucleotídeo codificador de uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, consultar a revelação por Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, de expressão heteróloga de um análogo de peptídeo lítico de cecropina-beta para tornar plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.

[0175] (J) Um gene codificador de uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral em células de plantas transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença efetuado pelo vírus a partir do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como por vírus relacionados. Consultar, Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:45

1. A resistência mediada por revestimento tem sido conferida em plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfalfa, vírus do mosaico do pepino, vírus da risca do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus do entalhe do tabaco, tobravírus e vírus do mosaico do tabaco. Id.

[0176] (K) Um gene que codifica um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo direcionado a uma função metabólica essencial nos intestinos do inseto poderia inativar uma enzima afetada, exterminando o inseto. Cf. Taylor, et al., Resumo n° 497, SEVENTH INT’L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edimburgo, Escócia, 1994) (desativação enzimática em tabaco transgênico por meio de produção de fragmentos de anticorpos de cadeia única).

[0177] (L) Um gene codificador de um anticorpo específico de vírus. Consultar, por exemplo, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, que mostra que as plantas transgênicas que expressam genes de anticorpo recombinante são protegidas do ataque de vírus.

[0178] (M) Um polinucleotídeo codificador de uma proteína de retenção de desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Desse modo, endo alfa-1,4-D- poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutriente de planta solubilizando-se a homo-alfa- 1,4-D-galacturonase de parede de célula de planta. Consultar, Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10:1436. A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão é descrita por Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367.

[0179] (N) Um polinucleotídeo codificador de uma proteína de retenção de desenvolvimento produzida na natureza por uma planta. Por exemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305 mostrou que plantas transgênicas que expressam o gene de desativação de ribossomo de cevada têm uma resistência aumentada à doença fúngica.

[0180] (O) Genes envolvidos na Resposta de Resistência Adquirida Sistêmica (SAR) e/ou os genes relacionados à patogênese. Briggs, (1995) Current Biology 5(2), Pieterse e Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456 a 464 e Somssich, (2003) Cell 113(7):815 a 816.

[0181] (P) Genes antifúngicos (Cornelissen e Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709 a 712 e Parijs, et al., (1991) Planta 183:258 a 264 e Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137 a 149. Também consultar os Pedidos de Patente n° U.S. 09/950.933; 11/619.645; 11/657.710; 11/748.994; 11/774.121 e Patentes nos U.S. 6.891.085 e 7.306.946. As quinases semelhantes a receptor LysM para a percepção de fragmentos de quitina como uma primeira etapa na resposta de defesa de planta contra patógenos fúngicos (documento n° US 2012/0110696).

[0182] (Q) Genes de desintoxicação, como para fumonisina, beauvericina, moniliformina e zearalenona e seus derivados estruturalmente relacionados. Por exemplo consultar, as Patentes nos U.S. 5.716.820; 5.792.931; 5.798.255; 5.846.812; 6.083.736; 6.538.177; 6.388.171 e 6.812.380.

[0183] (R) Um polinucleotídeo codificador de uma Cistatina e inibidores de proteinase de cisteína. Consultar a Patente n° U.S. 7.205.453.

[0184] (S) Genes de defensina. Consultar o documento n° WO 2003/000863 e as Patentes nosU.S. 6.911.577; 6.855.865; 6.777.592 e 7.238.781.

[0185] (T) Genes que conferem resistência a nemátodos. Consultar, por exemplo, o Pedido PCT n° WO 1996/30517; Pedido PCT n° WO 1993/19181, documento n° WO 2003/033651 e Urwin, et al., (1998) Planta 204:472 a 479, Williamson, (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327 a 331; Patentes nos U.S. 6.284.948 e 7.301.069 e genes miR164 (documento n° WO 2012/058266).

[0186] (U) Genes que conferem resistência à podridão de raízes de Phytophthora, como os genes Rps 1, Rps 1-a, Rps 1-b, Rps 1-c, Rps 1-d, Rps 1-e, Rps 1-k, Rps 2, Rps 3-a, Rps 3-b, Rps 3-c, Rps 4, Rps 5, Rps 6, Rps 7 e outros genes Rps. Consultar, por exemplo, Shoemaker, et al., Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean, Plant Genome IV Conference, San Diego, Califórnia (1995).

[0187] (V) Genes que conferem resistência a Podridão de Caule Marrom, conforme descrito na Patente n° U.S. 5.689.035 e incorporada a título de referência com esse propósito.

[0188] (W) Genes que conferem resistência a Colletotrichum, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente n° U.S. US 2009/0035765 e incorporada a título de referência com esse propósito. Isso inclui o locus Rcg que pode ser utilizado com uma conversão de locus único.

2. Transgenes que Conferem Resistência a um Herbicida, por Exemplo:

[0189] (A) Um polinucleotídeo codificador de resistência a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, como uma imidazolinona ou uma sulfonilureia. Os genes exemplificativos nessa categoria codificam a enzima ALS e AHAS mutante conforme descrito, por exemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1241 e Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Também consultar as Patentes nos U.S. 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 e 5.378.824; Pedido de Patente n° U.S. 11/683.737 e Publicação Internacional n° WO 1996/33270.

[0190] (B) Um polinucleotídeo codificador de uma proteína para resistência a Glifosato (resistência conferida por 5-enolpiruvil-3-fosfiquimato sintase (EPSP) mutante e genes aroA, respectivamente) e outros compostos fosfônicos, como glufosinato (fosfinotricina acetil transferase (PAT) e genes de fosfinotricina acetil transferase (bar) Streptomyces hygroscopicus), e ácidos piridinóxi ou fenóxi propiônicos e ciclo-hexonas (genes codificadores de inibidor ACCase). Consultar, por exemplo, a Patente n° U.S. 4.940.835 para Shah, et al., a qual revela a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato. A Patente n° U.S. 5.627.061 de Barry, et al., também descreve os genes codificantes de enzimas EPSPS. Também consultar as Patentes nos U.S. 6.566.587; 6.338.961; 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 5.094.945, 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; documento Re. 36,449; RE 37,287 E e 5,491,288 e Publicações Internacionais EP 1173580; WO 2001/66704; EP 1173581 e EP 1173582, que são incorporadas no presente documento a título de referência com esse propósito. A resistência a glifosato também é conferida a plantas que expressam um gene codificante de uma enzima glifosato oxidorredutase, conforme descrito mais completamente nas Patentes nos U.S. 5.776.760 e 5.463.175, que são incorporadas ao presente documento a título de referência com esse propósito. Além disso, a resistência a glifosato pode ser conferida a plantas pela superexpressão de genes codificadores de glifosato N-acetiltransferase. Consultar, por exemplo, as Patentes nos U.S. 7.462.481; 7.405.074 e a Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2008/0234130. Uma molécula de DNA codificante de um gene aroA mutante pode ser obtida sob o Número de Acesso ATCC® 39256 e a sequência de nucleotídeo do gene mutante é revelada na Patente n° U.S. 4.769.061 de Comai. O Pedido n° EP 0 333 033 de Kumada, et al., e a Patente n° U.S. 4.975.374 de Goodman, et al., revelam sequências de nucleotídeo de genes de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas, como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeo de um gene fosfinotricina-acetil- transferase é fornecida nos Pedidos n° EP 0 242 246 e 0 242 236 de Leemans, et al.,; De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7:61, que descrevem a produção de plantas transgênicas que expressa os genes bar quiméricos que codificam a atividade de acetil transferase de fosfinotricina. Também consultar as Patentes nos U.S. 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 e 5.879.903, que são incorporadas ao presente documento a título de referência com esse propósito. Os genes exemplificativos que conferem resistência a ácidos fenóxi propiônicos e ciclo- hexonas, como setoxidim e haloxifope, são os genes Acc1-S1, Acc1- S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.

[0191] (C) Um polinucleotídeo codificador de uma proteína para resistência a herbicida que inibe a fotossíntese, como uma triazina (psbA e gs+genes) e uma benzonitrila (gene nitrilase). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169 descreve a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos codificadores de genes psbA mutantes. As sequências de nucleotídeos para genes nitrilase são reveladas na Patente n° U.S. 4.810.648 de Stalker e moléculas de DNA que contêm esses genes disponíveis sob os Números de Acesso ATCC® 53435, 67441 e 67442. A clonagem e a expressão de DNA que codifica uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173.

[0192] (D) Um polinucleotídeo codificador de uma proteína para resistência a aceto-hidroxiácido sintase, que foi constatada por tornar plantas que expressam essa enzima resistentes a múltiplos tipos de herbicidas, foi introduzido em uma variedade de plantas (consultar, por exemplo, Hattori, et al., (1995) Mol Gen Genet. 246:419). Outros genes que conferem resistência a herbicidas incluem: um gene codificador de uma proteína quimérica de citocromo de rato P4507A1 e oxidorredutase P450 de citocromo de NADPH de levedura (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol 106:17), genes para glutationa redutase e superóxido dismutase (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1.687) e genes para várias fosfotransferases (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619).

[0193] (E) Um polinucleotídeo codificador de resistência a uma protoporfirinogênio oxidase (protox) de direcionamento de herbicida que é necessário para a produção de clorofila. A enzima protox serve como o direcionamento para uma variedade de compostos herbicidas. Esses herbicidas também inibem o crescimento de todas as espécies diferentes de plantas presentes, causando sua destruição total. O desenvolvimento de plantas que contêm atividade de protox alterada que são resistentes a esses herbicidas é descrito nas Patentes nos U.S. 6.288.306 B1; 6.282.837 B1 e 5.767.373 e na Publicação Internacional n° WO 2001/12825.

[0194] (F) O gene aad-1 (originalmente de Sphingobium herbicidovorans) codifica a proteína arilalcoxialcanoato desoxigenase (AAD-1). O traço confere tolerância aos herbicidas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ariloxifenoxipropionato (comumente chamados de herbicidas "fope", como quizalofope). O gene aad-1, em si, para tolerância a herbicida em plantas foi primeiramente revelado no documento n° WO 2005/107437 (também consultar o documento n° US 2009/0093366). O gene aad-12, derivado de Delftia acidovorans, que codifica a proteína ariloxialcanoato desoxigenase (AAD-12) que confere tolerância a ácido 2,4-diclorofenoxiacético e herbicidas de piridiloxiacetato desativando-se diversos herbicidas com uma porção química de ariloxialcanoato, incluindo fenóxi auxina (por exemplo, 2,4-D, MCPA), assim como piridilóxi auxinas (por exemplo, fluroxipir, triclopir).

[0195] (G) Um polinucleotídeo codificador de uma dicamba mono-oxigenase resistente a herbicida revelada na Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2003/0135879 para conferir tolerância a dicamba;

[0196] (H) Uma molécula de polinucleotídeo codificadora de bromoxinil nitrilase (Bxn) revelada na Patente n° U.S. 4.810.648 para conferir tolerância a bromoxinil;

[0197] (I) Uma molécula de polinucleotídeo codificadora de fitoeno (crtl) descrita em Misawa, et al., (1993) Plant J. 4:833 a 840 e em Misawa, et al., (1994) Plant J. 6:481 a 489 para tolerância a norflurazon.

3. Transgenes que Conferem ou Contribuem para uma Característica de Grão Alterado

[0198] Como:

[0199] (A) Ácidos graxos alterados, por exemplo, por

[0200] (1) Regulação descendente de esteraroil-ACP para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Consultar, Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624 e WO 1999/64579 (Genes to Alter Lipid Profiles in Corn).

[0201] (2) Elevação do ácido oleico por meio de modificação de gene de FAD-2 e/ou diminuição de ácido linolênico por meio de modificação de gene FAD-3 (consultar as Patentes nos U.S. 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 e documento n° WO 1993/11245).

[0202] (3) Alteração de teor de linonênico conjugado ou ácido linolênico, como no documento n° WO 2001/12800.

[0203] (4) Alteração de LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1 ps, vários genes Ipa, como Ipa1, Ipa3, hpt ou hggt. Por exemplo, consultar os documentos n° WO 2002/42424, n° WO 1998/22604, n° WO 2003/011015, n° WO 2002/057439, n° WO 2003/011015, as Patentes nos U.S. 6.423.886, 6.197.561, 6.825.397 e as Publicações de Pedido de Patente n° U.S. 2003/0079247, US 2003/0204870 e Rivera-Madrid, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5620 a 5624.

[0204] (5) Genes codificadores de delta-8 dessaturase para produzir ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (Patentes nos U.S. 8.058.571 e 8.338.152), delta-9 dessaturase para reduzir gorduras saturadas (Patente n° U.S. 8.063.269), Primula ?6-dessaturase para intensificar os perfis de ácido graxo omega-3.

[0205] (6) Ácidos nucleicos e proteínas isolados associados à regulação de metabolismo de lipídeo e açúcar, em particular, proteína de metabolismo de lipídeo (LMP) usada em métodos para produzir plantas transgênicas e modulação de níveis de compostos de armazenamento de sementes incluindo lipídeos, ácidos graxos, amidos ou proteínas de armazenamento de sementes e uso em métodos para modular o tamanho de semente, número de semente, pesos de semente, comprimento de raiz e tamanho de folha de plantas (documento n° EP 2404499).

[0206] (7) Alteração de expressão de uma proteína de Expressão de Alto Nível de Induzível de Açúcar 2 (HSI2) na planta para aumentar ou diminuir a expressão de HSI2 na planta. Aumentar a expressão de HSI2 aumenta o teor de óleo enquanto a diminuição da expressão de HSI2 diminui a sensibilidade de ácido abscísico e/ou aumenta a resistência à seca (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2012/0066794).

[0207] (8) Expressão de citocromo b5 (Cb5) independente ou com FAD2 para modular o teor de óleo de semente de planta, particularmente para aumentar os níveis de ácidos graxos omega-3 e intensificar a razão entre ácidos graxos omega-6 e omega-3 (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2011/0191904).

[0208] (9) As moléculas de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos semelhantes a wrinkled1 para modular o metabolismo de açúcar (Patente n° U.S. 8.217.223) .

[0209] (B) Teor de fósforo alterado, por exemplo, por

[0210] (1) Introdução de um gene de codificação por fitase aprimoraria o rompimento de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. Por exemplo, consultar, Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, para uma revelação da sequência de nucleotídeo de um gene de fitase de Aspergillus niger.

[0211] (2) Modular um gene que reduz o teor de fitato. Em maís, isso, por exemplo, poderia ser alcançado por clonagem e, então, reintrodução de DNA associado a um ou mais dentre os alelos, como os alelos de LPA, identificados em mutantes de maís distinguidos por níveis baixos de ácido fítico, como no documento n° WO 2005/113778 e/ou alterando-se atividade de inositol quinase como no documento n° WO 2002/059324, Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2003/0009011, documento n° WO 2003/027243, Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2003/0079247, documento n° WO 1999/05298, Patente n° U.S. 6.197.561, Patente n° U.S. 6.291.224, Patente n° U.S. 6.391.348, documento n° WO 2002/059324, Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2003/0079247, documento n° WO 1998/45448, documento n° WO 1999/55882, documento n° WO 2001/04147.

[0212] (C) Carboidratos alterados afetados, por exemplo, alterando-se um gene para uma enzima que afeta o padrão de ramificação de amido ou um gene que altera tioredoxina, como NTR e/ou TRX (consultar a Patente n° U.S. 6.531.648 que é incorporada a título de referência com esse propósito) e/ou uma gama zeína knock out ou mutante, como cs27 ou TUSC27 ou en27 (consultar Patente n° U.S. 6.858.778 e Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2005/0160488, Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2005/0204418, que são incorporados a título de referência com esse propósito). Consultar Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (sequência de nucleotídeo de gene frutosiltransferase mutante de Streptococcus), Steinmetz, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (sequência de nucleotídeo de gene levansucrase de Bacillus subtilis), Pen, et al., (1992) Bio/Technology 10:292 (produção de plantas transgênicas que expressam alfa-amilase de Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (sequências de nucleotídeo de genes invertase de tomate), S0gaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (mutagênese sítio-dirigida de gene alfa-amilase de cevada) e Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima de ramificação de amido de endosperma de maís II), documento n° WO 1999/10498 (digestibilidade melhorada e/ou extração de amido através da modificação de UDP-D-xilose 4- epimerase, Frágil 1 e 2, Ref1, HCHL, C4H), Patente n° U.S. 6.232.529 (método para produzir semente oleaginosa superior por modificação de níveis de amido (AGP)). Os genes de modificação de ácido graxo mencionados no presente documento também podem ser usados para afetar o teor de amido e/ou composição através da inter-relação das vias de amido e óleo.

[0213] (D) Teor ou composição de antioxidante alterado, como alteração de tocoferol ou trocotrienóis. Por exemplo, consultar, Patente n° U.S. 6.787.683, Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2004/0034886 e documento n° WO 2000/68393 que envolvem a manipulação de níveis antioxidantes e o documento n° WO 2003/082899 através da alteração de uma homogentisato geranil-geranil transferase (hggt).

[0214] (E) Aminoácidos de semente essenciais alterados. Por exemplo, consultar a Patente n° U.S. 6.127.600 (método para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), Patente n° U.S. 6.080.913 (métodos binários para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), Patente n° U.S. 5.990.389 (lisina superior), documento n° WO 1999/40209 (alteração de composições de aminoácido em sementes), documento n° WO 1999/29882 (métodos para alterar o teor de aminoácido de proteínas), Patente n° U.S. 5.850.016 (alteração de composições de aminoácido em sementes), documento n° WO 1998/20133 (proteínas com níveis aprimorados de aminoácidos essenciais), Patente n° U.S. 5.885.802 (metionina alta), Patente n° U.S. 5.885.801 (treonina superior), Patente n° U.S. 6.664.445 (enzimas biossintéticas de aminoácido de planta), Patente n° U.S. 6.459.019 (lisina e treonina aumentadas), Patente n° U.S. 6.441.274 (subunidade beta de triptofano sintase de planta), Patente n° U.S. 6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), Patente n° U.S. 5.939.599 (enxofre superior), Patente n° U.S. 5.912.414 (metionina aumentada), documento n° WO 1998/56935 (enzimas biossintéticas de aminoácido de planta), documento n° WO 1998/45458 (proteína de semente modificada geneticamente que tem porcentagem superior de aminoácidos essenciais), documento n° WO 1998/42831 (lisina aumentada), Patente n° U.S. 5.633.436 (aumentar teor de aminoácido de enxofre), Patente n° U.S. 5.559.223 (proteínas de armazenamento sintético com estrutura definida contendo níveis programáveis de aminoácidos essenciais para a melhora do valor nutricional de plantas), documento n° WO 1996/01905 (treonina aumentada), documento n° WO 1995/15392 (lisina aumentada), Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2003/0163838, Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2003/0150014, Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2004/0068767, Patente n° U.S. 6.803.498, documento n° WO 2001/79516.

4. Genes que Controlam a Esterilidade Masculina:

[0215] Há diversos métodos para conferir esterilidade masculina genética disponíveis, como múltiplos genes mutantes em localizações separadas dentro do genoma que confere esterilidade masculina, conforme revelado nas Patentes nos U.S. 4.654.465 e 4.727.219 de Brar, et al., e translocações cromossômicas, conforme descrito por Patterson nas Patentes nos U.S. 3.861.709 e 3.710.511. Além desses métodos, Albertsen, et al.,Patente n° U.S. 5.432.068, descreve um sistema de esterilidade masculina nuclear que inclui: identificar um gene que é crítico à fertilidade masculina; silenciar esse gene nativo que é crítico à fertilidade masculina; remover o promotor nativo do gene de fertilidade masculina essencial e substituir o mesmo por um promotor induzível; inserir esse gene geneticamente modificado de volta na planta; e criando, desse modo, uma planta que é masculina estéril devido ao promotor induzível não estar "ligado", resultando no gene de fertilidade masculina não transcrito. A fertilidade é restaurada induzindo ou "ligando" o promotor, o que permite, por sua vez, que o gene que confere fertilidade masculina seja transcrito.

[0216] (A) Introdução de um gene deacetilase sob o controle de um promotor específico de tapetum e com a aplicação de N-Ac-PPT químico (documento n° WO 2001/29237).

[0217] (B) Introdução de vários promotores específicos de estame (documentos n° WO 1992/13956, n° WO 1992/13957).

[0218] (C) Introdução do gene barnase e barstar (Paul, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 19:611 a 622).

[0219] Para exemplos adicionais de sistemas e genes nucleares de esterilidade masculina e feminina, também consultar as Patentes n°s U.S. 5.859.341; 6.297.426; 5.478.369; 5.824.524; 5.850.014 e 6.265.640, todas as quais são incorporadas ao presente documento a título de referência.

5. Genes que criam um sítio para integração de DNA específica de sítio.

[0220] Isso inclui a introdução de sítios de FRT que podem ser usados no sistema FLP/FRT e/ou sítios Lox que podem ser usados no sistema Cre/Loxp. Por exemplo, consultar, Lyznik, et al. , (2003) Plant Cell Rep 21:925 a 932 e documento n° WO 1999/25821, os quais são incorporados ao presente documento a título de referência. Outros sistemas que podem ser usados incluem a recombinase Gin de fago Mu (Maeser, et al., (1991) Vicki Chandler, The Maize Handbook capítulo 118 (Springer-Verlag 1994), a recombinase Pin de E. coli (Enomoto, et al., 1983) e o sistema R/RS do plasmídeo pSRi (Araki, et al., 1992).

6. Genes que afetam a resistência a estresse abiótico

[0221] Incluem, mas sem limitação, a florescimento, desenvolvimento de espiga e semente, aprimoramento da utilização de nitrogênio, responsividade de nitrogênio alterada, resistência à seca ou tolerância, resistência ao frio ou tolerância e resistência ou tolerância ao sal e rendimento aumentado sob tensão.

[0222] (A) Por exemplo, consultar: Documento n° WO 2000/73475, em que a eficácia de uso de água é alterada através da alteração de malato; as Patentes n°s U.S. 5.892.009, 5.965.705, 5.929.305, 5.891.859, 6.417.428, 6.664.446, 6.706.866, 6.717.034, 6.801.104, documentos n° WO 2000/060089, n° WO 2001/026459, n° WO 2001/035725, n° WO 2001/034726, n° WO 2001/035727, n° WO 2001/036444, n° WO 2001/036597, n° WO 2001/036598, n° WO 2002/015675, n° WO 2002/017430, n° WO 2002/077185, n° WO 2002/079403, n° WO 2003/013227, n° WO 2003/013228, n° WO 2003/014327, n° WO 2004/031349, n° WO 2004/076638, n° WO 199809521.

[0223] (B) O documento n° WO 199938977 que descreve genes, incluindo genes CBF e fatores de transcrição eficazes na mitigação de efeitos negativos de congelamento, salinidade e seca altas em plantas, assim como conferir outros efeitos positivos no fenótipo de planta.

[0224] (C) Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2004/0148654 e documento n° WO 2001/36596, em que o ácido abscísico é alterado em plantas que resultam em fenótipo de planta melhorado, como rendimento aumentado e/ou tolerância aumentada a estresse abiótico.

[0225] (D) Documentos n° WO 2000/006341, n° WO 2004/090143, Patentes nos U.S. 7.531.723 e 6.992.237 em que a expressão de citoquinina é modificada, resultando em plantas com tolerância a estresse aumentada, como tolerância à seca e/ou rendimento aumentado. Também consultar os documentos n° WO 2002/02776, n° WO 2003/052063, n° JP 2002/281975, Patente n° U.S. 6.084.153, documento n° WO 2001/64898, Patente n° U.S. 6.177.275 e Patente n° U.S. 6.107.547 (aprimoramento de utilização de nitrogênio e resposta de nitrogênio alterada).

[0226] (E) Para alteração de etileno, consultar a Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2004/0128719, a Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2003/0166197 e o documento n° WO 2000/32761.

[0227] (F) Para fatores de transcrição de planta ou reguladores de transcrição de estresse abiótico, consultar, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2004/0098764 ou Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2004/0078852.

[0228] (G) Genes que aumentam a expressão de pirofosfatase vacuolar, como AVP1 (Patente n° U.S. 8.058.515) para rendimento aumentado; ácido nucleico codificador de um polipeptídeo HSFA4 ou um polipeptídeo HSFA5 (Fator de Choque Térmico da classe A4 ou A5), um polipeptídeo de proteína transportadora de oligopeptídeo (semelhante a OPT4); um polipeptídeo semelhante a plastochron2 (semelhante a PLA2) ou um polipeptídeo semelhante a homeobox 1 relacionado a Wuschel (semelhante a WOX1) (Pedido de Publicação de Patente n° U.S. 2011/0283420).

[0229] (H) Regulação descendente de polinucleotídeos codificadores de proteínas de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) para modular o extermínio de célula programado (Patente n° U.S. 8.058.510) para vigor aumentado.

[0230] (I) Polinucleotídeo de codificação de polipeptídeos DTP21 para conferir resistência à seca (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2011/0277181).

[0231] (J) As sequências de nucleotídeo codificadoras das proteínas de ACC Sintase 3 (ACS3) para modular o desenvolvimento, modular resposta ao estresse e modular a tolerância ao estresse (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2010/0287669).

[0232] (K) Polinucleotídeos que codificam proteínas que conferem um fenótipo de tolerância à seca (DTP) para conferir resistência à seca (documento n° WO 2012/058528).

[0233] (L) Genes de tocoferol ciclase (TC) para conferir tolerância à seca e sais (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2012/0272352).

[0234] (M) Proteínas de família de terminal amino CAAX para tolerância ao estresse (Patente n° U.S. 8.338.661).

[0235] (N) Mutações no gene de codificação de SAL1 têm tolerância ao estresse aumentada, incluindo resistência à seca aumentada (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2010/0257633).

[0236] (O) Expressão de uma sequência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: polipeptídeo GRF, polipeptídeo semelhante a RAA1, polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL, e polipeptídeo YTP que aumentam os traços relacionados ao rendimento (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2011/0061133).

[0237] (P) Modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo de Trealose Fosfato Fosfatase de Classe III (TPP) para aprimorar os traços relacionados ao rendimento em plantas, aumentando particularmente o rendimento de semente (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2010/0024067).

[0238] Outros genes e fatores de transcrição que afetam o crescimento de planta e traços agronômicos, como o rendimento, florescimento, crescimento de planta e/ou estrutura de planta, podem ser introduzidos ou sofrer introgressão em plantas, consultar, por exemplo, os documentos n° WO 1997/49811 (LHY), n° WO 1998/56918 (ESD4), n° WO 1997/10339 e Patente n° U.S. 6.573.430 (TFL), Patente n° U.S. 6.713.663 (FT), documentos n° WO 1996/14414 (CON), n° WO 1996/38560, n° WO 2001/21822 (VRN1), n° WO 2000/44918 (VRN2), n° WO 1999/49064 (GI), n° WO 2000/46358 (FR1), n° WO 1997/29123, Patente n° U.S. 6.794.560, Patente n° U.S. 6.307.126 (GAI), documentos n° WO 1999/09174 (D8 e Rht) e n° WO 2004/076638 e n° WO 2004/031349 (fatores de transcrição).

7. Genes que conferem rendimento aumentado

[0239] (A)Uma planta de cultura transgênica transformada por um ácido nucleico de codificação de Polipeptídeo semelhante a 1-Aminociclopropano-1-Carboxilato Deaminase (ACCDP), em que a expressão da sequência de ácido nucleico na planta de cultura resulta no crescimento de raiz aumentado da planta, e/ou rendimento aumentado, e/ou tolerância aumentada ao estresse ambiental, como em comparação a uma variedade do tipo selvagem da planta (Patente n° U.S. 8.097.769).

[0240] (B)A superexpressão de gene de proteína de dedo de zinco de maís (Zm-ZFP1) com o uso de um promotor preferido para semente demonstrou aprimorar o crescimento de planta, aumentar o número de grãos e peso de grãos total por planta (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2012/0079623).

[0241] (C)A superexpressão constitutiva de proteína de domínio de limites de órgão lateral de maís (LOB) (Zm-LOBDP1) demonstrou aumentar o número de grãos e o peso de grãos total por planta (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2012/0079622).

[0242] (D)O aprimoramento de traços relacionados ao rendimento em plantas modulando-se a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo semelhante a VIM1 (Variante em Metilação 1) ou um polipeptídeo semelhante a VTC2 (GDP-L-galactose fosforilase) ou um polipeptídeo DUF1685 ou um polipeptídeo semelhante a ARF6 (Fator de Resposta de Auxina) (documento n° WO 2012/038893).

[0243] (E)Modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo semelhante a Ste20 ou um homólogo do mesmo fornece plantas que têm rendimento aumentado em relação a plantas de controle (documento n° EP 2431472).

[0244] (F) Polipeptídeos de nucleosídeo difosfatase quinase (NDK) codificadores de genes e homólogos dos mesmos para modificar a arquitetura de raiz da planta (Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2009/0064373).

8. Genes que conferem digestibilidade de planta.

[0245] (A)Alteração do nível de xilano presente na parede celular de uma planta modulando-se a expressão de xilano sintase (Patente n° U.S. 8.173.866).

[0246] Em algumas modalidades, o traço empilhado pode ser um traço ou evento que recebeu aprovação regulamentar incluindo, mas sem limitação, eventos com aprovação regulamentar que são bem conhecidos pelo versado na técnica e podem ser encontrados no Center for Environmental Risk Assessment (cera- gmc.org/?action=gm_crop_database, que pode ser acessado com o uso do prefixo “www”) e no International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications (isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp, que pode ser acessado com o uso do prefixo “www”).

Silenciamento de gene

[0247] Em algumas modalidades, o traço empilhado pode estar na forma de silenciamento de um ou mais polinucleotídeos de interesse resultando na supressão de um ou mais polipeptídeos de praga direcionada. Em algumas modalidades, o silenciamento é alcançado através do uso de um construto de DNA de supressão.

[0248] Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos do polipeptídeo IPD073 ou fragmentos ou variantes dos mesmos podem ser empilhados com um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais polipeptídeos que têm atividade inseticida ou traços agronômicos conforme estabelecido supra e, opcionalmente, podem incluir adicionalmente um ou mais polinucleotídeos que fornecem silenciamento de gene de um ou mais polinucleotídeos-alvo conforme discutido infra.

[0249] "Construto de DNA de supressão" é um construto de DNA recombinante que, quando transformado ou integrado de modo estável ao genoma da planta, resulta no "silenciamento" de um gene direcionado na planta. O gene de direcionamento pode ser endógeno ou transgênico para a planta. "Silenciamento", conforme usado no presente documento em relação ao gene de direcionamento, se refere geralmente à supressão de níveis de mRNA ou proteína/enzima expressos pelo gene de direcionamento, e/ou o nível da atividade de enzima ou funcionalidade de proteína. O termo "supressão"inclui abaixar, reduzir, declinar, diminuir, inibir, eliminar e prevenir. "Silenciamento" ou "silenciamento de gene"não especifica mecanismo e é inclusivo, sem limitação, antissentido, cossupressão, supressão viral, supressão em grampo, supressão de haste-laço, abordagens à base de RNAi e abordagens à base de RNA pequeno.

[0250] Um construto de DNA de supressão pode compreender uma região derivada de um gene de direcionamento de interesse e pode compreender toda ou parte da sequência de ácido nucleico da fita de sentido (ou fita de antissentido) do gene de direcionamento de interesse. Dependendo da abordagem a ser utilizada, a região pode ser 100% idêntica ou menos que 100% idêntica (por exemplo, pelo menos 50% ou qualquer número inteiro entre 51% e 100% idêntica) a toda ou parte da fita de sentido (ou fita de antissentido) do gene de interesse.

[0251] Os construtos de DNA de supressão são bem conhecidos na técnica, são prontamente construídos uma vez que o gene de direcionamento de interesse é selecionado, e incluem, sem limitação, construtos de cossupressão, construtos de antissentido, construtos de supressão viral, construtos de supressão em grampo, construtos de supressão de haste-laço, construtos de produção de RNA de fita dupla, e mais geralmente, construtos de RNAi (interferência de RNA) e construtos de RNA pequenos, como construtos de siRNA (RNA de intereferência curta) e construtos de miRNA (microRNA).

[0252] "Inibição antissentido" se refere à produção de transcritos de RNA de antissentido com capacidade para suprimir a expressão da proteína direcionada.

[0253] "RNA de antissentido" se refere a um transcrito de RNA que é complementar a todo ou parte de um transcrito primário direcionado ou mRNA e que bloqueia a expressão de um fragmento de ácido nucleico isolado direcionado (Patente n° U.S. 5.107.065). A complementaridade de um RNA de antissentido pode estar com qualquer parte do transcrito de gene específico, isto é, na sequência de não codificação 5', sequência de não codificação 3', íntrons ou a sequência de codificação.

[0254] "Cossupressão"se refere à produção de transcritos de RNA de sentido com capacidade para suprimir a expressão da proteína direcionada. RNA de "sentido" se refere ao transcrito de RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzido na proteína dentro de uma célula ou in vitro. Os construtos de cossupressão em plantas foram anteriormente projetados focando- se na superexpressão de uma sequência de ácido nucleico que tem homologia a um mRNA nativo, na orientação de sentido, que resulta na redução de todo o RNA que tem homologia à sequência superexpressa (consultar Vaucheret, et al., (1998) Plant J. 16:651 a 659 e Gura, (2000) Nature 404:804 a 808).

[0255] Outra variação descreve o uso de sequências virais de planta para direcionar a supressão de sequências de codificação de mRNA proximal (Publicação PCT n° WO 1998/36083).

[0256] Um trabalho recente descreveu o uso de estruturas "em grampo" que incorporam toda ou parte de uma sequência de codificação de mRNA em uma orientação complementar que resulta em uma estrutura de "haste-laço" potencial para o RNA expresso (Publicação PCT n° WO 1999/53050). Nesse caso, a haste é formada por polinucleotídeos correspondentes ao gene de interesse inserido na orientação de sentido ou antissentido em relação ao promotor e o laço é formado por alguns polinucleotídeos do gene de interesse, que não têm um complemento no construto. Isso aumenta a frequência de cossupressão ou silenciamento nas plantas transgênicas recuperadas. Para revisão de supressão em grampo, consultar Wesley, et al., (2003) Methods in Molecular Biology, Plant Functional Genomics: Methods and Protocols 236:273 a 286.

[0257] Um construto em que a haste é formada por pelo menos 30 nucleotídeos de um gene a ser suprimido e o laço é formado por uma sequência de nucleotídeo aleatória também foi usado de modo eficaz para supressão (Publicação PCT n° WO 1999/61632).

[0258] O uso de sequências poli-T e poli-A para gerar a haste na estrutura de haste-laço também foi descrito (Publicação PCT n° WO 2002/00894).

[0259] Ainda outra variação inclui o uso de repetições sintéticas para promover a formação de uma haste na estrutura de haste-laço. Os organismos transgênicos preparados com tais fragmentos de DNA recombinantes demonstraram ter níveis reduzidos da proteína codificada pelo fragmento de nucleotídeo que forma o laço conforme descrito na Publicação PCT n° WO 2002/00904.

[0260] A interferência de RNA se refere ao processo de silenciamento de gene pós-transcrição específico de sequência em animais mediado por RNAs de interferência curta (siRNAs) (Fire, et al., (1998) Nature 391:806). O processo correspondente em plantas é comumente chamado de silenciamento de gene pós- transcrição (PTGS) ou silenciamento de RNA e também é chamado de repressão em fungos. Supõe-se que o processo de silenciamento de gene pós-transcrição seja um mecanismo de defesa celular conservado de modo evolucionário usado para prevenir a expressão de genes estranhos e é comumente compartilhado por flora e filo diversos (Fire, et al., (1999) Trends Genet. 15:358). Tal proteção de expressão de gene estranho pode ter evoluído em resposta à produção de RNAs de fita dupla (dsRNAs) derivados da infecção viral ou da integração aleatória de elementos de transposon em um genoma hospedeiro por meio de uma resposta celular que destrói especificamente o RNA de fita única homólogo de RNA genômico viral. A presença de dsRNA em células aciona a resposta de RNAi através de um mecanismo que ainda será distinguido completamente.

[0261] A presença de dsRNAs longos em células estimula a atividade de uma enzima ribonuclease III chamada de dicer. Dicer é envolvida no processamento do dsRNA em partes curtas de dsRNA conhecidas como RNAs de interferência curta (siRNAs) (Berstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os RNAs de interferência curta derivados da atividade de dicer têm tipicamente cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos em comprimento e compreendem cerca de 19 duplexes de pares de bases (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Dicer também foi implicada na remoção de RNAs temporais curtos de 21 e 22 nucleotídeos (stRNAs) do RNA precursor de estrutura conservada que são implicados no controle de tradução (Hutvagner, et al., (2001) Science 293:834). A resposta de RNAi também fornece um complexo de endonuclease, comumente chamado de um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que media a clivagem de RNA de fita única que tem complementaridade de sequência com a fita de antissentido do duplex de siRNA. A clivagem do RNA de direcionamento ocorre no meio da região complementar à fita de antissentido do duplex de siRNA (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Além disso, a interferência de RNA também pode envolver silenciamento de gene mediado por RNA pequeno (por exemplo, miRNA), presumivelmente através de mecanismos celulares que regulam a estrutura de cromatina e previnem, assim, a transcrição de sequências de gene de direcionamento (consultar, por exemplo, Allshire, (2002) Science 297:1.818 a 1.819; Volpe, et al., (2002) Science 297:1.833 a 1.837; Jenuwein, (2002) Science 297:2.215 a 2.218 e Hall, et al., (2002) Science 297:2.232 a 2.237). Como tais, as moléculas de miRNA da revelação podem ser usadas para mediar o silenciamento de gene por meio da interação com transcritos de RNA ou alternadamente por interação com sequências de gene particulares, em que tal interação resulta no silenciamento de gene no nível de transcrição ou pós- transcrição.

[0262] Métodos e composições são adicionalmente fornecidos, os quais permitem um aumento no RNAi produzido a partir do elemento de silenciamento. Em tais modalidades, os métodos e composições empregam um primeiro polinucleotídeo que compreende um elemento de silenciamento para uma sequência de praga alvo operacionalmente ligada a um promotor ativo na célula de planta; e, um segundo polinucleotídeo que compreende um elemento intensificador de supressor que compreende a sequência de praga alvo ou uma variante ativa ou fragmento da mesma operacionalmente ligada a um promotor ativo na célula de planta. A expressão combinada do elemento de silenciamento com o elemento de aprimoramento de supressor leva a uma amplificação aumentada do RNA inibidor produzido a partir do elemento de silenciamento sobre aquele alcançável apenas com a expressão do elemento de silenciamento independente. Além da amplificação aumentada das espécies de RNAi específico em si, os métodos e as composições permitem adicionalmente a produção de uma população diversa de espécies de RNAi que pode aprimorar a eficácia de interrupção de expressão de gene de direcionamento. Como tal, quando o elemento de aprimoramento de supressor é expresso em uma célula de planta em combinação com o elemento de silenciamento, os métodos e a composição podem permitir a produção sistêmica de RNAi ao longo da planta; a produção de quantidades maiores de RNAi do que seria observado apenas com o construto de elemento de silenciamento independente; e, a carga melhorada de RNAi no floema da planta, fornecendo, desse modo, o controle melhor de insetos de alimentação de floema por uma abordagem de RNAi. Desse modo, os vários métodos e composições fornecem métodos melhorados para a entrega de RNA inibitório ao organismo de direcionamento. Consultar, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2009/0188008.

[0263] Conforme usado no presente documento, um "elemento de aprimoramento de supressor" compreende um polinucleotídeo que compreende a sequência de direcionamento a ser suprimida ou um fragmento ativo ou variante da mesma. É reconhecido que o elemento de aprimoramento de supressor não precisa ser idêntico à sequência de direcionamento, mas em vez disso, o elemento de aprimoramento de supressor pode compreender uma variante da sequência de direcionamento, enquanto o elemento de aprimoramento de supressor tiver identidade de sequência suficiente à sequência de direcionamento para permitir um nível aumentado do RNAi produzido pelo elemento de silenciamento sobre aquele alcançável apenas com a expressão do elemento de silenciamento. De modo similar, o elemento de aprimoramento de supressor pode compreender um fragmento da sequência de direcionamento, em que o fragmento é de comprimento suficiente para permitir um nível aumentado do RNAi produzido pelo elemento de silenciamento sobre aquele alcançável apenas com a expressão do elemento de silenciamento.

[0264] É reconhecido que múltiplos elementos de aprimoramento de supressor da mesma sequência de direcionamento ou de sequências de direcionamento diferentes ou de regiões diferentes da mesma sequência de direcionamento podem ser empregados. Por exemplo, os elementos de aprimoramento de supressor empregados podem compreender fragmentos da sequência de direcionamento derivados da região diferente da sequência de direcionamento (isto é, de 3‘UTR, sequência de codificação, íntron e/ou 5‘UTR). Adicionalmente, o elemento de aprimoramento de supressor pode ser contido em um cassete de expressão, conforme descrito em outro local no presente documento, e em modalidades específicas, o elemento de aprimoramento de supressor está no mesmo ou em um vetor ou construto de DNA diferente do elemento de silenciamento. O elemento de aprimoramento de supressor pode ser ligado de modo operacional a um promotor, conforme revelado no presente documento. É reconhecido que o elemento de aprimoramento de supressor pode ser expresso de modo constitutivo ou alternativamente, pode ser produzido de uma maneira específica de estágio que emprega os vários promotores regulados de modo associado ao desenvolvimento ou preferidos para tecido ou induzíveis que são discutidos em qualquer local no presente documento.

[0265] Em modalidades específicas, empregando tanto um elemento de silenciamento quanto o elemento de aprimoramento de supressor, a produção sistêmica de RNAi ocorre ao longo da planta inteira. Em modalidades adicionais, a planta ou partes de planta da revelação têm uma carga melhorada de RNAi no floema da planta em relação ao que seria observado com a expressão do construto de elemento de silenciamento independente e, desse modo, fornecem um controle melhor de insetos de alimentação de floema por uma abordagem de RNAi. Em modalidades específicas, as plantas, partes de planta e células de plantas da revelação podem ser distinguidas adicionalmente por permitir a produção de uma diversidade de espécies de RNAi que podem aprimorar a eficácia de interrupção de expressão de gene de direcionamento.

[0266] Em modalidades específicas, a expressão combinada do elemento de silenciamento e do elemento de aprimoramento de supressor aumenta a concentração do RNA inibitório na célula de planta, planta, parte de planta, tecido de planta ou floema sobre o nível que é alcançado quando o elemento de silenciamento é expresso independentemente.

[0267] Conforme usado no presente documento, um "nível aumentado de RNA inibitório"compreende qualquer aumento significativo de modo estatístico no nível de RNAi produzido em uma planta que tem a expressão combinada quando em comparação a uma planta de controle apropriada. Por exemplo, um aumento no nível de RNAi na planta, parte de planta ou célula de planta pode compreender um aumento de pelo menos cerca de 1%, cerca de 1% a 5%, cerca de 5% a 10%, cerca de 10% a 20%, cerca de 20% a 30%, cerca de 30% a 40%, cerca de 40% a 50%, cerca de 50% a 60%, cerca de 60 a 70%, cerca de 70% a 80%, cerca de 80% a 90%, cerca de 90% a 100% ou maior no nível de RNAi na planta, parte de planta, célula ou floema de planta quando em comparação a um controle apropriado. Em outras modalidades, o aumento no nível de RNAi na planta, parte de planta, célula ou floema de planta pode compreender um aumento de pelo menos cerca de 1 vez, cerca de 1 vez a 5 vezes, cerca de 5 vezes a 10 vezes, cerca de 10 vezes a 20 vezes, cerca de 20 vezes a 30 vezes, cerca de 30 vezes a 40 vezes, cerca de 40 vezes a 50 vezes, cerca de 50 vezes a 60 vezes, cerca de 60 vezes a 70 vezes, cerca de 70 vezes a 80 vezes, cerca de 80 vezes a 90 vezes, cerca de 90 vezes a 100 vezes ou maior no nível de RNAi na planta, parte de planta, célula ou floema de planta quando em comparação a um controle apropriado. Os exemplos de expressão combinada do elemento de silenciamento com o elemento de aprimoramento de supressor para o controle de Percevejos e Lygus podem ser encontrados na Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2011/0301223 e na Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2009/0192117.

[0268] Algumas modalidades se referem à regulação descendente de expressão de genes de direcionamento em espécies de praga de inseto por moléculas de ácido ribonucleico (RNA) interferentes. A Publicação PCT n° WO 2007/074405 descreve métodos para inibir a expressão de genes de direcionamento em pragas invertebradas incluindo besouro do Colorado da batata. A Publicação PCT n° WO 2005/110068 descreve métodos para inibir a expressão de genes de direcionamento em pragas invertebradas incluindo, em particular, verme da raiz do milho do oeste como um meio para controlar a infestação de inseto. Adicionalmente, a Publicação PCT n° WO 2009/091864 descreve composições e métodos para a supressão de genes de direcionamento de espécies de praga de inseto incluindo pragas do gênero Lygus. As moléculas de ácido nucleico incluindo RNAi para direcionar a subunidade de ATPase H vacuolar são úteis para controlar uma população de pragas de Coleópteros e infestação conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2012/0198586. A Publicação PCT n° WO 2012/055982 descreve ácido ribonucleico (RNA ou RNA de fita dupla) que inibe ou regula de modo descendente a expressão de um gene de direcionamento que codifica: uma proteína ribossômica de inseto, como a proteína ribossômica L19, a proteína ribossômica L40 ou a proteína ribossômica S27A; uma subunidade de proteassoma de inseto, como a proteína Rpn6, Pros 25, a proteína Rpn2, a proteína de subunidade beta 1 de proteassoma ou a proteína beta 2 Pros; um ß-coat0mero de inseto da vesícula COPI, o Y—coatômero da vesícula COPI, a proteína de ß' — coatômero ou o Z—coatômero da vesícula COPI; uma proteína de Tetraspanina 2 A de inseto que é uma proteína de domínio transmembranar putativa; uma proteína de inseto que pertence à família de actina, como Actina 5C; uma proteína de ubiquitina-5E de inseto; uma proteína Sec23 de inseto que é um ativador de GTPase envolvido em transporte de proteína intracelular; uma proteína enrugada de inseto que é uma miosina não convencional que é envolvida na atividade motora; uma proteína de torcicolo de inseto que é envolvida na regulação de splicing de mRNA alternativo nuclear; uma proteína de subunidade G de ATPase H+ vacuolar de inseto e um Tbp-1 de inseto, como a proteína de ligação Tat. As Publicações de Pedido de Patente n° U.S. 2012/029750, n° US 20120297501, e n° 2012/0322660 descrevem os ácidos ribonucleicos interferentes (RNA ou RNA de fita dupla) que funcionam mediante captação por uma espécie de praga de inseto para regular de modo descendente a expressão de um gene de direcionamento na dita praga de inseto, em que o RNA compreende pelo menos um elemento de silenciamento, em que o elemento de silenciamento é uma região de RNA de fita dupla que compreende fitas complementares aneladas, em que uma fita compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência de direcionamento de nucleotídeo dentro do gene de direcionamento. A Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2012/0164205 descreve direcionamentos potenciais para ácidos ribonucleicos de fita dupla interferentes para inibir pragas invertebradas incluindo: uma Sequência Homóloga Chd3, uma Sequência Homóloga de Beta- Tubulina, uma Sequência Homóloga de ATPase V de 40 kDa, uma Sequência Homóloga de EF1a, uma Sequência Homóloga p28 de Subunidade de Proteassoma 26S, uma Sequência Homóloga de Hidrolase de Epóxido de Hormônio Juvenil, uma Sequência Homóloga de Proteína de Canal de Cloreto Dependente de Inchaço, uma Sequência Homóloga de Proteína Glicose-6-Fosfato 1- Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Proteína Act42A, uma Sequência Homóloga de Fator 1 de Ribosilação de ADP, uma Sequência Homóloga de Proteína de Fator IIB de Transcrição, umas Sequências Homólogas de Quitinase, uma Sequência Homóloga de Enzima de Conjugação de Ubiquitina, uma Sequência Homóloga de Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Ubiquitina B, um Homólogo de Esterase de Hormônio Juvenil e uma Sequência Homóloga de Alfa Tubulina. Uso em Controle de Pesticida

[0269] Os métodos gerais para empregar cepas que compreendem uma sequência de ácido nucleico das modalidades ou uma variante da mesma em controle de pesticida ou na projeção de outros organismos como agentes pesticidas são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, a Patente n° U.S. 5.039.523 e o documento n° EP 0480762A2.

[0270] Os hospedeiros de micro-organismos que são conhecidos por ocupar a "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplana) de uma ou mais culturas de interesse podem ser selecionados. Esses micro-organismos são selecionados de modo a terem capacidade de competir de modo bem sucedido no ambiente particular com os micro-organismos do tipo selvagem, fornecer manutenção estável e expressão do gene que expressa o polipeptídeo IPD073 e, desejavelmente, fornecer proteção aprimorada do pesticida contra degradação ambiental e inativação.

[0271] Alternativamente, o polipeptídeo IPD073 é produzido introduzindo-se um gene heterólogo em um hospedeiro celular. A expressão do gene heterólogo resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Essas células são, então, tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente de praga (ou pragas) de direcionamento. O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Esses polipeptídeos IPD073 naturalmente encapsulados podem então ser formulados de acordo com técnicas convencionais para a aplicação ao ambiente hospedando uma praga-alvo, por exemplo, água do solo, água e folhagem de plantas. Consultar, por exemplo, o documento n° EPA 0192319 e as referências citadas no mesmo.

Composições Pesticidas

[0272] Em algumas modalidades, os ingredientes ativos podem ser aplicados na forma de composições e podem ser aplicados na área de cultura ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, exterminadores de gramíneas, crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabonetes pesticidas, óleos inativos, polímeros e/ou formulações de carreador de liberação por tempo ou biodegradável que permite a dosagem a longo prazo de uma área de direcionamento após uma aplicação única da formulação. Os mesmos também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbiocidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas ou misturas de diversas dentre essas preparações, se desejado, junto com carreadores adicionais aceitáveis de modo agrícola, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação empregados de modo costumeiro na técnica de formulação. Os carreadores e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias empregadas de modo comum na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, acentuadores de pegajosidade, ligantes ou fertilizantes. De modo similar, as formulações podem ser preparadas em “iscas” comestíveis ou fabricadas em “armadilhas” para praga para permitir alimentação ou ingestão por uma praga alvo da formulação pesticida.

[0273] Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo ou uma composição agroquímica que contém pelo menos um dos polipeptídeos IPD073 produzido através das cepas bacterianas incluem aplicação em folha, revestimento de semente e aplicação em solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[0274] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, coloide, solução ou semelhantes, e pode ser preparada por tais meios convencionais, como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células que compreende o polipeptídeo. Em todas as tais composições que contêm pelo menos um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

[0275] As pragas de Lepidópteros, Diptera, Heteroptera, nemátodos, Hemiptera ou Coleópteros podem ser exterminadas ou reduzidas em números em uma dada área pelos métodos da revelação ou podem ser aplicados de modo profilático em uma área ambiental para impedir a infestação por uma praga suscetível. Preferencialmente, a praga ingere ou faz contato com uma quantidade eficaz para pesticida do polipeptídeo. "Quantidade eficaz para pesticida", conforme usado no presente documento, se refere a uma quantidade do pesticida que é capaz de exterminar pelo menos uma praga ou reduzir de modo notável o crescimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal de praga. Essa quantidade irá variar dependendo de tais fatores como, por exemplo, as pragas-alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, a localização, a planta, cultura ou local agrícola a ser tratado, as condições ambientais e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação de composição polipeptídica eficaz para pesticida. As formulações também podem variar em relação a condições climáticas, considerações ambientais e/ou frequência de aplicação e/ou severidade de infestação de praga.

[0276] As composições pesticidas descritas podem ser produzidas formulando-se a célula bacteriana, suspensão de Cristal e/ou esporo ou componente de proteína isolada com o carreador agriculturalmente aceitável desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em meios apropriados, como liofilizada, secada a frio, dessecada ou em um carreador, meio ou diluente aquoso adequado, como salino ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões de óleo/água ou como um pó molhável ou em combinação com qualquer outro material carreador adequado para aplicação agrícola. Os carreadores agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. O termo "carreador aceitável de modo agrícola"abrange todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, aprimoradores de pegajosidade, ligantes, etc. que são usados de modo comum na tecnologia de formulação de pesticida; esses são bem conhecidos por aqueles versados na técnica de formulação de pesticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparados por vários meios, por exemplo, por mistura de modo homogêneo, mescla e/ou moagem da composição pesticida com adjuvantes adequados com o uso de técnicas de formulação convencional. As formulações e métodos de aplicação adequados são descritos na Patente n° U.S. 6.468.523, incorporada ao presente documento a título de referência. As plantas também podem ser tratadas com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas. As composições químicas exemplificativas incluem: Herbicidas de Frutas/Vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzin, Simazina, Trifluralina, Fluazifope, Glufosinato, Halosulfuron Gowan, Paraquate, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halosulfuron, Indaziflam; InseticidasdeFrutas/Vegetais: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbaryl, Carbofuran, Chlorpyrifos, Cypermethrin, Deltamethrin, Diazinon, Malathion, Abamectin, Cyfluthrin/beta-cyfluthrin, Esfenvalerate, Lambda-cyhalothrin, Acequinocyl, Bifenazate, Methoxyfenozide, Novaluron, Chromafenozide, Thiacloprid, Dinotefuran, FluaCrypyrim, Tolfenpyrad, Clothianidin, Spirodiclofen, Gamma-cyhalothrin, Spiromesifen, Spinosad, Rynaxypyr, Cyazypyr, Spinoteram, Triflumuron, Spirotetramat, Imidacloprid, Flubendiamide, Thiodicarb, Metaflumizone, Sulfoxaflor, Cyflumetofen, Cyanopyrafen, Imidacloprid, Clothianidin, Thiamethoxam, Spinotoram, Thiodicarb, Flonicamid, Methiocarb, Emamectin- benzoate, Indoxacarb, Forthiazate, Fenamiphos, Cadusaphos, Pyriproxifen, Fenbutatin-oxid, Hexthiazox, Methomyl, 4-[[(6- Chlorpyridin-3-yl)methyl](2,2-difluorethyl)amino]furan-2(5H)- on; Fungicidas de Frutas/Vegetais: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato metílico, Azoxistrobina, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Kresoxim metílico, Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobina, Etaboxam, Iprovalicarbe, Trifloxistrobina, Fenexamida, fumarato de oxpoconazol, ciazofamida, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamida, Boscalida; Herbicidas de Cereais: Isoproturon, Bromoxinil, Ioxinil, Fenóxidos, Clorosulfuron, Clodinafope, Diclofope, Diflufenican, Fenoxaprope, Florasulam, Fluoroxipir, Metsulfuron, Triasulfuron, Flucarbazona, Iodosulfuron, Propoxicarbazona, Picolinafen, Mesosulfuron, Beflubutamida, Pinoxaden, Amidosulfuron, Tifensulfuron Metil, Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfosulfuron, Pirasulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxasulfon; Fungicidas de Cereais: Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorf, Epoxiconazol, Kresoxim metílico, Quinoxifen, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobin, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobin; InseticidasdeCereais: Dimetoato, Lambda-cialotrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, ß-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiaclopride, Acetamiprida, Dinetofuran, Clorpirifós, Metamidofós, Oxidemeton metílico, Pirimicarbe, Metiocarbe; Herbicidas de Maís:Atrazina, Alacloro, Bromoxinil, Acetocloro, Dicamba, Clopiralida, (S- )Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S- )Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfon; Inseticidas de Maís: Carbofuran, Clorpirifós, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda-Cialotrina, Teflutrina, Terbufós, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarbe, ß-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina,Tebupirimifós, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarbe, Espirodiclofeno, Espirotetramate; Fungicidas de Maís: Fenitropano, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas de Arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cialofope, Daimuron, Fentrazamida, Imazosulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfuron, Piributicarbe, Quinclorac, Tiobencarbe, Indanofano, Flufenacete, Fentrazamida, Halosulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalida, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxisulfuron, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprope, Pirimisulfan; Inseticidas de Arroz: Diazinon, Fenitrotiona, Fenobucarb, Monocrotofós, Benfuracarbe, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronil, Imidacloprida, Isoprocarbe, Tiacloprida, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprida, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifós, Cartape, Metamidofós, Etofenprox, Triazofós, 4-[[(6- Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Carbofurano, Benfuracarbe; Fungicidas de Arroz: Tiofanato metílico, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfós, Ferimzone, Iprobenfós, Isoprotiolana, Pencicuron, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas de Algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfen, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifope-butil, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobaque sódico, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazin, Tidiazuron; Inseticidas de Algodão: Acefato, Aldicarbe, Clorpirifós, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocrotofós, Abamectina, Acetamiprida, Benzoato de Emamectina, Imidacloprida, Indoxacarbe, Lambda-Cialotrina, Espinosade, Tiodicarbe, Gama-Cialotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta- Ciflutrina, Espirotetramato, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, gama Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Tiodicarbe, Avermectina, Flonicamida, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofós, Triazofós, Endosulfan; Fungicidas de Algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas de Soja: Alacloro, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron Etílico, Cloransulam Metílico, Fenoxaprope, Fomesafen, Fluazifope, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolacloro, Metribuzin, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Inseticidas de Soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Paration, Tiocarbe, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprole, Deltametrina, ß-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan- 2(5H)-on, Espirotetramate, Espinodiclofeno, Triflumuron, Flonicamida, Tiodicarbe, beta-Ciflutrina; Fungicidas de Soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas de Beterraba sacarina: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralida, Fluazifope, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflusulfuron, Tepraloxidim, Quizalofope; Inseticidas de Beterraba sacarina: Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Deltametrina, ß- Ciflutrina, gama/lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas de Canola: Clopiralida, Diclofope, Fluazifope, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralina Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofope, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas de Canola: Azoxistrobina, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Inseticidas de Canola: Organofosfatos de carbofurano, Piretroides, Tiacloprida, Deltametrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprida, Dinetofurano, ß-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, tau- Fluvaleriato, Etiprol, Espinosade, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-on. [0001]

[0277] Em algumas modalidades, o herbicida é Atrazina, Bromacil, Diuron, Clorsulfuron, Metsulfuron, Tifensulfuron Metil, Tribenuron, Acetoclor, Dicamba, Isoxaflutole, Nicosulfuron, Rimsulfuron, Piritiobaque- sódico, Flumioxazin, Clorimuron-Etil, Metribuzin, Quizalofop, S- metolaclor, Hexazinona ou combinações dao mesmos.

[0278] Em algumas modalidades, o inseticida é Esfenvalerato, Clorantraniliprol, Metomil, Indoxacarbe, Oxamil ou combinações dos mesmos.

Atividade pesticida e inseticida

[0279] "Praga" inclui, mas sem limitação, insetos, fungos, bactérias, nemátodos, ácaros, carrapatos e semelhantes. As pragas de inseto incluem insetos selecionados dentre as ordens Coleóptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidóptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepidóptera e Coleóptera.

[0280] Aqueles versados na técnica reconhecerão que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Os compostos das modalidades exibem atividade contra pragas de inseto, que podem incluir pragas agronômicas, florestais, estufas, viveiros, plantas ornamentais, alimentos e fibras, de saúde pública e animal, de estrutura doméstica e comercial, domésticas e de produtos armazenados de importância econômica.

[0281] Larvas da ordem Lepidóptera incluem, mas sem limitação, lagartas-militares, larvas cortadoras, lagartas falsa-medideiras e lagartas da maçã-do-algodoeiro na família Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith (lagarta-militar do outono); S. exiguaHübner (lagarta-militar da beterraba); S. litura Fabricius (lagarta cortadora do tabaco, lagarta-rosca de tabaco); Mamestra configurata Walker (lagarta-militar bertha); M. brassicae Linnaeus (traça do repolho); Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta-rosca); A. orthogonia Morrison (lagarta-rosca ocidental); A. subterranea Fabricius (lagarta-rosca granulada); Alabama argillaceaHübner (Curuquerê-do-algodoeiro); Trichoplusia niHübner (falsa-medideira da couve); Pseudoplusia includens Walker (falsa-medideira da soja); Anticarsia gemmatalisHübner (lagarta-da-soja); Hypena scabra Fabricius (verme-de-trevo verde); Heliothis virescens Fabricius (lagarta da maça); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-militar); Athetis mindara Barnes e Mcdunnough (lagarta-rosca de pele áspera); Euxoa messoria Harris (lagarta-rosca de lado escuro); Earias insulana Boisduval (lagarta capulho espinhosa); E. vittella Fabricius (lagarta capulho pontilhada); Helicoverpa armigeraHübner (lagarta capulho americana); H. zea Boddie (lagarta de espiga de milho ou lagarta de capulho de algodão); Melanchra picta Harris (lagartas zebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (lagarta-rosca de citros); brocas, traça-das- paredes, lagartas cone e skeletonizers da famíliaPyralidae Ostrinia nubilalisHübner (broca de milho europeia); Amyelois transitella Walker (lagarta de laranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (Traça do trigo mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça-do-cacau); Chilo suppressalis Walker (broca de caule de arroz); C. partellus, (broca de sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (traça de arroz); Crambus caliginosellus Clemens (lagarta de rede de raiz de milho); C. teterrellus Zincken (lagarta que tece teia de gramíneas); Cnaphalocrocis medinalisGuenée (traça tortricídea de arroz); Desmia funeralis Hübner (dobrador de folha de uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (lagarta de melão); D. nitidalis Stoll (lagarta de picles); Diatraea grandiosella Dyar (broca de milho sudoeste), D. saccharalis Fabricius (broca de cana-de-açúcar); Eoreuma loftini Dyar (broca de arroz mexicano); Ephestia elutellaHübner (traça do tabaco (cacau); Galleria mellonella Linnaeus (traça grande da cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (lagarta de rede de céspede); Homoeosoma electellum Hulst (traça de girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (broca-do-colo); Achroia grisella Fabricius (traça da cera); Loxostege sticticalis Linnaeus (lagarta de rede de beterraba); Orthaga thyrisalis Walker (mariposa teia da árvore do chá); Maruca testulalis Geyer (broca de feijão); Plodia interpunctellaHübner (Mariposa de refeição Indiana); Scirpophaga incertulas Walker (broca do tronco amarelo); Udea rubigalisGuenée (traça do aipo); e lagartas enroladeiras, lagartas de broto, lagartas de semente e lagartas de fruta na família Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (lagarta de broto de cabeça preta do oeste); A. variana Fernald (lagarta de broto de cabeça preta do leste); Archips argyrospila Walker (lagarta enroladeira de árvore frutífera); A. rosana Linnaeus (lagarta enroladeira europeia); e outras espécies Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (traça tortricídea dos frutos de verão); Cochylis hospes Walsingham (mariposa bandeada de girassol); Cydia latiferreana Walsingham (traça da avelaneira); C. pomonella Linnaeus (Bichado das 5 pomoideas); Platynota flavedana Clemens (lagarta enroladeira de folha variegado); P. stultana Walsingham (lagarta enroladeira de folha de onívoro); Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (Eudémis); Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (traça vermelha dos 10 gomos); Endopiza viteana Clemens (mariposa de bagas de uva); Eupoecilia ambiguella Hübner (Cochilis); Bonagota salubricola Meyrick (Lagarta enroladeira da maçã); Grapholita molesta Busck (Traça oriental do pessegueiro); Suleima helianthana Riley (mariposa de broto de girassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp..

[0282] Outras pragas agronômicas selecionadas da ordem Lepidóptera incluem, mas sem limitação, Alsophila pometaria Harris (locustas); Anarsia lineatella Zeller (broca do pêssego); Anisota senatoria J.E. Smith (lagarta de carvalho de listras laranjas); Antheraea pernyiGuérin-Méneville (Traça de Tussah de Carvalho Chinesa); Bombyx mori Linnaeus (Mariposa-de- seda); Bucculatrix thurberiella Busck (Lagarta mineradora das folhas); Colias eurytheme Boisduval (lagarta de alfalfa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta de nogueira); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (Mariposa-de-seda siberiana), Ennomos subsignariaHübner (lagarta de olmoErannis tiliaria Harris (mede-palmo de tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (maripora de rabo marrom); Harrisina americanaGuérin-Méneville (skeletonizer de folha de uva); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta de faixa); Hyphantria cunea Drury (larva de teias de outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (oxiúro de tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (lagarta-enroladora de cicuta do leste); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (lagarta- enroladora de cicuta do oeste); Leucoma salicis Linnaeus (mariposa de cetim); Lymantria dispar Linnaeus (mariposa- cigana); Manduca quinquemaculata Haworth (mariposa falcão de 5 manchas, hornworm de tomate); M. sexta Haworth (hornworm de tomate, hornworm de tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (Traça de inverno); Paleacrita vernata Peck (lagarta de gangrena de primavera); Papilio cresphontes Cramer (calda engolidora gigante, cachorro laranja); Phryganidia californica Packard (lagarta de carvalho da Califórnia); Phyllocnistis citrella Stainton (minerador de folha de citros); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minerador de folha manchado); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta grande branca); P. rapae Linnaeus (borboleta pequena branca); P. napi Linnaeus (borboleta branca com verde raiado); Platyptilia carduidactyla Riley (mariposa plumosa de alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (mariposa de costas de diamante); Pectinophora gossypiella Saunders lagarta capulho rosa); Pontia protodice Boisduval and Leconte (lagarta de repolho do sul); Sabulodes aegrotataGuenée (lagarta enroladora de onívoros); Schizura concinna J.E. Smith (lagarta arqueada vermelha); Sitotroga cerealella Olivier (mariposa Angoumois dos cereais); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (mariposa processionária do pinheiro); Tineola bisselliella Hummel (traça doméstica de riscas); Tuta absoluta Meyrick (lagarta mineira do tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (mariposa arminho); Heliothis subflexaGuenée; Malacosoma spp. e Orgyia spp.

[0283] São de interesse as larvas e os adultos da ordem Coleóptera incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae e Curculionidae (incluindo, mas sem limitação: Anthonomus grandis Boheman (bicudo-do-algodeiro); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgulho da água do arroz); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho do celeiro); S. oryzae Linnaeus (gorgulho do arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha de trevo); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule de girassol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho vermelho da semente de girassol); S. sordidus LeConte (gorgulho cinzento da semente de girassol); Sfenophorus maidis Chittenden (gorgulho do maís)); besouros-pulga, besouros do pepino, vermes da raiz, besouros da folha, besouros da batata e lagartas mineiras na família Chrysomelidae (incluindo, mas sem limitação: Leptinotarsa decemlineata Say (besouro do Colorado da batata); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (verme de raiz do milho ocidental); D. barberi Smith e Lawrence (verme de raiz do milho do norte); D. undecimpunctata howardi Barber (verme de raiz do milho do sul); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (besouro-pulga do milho); Phyllotreta cruciferae Goeze (besouro-pulga crucífero); Phyllotreta striolata (besouro-pulga listrado); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis da uva); Oulema melanopus Linnaeus (besouro da folha de cereal); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro do girassol)); besouros da família Coccinellidae (incluindo, mas sem limitação: Epilachna varivestis Mulsant (besouro mexicano do feijão)); Escaravelhos e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, mas sem limitação: Popillia japonica Newman (besouro japonês); Cyclocephala borealis Arrow (escaravelho mascarado do norte, escaravelho branco); C. immaculata Olivier (escaravelho mascarado do sul, escaravelho branco); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (escaravelho europeu); Phyllophaga crinita Burmeister (escaravelho branco); Ligyrus gibbosus De Geer (besouro da cenoura)); besouros de carpete da família Dermestidae; larvas-arame da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besouros da casca da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae.

[0284] Adultos e imaturos da ordem Diptera são de interesse, incluindo lagartas mineiras Agromyza parvicornis Loew (lagarta mineira da folha do milho); moscas (incluindo, mas sem limitação: Contarinia sorghicola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol)); moscas dos frutos (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas dos frutos); vermes (incluindo, mas sem limitação: Delia platura Meigen (verme da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outra Delia spp., Meromyza americana Fitch (verme do caule do trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas menores domésticas); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas da face, moscas de corno, moscas de sopro, Chrysomya spp.; Phormia spp. e outras pragas de moscas, moscas dos cavalos Tabanus spp.; moscas da família Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; besouros do gado Hypoderma spp.; moscas dos veados Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outra Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium spp.; Simulium spp.; moscas mordedoras, moscas da areia, esciarídeos e outros Nematocera.

[0285] Incluídos como insetos de interesse estão adultos e ninfas das ordens Hemíptera e Homóptera, tais como, mas sem limitação, adelgídeo da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cicadas da família Cicadidae, cigarrinhas, Empoasca spp.; da Cicadellidae, cigarrinhas de plantas das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, cigarrinhas de árvore da família Membracidae, psilídeos da família Psyllidae, moscas-brancas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, pfiloxera da família Phylloxeridae, cochonilhas-farinhentas da família Pseudococcidae, escalas das famílias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae Ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejo-de-renda da família Tingidae, percevejos da família Pentatomidae, percevejos-de- cincha, Blissus spp.; e outros percevejos de semente da família Lygaeidae, cigarrinhas da família Cercopidae, percevejos de polpa da família Coreidae e percevejos vermelhos e percevejos manchados de algodão da família Pyrrhocoridae.

[0286] Os membros agronomicamente importantes da ordem Hemiptera incluem adicionalmente, mas sem limitação: Acyrthisiphon pisum Harris (afídeo de ervilha); Aphis craccivora Koch (afídeo do feijão-frade); A. fabae Scopoli (afídeo do feijão preto); A. gossypii Glover (afídeo do algodão, afídeo do melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz de milho); A. pomi De Geer (afídeo da maçã); A. spiraecola Patch (afídeo de spiraea); Aulacorthum solani Kaltenbach (afídeo de Dedalis); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (afídeo do morango); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (afídeo do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (afídeo cinzento da macieira); Eriosoma lanigerum Hausmann (afídeo lanígero das macieiras); Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (afídeo farinhento da ameixa); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afídeo do nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (afídeo do cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afídeo da batata); Myzus persicae Sulzer (afídeo do pessegueiro, afídeo verde do pessegueiro); Nasonovia ribisnigri Mosley (afídeo do alface); Pemphigus spp. (afídeos da raiz e afídeos de galha); Rhopalosiphum maidis Fitch (afídeo da folha do milho); R. padi Linnaeus (afídeo-da-cerejeira-brava); Schizaphis graminum Rondani (pulgão dos cereais); Sipha flava Forbes (afídeo amarelo da cana-de-açúcar); Sitobion avenae Fabricius (afídeo inglês dos grãos); Therioaphis maculata Buckton (afídeo manchado da alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afídeo preto dos citrinos) e T. citricida Kirkaldy (afídeo marrom dos citrinos); Adelges spp. (adelgídeos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de nogueira-pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata doce); B. argentifolii Bellows & Perring (mosca-branca da folha de prata); Dialeurodes citri Ashmead (mosca-branca dos citrinos); Trialeurodes abutiloneus (mosca-branca de asa listrada) e T. vaporariorum Westwood (mosca-branca de estufa); Empoasca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (cigarrinha menor marrom); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cigarrinha de áster); Nephotettix cinticeps Uhler (cigarrinha verde); N. nigropictus Stâl (cigarrinha do arroz); Nilaparvata lugens Stâl (cigarrinha marrom); Peregrinus maidis Ashmead (cigarrinha do milho); Sogatella furcifera Horvath (cigarrinha de costas brancas); Sogatodes orizicola Muir (delfacídeo do arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha branca da macieira); Erythroneoura spp. (cigarrinhas da uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya purchasi Maskell (pulgão branco); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (pulgão de São José); Planococcus citri Risso (cochonilha dos citrinos); Pseudococcus spp. (outro complexo de cochonilha); Cacopsylla pyricola Foerster (psilídeo da pera); Trioza diospyri Ashmead (psilídeo do caqui).

[0287] Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Hemíptera incluem, mas sem limitação: Acrosternum hilare Say (percevejo verde); Anasa tristis De Geer (escaravelho da abóbora); Blissus leucopterus leucopterus Say (escaravelho das gramíneas); Corythuca gossypii Fabricius (escaravelho da renda de algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (escaravelho do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer (percevejo manchador de algodão); Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo manchado); Graptostethus spp. (complexo de escaravelhos de semente); Leptoglossus corculus Say (escaravelho de semente de pinheiro de pé em folha); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (escaravelho manchado da planta); L. Hesperus Knight (escaravelho ocidental manchado da planta); L. pratensis Linnaeus (escaravelho comum de prado); L. rugulipennis Poppius (escaravelho europeu manchado da planta); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsídeo verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (escaravelho grande da asclépia); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão).

[0288] Adicionalmente, as modalidades podem ser eficazes contra Hemiptera como Calocoris norvegicus Gmelin (escaravelho do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (capsídeo da maçã); Cyrtopeltis modestus Distant (escaravelho do tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga de marca branca); Diaphnocoris chlorionis Say (escaravelho de espinheiro-da-Virgínia); Labopidicola allii Knight (escaravelho da planta de cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão); Adelphocoris rapidus Say (escaravelho rápido da planta); Poecilocapsus lineatus Fabricius (escaravelho da planta de quatro linhas); Nysius ericae Schilling (escaravelho falso das gramíneas); Nysius raphanus Howard (escaravelho falso das gramíneas); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.

[0289] Também são incluídos os adultos e as larvas da ordem Acari (ácaros), como Aceria tosichella Keifer (ácaro do enrolamento do trigo); Petrobia latensMüller (ácaro marrom do trigo); ácaros aranhas e ácaros vermelhos na família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro vermelho europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro aranha de duas manchas); (T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro aranha carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (ácaro aranha do morango); ácaros planos na família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano dos citrinos); ácaros da ferugem e do broto na família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, os ácaros de poeira na família Epidermoptidae, ácaros do folículo na família Demodicidae, ácaros dos grãos na família Glycyphagidae, carrapatos na ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato de veado); I. holocyclus Neumann (carrapato da paralisia australiana); Dermacentor variabilis Say (carrapato do cão americano); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato lone star) e ácaros de sarna e coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae.

[0290] As pragas de inseto da ordem Thysanura são de interesse, como Lepisma saccharina Linnaeus (traça); Thermobia domestica Packard (tesourinha).

[0291] As pragas de artrópodes adicionais abrangidas incluem: aranhas na ordem Araneae como Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik (aranha reclusa marrom) e a Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra) e centopeias na ordem Scutigeromorpha como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia doméstica).

[0292] As pragas de inseto de interesse incluem a superfamília de percevejos e outros insetos relacionados incluindo, mas sem limitação, espécies que pertencem à família Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus e Bagrada hilaris (escaravelho Bagrada)), a família Plataspidae (Megacopta cribraria - Plataspid do feijão) e uma família Cydnidae (Scaptocoris castanea - percevejo da raiz) e espécies de Lepidópteros incluindo, mas sem limitação: traça-das-crucíferas, por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker e lagarta-da-soja por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner.

[0293] Os métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Czapla e Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480 a 2485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199 a 206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293 e Patente n° U.S. 5.743.477, todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Consultar, por exemplo Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293. Tais ensaios podem incluir colocar plantas em contato com uma ou mais pragas e determinar a habilidade da planta para sobreviver e/ou causar o extermínio das pragas.

[0294] Nemátodos incluem nemátodos parasíticos, como nemátodos das galhas radiculares, formadores de cistos e lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos nemátodos de cisto, incluindo, mas sem limitação, Heterodera glycines(nemátodo do cisto da soja); Heterodera schachtii(nemátodo do cisto da beterraba); Heterodera avenae(nemátodo do cisto do cereal) e Globodera rostochiensis e Globodera pailida(nemátodo do cisto da batata). Os nemátodos de lesão incluem Pratylenchus spp.

Tratamento de Semente

[0295] Para proteger e aprimorar as tecnologias de produção de rendimento e traço, as opções de tratamento de semente podem fornecer flexibilidade de plano de cultura adicional e controle custo-benefício contra insetos, gramíneas e doenças. O material de semente pode ser tratado, tipicamente tratado em superfície, com uma composição que compreende combinações de herbicidas químicos ou biológicos, fitoprotetores herbicidas, inseticidas, fungicidas, inibidores de germinação e aprimoradores, nutrientes, reguladores e ativadores de crescimento de planta, bactericidas, nematocidas, avicidas e/ou moluscicidas. Esses compostos são tipicamente formulados juntos com carreadores, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação adicionais empregados de modo costumeiro na técnica de formulação. Os revestimentos podem ser aplicados impregnando-se o material de propagação com uma formulação líquida ou por revestimento com uma formulação úmida ou seca combinada. Os exemplos dos vários tipos de compostos que podem ser usados como tratamentos de semente são fornecidos em The Pesticide Manual: A World Compendium, C.D.S. Tomlin Ed., publicado por British Crop Production Council, que é incorporado ao presente documento a título de referência.

[0296] Alguns tratamentos de semente que podem ser usados em semente de cultivo incluem, mas sem limitação, um ou mais dentre ácido abscísico, acibenzolar-S-metil, avermectina, amitrol, azaconazol, azospirillum, azadiractina, azoxistrobina, Bacillus spp. (o que inclui um ou mais espécies dentre cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis e/ou thuringiensis), bradyrhizobium spp. (o que inclui um ou mais dentre betae, canariense, elkanii, iriomotense, japonicum, liaonigense, pachyrhizi e/ou yuanmingense), captana, carboxina, quitosana, clotianidina, cobre, ciazipir, difenoconazol, etidiazole, fipronil, fludioxonil, fluoxastrobina, fluquinconazol, flurazole, fluxofenim, proteína harpina, imazalil, imidacloprid, ipconazol, isoflavonoides, lipo-quito- oligosacarídeo, mancozeb, manganês, maneb, mefenoxam, metalaxil, metconazol, miclobutanil, PCNB, penflufen, penicillium, pentiopirade, permetrina, picoxistrobina, protioconazol, piraclostrobina, rinaxipir, S-metolaclor, saponina, sedaxano, TCMTB, tebuconazol, tiabendazol, tiametoxam, tiocarb, thiram, tolclofos-metil, triadimenol, tricoderma, trifloxistrobina, triticonazol e/ou zinco. Revestimento de semente PCNB se refere ao Número de Registro EPA 00293500419, que contém quintozen e terrazol. TCMTB se refere a 2-(tiocianometiltio) benzotiazol.

[0297] As variedades de semente e sementes com traços transgênicos específicos podem ser testadas para determinar quais opções de tratamento de semente e taxas de aplicação podem complementar tais variedades e traços transgênicos a fim de aprimorar o rendimento. Por exemplo, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório mas a suscetibilidade à ferrugem do milho pode se beneficiar a partir do uso de um tratamento de semente que fornece a proteção contra ferrugem do milho, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório, mas a suscetibilidade a nemátodo de cisto pode se beneficiar a partir do uso de um tratamento de semente que fornece proteção contra nemátodo de cisto, e assim por diante. De modo semelhante, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a inseto pode se beneficiar a partir do segundo modo de ação conferido pelo tratamento de semente, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a herbicida pode se beneficiar a partir de um tratamento de semente com um fitoprotetor que aprimora a resistência de plantas àquele herbicida, etc. Adicionalmente, o estabelecimento de raiz satisfatório e a emergência inicial resultantes do uso apropriado de um tratamento de semente podem resultar em um uso de nitrogênio mais eficaz, uma habilidade melhor para resistir à seca e um aumento geral em potencial de rendimento de uma variedade ou variedades que contêm um certo traço quando combinadas com um tratamento de semente.

Métodos para exterminar uma praga de inseto e controlar uma população de insetos

[0298] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para exterminar uma praga de inseto compreendendo colocar a praga de inseto, seja simultânea seja sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um polipeptídeo IPD073 recombinante. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para exterminar uma praga de inseto que compreende colocar a praga de inseto com em contato com uma quantidade eficaz de inseticida de uma proteína pesticida recombinante da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, SEQ ID NO: 571 ou a variante das mesmas.

[0299] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto compreendendo colocar a população de praga de inseto, seja simultânea seja sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um polipeptídeo IPD073 recombinante. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um polipeptídeo IPD073 recombinante da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, SEQ ID NO: 571 ou a variante das mesmas. Conforme usado no presente documento, "controlar uma população de pragas" ou "controla uma praga" se refere a qualquer efeito em uma praga que resulta na limitação do dano que a praga causa. Controlar uma praga inclui, mas sem limitação, exterminar a praga, inibir o desenvolvimento da praga, alterar a fertilidade ou crescimento da praga de tal maneira que a praga forneça menos dano à planta, diminuir o número de descendentes produzido, produzir pragas menos adaptadas, produzir pragas mais suscetíveis a ataque de predadores ou impedir as pragas de se alimentarem com a planta.

[0300] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto resistente a uma proteína pesticida compreendendo colocar a população de praga de inseto, seja simultânea seja sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um polipeptídeo IPD073 recombinante. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto resistente a uma proteína pesticida compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um polipeptídeo IPD073 recombinante da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, SEQ ID NO: 571 ou a variante das mesmas.

[0301] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para proteger uma planta contra uma praga de inseto, compreendendo expressar na planta ou célula da mesma pelo menos um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo IPD073. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para proteger uma planta de um praga de inseto que compreende expressar na planta ou célula da mesma um polinucleotídeo recombinante que codifica o polipeptídeo IPD073 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, SEQ ID NO: 571 ou variantes das mesmas.

Estratégias de Gerenciamento de Resistência a Insetos (IRM)

[0302] A expressão de d-endotoxinas de B. thuringiensis em plantas de milho transgênicas se demonstrou como um meio eficaz para controlar pragas de inseto importantes para agricultura (Perlak, et al., 1990; 1993). Entretanto, os insetos evoluíram, de modo que se tornassem resistentes a d- endotoxinas de B. thuringiensis expressas em plantas transgênicas. Tal resistência, se disseminada, limitaria claramente o valor comercial de germoplasma que contém genes codificadores de tais d-endotoxinas de B. thuringiensis.

[0303] Uma maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir de modo contemporâneo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas é fornecer refúgios (uma seção de culturas/milho não inseticidas) não transgênicos (isto é, proteínas não inseticidas) para uso com culturas transgênicas que produzem uma proteína inseticida única ativa contra pragas-alvo. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) publica as exigências para o uso com culturas transgênicas que produzem uma proteína Bt única ativa contra pragas-alvo. Além disso, a National Corn Growers Association, em seu sítio da web: (ncga.com/inseto-resistência-management-fact-sheet-bt-corn, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) também fornece orientação similar em relação a exigências de refúgio. Devido a perdas de insetos dentro da área de refúgio, os refúgios maiores podem reduzir o rendimento geral.

[0304] Outra maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir de modo contemporâneo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas seria uma reposição de genes inseticidas que são eficazes contra grupos de pragas de inseto e que manifestam seus efeitos através de modos diferentes de ação.

[0305] A expressão em uma planta de duas ou mais composições inseticidas tóxicas para a mesma espécie de inseto, em que cada inseticida é expresso em níveis eficazes, seria outra maneira para alcançar o controle do desenvolvimento de resistência. Isso tem base no princípio de que a evolução de resistência contra dois modos separados de ação é muito mais improvável que apenas um. Roush, por exemplo, destaca estratégias com duas toxinas, também chamadas de "formação de pirâmide"ou "empilhamento" para o gerenciamento de culturas transgênicas inseticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:1777 a 1786). O empilhamento ou formação de pirâmide de duas proteínas diferentes, cada uma eficaz contra as pragas-alvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir uso de um refúgio menor. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos exige significativamente menos refúgio estruturado (geralmente 5%) de milho não Bt a ser plantado em relação aos produtos de traço único (geralmente 20%). Há várias maneiras para fornecer os efeitos de IRM de um refúgio, incluindo vários padrões de plantio geométricos nos campos e misturas de semente em bolsas, conforme discutido adicionalmente por Roush.

[0306] Em algumas modalidades, os polipeptídeos IPD073 da revelação são úteis como uma estratégia de gerenciamento de resistência a inseto em combinação (isto é, em pirâmide) com outras proteínas pesticidas incluem, mas sem limitação, toxinas Bt, proteínas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Photorhabdus sp. e semelhantes.

[0307] São fornecidos os métodos para controlar infestação (ou infestações) de insetos de Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica que promovem gerenciamento de resistência a inseto que compreendem expressar na planta pelo menos duas proteínas inseticidas diferentes que têm modos diferentes de ação.

[0308] Em algumas modalidades, os métodos de controle da infestação de inseto do tipo Lepidópteros e/ou Coleóptera em uma planta transgênica e de promover o gerenciamento de resistência a inseto compreendendo expressar na planta pelo menos duas proteínas inseticidas diferentes que têm diferentes modos de ação, em que pelo menos uma das proteínas inseticidas compreendem um polipeptídeo IPD073 inseticida aos insetos na ordem Lepidópteros e/ou Coleóptera.

[0309] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de inseto do tipo Lepidópteros e/ou Coleóptera em uma planta transgênica e de promover gerenciamento de resistência a inseto compreendendo expressar na planta pelo menos duas proteínas inseticidas diferentes que têm diferentes modos de ação, em que pelo menos uma das proteínas inseticidas compreende um polipeptídeo IPD073 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, SEQ ID NO: 571 ou variantes das mesmas, inseticidas para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera.

[0310] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de inseto Lepidóptera e/ou Coleóptera em uma planta transgênica e de promoção de gerenciamento de resistência a insetos compreendem expressar na planta transgênica um polipeptídeo IPD073 e uma proteína Cry inseticida para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera que têm diferentes modos de ação.

[0311] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de inseto Lepidóptera e/ou Coleóptera em uma planta transgênica e de promoção de gerenciamento de resistência a insetos compreendem na planta transgênica um polipeptídeo IPD073 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, SEQ ID NO: 571 ou variantes das mesmas e uma proteína Cry inseticida para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera que têm diferentes modos de ação.

[0312] Também são fornecidos métodos de redução da probabilidade de emergência de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros para plantas transgênicas que se expressam nas plantas as proteínas inseticidas para controlar as espécies de inseto, compreendendo a expressão de um polipeptídeo IPD073 inseticida para as espécies de inseto em combinação com uma segunda proteína inseticida para as espécies de inseto que têm diferentes modos de ação.

[0313] Também são fornecidos meios para o gerenciamento de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros eficaz de plantas transgênicas compreendendo coexpressar em altos níveis nas plantas duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas para insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros, mas cada uma exibe um modo diferente de efetuar sua atividade de extermínio, em que as duas ou mais proteínas inseticidas compreendem um polipeptídeo IPD073 e uma proteína Cry. Também são fornecidos meios para o gerenciamento de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros eficaz de plantas transgênicas compreendendo coexpressar em altos níveis nas plantas duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas para insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros, sendo que cada uma exibe um modo diferente de efetuar sua atividade de extermínio, em que as duas ou mais proteínas inseticidas compreendem um polipeptídeo IPD073 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, SEQ ID NO: 571 ou variantes das mesmas e uma proteína Cry.

[0314] Além disso, os métodos são fornecidos para obter aprovação regulamentar para o plantio ou comercialização de plantas que expressam proteínas inseticidas para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera, compreendendo a etapa de se referir a, apresentar ou confiar em dados de ligação de ensaio de inseto que mostram que o polipeptídeo IPD073 não compete com os sítios de ligação para proteínas Cry em tais insetos. Além disso, os métodos são fornecidos para obter aprovação regulamentar para o plantio ou a comercialização de plantas que expressam proteínas inseticidas para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera, compreendendo a etapa de se referir a, apresentar ou confiar em dados de ligação de ensaio de inseto que mostram que o polipeptídeo IPD073 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 292 a 568, SEQ ID NO: 571 ou variante das mesmas não competem com locais de ligação para proteínas Cry em tais insetos.

Métodos para Aumentar o Rendimento de Planta

[0315] Os métodos para aumentar o rendimento de planta são fornecidos. Os métodos compreendem fornecer uma planta ou célula de planta que expressa um polinucleotídeo codificador da sequência de polipeptídeo pesticida revelada no presente documento e cultivar a planta ou uma semente da mesma em um campo infestado com uma praga contra a qual o polipeptídeo tem atividade pesticida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem atividade pesticida contra uma praga de Lepidópteros, Coleópteros, Diptera, Hemiptera ou nemátodos e o campo é infestado com uma praga de Lepidópteros, Hemiptera, Coleópteros, Diptera ou nemátodos.

[0316] Conforme definido no presente documento, o "rendimento" da planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. "Biomassa", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer produto de planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhora no rendimento do produto de planta medido. Aumentar o rendimento de planta tem diversas aplicações comerciais. Por exemplo, aumentar a biomassa de folha de planta pode aumentar o rendimento de vegetais com folhas para consumo humano ou animal. Adicionalmente, o aumento de biomassa de folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de planta. Um aumento em rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas sem limitação, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos de 30%, pelo menos de 50%, pelo menos de 70%, pelo menos de 100% ou um aumento maior em rendimento em comparação a uma planta que não expressa a sequência pesticida.

[0317] Em métodos específicos, o rendimento de planta é aumentado como resultado de resistência a praga aprimorada de uma planta que expressa um polipeptídeo IPD073 revelado no presente documento. A expressão do polipeptídeo IPD073 resulta em uma capacidade reduzida de uma praga infestar ou se alimentar da planta aprimorando, assim, o rendimento da planta.

Métodos de Processamento

[0318] São adicionalmente fornecidos métodos de processamento de uma planta, parte de planta ou semente para obter um alimento ou produto alimentício a partir de uma planta, parte de planta ou semente que compreende um polipeptídeo IPD073. As plantas, partes de planta ou sementes fornecidas no presente documento podem ser processadas para render óleo, produtos de proteína e/ou subprodutos que são derivados obtidos pelo processamento que têm valor comercial. Os exemplos não limitantes incluem sementes transgênicas que compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD073 que pode ser processado para produzir óleo de soja, produtos de soja e/ou subprodutos de soja.

[0319] "Processar" se refere a quaisquer métodos físicos e químicos usados para obter qualquer produto de soja e incluem, mas sem limitação, o condicionamento térmico, floculação e moagem, extrusão, extração de solvente ou embebição aquosa e extração de sementes inteiras ou parciais.

[0320] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração e não como limitação.

EXPERIMENTOS Exemplo 1: Identificação de uma proteína inseticida ativa contra Lagarta-da-raiz do milho (WCRW) da cepa LBV2669

[0321] A proteína ativa IPD073Aa de WCRW (Diabrotica virgifera) (SEQ ID NO: 2) foi identificada por meio de purificação de proteína, espectrometria de massa por cromatografia líquida (LC-MS/MS) e clonagem de PCR da cepa de Pseudomonas chlororaphis LBV2669 conforme segue:

[0322] A cepa Pseudomonas LBV2669 foi cultivada em meio ISP-2 (Extrato de levedura 4,0 g/l, extrato de malte 10,0 g/l, dextrose 4,0 g/l) por 2 dias a 25 °C e 250 rpm. As células foram colhidas por meio de centrifugação e os péletes de célula foram lavados uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes do armazenamento a -70 °C. Para a purificação, as células foram descongeladas e ressuspensas em 25 mM de tampão de Tris, pH 8 (tampão A) que contém coquetel de inibidor de protease V da CalBiochem. Um lisato limpo cru foi obtido passando-se as células através de um homogeneizador a 206,84 MPa (30.000 psi), seguido pela centrifugação a 13.800 x g por 20 min. O sobrenadante foi carregado para uma coluna de HQ POROS® (troca de cátions, Life Technologies) e eluído com um gradiente linear para 0,5 M de NaCl em Tampão A. As frações foram dessalgadas e submetidas à identificação de atividade inseticida. As frações ativas foram agrupadas e o sulfato de amônio foi adicionado a uma concentração de 1 M. As proteínas foram adicionalmente separadas em uma coluna de Fenila-HP (cromatografia de interação hidrofóbica, GE Healthcare), que foi equilibrada em tampão A, contendo 1 M de sulfato de amônio. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de 1 M a 0 M de sulfato de amônio em tampão A. Após dessalgamento, as funções ativas foram identificadas em ensaios de alimentação de inseto com dieta artificial. A purificação adicional foi obtida por meio de cromatografia de troca de ânion de alta resolução com o uso de coluna Mono Q® (GE Healthcare) e um gradiente de sal linear de 0 a 500 mM de NaCl em tampão A.

[0323] As frações ativas altamente enriquecidas foram analisadas por meio de SDS-PAGE. A banda de proteína candidata foi removida, digerida com tripsina e analisada por meio de cromatografia nano-líquida/espectrometria de massa em tandem por eletroaspersão (nano-LC/ESI-MS/MS) em um espectrômetro de massa Orbitrap Thermo Q Exactive™ (Thermo Fisher Scientific) interfaceado com um sistema nano-Ic Eksigent NanoLC 1-D Plus (AB Sciex, Framingham, MA 01701, EUA). Então, os espectros de íon de produto foram coletados em um modo de aquisição dependente de dados após uma varredura de pesquisa MS1.

[0324] A identificação de proteína foi realizada por meio de buscas em banco de dados com o uso do software Mascot (Matrix Science, Boston, MA 02110, EUA). A pesquisa contra o banco de dados interno, que combina sequências de proteína bacteriana interna, e banco de dados de proteína SWISS-PROT identificou um gene novo codificado pela cepa LBV2669, que foi projetada como IPD073Aa (SEQ ID NO: 1).

[0325] Os bioensaios de WCRW foram conduzidos com o uso de amostras de 10 microlitros de lisato celular misturadas com dieta de WCRW de baixo derretimento derretida (Southland Products Inc., Lake Village, Arkansas) em um formato de 96 cavidades. Neonatos de Diabrotica virgifera virgifera foram colocados em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades. O ensaio foi executado por quatro dias a 25 °C e, então, classificado quanto à mortalidade de inseto e atrofia de crescimento de inseto. As classificações foram indicada como mortos, severamente atrofiado (pouco ou nenhum crescimento, porém vivo), atrofiado (crescimento até segundo instar, mas não equivalente aos controles) ou nenhuma atividade.

[0326] O DNA genômico da cepa LBV2669 foi extraído com um Kit de Extração de DNA Genômico Bacteriano Sigma (n° Cat NA2110-KT, Sigma-Aldrich, Caixa Postal 14508, St. Louis, MO 63178) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de DNA foi determinada com o uso de um Espectrofotômetro NanoDrop™ (Thermo Scientific, 3411 Silverside Road, Bancroft Building, Suite 100, Wilmington, DE 19810) e o DNA genômico foi diluído para 40ng/ul com água estéril. Uma reação de PCR de 25 ul foi definida combinando-se 80 ng de DNA genômico, 2 ul (5 uM) de iniciadores de DNA ribossômico 16S TACCTTGTTACGACTT (SEQ ID NO: 572) e AGAGTTTGATCMTGGCTCAG (SEQ ID NO: 573), 1 ul de dNTP a 10cmM, 1x tampão Phusion® HF, e 1 unidade de DNA Polimerase de Fidelidade Alta Phusion® (New England Biolabs, n° Cat M0530L, 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723). A reação de PCR foi executada no Termociclador MJ Research PTC-200 (Bio-Rad Laboratories, Inc., 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, Califórnia, 94547, EUA) com o programa a seguir: 96 °C durante 1 min; 30 ciclos de 96 °C durante 15 segundos, 52 °C durante 2 minutos e 72 °C durante 2 minutos; 72 °C durante 10 minutos; e permanecer em 4°C. Os produtos de PCR foram purificados com o Kit de purificação de DNA Qiaquick® (n° Cat 28104, QIAGEN Inc., 27220 Turnberry Lane, Valencia, CA 91355). A amostra de PCR purificada foi sequenciada em DNA e a sequência de DNA ribossômico 16S resultante foi buscada por BLAST no banco de dados de NCBI que indicou que LBV2669 é uma cepa Pseudomonas chlororaphis.

[0327] O DNA genômico da cepa LBV2669 isolada também foi preparado de acordo com um protocolo de construção de biblioteca desenvolvido por Illumina e sequenciado com o uso do Analisador de Genoma IIx Illumina®. As sequências contíguas de ácido nucleico foram montadas e quadros de leitura aberta foram gerados.

Exemplo 2: Identificação de homólogos de IPD073Aa

[0328] Identidades de gene podem ser determinadas por condução de buscas com BLAST (Basic Local Alignment 20 Search Tool; Altschul, et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403 a 410; consultar também ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) sob parâmetros padrão por similaridade com sequências contidas no banco de dados “nr” BLAST comercialmente disponível (que compreende todas as traduções CDS de GenBank não redundantes, sequências derivadas do Banco de Dados de Proteína Brookhaven de estrutura tridimensional, o último grande lançamento do banco de dados de sequência de proteína SWISS-PROT 25, bancos de dados EMBL e DDBJ. Além dos bandos de dados públicos, os bancos de dados internos foram buscados. A sequência de polinucleotídeo SEQ ID NO 1: foi analisada. A Tabela 1 mostra os homólogos de polipeptídeo IPD073Aa e suas origens. A Tabela 2 mostra o percentual de identidade de sequência de aminoácidos dos homólogos de polipeptídeo IPD073. Tabela 1 Tabela 2

Exemplo 3: Expressão de E. coli de IPD073Aa e proteínas homólogas

[0329] O gene IPD073Aa (SEQ ID NO: 1) foi amplificado por meio de PCR com o uso de DNA genômico isolado da cepa LBV2669 com o uso do iniciador direto e o iniciador reverso mostrados na Tabela 3. O produto de PCR resultante foi a sequência de DNA verificada e clonada para pET24 (Novagen) no quadro com uma etiqueta His de terminal C para purificação. O gene (SEQ ID NO: 3) que codifica IPD073Ab foi clonado em pET24, com o uso de preparação de DNA genômico da cepa interna LBV6019 como um modelo para amplificação de gene por meio de PCR com o uso de sequências de iniciador mostradas na Tabela 3. IPD073Ca (SEQ ID NO: 6) e IPD073Ea (SEQ ID NO: 14) foram identificados a partir do banco de dados de sequência de NCBI e seus genes (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 13, respectivamente) foram obtidas através da síntese incluindo extremidades 5' e 3'compatíveis para a clonagem a jusante para pET24. Tabela 3

[0330] O DNA plasmidial pET24, contendo o respectivo inserto de gene IPD073, foi transformado em células de E. coli BL21-DE3 competentes para a expressão de proteína recombinante. As células de E. coli foram cultivadas de um dia para o outro a 37 °C com seleção de Canamicina a 40 ug/ml e, então, inoculadas para um meio 2xYT fresco (1:25) e adicionalmente cultivadas para uma densidade óptica de cerca de 0,8. Nesse ponto, as células foram resfriadas na presença de 1 mM de ITPG e adicionalmente cultivadas a 16 °C por 16 horas para induzir a expressão de proteína. As proteínas expressas por E. coli foram purificadas por meio de cromatografia de íons metálicos imobilizados com o uso de Ni-NTA agarose (Qiagen®, Alemanha) de acordo com os protocolos do fabricante.

Exemplo 4: Atividade inseticida de IPD073Aa e proteínas homólogas

[0331] Uma série de concentrações do IPD073Aa purificado (SEQ ID NO: 2), IPD073Ab (SEQ ID NO: 4), IPD073Ca (SEQ ID NO: 6), IPD073Cb (SEQ ID NO: 8) e IPD073Ea (SEQ ID NO: 14) as proteínas foram testadas contra espécies Coleóptera, Lepidóptera e Hemíptera (Lygus hespera). As concentrações para inibição de 50% dos indivíduos (IC50) foram calculadas em dois experimentos independentes. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

[0332] Para medir as atividades inseticidas contra WCRW (Diabrotica virgifera) os bioensaios foram conduzidos com o uso de 10 ul das amostras de proteína purificada misturadas com 50 ul de dieta de WCRW artificial (baseado em Bio-Serv F9800B) em cada placa de bioensaio de 96 cavidades (BD Falcon 353910). Um número variável de neonatos de Diabrotica virgifera (3 a 9) foram colocados em cada cavidade da placa de 96 cavidades. O ensaio foi executado por quatro dias a 25 °C sem luz e, então, classificado quanto à mortalidade e atrofia.

[0333] As sensibilidades à SCRW (Diabrotica undecimpunctata howardi), lagarta-da-raiz do milho do norte (NCRW, Diabrotica barberi) besouro de San Antonio (Diabrotica speciosa) foram avaliadas de maneira semelhante. 10 ul das amostras de proteína purificada foram misturados com 50 ul de dieta de SCRW artificial (com base em Bio-Serv F9800B) em cada placa de bioensaio de 96 cavidades (BD Falcon 353910). Um número variável (3 a 5) de neonatos de qualquer espécie Diabrotica foi colocado em cada cavidade da placa de 96 cavidades. O ensaio foi executado por quatro dias a 25 °C sem luz e, então, classificado quanto à mortalidade e atrofia.

[0334] Os ensaios de alimentação de Lepidóptera foram conduzidos em uma dieta artificial em uma configuração de placa de 96 cavidades. A proteína purificada foi incorporada com a dieta artificial específica a Lepidóptero em uma razão de 10 ul de proteína e 40 ul de mistura de dieta. Duas a cinco larvas neonatas foram colocadas em cada cavidade para se alimentar ad libitum por 5 dias. Resultados foram expressos como positivos para as reações de larvas tais como atrofia e ou mortalidade. Os resultados foram expressos como negativos quando as larvas foram similares ao controle negativo que tem dieta de alimentação na qual apenas o tampão acima foi aplicado.

[0335] As proteínas IPD073 foram ensaiadas em broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta-de-espiga de milho (Helicoverpa zea), lagarta-rosca preta (Agrotis ipsilon), lagarta-militar de outono (Spodoptera frugiperda) e Falsa- medideira de soja (Pseudoplusia includens). Nenhuma das proteínas IPD073 mostrou atividade contra pragas Lepidópteras nas concentrações testadas. Tabela 4

Exemplo 5: Ausência de Resistência Cruzada de IPD073Aa em cepa resistente a mCry3A de WCRW

[0336] A cepa de WCRW resistente a mCry3A foi desenvolvida por seleções de WCRW em plantas de maís transgênico de mCry3A com nível de expressão T0 de mCry3A a >10.000 ppm de proteínas totais em raízes. Sete seleções foram feitas nas larvas F3, F6, F7, F8, F10, F12, F14. Os ovos de F16 de insetos resistentes a Cry3A tiveram uma razão de resistência (RR) de >46 vezes para mCry3A em comparação com a colônia de laboratório suscetível e foram usados para testar resistência cruzada de IPD073Aa (SEQ ID NO: 2). Bioensaios de incorporação de dieta de WCRW padronizados foram utilizados para avaliar os efeitos de IPD073Aa (SEQ ID NO: 2) em larvas de WCRW. As larvas neonatas de WCRW foram colocadas nas placas que contêm a dieta de bioensaio e proteína inseticida com 4 réplicas para cada tratamento de concentração por 3 dias depois da iniciação de cada bioensaio. A mortalidade de inseto e a atrofia grave foram classificadas e usadas para calcular concentrações inibidoras (IC50 e LC50) com base em análises de probabilidade. A razão de resistência (RR) foi calculada conforme a seguir: RR = (LC/IC50 de WCRW resistente) / (LC/IC50 de WCRW suscetível). Conforme mostrado na Tabela 5, os insetos WCRW resistentes a Cry3A eram sensíveis a IPD073Aa (SEQ ID NO: 2). Tabela 5

Exemplo 6: Transformação Estável Mediada por Agrobacterium de Maís

[0337] Para a transformação de maís mediada por Agrobacterium com IPD073Aa (SEQ ID NO: 1), o método de Zhao foi empregado (Patente no US 5.981.840 e Publicação de Patente Internacional no WO 1998/32326, cujos conteúdos são incorporados ao presente documento a título de referência). Brevemente, os embriões imaturos foram isolados do maís e os embriões foram colocados em contato com uma Suspensão de Agrobacterium, em que as bactérias tinham capacidade de transferir um IPD073a para pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nessa etapa os embriões imaturos foram imersos em uma suspensão de Agrobacterium para a iniciação de inoculação. Os embriões foram cocultivados por um tempo com o Agrobacterium (etapa 2: a etapa de cocultivar). Os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para a eliminação de Agrobacterium e para uma fase de repouso para as células infectadas. Em seguida, embriões inoculados foram cultivados em meio que contém um agente seletivo e o cultivo de calo transformado é recuperado (etapa 4: etapa de selecionar). Os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido com um agente seletivo resultando no crescimento seletivo de células transformadas. O calo foi então regenerado em plantas (etapa 5: a etapa de regenerar), e os calos cultivados em meio seletivo foram cultivados em meio sólido para regenerar as plantas.

[0338] Para detecção da proteína IPD073Aa (SEQ ID NO: 2) em tecido de folha 4, punções/amostra de folha liofilizada foram pulverizadas e ressuspensas em 100 µl de PBS contendo 0,1% de Tween 20 (PBST), 1% de beta-mercaptoetanol contendo 1 tablete/7 ml de Mini inibidor de proteinase completo (Roche 1183615301). A suspensão foi sonicada por 2 min e depois centrifugada a 4 °C, 20.000 g por 15 min. A uma alíquota de sobrenadante, 1/3 de volume de Tampão de Amostra de 3X NuPAGE® LDS (Invitrogen™ (CA, EUA), 1% de B-ME contendo 1 tablete/7 ml de Mini inibidor de proteinase completo foi adicionado. A reação foi aquecida a 80 °C por 10 min e depois centrifugada. Uma amostra de sobrenadante foi carregada em 4 a 12% de géis BisTris Midi com tampão de execução MES conforme instruções do fabricante (Invitrogen™) e transferida para uma membrana de nitrocelulose com o uso de um aparelho iBlot® (Invitrogen™). A membrana de nitrocelulose foi incubada em PBST contendo 5% de leite desnatado em pó por 2 horas antes da incubação de um dia para o outro em anti-IPD073Aa de coelho com afinidade purificada em PBST de um dia para o outro. A membrana foi enxaguada três vezes com PBST e depois incubada em PBST por 15 min e depois duas vezes por 5 min antes de incubar por 2 horas em PBST com HRP-anti-coleho de cabra por 3 horas. As proteínas detectadas foram visualizadas com o uso de Reagentes de ECL Western Blotting (GE Healthcare cat # RPN2106) e filme MR de Kodak® Biomax®. Para detecção da proteínas IPD073Aa nas raízes, as raízes foram liofilizadas e 2 mg de pó por amostra foram ressuspensos em LDS, 1% de beta-mercaptoetanol contendo 1 tablete/7 ml de Mini inibidor de proteinase completo foi adicionado. A reação foi aquecida a 80° C por 10 min e depois centrifugada a 4 °C, 20.000 g por 15 min. Uma amostra de sobrenadante foi carregada em 4 a 12% de géis Bis-Tris Midi com tampão de execução MES conforme instruções do fabricante (Invitrogen™) e transferida para uma membrana de nitrocelulose com o uso de um aparelho iBlot® (Invitrogen™). A membrana de nitrocelulose foi incubada em PBST contendo 5% de leite desnatado em pó por 2 horas antes da incubação de um dia para o outro em anticorpo anti-IPD073Aa de coelho policlonal com afinidade purificada em PBST de um dia para o outro. A membrana foi enxaguada três vezes com PBST e depois incubada em PBST por 15 min e depois duas vezes 5 min antes da incubação por 2 horas em PBST com HRP-anti-coelho de cabra por 3 horas. As proteínas de ligação de anticorpo foram detectadas com o uso de Reagentes ECL™ Western Blotting (GE Healthcare cat # RPN2106) e filme MR Kodak® Biomax® MR.

[0339] As plantas de maís transgênicas positivas para expressão das proteínas inseticidas são testadas pela atividade pesticida com o uso de bioensaios padrão conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, bioensaios de remoção de raiz e bioensaios de planta total. Consulte, por exemplo, a Patente n° US 7.030.295 e Publicação Internacional Número WO 2003/018810.

Exemplo 7: Construto de Vetor de Expressão para expressão de IPD073Aa em plantas

[0340] O vetor de expressão de planta, PHP61755, foi construído para incluir um cassete de transgene contendo o gene IPD073Aa (SEQ ID NO: 569) sob controle do promotor BSV(AY)TR (patente no US 8338662 B2) em combinação com um elemento intensificador. Esse construto foi usado para gerar eventos de maís transgênico para avaliar a eficácia da planta contra a lagarta-da-raiz do milho.

[0341] Os resultados de eficácia T0 GH para eventos gerados a partir do PHP61755 são mostrados na Figura 2. A eficácia foi observada em relação aos eventos de controle negativo conforme medido por meio de proteção de raiz da lagarta- da-raiz do milho ocidental. A proteção de raiz foi medida de acordo com o número de nós de raízes danificados (CRWNIS = pontuação de danos ao nó por lagarta-de-raiz de milho) com o uso do método desenvolvido por Oleson, et al. (2005) [J. Econ Entomol. 98(1):1 a 8]. A classificação de lesão de raiz é medida de "0" a "3" com "0" indicando nenhuma lesão de raiz visível, "1" indicando 1 nós de dano de raiz, "2" indicando 2 nós ou dano de raiz, e "3" indicando um escore máximo de 3 nós de dano de raiz. As classificações intermediárias (por exemplo, 1,5) indicam frações adicionais de nós de dano (por exemplo, um nó e meio lesionados).

Exemplo 8: Criação de variantes embaralhadas de polipeptídeo IPD073 com múltiplas substituições de aminoácidos

[0342] Para criar variantes de polipeptídeo IPD073 com múltiplas substituições de aminoácidos, as bibliotecas variantes foram geradas por meio de embaralhamento de família (Chia-Chun J. Chang et al, 1999, Nature Biotechnology 17, 793 a 797) da codificação de polinucleotídeos IPD073Aa (SEQ ID NO: 2), IPD073Ab (SEQ ID NO: 4), IPD073Ca (SEQ ID NO: 6) e IPD073Ea (SEQ ID NO: 14). Dois tipos de bibliotecas foram produzidas. Na primeira biblioteca, IPD073Aa (SEQ ID NO: 1), IPD073Ab (SEQ ID NO: 3) e IPD073Ca (SEQ ID NO: 5) foram usadas como genes parentais. No segundo tipo de bibliotecas, IPD073Ab (SEQ ID NO: 4) ou IPD073Ca (SEQ ID NO: 5) foram usadas como cadeia principal original e as mutações foram introduzidas por meio de aumento de oligos de DNA que carregam diversidade de outros três homólogos de IPD073 (Stutzman-Engwall K. et al, 2005, Metabolic Engineering 7 (1) 27 a 37). Após a transformação das variantes da biblioteca em células de E. coli, as colônias atingiram o pico e foram cultivadas em placas de 96 poços para a expressão de proteína. Os lisatos celulares foram gerados por meio de Reagente de Extração de Proteína B-PER® de Thermo Scientific (3747 N Meridian Rd, Rockford, IL, EUA 61101) e triados para atividade inseticida de WCRW. As variantes ativas foram sequenciadas e as substituições de aminoácidos foram identificadas. Um total de 1702 variantes de biblioteca foram triados e as 277 variantes ativas foram recuperadas (Tabela 6). Tabela 6

[0343] A identidade de sequência de variantes ativas para IPD073Aa foi calculada com o uso do algoritmo Needleman-Wunsch, conforme implantado no programa de Needle (pacote de ferramentas EMBOSS). O percentual de identidade em comparação com IPD073Aa (SEQ ID NO: 2), número de variantes identificado em cada nível de percentual de identidade, e a designação de variante são resumidos na Tabela 7. Tabela 7

Exemplo 9: Transformação e Regeneração de Soja (máx de Glicina)

[0344] As linhagens de soja transgênica são geradas pelo método de bombardeamento por pistola de partículas (Klein et al., Nature (London) 327:70 a 73 (1987); Patente n° US 4.945.050) com o uso de um instrumento BIORAD Biolistic PDS1000/He e DNA plasmidial ou de fragmento. As soluções de estoque e meios são usados para a transformação e regeneração de plantas de soja:

Soluções de estoque:

[0345] Estoque de Sulfato 100 X: 37,0 g de MgSO4.7H2O, 1,69 g de MnSO4.H2O, 0,86 g de ZnSO4.7H2O, 0,0025 g de CuSO4.5H2O

[0346] Estoque de Haletos 100 X: 30,0 g de CaCl2.2H2O, 0,083 g de KI, 0,0025 g de CoCl2.6H2O

[0347] Estoque de P, B, Mo 100X: 18,5 g KH2PO4, 0,62 g de H3BO3, 0,025 g de Na2MoO4.2H2O

[0348] Estoque de Fe EDTA 100X: 3,724 g de Na2EDTA, 2,784 g de FeSO4.7H2O

[0349] Estoque de 2,4-D: 10 mg/ml de Vitamina

[0350] Vitaminas B5, Estoque 1000X: 100,0 g de mio-inositol, 1,0 g de ácido nicotínico, 1,0 g de piridoxina HCl, 10 g de tiamina.HCL.

Meios (por litro):

[0351] Meio Sólido SB199: 1 pacote de sais de MS (Gibco/ BRL - n° de Cat. 11117-066), 1 ml de vitaminas B5 estoque 1000X, 30g de Sacarose, 4 ml de 2, 4-D (40 mg/l de concentração final), pH 7,0, 2 gm de Gelrita

[0352] Meio Sólido SB1: 1 pacote de sais de MS (Gibco/ BRL - n° de Cat. 11117-066), 1 ml de vitaminas B5 estoque 1000X, 31,5 g de Glicose, 2 ml de 2, 4-D (20 mg/l concentração final), pH 5,7, 8 g de TC ágar

[0353] SB196: 10 ml de cada uma das soluções de estoque acima 1-4, 1 ml de estoque de Vitamina B5, 0,463 g de (NH4)2 SO4, 2,83 g de KNO3, 1 ml de estoque 2,4 D, 1 g de asparagina, 10 g de Sacarose, pH 5,7

[0354] SB71-4: Sais B5 de Gamborg, 20 g de sacarose, 5 g de TC ágar, pH 5,7.

[0355] SB103: 1 pacote de mistura de sais de Murashige e Skoog, 1 ml de estoque de Vitamina B5, 750 mg de hexa-hidrato de MgCl2, 60 g de maltose, 2 g de gelrita, pH 5,7.

[0356] SB166: SB103 complementado com 5 g por litro de carvão vegetal ativado. IniciaçãodeCulturaemSuspensãoEmbriogênicadaSoja:

[0357] As vagens com sementes imaturas de plantas de soja disponíveis 45 a 55 dias após o plantio são colhidas, removidas de suas cascas e colocadas em uma caixa de magenta esterilizada. As sementes de soja são esterilizadas agitando-se as mesmas por 15 min em uma solução de 5% de Clorox® com 1 gota de sabão Ivory™ (isto é, 95 ml de água destilada autoclavada mais 5 ml de Clorox® e 1 gota de sabão, bem misturadas). As sementes são enxaguadas com o uso de 2 l de água destilada e aqueles menos de 3 mm são colocados em lâmina de microscópio individuais. A extremidade menor da semente é cortada e os cotilédones são pressionados para fora do revestimento das sementes. Os cotilédones são transferidos para as plantas que contêm meio SB199 (25 a 30 cotilédones por placa) por 2 semanas, então, transferidas para SB1 por 2 a 4 semanas. As placas foram enroladas com fita de fibra. Após esse tempo, os embriões secundários são cortados e colocados em meio líquido SB196 por 7 dias.

Condições de cultivo:

[0358] As culturas de suspensão embriogênica da soja (conforme 93Y21) foram mantidas em 50 ml de meio líquido SB196 em um agitador giratório, 100 a 150 rpm, 26 °C em fotoperíodo de 16:8 h dia/noite em intensidade de luz de 80 a 100 µE/m2/s. As culturas são subcultivadas a cada 7 a 14 dias por meio de inoculação até a quantidade de tecido do tamanho de ^ moeda de dez centavos (nódulos agrupados juntos) em 50 ml de líquido fresco SB196.

Preparação de DNA para Bombardeamento:

[0359] Em procedimentos de bombardeamento por pistola de partículas, é possível usar 1) todo o DNA plasmidial purificado; ou 2) fragmentos de DNA contendo apenas o cassete (ou cassetes) de expressão de DNA recombinante de interesse. Para cada uma das dezessete transformações de bombardeamento, 85 µl de suspensão são preparados contendo 1 a 90 picogramas (pg) de DNA plasmidial por par básico de cada plasmídeo de DNA. Os plasmídeo de DNA ou fragmentos são coprecipitados em partículas de ouro conforme segue. Os DNAs em suspensão são adicionados à 50 µl de uma suspensão de partículas de ouro de 10 a 60 mg/ml 0,6 µm e, então, combinados com 50 µl de CaCl2 (2,5 M) e 20 µl de espermidina (0,1 M). A mistura é submetido a vórtice por 5 s, girada em uma microcentrífuga por 5 s, e o sobrenadante foi removido. As partículas revestidas de DNA são, então, lavadas uma vez com 150 µl de 100% de etanol, submetidas a vórtice e giradas em uma microcentrífuga novamente, então, ressuspensas em 85 µl de etanol anidro. Cinco µl das partículas de ouro revestido de DNA são, então, carregadas em cada disco de macrocarreador.

Preparação de Tecido e Bombardeamento com DNA:

[0360] Aproximadamente 100 mg de cultura de suspensão de duas semanas de idade são colocados em uma placa de petri de 60 mm X 15 mm vazia e o líquido residual foi removido do tecido com o uso de uma pipeta. O tecido é colocado em cerca de 8,89 cm (3,5 polegadas) distante da peneira de retenção e cada placa de tecido é bombardeada uma vez. A pressão de ruptura de membrana é definida a 4,48 MPa (650 psi) e a câmara é evacuada para -71,12 cm (-28 polegadas) de Hg. Seguindo-se o bombardeamento, o tecido de cada placa é dividido entre dois frascos, colocados de volta no meio líquido e cultivados conforme descrito acima. SeleçãodeEmbriõesTransformadoseRegeneraçãodePlanta:

[0361] Após bombardeamento, o tecido de cada placa bombardeada é dividido e colocado em dois frascos de meio de manutenção de cultura de líquido SB196 por placa de tecido bombardeado. Sete dias pós bombardeamento, o meio líquido em cada frasco é substituído por meio de manutenção de cultura de SB196 fresco complementado com 100 ng/ml de agente seletivo (meio de seleção). Para a seleção de células de soja transformadas o agente seletivo usado pode ser um composto de sulfonilureia (SU) com o nome químico, 2-cloro-N-((4-metoxi-6 meti-1,3,5-triazina- 2-il)aminocarbonil) benzenossulfonamida (nomes comuns: DPX- W4189 e clorossulforon). O clorossulfuron é o ingrediente ativo no herbicida de sulfonilureia da DuPont, GLEAN®. O meio de seleção contendo SU é substituído a cada duas semanas por 8 semanas. Após o período de seleção de 8 semanas, as ilhas de tecido transformado verde são observadas crescendo a partir de agrupamentos embriônicos necróticos não transformados. Os eventos transgênicos putativos são isolados e mantidos em meio líquido SB196 com SU a 100 ng/ml por mais 5 semanas com alterações de meios a cada 1 a 2 semanas para gerar culturas de suspensão embriogênica novas, propagadas em termos de clonagem e transformadas. Os embriões permaneceram em contato com SU um total de cerca de 13 semanas. As culturas de suspensão são subcultivadas e mantidas como agrupamentos de embriões imaturos e também regenerados em plantas totais por meio de maturação e germinação de embriões somáticos individuais.

[0362] Os embriões somáticos se tornaram adequados para a germinação após quatro semanas em meio de maturação (1 semana em SB166 seguido por 3 semanas em SB103). Os mesmos são, então, removidos do meio de maturação e secos em placa de petri vazias por até sete dias. Os embriões secos são, então, plantados em meio SB71-4 em que são permitidos a germinar sob a mesma luz e condições de temperatura conforme descrito acima. Os embriões germinados são transferidos para o meio de plantio em potes e cultuados até a maturidade para produção de semente.

[0363] Deve ser entendido que esta revelação não é limitada à metodologia, protocolos, linhagens celulares, gêneros e reagentes particulares descritos, visto que os mesmos podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento tem o propósito de descrever apenas as modalidades particulares e não é destinada a limitar o escopo da presente revelação.

[0364] Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, a referência a "uma célula"inclui uma pluralidade de tais células e a referência a "a proteína"inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes das mesmas conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta revelação pertence, a menos que claramente indicado de outro modo.

[0365] A descrição acima de várias modalidades ilustradas da revelação não pretende ser exaustiva ou limitar o escopo à forma precisa revelada. Embora modalidades específicas e exemplos sejam descritos no presente documento com propósitos de ilustração, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da revelação, como aqueles indivíduos versados na técnica relevante reconhecerão. Os ensinamentos fornecidos no presente documento podem ser aplicados com outros propósitos, diferentes daqueles dos exemplos descritos acima. Diversas modificações e variações são possíveis a luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicações anexas.

[0366] Essas e outras mudanças podem ser feitas a luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados como limitantes para as modalidades específicas reveladas no relatório descritivo e nas reivindicações.

[0367] Toda a revelação de cada documento citado (o que inclui patentes, pedidos de patente, artigos de periódico, resumos, manuais, livros e outras revelações) nos Antecedentes da Técnica, Descrição Detalhada e Exemplos é incorporada ao presente documento a título de referência em suas totalidades.

[0368] Esforços foram feitos para garantir precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, concentrações, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser permitidos. A não ser que indicado de outro modo, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio; a temperatura está em graus centígrados; e a pressão está em ou próxima à atmosférica.

Claims (20)

1. Polipeptídeo IPD073 isolado caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 407, 409, 411, 421, 422, 427, 431-435, 443, 444, 447, 451, 454, 455, 463, 471, 474, 475, 486, 492, 493, 510, 516, 527, 535, 536, 541, 545, 547, 550, 555, 559, 560, 563, 564, 567, ou 568, ligado a uma sequência sinal heteróloga ou a uma sequência de trânsito heteróloga.

2. Polipeptídeo IPD073 isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo IPD073 tem atividade inseticida contra uma espécie de Diabrotica.

3. Polipeptídeo IPD073 isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a espécie de Diabroticaé selecionada dentre Diabrotica virgifera, Diabrotica undecimpunctata howardi, Diabrotica barberi e Diabrotica speciosa.

4. Polinucleotídeo recombinante caracterizado pelo fato de que possui a sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 130, 132, 134, 144, 145, 150, 154-158, 166, 167, 170, 174, 177, 178, 186, 194, 197, 198, 209, 215, 216, 233, 239, 250, 258, 259, 264, 268, 270, 273, 278, 282, 283, 286, 287, 290, ou 291ou um degenerado da mesma que codifica o polipeptídeo IPD073 selecionado dentre a SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 407, 409, 411, 421, 422, 427, 431-435, 443, 444, 447, 451, 454, 455, 463, 471, 474, 475, 486, 492, 493, 510, 516, 527, 535, 536, 541, 545, 547, 550, 555, 559, 560, 563, 564, 567, ou 568, respectivamente, em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um elemento regulatório heterólogo.

5. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é um polinucleotídeo não genômico.

6. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que tem códons otimizados para a expressão em uma cultura agricolamente importante.

7. Célula hospedeira microbiana caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 4, em que a referida célula é bacteriana.

8. Método de obtenção de uma célula hospedeira transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula hospedeira com o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 4; e (b) cultivar a referida célula hospedeira transformada sob condições de crescimento de célula hospedeira.

9. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 4, operacionalmente ligado a um elemento regulatório heterólogo.

10. Composição caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo IPD073, conforme definido na reivindicação 1 e pelo menos um segundo componente selecionado dentre: adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, aprimoradores de pegajosidade e ligantes.

11. Método para controlar uma população de praga de inseto caracterizado pelo fato de que compreende colocar a população de praga de inseto em contato com o polipeptídeo IPD073, conforme definido na reivindicação 1.

12. Método de inibição de crescimento ou de extermínio de uma praga de inseto caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato a praga de inseto com uma composição que compreende o polipeptídeo IPD073, conforme definido na reivindicação 1.

13. Método de controle de uma infestação de insetos de Coleópteros em uma planta transgênica ou cultura caracterizado pelo fato de que compreende expressar na planta um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IPD073, conforme definido na reivindicação 1.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o inseto ou a população de inseto é resistente a pelo menos uma toxina Bt.

15. Uso do polipeptídeo IPD073, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para inibir o crescimento ou extermínio de um inseto ou uma população de inseto.

16. Método de obtenção de uma planta transgênica caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula de planta com o construto de DNA conforme definido na reivindicação 9; (b) cultivar a referida célula de planta transformada sob condições de crescimento de célula de planta; e (c) regenerar uma planta transgênica a partir da referida célula de planta transformada.

17. Método de obtenção de uma célula de planta transgênica caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula de planta com o construto de DNA conforme definido na reivindicação 9; (b) cultivar a referida célula de planta transformada sob condições de crescimento de célula de planta.

18. Método para controlar uma população de praga de inseto caracterizado pelo fato de que compreende colocar a população de praga de inseto em contato com a planta transgênica, obtida pelo método conforme definido na reivindicação 16, ou com a célula de planta, conforme obtida pelo método na reivindicação 17.

19. Método de inibição de crescimento ou extermínio de uma praga de inseto caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato a praga de inseto com a planta transgênica, obtida pelo método conforme definido na reivindicação 16, ou com a célula de planta, obtida pelo método conforme definido na reivindicação 17.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o inseto ou a população de inseto é resistente a pelo menos uma toxina Bt.