BR122025012000A2 - Métodos para preparar l-glufosinato - Google Patents

Abstract

São fornecidos métodos para a produção de L-glufosinato (também conhecido como fosfinotricina ou ácido (S) -2-amino-4- (hidroxi (metil) fosfonoil) butanóico). Os métodos compreendem um processo de duas etapas. O primeiro passo envolve a desaminação oxidativa do D-glufosinato em PPO (ácido (2-oxo-4- (hidroxi (metil) fosfinoílo) butírico). O segundo passo envolve a aminação específica de PPO em L-glufosinato, utilizando um grupo amina de um ou mais dadores de amina. Combinando estas duas reações, a proporção de L-glufosinato em uma mistura de Lglufosinato e D-glufosinato pode ser substancialmente aumentada.

Description

REFERÊNCIA ÀS PEDIDOS PRIORITÁRIOS

[01] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. n° 62/302.421, depositado em 2 de março de 2016; Pedido Provisório U.S. n° 62/336.989, depositado em 16 de maio de 2016; e o Pedido Provisório U.S. N ° 62/413.240, depositado em 26 de outubro de 2016, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

CAMPO DE APLICAÇÃO

[02] São aqui descritos métodos para produzir um estereoisómero único de glufosinato, particularmente para a produção de L-glufosinato.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[03] O herbicida glufosinato é um herbicida não seletivo, aplicado na forma foliar, considerado um dos herbicidas mais seguros do ponto de vista toxicológico ou ambiental. Os métodos atuais de síntese química comercialpara o glufosinato produzem uma mistura racêmica de L- e D- glufosinato (Duke et al. 2010 Toxins 2:1943-1962). No entanto, o L-glufosinato (também conhecido como fosfinotricina ou ácido (S) -2-amino-4- (hidroxi (metil) fosfonoil) butanóico) é muito mais potente que o D- glufosinato. (Ruhland et al. (2002) Environ. Biosafety Res. 1:29-37).

[04] Portanto, são necessários métodos para produzir apenas ou principalmente a forma ativa de L-glufosinato. Anteriormente, métodos rentáveis para gerar L-glufosinato puro, ou uma mistura de D- e L-glufosinato enriquecida para L-glufosinato, não estavam disponíveis. São descritos aqui novos métodos de custo efetivo para a produção de L- glufosinato.

RESUMO

[05] Composições e métodos para produzir L-glufosinato são fornecidos. O primeiro passo do processo envolve a desaminação oxidativa do D-glufosinato em PPO (ácido 2-oxo-4- (hidroxi (metil) fosfinoil) butírico). O segundo passo envolve a aminação específica de PPO em L-glufosinato,utilizando um grupo amina de um ou mais dadores de amina. Em algumas formas de realização, o método envolve a reação de D- glufosinato com um D-aminoácido oxidase (DAAO) enzyma para formar PPO (ácido 2-oxo-4- (hidroxi (metil) fosfinoílo)butírico); seguido pela aminação da PPO ao L-glufosinato por uma enzima transaminase (TA), usando um grupo amina de um ou mais doadores de amina, em que ao menos 70% do D-glufosinatoé eliminado e/ou o rendimento de L-glufosinato é ao menos 85%do glufosinato racémico inserido ou ao menos 70 a 85% do D- glufosinato é convertido em L-glufosinato. Em algumas formasde realização, doador de amina não reagido de uma reação podeser reutilizado em outras rondas de reação. Opcionalmente, o D-glufosinato está originalmente presente (isto é, no passo de reação) em uma mistura racémica de D- e L-glufosinato.

[06] A enzima DAAO deve ter uma atividade aumentada de aproximadamente 3 μmol/min * mg ou mais para conduzir a reação. As enzimas DAAO estão disponíveis na técnica e podem ser modificadas ou transformadas para ter a necessária atividade aumentada necessária para conduzir o processo. Desta maneira, enzimas mutantes ou modificadas deR hodosporidium toruloides (UniProt P80324), Trigonopsis variabilis (UniProt Q99042), Neolentinus lepideus (GenBank KZT28066.1), Trichoderma reesei (GenBank XP_006968548.1), ou Trichosporon oleaginosus (KLT40252.1) podem ser usadas. Em algumas formas de realização, a enzima DAAO é um mutante DAAO com base na sequência de Rhodosporidium toruloides. Embora possam ser feitas e testadas via mutações quanto ao efeito naatividade, o DAAO mutante em algumas formas de realizaçãopode compreender mutações nas posições 54, 56, 58, 213 e/ou 238. Por exemplo, o mutante DAAO pode compreender uma ou mais das seguintes mutações na posição 54: N54C, N54L, N54T, ou N54V. O mutante DAAO pode opcionalmente compreender a seguinte mutação na posição 56: T56M. O mutante DAAO pode opcionalmente compreender uma ou mais das seguintes mutações na posição 58: F58A, F58G, F58H, F58K, F58N, F58Q, F58R, F58S, ou F58T. Opcionalmente, o mutante DAAO pode compreendera seguinte mutação na posição 213: M213S. Em algumas formas de realização, o mutante DAAO pode compreender uma ou mais das seguintes combinações de mutações: F58K e M213S; N54T e T56M; N54V e F58Q; e/ou N54V, F58Q e M213S. Em cada caso, a enzima precisa ter uma atividade igual ou maior que aproximadamente 3 umol/min * mg, maior que aproximadamente 4 umol/min * mg ou mais. Uma enzima do tipo selvagem pode ser utilizada nos métodos da invenção, desde que a enzima possua um nível de atividade como estabelecido acima.

[07] A enzima TA pode ser uma transaminase gabT de Escherichia coli (UniProt P22256). Alternativamente, a enzimaTA pode ser uma transaminase com a sequência identificadacomo SEQ ID NO: 1. A enzima TA também pode ser selecionadacom base na similaridade com SEQ ID NO: 1 e/ou mutado para melhorar sua atividade na reação desejada. Assim, sequências com 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, com base no método BLASTP de alinhamento, e reter a atividade de transaminase estão abrangidos pela presente invenção. Qualquer sequência de ADN que codifique a sequência enzimática de SEQ ID NO: 1 ou suas variantes tambémestão abrangidos pela presente invenção.

[08] A etapa de reação e a etapa de aminação podem ser realizadas em um único recipiente ou em recipientes separados. Em uma forma de realização, todos os reagentes são substancialmente adicionados no início da reação. Alternativamente, os reagentes para o passo de reação e os reagentes para o passo de aminação são adicionados ao recipiente único em momentos diferentes.

[09] É também aqui descrito um método para controlar seletivamente ervas daninhas em um campo contendo um cultivo de sementes plantadas ou cultivos que podem ser opcionalmente resistentes ao glufosinato, compreendendo a aplicação de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo L- glufosinato em um excesso enantiómico superior a 90% em relação à D- glufosinato no campo. É também aqui descrito um método para controlar seletivamente ervas daninhas em um campo, controlar ervas daninhas em outras áreas, desfolhar plantas ou cultivos, e/ou dessecado de cultivos antes da colheita, compreendendo a aplicação de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo L-glufosinato em um excesso enantiómico superior a 90% em relação à D-glufosinato e mais de 0,01%, mas menos de 15% PPO no campo

[0010] Os detalhes de uma ou mais formas de realização são apresentados nos desenhos e na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens serão evidentes a partirda descrição e desenhos e das reivindicações.

[0011] Algumas composições da invenção compreendem D- glufosinato, PPO e L-glufosinato. Em tais composições, L- glufosinato está presente em uma concentração igual ousuperior a 80%, superior a 90%, superior a 95%, superior a 96%, superior a 97%, superior a 98% ou superior a 99% em pesocomposição, com base no peso combinado de D-glufosinato, PPOe L-glufosinato. Outras composições compreendem o L- glufosinato em concentrações iguais a 80% ou maiores após o isolamento do L-glufosinato da presente mistura reacional.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] A Figura 1 é um esquema de uma conversão exemplarde D-glufosinato em L-glufosinato. O produto doador de amina e cetoácido são exemplos e não se destinam a ser limitativos.

[0013] A Figura 2 é um gráfico que mostra as concentrações de L-glufosinato (círculos), D-glufosinato (triângulos) e PPO (quadrados) durante uma de-racemização de um passo por uma variante mutante N54T, T56M, F58K e M213S de Rhodosporidium toruloides DAAO e a E. coli gabT transaminase.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0014] São fornecidas composições e métodos para a produção de L-glufosinato (também conhecido como fosfinotricina ou ácido (S) -2-amino-4- (hidroxi (metil) fosfonoil) butanóico). Os métodos compreendem um processo de duas etapas, que pode opcionalmente ocorrer em um único vaso e quase simultaneamente. O primeiro passo envolve a desaminação oxidativa do D- glufosinato em PPO Ácido (2-oxo-4-(hidroxi (metil) fosfinoílo) butírico). O segundo passo envolve a aminação específica de PPO em L-glufosinato, utilizando um grupo amina de um ou mais dadores de amina. Combinando estas duas reações, a proporção de L-glufosinato pode ser substancialmente aumentada em uma mistura racémica de glufosinato. Assim, são aqui fornecidos métodos para obter uma composição consistindo substancialmente de L-glufosinato. Uma vez que o L-glufosinato é mais potente que o D-glufosinato, são necessárias quantidades menores da composição para serem eficazes como um herbicida.

[0015] Em uma forma de realização, como a aqui descrita, é uma composição que compreende uma mistura de L-glufosinato, PPO e D-glufosinato, em que o L-glufosinato é o composto predominante entre a mistura de L-glufosinato, PPO e D- glufosinato. Tal composição pode ser utilizada diretamente como um herbicida como PPO pode contribuir atividade herbicida (EP0030424). Em outras formas de realização, o L- glufosinato pode ser purificado ou substancialmentepurificado e utilizado como herbicida.

[0016] As composições de L-glufosinato podem compreender D- glufosinato, PPO e L-glufosinato. Opcionalmente, a quantidade de L-glufosinato é 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, ou aproximadamente 95% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais com base no peso combinado de D-glufosinato, PPO e L- glufosinato. Opcionalmente, a quantidade de D-glufosinato é 10% ou menos, 5% ou menos, 2.5% ou menos, ou 1% ou menos com base no peso combinado de D-glufosinato, PPO e L-glufosinato. Opcionalmente, a quantidade de PPO é superior a 1% mas inferior a 20%, inferior a 15%, inferior a 10% ou inferior a 5%, com base no peso do D- glufosinato, do PPO e do L- glufosinato. Estas composições podem opcionalmente ocorrer como pós secos ou dissolvidos em veículo aquoso ou não aquoso e podem estar opcionalmente presentes espécies químicas adicionais . 7/69 Opcionalmente, a composição é preparada e usada em um ambiente ex vivo.

[0017] Reconhece-se também que o L-glufosinato pode ser ainda isolado e utilizado em formulações como um herbicida.

[0018] Também se descrevem formulações. As formulações compreendem o L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 10-30% em peso da formulação; um ou mais componentes adicionais selecionados do grupo que consiste em sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 10-40% em peso da formulação; 1- metoxi-2-propanol em uma quantidade de 0.5-2% em peso da formulação; dipropileno glicol em uma quantidade de 4-18% em peso da formulação; e alquil polissacarídeo em uma quantidade de 4-20% em peso da formulação; e água como o resto da formulação. Opcionalmente, a formulação compreende L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 12.25% em peso da formulação; sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 31.6% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; dipropileno glicol em uma quantidade de 8.6% em peso da formulação; alquil polissacarídeo em uma quantidade de 9.8% em peso da formulação; e água em uma quantidade de 36.75% em peso da formulação. Opcionalmente, a formulação compreende L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 24.5% em peso da formulação; sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidadede 31.6% em peso da formulação; 1-metoxi-2- propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; dipropileno glicol em uma quantidade de 8.6% em peso da formulação; alquil polissacarídeo em uma quantidade de 9.8% em peso da formulação; e água em uma quantidade de 24.5% em peso da 8/69 formulação. Opcionalmente, a formulação compreende L- glufosinato de amônio em uma quantidade de 12.25% em peso da formulação; sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidadede 15.8% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 0.5% em peso da formulação; dipropileno glicol em uma quantidade de 4.3% em peso da formulação; alquil polissacarídeo em uma quantidade de 4.9% em peso da formulação; e água em uma quantidade de 62.25% em peso da formulação. Opcionalmente, a formulação compreende L- glufosinato de amônio em uma quantidade de 24.5% em peso da formulação; sulfato de alquil éter, sal de sódio em uma quantidade de 22.1% em peso da formulação; 1-metoxi-2- propanol em uma quantidade de 1.0% em peso da formulação; alquil polissacarídeo em uma quantidade de 6.2% em peso da formulação; e água em uma quantidade de 46.2% em peso da formulação.

[0019] Embora os métodos possam ser utilizados para produzir um L-glufosinato substancialmente purificado em uma reação descontínua, reconhece-se que pode ser utilizado um processo contínuo.

I. Métodos de Síntese

[0020] Métodos para a conversão de D-glufosinato em L- glufosinato são fornecidos. Os métodos aqui descritos proporcionam um meio para a conversão de uma matéria-prima de baixo custo de uma mistura racémica de D- e L-glufosinato em um produto mais valioso que foi enriquecida para L- glufosinato. Os métodos para conversão incluem duas etapas, que podem ocorrer em um ou mais recipientes separados. O primeiro passo é a desaminação oxidativa do D-glufosinato (que pode estar presente em uma mistura racêmica de D- e L- glufosinato) em PPO ácido (2-oxo-4- (hidroxi (metil) fosfinoílo) butírico). Este passo pode ser catalisado por uma enzima D- aminoácido oxidase (DAAO), a enzima D-aminoácido desidrogenase (DAAD), ou por conversão química. O segundo passo é a aminação específica de PPO a L-glufosinato,utilizando um grupo amina de um ou mais doadores de amina. Tais doadores de amina podem ser selecionados do glutamato, L-glutamato, lisina, alanina, isopropilamina, sec-butilamina, feniletilamina e semelhantes. Este passo pode ser catalisado por uma enzima transaminase (TA), uma enzima L-aminoácido desidrogenase (LAAD), ou por conversão química. Utilizando os métodos aqui descritos, podem ser obtidas composições de L- glufosinato substancialmente purificado.

[0021] A Figura 1 apresenta um exemplo da conversão de D- glufosinato em L-glufosinato. Como mencionado acima, o método envolve um processo de duas etapas. Como ilustrado, o primeiro passo é uma desaminação oxidativa de D-glufosinatoem PPO e o segundo passo é uma aminação de PPO em L- glufosinato.

[0022] O primeiro passo, isto é, a desaminação oxidativa do D-glufosinato a PPO, pode ser catalisado por várias classes de enzimas ou pode ocorrer não enzimaticamente. Tais enzimas incluem DAAO, DAAD e D-aminoácido desidratase.

[0023] Em uma forma de realização uma enzima DAAO é usada para catalisar a conversão de D-glufosinato em PPO. Tal reação tem a seguinte estequiometria:

[0024] Considerando que a solubilidade do oxigênio no tampão de reação aquoso é tipicamente baixa comparada àquela do glufosinato, para um processo eficiente, o oxigênio deve ser introduzido durante todo o período de tempo da reação DAAO. Isto está em contraste com, por exemplo, a reação de Hawkes apresentada nas Patentes dos EUA Nos: 7,723,576; 7,939,709; 8.642.836; e 8.946.507 em que a reação foi conduzida em um vaso selado. Inicialmente, o D-glufosinato está presente em concentrações superiores a 30 g/L até 140 g/L. O nível inicial de oxigênio é tipicamente afetado pela temperatura da reação, mas normalmente está inicialmente presente em aproximadamente 8 mg/L e é adicionado ao longo da reação para permitir oxigênio suficiente para a reação continuar em ritmo acelerado. A água está normalmente, mas não obrigatoriamente, presente em mais de 500 g/L.

[0025] Várias enzimas DAAO são conhecidas na técnica e podem ser utilizadas nos métodos aqui descritos, desde que sejam capazes de aceitar o D-glufosinato como substrato e proporcionem uma atividade suficiente para conduzir a reação.As enzimas DAAO úteis nos métodos da invenção têm uma atividade igual ou superior a aproximadamente 3 umol/min * mg, superior a aproximadamente 4 umol/min * mg, ou mais elevada. Uma enzima do tipo selvagem pode ser utilizada nos métodos da invenção, desde que a enzima possua um nível de atividade como estabelecido acima. Tais enzimas DAAO que podem ser usadas no método incluem as de Rhodosporidium toruloides, Trigonopsis variabilis, Fusarium sp, Candida sp, Schizosasaccharomyces sp, Verticillium sp, Neolentinus lepideus, Trichoderma reesei, Trichosporon oleaginosus, e 11/69 similares que foram modificadas para aumentar a atividade. Qualquer enzima DAAO pode ser utilizada como enzima de partida, incluindo as que possuem sequências correspondentes aos números de acesso Swissprot P80324, Q99042, P00371, and P24552 ou números SPTREMBL Q9HGY3 e Q9Y7N4 ou Números GenBank KZT28066.1, XP_006968548.1, e KLT40252.1. As sequências de ADN que codificam o DAAO podem ser selecionadas de sequências estabelecidas em acessos EMBL A56901, RGU60066, Z50019,SSDA04, D00809, AB042032, RCDAAOX, A81420, e SPCC1450, ou podem ser optimizadas a partir das sequências proteicas indicadas acima para expressão ótima no hospedeiro/s de expressão escolhido/s. A Patente U.S. No. 8222728 descreve enzimas DAAO de Candida intermedia. Tais sequências são aqui incorporadas por referência. Estas enzimas podem ser modificadas para aumentar a atividade e utilizadas nosmétodos da invenção.

[0026] Enzimas adicionais DAAO podem ser identificados em uma variedade de maneiras, incluindo a semelhança de sequência e testes funcionais. A enzima DAAO pode ser uma enzima DAAO mutante que é capaz de aceitar o D-glufosinato como substrato. Em Hawkes et al., Supra, um mutante DAAO com base na sequência de Rhodosporidium toruloides (consistindo nas mutações F58K e M213S) demonstrou aceitar o D-glufosinatocomo substrato (Hawkes et al. (2011) Plant Biotechnol J. 9(3):301-14). Outras enzimas DAAO podem ser modificadas de forma semelhante para aceitar o D-glufosinato e ter maior atividade. isto é, a atividade necessária para conduzir o método da invenção. Do mesmo modo, as enzimas DAAO conhecidas podem ser melhoradas por mutagénese, e/ou novas enzimas DAAO podem ser identificadas.

[0027] Em algumas formas de realização, enzimas mutantes podem ser preparadas e testadas nos métodos aqui descritos.As enzimas DAAO mutantes (por exemplo, de Rhodotorula gracilis) podem incluir uma mutação, duas mutações, três mutações ou mais de três mutações (por exemplo, quatro mutações, cinco mutações, seis mutações, sete mutações, oito mutações, nove mutações ou dez mutações ou mais) nas posições na sequência mutante em comparação com a sequência do tipo selvagem. O DAAO mutante pode opcionalmente compreender mutações nas posições 54, 56, 58, 213 e/ou 238. Em algumas formas de realização, tais mutantes podem compreender substituições de aminoácidos nas posições 54 e 56 comparado com a sequência do tipo selvagem. Em outras formas de realização, tais mutantes podem compreender substituições de aminoácidos nas posições 54 e 58 comparado com a sequência do tipo selvagem. Em outras formas de realização, tais mutantes podem incluir substituições de aminoácidos nas posições 54, 213, e 238 comparado com a sequência do tipo selvagem.

[0028] Opcionalmente, na posição 54, a asparagina de tipo selvagem pode ser substituída por Ala, Cys, Gly, Ile, Ser, Leu ou, mais preferencialmente, Thr ou Val. Por exemplo, o mutante DAAO pode compreender uma das seguintes mutações na posição 54: N54C, N54L, N54T, ou N54V.

[0029] Opcionalmente, na posição 56, a treonina de tipo selvagem pode ser substituída por Ala, Cys, Gly, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Met, ou Val. Ver, Patente U.S. No. 7.939.709, que é aqui incorporada por referência. Por exemplo, o mutante DAAO pode compreender a mutação T56M.

[0030] Além disso, na posição 58, o tipo selvagem Phe pode ser substituído por Lys, Arg, Gln, Thr, Gly, Ser, Ala, Arg, Asn, ou His. O mutante DAAO pode opcionalmente incluir uma das seguintes mutações na posição 58: F58A, F58G, F58H, F58K,F58N, F58Q, F58R, F58S, ou F58T. Em algumas formas de realização, o mutante DAAO não inclui uma mutação na posição 58.

[0031] Opcionalmente, na posição 213, a metionina do tipo selvagem é substituída por Arg, Lys, Ser, Cys, Asn, ou Ala. Em alguns exemplos, o mutante DAAO pode compreender a mutaçãoM213S.

[0032] Opcionalmente, na posição 238, a tirosina do tipo selvagem é substituída por His, Ser, Gys, Asn, ou Ala.

[0033] Em algumas formas de realização, o mutante DAAO pode compreender uma ou mais das seguintes combinações de mutações: F58K e M213S; N54T e T56M; N54V e F58Q; N54C e F58H; N54T e F58T; N54T e F58G; N54T e F58Q; N54T e F58A; N54L e F58R; N54V e F58R; N54V e F58N; e/ou N54V, F58Q, e M213S.

[0034] Em uma forma de realização, o mutante DAAO compreende mutações em outras enzimas DAAO em posições equivalentes a posições 54, 56, 58, 213, e/ou 238 deR hodosporidium toruloides DAAO ou Trigonopsis variabilis DAAO.

[0035] Outras D oxidases de aminoácidos adequadas podem ser obtidas preferencialmente de fontes fúngicas. Tais enzimas DAAO podem ser identificadas e testadas para utilização nos métodos da invenção. Para determinar se a enzima aceitará o D-glufosinato como substrato, um ensaio de eletrodo de oxigênio (Hawkes, 2011, supra), ensaio colorimétrico (Berneman A, Alves-Ferreira M, Coatnoan N, Chamond N, Minoprio P (2010) Método colorimétrico de oxidase de D-aminoácidos de alto e médio rendimento para determinaçãode D-Aminoácidos. Aplicação para o aminoácido Racemases. J Microbial Biochem Technol 2: 139146), e/ou medição direta (via cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), espectrometria de massa - cromatografia líquida (LC-MS), ou similar) de formação de produto pode ser usada.

[0036] A reação catalisada pela enzima DAAO requer oxigênio. Em algumas formas de realização, oxigênio, ar enriquecido com oxigênio, um fluxo de gás enriquecido com oxigênio, ou ar, é introduzido na reação, seja no espaço da cabeça, seja através do gás de aspersão através do vaso de reação, intermitentemente ou continuamente, para aumentar a taxa de reação. Adicionalmente, noutras formas de realização, opcionalmente combinadas com gás de aspersão através do vaso de reação, pode ser utilizado um reator pressurizado. Ou seja, o reator pode ser selado e permitido consumir O2. O uso de uma câmara selada limitaria as emissões de vapor.

[0037] Quando uma enzima DAAO catalisa a conversão de D- glufosinato em PPO, o peróxido de hidrogênio (H2O2) evolui. Isto pode ser prejudicial para enzimas e outros componentes da biotransformação (por exemplo, produtos e/ou substratos). Portanto, em uma forma de realização, uma enzima, como a catalase, pode ser usada em adição à enzima DAAO para catalisar a eliminação do peróxido de hidrogênio. A catalase catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio com a seguinte estequiometria:

[0038] Em algumas formas de realização, o peróxido de hidrogênio pode ser eliminado usando reações de decomposição catalisadas e não catalisadas. Por exemplo, o peróxido de hidrogênio pode ser eliminado por uma reação de decomposição não catalisada usando mais calor e/ou pH. O peróxido de hidrogénio também pode ser eliminado por uma reação de decomposição catalisada utilizando, por exemplo, metais de transição e outros agentes, tais como iodeto de potássio. Além de eliminar o peróxido de hidrogênio, o uso de catalase também produz oxigênio (O2). A produção de oxigênio pela catalase pode auxiliar na facilitação da conversão do D- glufosinato em PPO usando a enzima DAAO, pois o DAAO requer oxigênio para funcionar.

[0039] Outras enzimas podem ser usadas para catalisar a conversão de D-glufosinato em PPO. Por exemplo, a DAAD enzyme that accepts D-glufosinato as a substrate can be used with the following stoichiometry:

[0040] É reconhecido que nos métodos onde um DAAD é usado, a reação catalisada pelo DAAD pode incluir reciclagem de cofator redox. Isto envolve a oxidação do aceitador reduzido para que ele possa aceitar mais elétrons do D-glufosinato.

[0041] Em uma forma de realização, a desaminação oxidativa química, em que um a-cetoácido intermediário é produzido apartir do aminoácido parental, pode ser utilizada nos métodos aqui descritos para converter o D-glufosinato em L-glufosinato. A desaminação oxidativa química envolve a conversão de um grupo amina em um grupo ceto com liberação concomitante de amônia, tipicamente usando íons metálicos, tais como cobre ou cobalto em uma solução aquosa a temperaturas entre a temperatura ambiente e o ponto de ebulição da solução e em um pH no intervalo de aproximadamente 4 - aproximadamente 10. Ver, por exemplo, Ikawa e Snell (1954) J. Am. Chem. Soc. 76 (19): 4900-4902, aqui incorporado por referência.

[0042] A conversão substancialmente completa (superior a 70%, superior a 75%, superior a 80%, superior a 85%, superiora 90%, superior a 95%) do D-glufosinato em PPO pode ocorrer dentro de 24 horas, dentro de 18 horas, dentro de 12 horas, dentro de 8 horas ou menos.

[0043] O segundo passo do método aqui descrito envolve a conversão de PPO em L-glufosinato utilizando uma enzima transaminase (TA), uma enzima L-aminoácido desidrogenase (LAAD), ou por conversão química. Em uma forma de realização,o método é uma reação catalisada por um TA. Um TA com a estéreo especificidade necessária que aceita PPO como substrato catalisa a aminação de PPO a L-glufosinato com a seguinte estequiometria: PPO + doador de amina => L-glufosinato + ácido ceto.

[0044] Se a reação é conduzida como um processo de duas fases em que o D-glufosinato é substancialmente convertido em PPO na ausência de transaminase e/ou doador de amina, as quantidades iniciais de PPO na segunda fase variam tipicamente de 10g/L a 140g/L; 20 g/l a 140 g/l; ou 30g/L a 140g/L. Se a reação é conduzida em um processo de fase única, as quantidades de partida de PPO são tipicamente menos do que 1 g/L e os mais altos níveis de PPO durante a reação são tipicamente menos do que 25 g/L. O doador de amina está inicialmente presente entre um excesso molar de 1 e 50 vezes em relação à quantidade inicial de glufosinato racêmico.

[0045] Os TA de utilidade nos métodos aqui descritos incluem a transaminase gabT de Escherichia coli (UniProt P22256, com a sequência identificada como SEQ ID NO: 3), que foi demonstrado que catalisa a reação desejada com PPO como substrato (Bartsch et al. (1990) Appl Environ Microbiol. 56(1):7-12). Outra enzima foi desenvolvida para catalisar a reação desejada a uma taxa mais alta usando isopropilamina como um doador de amina (Bhatia et al. (2004) Peptide Revolution: Genomics, Proteomics & Therapeutics, Proceedings of the Eighteenth American Peptide Symposium, Ed.Michael Chorev and Tomi K. Sawyer, July 19-23, 2003, pp. 47- 48). Uma transaminase com a sequência de aminoácidos da SEQID NO: 1 também catalisa a reação desejada com PPO eisopropilamina como substrato (Exemplo 11). Adicionalmente,as enzimas TA de em numerosos microorganismos, tais como Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces viridochromogenes, Candida albicans, e outros, podem ser utilizadas na prática dos métodos aqui descritos. Em particular, ver, por exemplo, EP0249188 e Patente U.S. No. 5.162.212, aqui incorporada porreferência. Se desejado, as enzimas podem evoluir por mutagênese para aumentar suas atividades. As enzimas TA mutantes podem ser selecionadas para a atividade desejada pelos ensaios descritos em Schulz et al. Appl Environ Microbiol. (1990) Jan. 56(1):1-6, e/ou medição direta dos produtos por HPLC, LC-MS ou produtos similares.

[0046] As enzimas TA adicionais para uso nos métodos podem ser identificadas por meio da triagem de coleções de TAs, como aquelas vendidas pela Prozomix Limited (Northumberland, Reino Unido), SyncoZymes (Xangai, China), Evocatal (Monheimam Rhein, Alemanha), Codexis (Redwood) City, CA) ou Abcam (Cambridge, Reino Unido) para a atividade desejada. 18/69 Alternativamente, a similaridade de sequência pode ser usada para identificar novas enzimas de TA. Finalmente, as enzimas TA também podem ser identificadas a partir de organismos capazes de catalisar a reação desejada.

[0047] A seleção de um doador de amina apropriado é importante para uma conversão económica de D-glufosinato em L-glufosinato. Uma variedade de questões pode serconsiderada, incluindo o custo do doador, termodinâmica de equilíbrio, recuperação potencial do doador, separação do produto cetoácido do L- glufosinato desejado e outros. Consequentemente, as enzimas TA que aceitam vários diferentes doadores de amina podem ser usadas, incluindo doadores de baixo custo como L-aspartato ou aspartato racêmico, L- glutamato ou glutamato racêmico, L-alanina ou alanina racêmica, L-feniletilamina ou fenilalanina racêmica, L - glicina ou glicina racêmica, L-lisina ou lisina racêmica, L- valina ou valina racêmica, L-serina ou serina racêmica, L- glutamina ou glutamina racêmica, isopropilamina, sec- butilamina, etanolamina, ácido 2-aminobutírico e ácido diaminoproprionico . Em algumas formas de realização, o doador de amina não é aspartato ou ácido aspártico (por exemplo, ácido L-aspártico, ácido D-aspártico ou ácido D, L- aspártico racémico).

[0048] Em formas de realização onde o amino doador é o glutamato, o coproduto ceto ácido que resulta da reação de transaminação é α-cetoglutarato (que também é referido como ácido α- cetoglutárico ou α-KG). O α-cetoglutarato pode ser isolado e/ou purificado utilizando modos conhecidos dos especialistas na técnica, tal como na Patente EP No. 0073711, Patente CN No. 10519873, Patente CN No. 105177065, Patente CN No. 104529755, e Zhan et al., Shipin Yu Shengwu Jishu Xuebao, 32(10): 1043-1048 (2013), cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O α- cetoglutarato produzido e isolado pode ser usado em uma variedade de aplicações, incluindo na sintetização de agentes farmacêuticos, aditivos alimentares e biomateriais. Opcionalmente, o α-cetoglutarato pode ser quimicamente convertido em glutamato racêmico ou L-glutamato, opcionalmente para reutilização na reação.

[0049] A aminação quimicamente redutiva envolve a conversão de um grupo cetona em um grupo amina através de um composto imina tipicamente por tratamento do composto ceto com uma amina adequada em uma solução orgânica. Aminas adequadas incluem, por exemplo, metilamina ou amónia. Solventes orgânicos adequados para utilizao na solução orgânica incluem tetra-hidrofurano, etanol, ou diclorometano (DCM). A aminação redutiva pode ser realizada a temperaturas entre a temperatura ambiente e o ponto de ebulição da solução. A imina produzida pode então ser reduzida utilizando um agente redutor em uma solução orgânica. Suitable reducing agents include, for example, NaBH4, NaHB(OAc)3, ou Na(CN)BH3. Solventes orgânicos adequados para uso na solução orgânica incluem tetraidrofurano, etanol, ou DCM. A reação de redução pode ser realizada a temperaturas entre 0°C e o ponto de ebulição da solução. Os especialistasna técnica saberão que o processo pode ser feito em "um único pote" ou em vários contêineres, ou seja, em transformações separadas. Além disso, os especialistas na técnica reconhecerão que o procedimento descrito fornecerá material amino racémico sempre que possível. O uso de um agente redutor quiral, como RuCl2[(S)-BINAP] e gás hidrogênio ou fonte latente de gás hidrogênio, ou aentes redutores à base de hidreto aquiral na presença de ligantes quirais, taiscomo (S)- ou (R)- VAPOL em uma proporção entre 1:1 e 1:0,05 pode produzir material amino enantiomericamente puro e/ou enriquecido. Ver, por exemplo, Mignonac (1921) Compt. Rend. 172:223 e G. Li, Y. Liang, J. C. Antilla (2007) J. Am. Chem. Soc., 129:5830-5831.

[0050] Um TA de tipo selvagem que aceita um doador deamina desejado pode ser identificado, ou um TA que normalmente não aceita um doador de amina desejado pode ser evoluído para aceitar o substrato desejado. Opcionalmente, a transaminase não é um aspartato transaminase. Opcionalmente, a transaminase não é 4- amino-butirato: 2-cetoglutarato transaminase. Em algumas formas de realização, a transaminase não é um sistema de combinação de enzimas que inclui transaminase e glutamato específicos de PPT: oxaloacetato transaminase.

[0051] Outras enzimas para catalisar a conversão de PPO em L- glufosinato incluem enzimas LAAD ou imine redutases que aceitam PPO como substrato. Tais enzimas LAAD utilizam a seguinte estequiometria:

[0052] As reações catalisadas por LAAD podem incluir a reciclagem de cofatores redox, que envolve a redução do aceitador oxidado para que ele possa doar mais elétrons parao PPO.

[0053] A aminação quimicamente redutora, quando um grupo amino é produzido a partir do composto ceto original, também pode ser utilizada para produzir glufosinato, no caso de não ser utilizado nenhum redutor quiral ou ligante, ou L-glufosinato, no caso de um redutor quiral ou ligando é usado.A 21/69 aminação quimicamente redutiva pode ser afetada conforme descrito acima.

[0054] A conversão substancialmente completa de PPO em L- glufosinato pode ocorrer dentro das 24 horas, dentro das 18 horas, dentro das 12 horas, dentro das 8 horas, dentro das 4 horas. Substancialmente completo, neste contexto, significa que a conversão de PPO em L-glufosinato é maior que aproximadamente 70%, maior que aproximadamente 75%, maior queaproximadamente 80%, maior que aproximadamente 85%, maior queaproximadamente 90%, maior que aproximadamente 95%, maior queaproximadamente 98%, ou maior que aproximadamente 99%.

[0055] Se a reação ocorre em um único recipiente ou vaso, a enzima TA pode ser adicionada com a enzima DAAO ou adicionada em um momento posterior, por exemplo, após a enzima DAAO ter sido autorizada a catalisar alguma ousubstancialmente toda a desaminação oxidativa.

[0056] Enzimas podem ser adicionadas à reação por vários métodos. Uma abordagem é expressar a(s) enzima s) em microorganismo(s), como E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris eoutros, e adicionar as células inteiras às reações como biocatalisadores celulares inteiros. Outra abordagem é expressar a(s) enzima(s), lisar os microrganismos e adicionar o lisado celular. Outra abordagem é purificar, ou parcialmente purificar, a(s) enzima(s) de um lisado e adicionar enzima(s) pura(s) ou parcialmente pura(s) à reação. Se múltiplas enzimas são necessárias para uma reação, as enzimas podem ser expressas em um ou vários microorganismos, incluindo a expressão de todas as enzimas dentro de um único microorganismo.

[0057] Uma outra abordagem, que pode ser combinado com as abordagens acima, é imobilizar enzima (s) a um suporte (estratégias exemplares são delineadas em Datta et al. (2013) 3 Biotech. Feb; 3(1): 1-9). Como delineado em Datta et al.,E não pretendendo ser limitante, as enzimas, isoladamente ou em combinação, podem, por exemplo, ser adsorvidas a, ou covalentemente ou não covalentemente ligadas a, ou encapsuladas dentro, polímeros naturais ou sintéticos ou veículos inorgânicos, incluindo agregados da própria enzima(s). Uma vez imobilizada, a(s) enzima(s) e veículo(s) podem ser dispersos em solução granulosa ou acondicionados em leitos, colunas, ou qualquer número de abordagens similares para a solução de reação de interação com as enzimas. Considerando que a aeração é importante para a reação DAAO aqui prevista, colunas de bolha ou similares podem ser usadas para imobilização enzimática. Como exemplos, a mistura de reação pode fluir através de uma coluna de enzimas imobilizadas (reação de fluxo), adicionada a um leito fixo ou coluna de enzimas imobilizadas, deixada reagir e removida da parte superior ou inferior do vaso de reação (fluxo de plugue), ou adicionada a enzimas imobilizadas dispersas e deixada reagir então as enzimas imobilizadas removidas por filtração, centrifugação, ou similar (lote). Assim, qualquer método para a imobilização das enzimas pode ser utilizado nosmétodos da invenção.

[0058] O DAAO, TA, e/ou outras reações podem ocorrer em um tampão. Os tampões exemplares comumente usados em reações de biotransformação incluem Tris, fosfato, ou qualquer um dos tampões da Good, como Ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico (MES); Ácido N- (2-acetamido) iminodiacético (ADA); ácido piperazina-N, N-bis (2-etanossulfico) (PIPES); Ácido N- (2- acetamido) -2-aminoetanossulfônico (ACES); Ácido β-hidroxi-4- morfolinapropanosulfônico (MOPSO); cloreto de colamina; Ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico (MOPS); Ácido N, N-Bis (2- hidroxietil) -2-aminoetanossulfônico (BES); ácido 2 - [[1,3- di- hidroxi-2- (hidroximetil) propan-2-il] amino] etanossulfônico (TES); ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinaetanossulfônico (HEPES); ácido 3-(Bis(2- hidroxietil)amino)-2-hidroxipropano-1-sulfônico (DIPSO); acetamidoglicina, ácido 3-(N-Tris(hidroximetil)metilamino(-2- hidroxipropanosulfônico) (TAPSO); ácidopiperazina-N,N‘- bis(2-hidroxipropanosulfônico) (POPSO); ácido 4-(2- hidroxietil)piperazina-1-(2-hidroxipropanosulfônico) (HEPPSO); ácido 3-[4-(2-hidroxietil)-1- piperazinil]propanosulfônico (HEPPS); tricina; glicinamida; bicina; ou ácido 3-[[1,3-dihidroxi-2-(hidroximetil)propan-2- il]amino]propano-1-sulfônico (TAPS). Receitas exemplares adicionais de tampãos podem ser encontradas em Whittall, J. e Sutton, P. W. (eds) (2012) Front Matter, em Practical Methods for Biocatalysis and Biotransformations 2, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK. Em algumas formas de realização, amônio pode atuar como um tampão. Um ou mais solventes orgânicostambém podem ser adicionados à reação.

[0059] Surpreendentemente, o DAAO, TA, e/ou outras reações podem ocorrer sem ou baixos níveis (menos de 1 mM) de tampão adicionado (exceto o amônio que pode opcionalmente estar presente devido à adição de glufosinato de amônio racêmico). Em particular, DAAO e TA imobilizado podem ser estáveis e ativos na presença de menos de 1 mM de tampão fosfato e sem outro tampão, exceto qualquer amônio presente devido à adição de glufosinato de amônio racêmico.

[0060] O material de partida glufosinato racémico pode ser fornecido em várias formas. Vários sais de glufosinato racêmico, como amônio e hidrocloreto, ou o zwitterion, podem ser usados. O glufosinato racêmico pode estar na forma de um pó sólido (como um pó com mais de 80%, 85%, 90%, ou 95% de pureza) ou uma solução aquosa (como aproximadamente 50% de solução de glufosinato racêmico).

[0061] Em algumas formas de realização, a reação ocorre dentro de um intervalo de pH definido, que pode ser entre pH 4 a pH 10 (por exemplo, entre pH 6 e pH 9, tal como aproximadamente pH 7,5 a pH 8).

[0062] Em algumas formas de realização, a reação ocorre a uma temperatura definida. A temperatura pode ser mantida em um ponto entre a temperatura ambiente e o ponto de ebuliçãodo solvente, mais tipicamente entre a temperatura ambiente e 50°C.

[0063] Como indicado, os métodos aqui descritos fornecem uma composição de L-glufosinato substancialmente puro (em vezde uma mistura racémica de L-glufosinato e D-glufosinato). L- glufosinato substancialmente puro significa que maior que o aproximadamente 70%, maior que aproximadamente 75%, maior que aproximadamente 80%, maior que aproximadamente 85%, maior que aproximadamente 90%, maior que aproximadamente 95%, maior que aproximadamente 96%, maior que aproximadamente 97%, maior que aproximadamente 98%, ou maior que aproximadamente 99% do D- glufosinato foi convertido em L-glufosinato resultando em uma composição tendo maior que aproximadamente 80%, maior que aproximadamente 85%, maior que aproximadamente 90%, maior que aproximadamente 95%, maior que aproximadamente 96%, maior que aproximadamente 97%, maior que aproximadamente 98%, ou maior que aproximadamente 99% L-glufosinato em comparação com a soma do D-glufosinato e o L-glufosinato presentes na composição.

[0064] Em uma forma de realização, o L-glufosinato não é isolado da mistura de biotransformação e é obtida uma composição compreendendo D-glufosinato, PPO e L-glufosinato. Esta composição conterá ao menos 80% L-glufosinato em peso da soma do L-glufosinato, D-glufosinate, e PPO, ao menos 90% L- glufosinato em peso da soma dos componentes. Esta composição pode ser utilizada diretamente como uma composiçãoherbicida ou como um ingrediente em um produto herbicida formulado.

[0065] Alternativamente, alguns ou todos os componentes diferentes do L-glufosinato podem ser removidos da mistura de biotransformação, a mistura opcionalmente concentrada, eentão a mistura pode ser usada diretamente (e/ou com a adiçãode vários adjuvantes) para a prevenção ou controle de ervasdaninhas. A mistura de biotransformação, em alguns casos, pode ser usada diretamente (e/ou com a adição de vários adjuvantes) para a prevenção ou controle de ervas daninhas.

[0066] Etapas adicionais para purificar o L-glufosinato podem ser adicionadas. Esses métodos de purificação e isolamento adicionais incluem troca iónica, extração, 26/69 formação de sal, cristalização e filtração; cada um pode ser usado várias vezes em combinações adequadas. Enzimas podemser removidas por filtração simples se suportadas, ou livres em solução pelo uso de ultrafiltração, o uso de absorventes como celite, celulose ou carbono, ou desnaturação através devárias técnicas conhecidas pelos especialistas na técnica.

[0067] Os processos de troca aniônica efetuam a separaçãopor adsorção seletiva de solutos em resinas escolhidas para este fim. Como os produtos e as impurezas devem serdissolvidos em uma única solução antes da adsorção, aconcentração da corrente do produto purificado por evaporaçãoou destilação antes do isolamento é geralmente necessária. Exemplos do uso de troca iônica para purificação sãodescritos por Schultz et al., E em EP0249188 (A2).

[0068] A purificação pode ser conseguida pela formação de um sal insolúvel de L-glufosinato pela adição de um ácido adequado, incluindo ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido acético e semelhantes. Similarmente, a purificação pode ser conseguida pela adição de uma base adequada para formar um sal insolúvel. Bases úteis incluem hidróxidos, carbonatos, sulfatos e fosfatos de metais alcalinos ou hidróxidos, carbonatos, sulfatos e fosfatos de metais alcalino-terrosos. Outras bases que contêm nitrogênio podem ser usadas, incluindo amônia, hidroxilamina, isopropilamina, trietilamina, tributilamina, piridina, 2-picolina, 3-picolina, 4-picolina, 2,4-lutidina, 2,6-lutidina, morfolina, N- metilmorfolina, 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-ene, e dimetiletanolamina. Pode ser vantajoso concentrar a mistura ou adicionar um solvente (ou ambos) para maximizar o rendimento e otimizar a pureza do sal desejado. Solventes 27/69 adequados para este fim incluem aquelesem que a solubilidade do sal desejado é muito baixa (tais solventes são frequentemente denominados “anti-solventes”). Os sais de L- glufosinato podem ser transformados em formas de glufosinato adequadas para formulação por métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Alternativamente, o L- glufosinato pode ser isolado como um zwitterion.

[0069] A US 9,255,115 B2 descreve como o sal de ido clorrico de L-glufosinato pode ser convertido na formazwiteriica com uma base tal como sodium hydroxide ou metóxidode sódio e depois cristalizado a partir de solvente aquoso de álcool para proporcionar L-glufosinato com pureza relativamente elevada. Este método tem a vantagem de produzirL-glufosinato cristalino que não é higroscópico e, portanto, mantém uma maior pureza em comparação com o L-glufosinato amorfo quando exposto à umidade ao longo do tempo.

[0070] Outros sais de L-glufosinato são conhecidos na técnica. Os documentos US 5.767.309 e US 5.869.668 divulgam autilização de bases de alcaloides quirais para formar sais diastereoméricos com glufosinato racémico. A purificação é conseguida porque o sal do L-glufosinato precipita da soluçãoem quantidade muito maior que o sal correspondente do D- glufosinato. Por conseguinte, este método pode ser utilizado com a presente invenção para obter L-glufosinato com elevado excesso enantiomérico, se desejado.

[0071] Opcionalmente, a purificação pode ser conseguida cristalizando primeiro uma ou mais impurezas, removendo as impurezas por filtração e depois purificando adicionalmente oL- glufosinato do filtrado resultante formando um sal como anteriormente descrito. Isto é vantajoso se o doador de 28/69 amina que não reagiu pode ser parcialmente ou completamente isolado e usado em reações subsequentes. Da mesma forma, a PPO que não reagiu parcialmente ou completamente isolada pode ser reciclada para uso em reações subsequentes.

[0072] A extração pode ser usada para purificar o produto. DE 3920570 C2 descreve um processo no qual o excesso de ácido glutâmico (usado como doador de amina) é precipitado ajustando o pH da solução para 3,7 a 4,2 com ácido sulfúrico.Após filtrar o ácido glutâmico, o pH do filtrado é reduzido para 1-2, após o que outras impurezas são extraídas para um solvente. Após extração e concentração, adiciona-se amónia à solução aquosa a um pH de 5-7, após o que precipita sulfato de amónio. O sulfato de amónio é removido por filtração e o filtrado resultante é concentrado para dar o sal de amónio doL-glufosinato.

[0073] O isolamento de L-glufosinato ou seus sais pode ser desejável, por exemplo, com a finalidade de transportar sólidos para a localização da formulação ou uso. Podem ser utilizados métodos industriais típicos de isolamento, por exemplo, filtração, centrifugação, etc. O produto isolado requer frequentemente a remoção de água, impurezas voláteis esolventes (se presentes) e equipamento de secagem industrial típico pode ser utilizado para este fim. Exemplos de tais equipamentos incluem fornos, secadores de tambor rotativo, secadores agitados, etc. Em alguns casos, pode ser vantajoso usar um secador por pulverização.

[0074] Não é necessário produzir um produto sólido após a purificação. Isto pode ser vantajoso se a formulação de L- glufosinato ocorrer no mesmo local usado para a produção de L- glufosinato. L-glufosinato e muitos dos seus sais são facilmente solúveis em água, e água é um líquido conveniente para uso na formulação de produtos. Por exemplo, o doador de amina é isolado por filtração e o filtrado resultante é concentrado por destilação. O pH do filtrado pode serajustado para um valor desejável e a solução resultante pode ser utilizada como é ou misturada com os ingredientes da formulação. Em outro exemplo, uma suspensão de L-glufosinatoou um dos seus sais pode ser preparado como descrito acima e isolado por filtração. O sólido pode ser dissolvido diretamente no filtro adicionando água ou um solvente adequado para obter uma solução de L- glufosinato.

II. Composições

[0075] Também são aqui descritas composições compreendendo os produtos de reação descritos acima. Em algumas formas de realização, a composição inclui substancialmente L- glufosinato e formas de sais catiônicos ou aniônicos aceitáveis, tais como os sais cloridrato, amónio, ou isopropilamónio. Em algumas formas de realização, a composição compreende uma mistura de L-glufosinato, PPO e D- glufosinato.

[0076] Opcionalmente, o L-glufosinato é o composto predominante entre o L-glufosinato, o PPO e o D-glufosinato. Por exemplo, L- glufosinato pode estar presente na composição em uma quantidade de ao menos 80% em peso da soma do L- glufosinato, PPO, e D- glufosinato, ao menos 85 % em peso da soma do L-glufosinato, PPO, e D-glufosinato, ao menos 90% em peso da soma do L- glufosinato, PPO, e D-glufosinato, ao menos 95% em peso da soma do L-glufosinato, PPO, e D-glufosinato,ao menos 96% em peso da soma do L-glufosinato, PPO, e D- glufosinato, ao menos 97% em peso da soma do L-glufosinato, PPO, e D-glufosinato, ao menos 98% em peso da soma do L- glufosinato, PPO, e D-glufosinato, ou ao menos 99% em peso da soma do L-glufosinato, PPO, e D-glufosinato.

[0077] A composição pode incluir PPO em um valor de até20% em peso da soma do L-glufosinato, PPO, e D-glufosinato. Opcionalmente, a composição inclui de 0,001% a 20% de PPO (por exemplo, de 0,05% a 15% ou de mais de 0,01% a menos de5% PPO). Por exemplo, a composição pode incluir PPO em uma quantidade de menos que 20%, menos que 19%, menos que 18%, menos que 17%, menos que 16%, menos que 15%, menos que 14%, menos que 13%, menos que 12%, menos que 11%, menos que 10%, menos que 9%, menos que 8%, menos que 7%, menos que 6%, menos que 5%, menos que 4%, menos que 3%, menos que 2%, menos que 1%, menos que 0.5%, menos que 0.1%, ou menos que 0.01% em peso da soma do as massas de L-glufosinato, PPO, e D- glufosinato.

[0078] D-Glufosinato pode estar presente na composição em uma quantidade de 15% ou menos em peso da soma do L- glufosinato, PPO, e D-glufosinato. Por exemplo, D- glufosinato pode estar presente em uma quantidade de 14 % ou menos, 13 % ou menos, 12 % ou menos, 11 % ou menos, 10 % ou menos, 9 % ou menos, 8 % ou menos, 7 % ou menos, 8 % ou menos, 6 % ou menos, 5 % ou menos, 4 % ou menos, 3 % ou menos, 2 % ou menos, 1 % ou menos, ou 0.5 % ou menos em peso da soma do L-glufosinato, PPO, e D-glufosinato.

[0079] Em algumas formas de realização, a composição pode conter pequenas quantidades (por exemplo, aproximadamente 10%ou menos, aproximadamente 8% ou menos, aproximadamente 5% ou menos, aproximadamente 2% ou menos, ou aproximadamente 1% ou menos em peso da composição) de D-glufosinato. Em algumas formas de realização, a composição pode conter pequenas quantidades (por exemplo, aproximadamente 15% ou menos,aproximadamente 10% ou menos, aproximadamente 8% ou menos, aproximadamente 5% ou menos, aproximadamente 2% ou menos, ou aproximadamente 1% ou menos em peso da composição) de PPO.

[0080] As composições aqui descritas são úteis para aplicação em um campo de plantas cultivadas para a prevenção ou controle de ervas daninhas. A composição pode ser formulada como um líquido para pulverização em um campo. O L- glufosinato é fornecido na composição em quantidadeseficazes. Como aqui utilizado, a quantidade eficaz significade aproximadamente 10 gramas de ingrediente ativo por hectarea aproximadamente 1500 gramas de ingrediente ativo por hectare, por exemplo, de aproximadamente 50 gramas a aproximadamente 400 gramas ou de aproximadamente 100 gramas a aproximadamente 350 gramas. Em algumas formas de realização,o ingrediente ativo é L-glufosinato. Por exemplo, a quantidade de L-glufosinato na composição pode ser aproximadamente 10 gramas, aproximadamente 50 gramas, aproximadamente 100 gramas, aproximadamente 150 gramas, aproximadamente 200 gramas, aproximadamente 250 gramas, aproximadamente 300 gramas, aproximadamente 350 gramas, aproximadamente 400 gramas, aproximadamente 500 gramas, aproximadamente 550 gramas, aproximadamente 600 gramas, aproximadamente 650 gramas, aproximadamente 700 gramas, aproximadamente 750 gramas, aproximadamente 800 gramas, aproximadamente 850 gramas, aproximadamente 900 gramas, aproximadamente 950 gramas, aproximadamente 1,000 gramas, aproximadamente 1,050 gramas, aproximadamente 1,100 gramas, aproximadamente 1,150 gramas, aproximadamente 1,200 gramas, aproximadamente 1,250 gramas, aproximadamente 1,300 gramas, aproximadamente 1,350 gramas, aproximadamente 1,400 gramas, aproximadamente 1,450 gramas, ou aproximadamente 1,500 gramasL- glufosinato por hectare.

[0081] As composições herbicidas (incluindo concentrados que requerem diluição antes da aplicação às plantas) aqui descritas contêm L-glufosinato (isto é, o ingrediente ativo),opcionalmente algum D-glufosinato residual e/ou PPO, e um oumais componentes adjuvantes em líquido ou forma sólida.

[0082] As composições são preparadas misturando o ingrediente ativo com um ou mais adjuvantes, tais como diluentes, extensores, portadores, tensioativos, solventes orgânicos, humidificantes, ou agentes condicionantes, para proporcionar uma composição na forma de um sólido particulado finamente dividido, pellets, solução, dispersão, ou emulsão. Assim, o ingrediente ativo pode ser utilizado com um adjuvante, tal como um sólido finamente dividido, um líquidode origem orgânica, água, um agente umectante, um agentedispersante, um agente emulsionante, ou qualquer combinaçãoadequada destes. Do ponto de vista econômico e de conveniência, a água é o diluente preferido. No entanto, nem todos os compostos são resistentes à hidrólise e, em algunscasos, isto pode ditar a utilização de meios solventes nãoaquosos, como entendido pelos especialistas na técnica.

[0083] Opcionalmente, um ou mais componentes adicionaispodem ser adicionados à composição para produzir uma composição herbicida formulada. Tais composições formuladaspodem incluir L-glufosinato, portadores (por exemplo, diluentes e/ou solventes) e outros componentes. A composição formulada inclui uma quantidade eficaz de L-glufosinato. Opcionalmente, o L-glufosinato pode estar presente na formade L-glufosinato de amônio. O L-glufosinato de amônio pode estar presente em uma quantidade que varia de 10% a 30% empeso da composição formulada. Por exemplo, o L-glufosinato de amônio pode estar presente em uma quantidade de 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 %, 22 %, 24 %, 26 %, 28 %, ou 30 % em peso da composição formulada. Opcionalmente, o L-glufosinato de amônio está presente em uma quantidade de 12.25 % ou de 24.5%.

[0084] Em alguns exemplos, a composição formulada pode incluir um ou mais surfactantes. Um surfactante adequado para uso na composição formulada inclui sulfato de alquil éter de sódio. O surfactante pode estar presente em uma quantidade de 10 % a 40 % em peso da composição formulada. Por exemplo, o surfactante pode estar presente em uma quantidade de 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 %, 22 %, 24 %, 26 %, 28 %, 30 %, 32 %, 34 %, 36 %, 38 %, ou 40 % em peso da composição formulada. Opcionalmente, o sulfato de alquil éter de sódio estápresente em uma quantidade de 11.05%, 15.8 %, 22.1%, ou 31.6%.

[0085] A composição formulada pode opcionalmente incluir um ou mais solventes (por exemplo, solventes orgânicos). Opcionalmente, o solvente pode ser 1-metoxi-2-propanol, dipropileno glicol, etilenoglicol e suas misturas. O um ou mais solventes podem estar presentes em uma quantidade que varia de 0.5 % a 20 % em peso da composição formulada. Por exemplo, a quantidade total de solventes na composição pode estar presente em uma quantidade de 0.5% a 18 %, 5 % a 15 %, ou 7.5 % a 10 % em peso da composição formulada.

[0086] Opcionalmente, o solvente inclui uma combinação de dois solventes. Por exemplo, os solventes na formulação podem incluir 1-metoxi-2-propanol e dipropileno glicol. O 1-metoxi-2-propanol pode estar presente, por exemplo, em uma quantidade de 0.5 % ao 2 % em peso da composição formulada. Por exemplo, 1-metoxi- 2-propanol pode estar presente em uma quantidade de 0.5 %, 0.6 %, 0.7 %, 0.8 %, 0.9 %, 1.0 %, 1.1 %, 1.2 %, 1.3 %, 1.4 %, 1.5 %, 1.6 %, 1.7 %, 1.8 %, 1.9 %, ou 2.0 % em peso da composição formulada. Opcionalmente, 1- metoxi- 2-propanol está presente em uma quantidade de 0.5 % ou 1.0 % em peso da composição formulada. Dipropileno glicol pode estar presente em uma quantidade de 4 % a 18 % em pesoda composição formulada. Por exemplo, dipropileno glicol pode estar presente em uma quantidade de 4 %, 6 %, 8 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, ou 18 % em peso da composição formulada. Opcionalmente, dipropileno glicol está presente em uma quantidade de 4.3 % ou 8.6 % em peso da composição formulada.

[0087] A composição formulada também pode incluir um ou mais umectantes polissacarídeos. Exemplos de umectantes de polissacáridos adequados incluem, por exemplo, alquil polissacarídeos, pentoses, xarope de milho com elevado teor de frutose, sorbitol e melaço. O umectante polissacarídeo, como o alquil polissacarídeo, pode estar presente na composição formulada em uma quantidade que varia de 4% a 20%.em peso da composição formulada. Por exemplo, a quantidade total de umectante polissacarídeo na composição pode estar presente em uma quantidade de 4 % to 18 %, 4.5 % to 15 %, ou 5 % a 10 % em peso da composição formulada. Em alguns exemplos, a quantidade total de umectante polissacarídico, 35/69 como o alquil polissacarídeo, presente na composição formulada pode ser 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, ou 18 %. Opcionalmente, o alquil polissacarídeo pode estar presente em uma quantidadede 3.2%, 4.9 %, 6.2%, ou 9.8 %.

[0088] Um diluente também pode ser incluído na composição formulada. Diluentes adequados incluem água e outros componentes aquosos. Opcionalmente, os diluentes estão presentes em uma quantidade necessária para produzir composições prontas para embalagem ou para uso.

[0089] Em um exemplo, a composição formulada inclui L- glufosinato de amônio em uma quantidade de 12.25% em peso da formulação; sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidadede 31.6% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; dipropileno glicol em uma quantidade de 8.6% em peso da formulação; alquil polissacarídeo em uma quantidade de 9.8% em peso da formulação; e água em uma quantidade de 36.75% em peso da formulação.

[0090] Em outro exemplo, a composição formulada inclui L- glufosinato de amônio em uma quantidade de 24.5% em peso da formulação; sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 31.6% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; dipropileno glicol em uma quantidade de 8.6% em peso da formulação; alquil polissacarídeo em uma quantidade de 9.8% em peso da formulação; e água em uma quantidade de 36.75% em peso da formulação.

[0091] Em outro exemplo, a composição formulada inclui L- glufosinato de amônio em uma quantidade de 12.25% em peso da formulação; sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 15.8% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 0.5% em peso da formulação; dipropileno glicol em uma quantidade de 4.3% em peso da formulação; alquil polissacarídeo em uma quantidade de 4.9% em peso da formulação; e água em uma quantidade de 62.25% em peso da formulação.

[0092] Em outro exemplo, a composição formulada inclui L- glufosinato de amônio em uma quantidade de 24.5% em peso da formulação; sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 22.1% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; alquil polissacarídeo em uma quantidade de 6.2% em peso da formulação; e água em uma quantidade de 46.2% em peso da formulação.

[0093] Em outro exemplo, a composição formulada inclui L- glufosinato de amônio em uma quantidade de 12.25% em peso da formulação; sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 22.1% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; alquil polissacarídeo em uma quantidade de 6.2% em peso da formulação; e água em uma quantidade de 58.45% em peso da formulação.

[0094] Em outro exemplo, a composição formulada inclui L- glufosinato de amônio em uma quantidade de 12.25% em peso da formulação; sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 11.05% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 0.5% em peso da formulação; alquil polissacarídeo em uma quantidade de 3.1% em peso da formulação; e água em uma quantidade de 73.1% em peso da 37/69 formulação.

[0095] Outros componentes adequados para utilização nas composições formuladas aqui proporcionadas são descritos nas Patentes U.S. Nos. 4,692,181 e 5,258,358, ambas as patentessão aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[0096] As composições herbicidas aqui descritas, particularmente líquidos e pós solúveis, podem conter como adjuvantes adicionais um ou mais agentes tensioativos em quantidades suficientes para tornar uma dada composição facilmente dispersível em água ou em óleo. A incorporação de um agente tensioativo nas composições aumenta grandemente asua eficácia. O agente tensioativo, tal como aqui utilizado, inclui agentes umectantes, agentes dispersantes, agentes de suspensão e agentes emulsionantes. Agentes aniônicos, catiônicos, e não- iônicos podem ser usados com igual facilidade.

[0097] Agentes umectantes adequados incluem alquilbenzenoe alquilnaftaleno sulfonatos, álcoois graxos sulfatados,aminas ou amidas ácidas, ésteres ácidos de cadeia longa de isotionato de sódio, ésteres de sulfossuccinato de sódio, ésteres de ácidos graxos sulfonados ou sulfonados, óleos vegetais sulfonados, glicóis acetilénicos diterciários, derivados de polioxietileno de alquilfenóis (particularmente isooctilfenol e nonilfenol) e derivados de polioxietileno dosmono ésteres de ácidos graxos superiores de anidridos de hexitol (por exemplo sorbitano). Dispersantes exemplares incluem metilcelulose, álcool polivinílico, ligninossulfonatos de sódio, alquilnaftaleno sulfonatos poliméricos, naftalenossulfonato de sódio, bisnaftalenossulfonato de polimetileno e lauratos de sódio N- metil-N- (ácido de cadeia longa).

[0098] As composições em pó dispersíveis em água podem ser feitas contendo um ou mais ingredientes ativos, um extensor sólido inerte e um ou mais agentes umectantes e dispersantes. Os extensores sólidos inertes são normalmente de origem mineral, tais como as argilas naturais, terra de diatomáceas e minerais sintéticos derivados de sílica e semelhantes. Exemplos de tais extensores incluem caulinites, argila atapulgite e silicato de magnésio sintético. Os pós dispersáveis em água aqui descritos podem opcionalmenteconter aproximadamente 5 a aproximadamente 95 partes em peso de ingrediente ativo (por exemplo, de aproximadamente 15 a 30partes em peso de ingrediente ativo), de aproximadamente 0.25 a 25 partes em peso de agente umectante, de aproximadamente 0.25 a 25 partes em peso de dispersante, e de 4.5 a aproximadamente 94.5 partes em peso de extensor sólidoinerte, sendo todas as partes em peso da composição total.Onde necessário, de aproximadamente 0.1 a 2.0 partes em pesode o extensor inerte sólido pode ser substituído por uminibidor de corrosão ou pelo agente antiespumante ou ambos.

[0099] As suspensões aquosas podem ser preparadas por dissolução ou por mistura e moagem de uma suspensão aquosa deum ingrediente ativo insolúvel em água na presença de umagente dispersante para obter uma pasta concentrada de partículas muito finamente divididas. A suspensão aquosaconcentrada resultante é caracterizada pelo seu tamanho de partícula extremamente pequeno, de modo que quando diluída e pulverizada, a cobertura é muito uniforme.

[00100] Óleos emulsionáveis são geralmente soluções de ingrediente ativo em solventes imiscíveis com água ou parcialmente imiscíveis em água juntamente com um agente ativo de superfície. Os solventes adequados para o ingrediente ativo aqui descrito incluem hidrocarbonetos e éteres, ésteres ou cetonas imiscíveis em água. As composições em óleo emulsionáveis contêm geralmente aproximadamente 5 a 95 partes de ingrediente ativo, aproximadamente 1 a 50 partesde agente tensioativo, e aproximadamente 4 a 94 partes de solvente, sendo todas as partes em peso com base no peso total do óleo emulsionável.

[00101] As composições aqui descritas podem também conter outros aditivos, por exemplo, fertilizantes, fitotóxicos e reguladores de crescimento de plantas, pesticidas e semelhantes utilizados como adjuvantes ou em combinação com qualquer um dos adjuvantes acima descritos. As composições aqui descritas podem também ser misturadas com os outros materiais, por exemplo, fertilizantes, outros fitotóxicos, etc., e aplicados em uma única aplicação.

[00102] Em cada um dos tipos de formulação aqui descritos, por exemplo, formulações líquidas e sólidas, a concentração dos ingredientes ativos é a mesma.

[00103] Em algumas formas de realização, a composição pode incluir o α-cetoglutarato como componente principal. O α- cetoglutarato é um importante ácido dicarboxílico e um dos principais intermediários no ciclo do ácido tricarboxílico e no metabolismo de aminoácidos. O cetoglutarato pode ser isolado a partir da mistura reacional por métodos tais como oestabelecido na Patente Francesa No. 07199, aqui incorporada por referência. A composição de α-cetoglutarato pode ser formulada com excipientes e veículos farmacêuticos, aditivos alimentares, ou componentes utilizados para formar biomateriais. A composição de α-cetoglutarato pode ser 40/69 utilizada em uma variedade de aplicações, incluindo a síntesede agentes farmacêuticos, aditivos alimentares e biomateriais, como descrito em Li et al., Bioprocess Biosyst Eng, 39:967-976 (2016).

[00104] É reconhecido que as composições herbicidas podem ser usadas em combinação com outros herbicidas. As composições herbicidas da presente invenção são frequentemente aplicadas em conjunto com um ou mais outros herbicidas para controlar uma variedade mais ampla de vegetação indesejável. Quando utilizados em conjunto com outros herbicidas, os compostos presentemente reivindicados podem ser formulados com o outro herbicida ou herbicidas, misturados em tanque com o outro herbicida ou herbicidas ou aplicados sequencialmente com o outro herbicida ou herbicidas. Alguns dos herbicidas que podem ser utilizados em conjunto com os compostos da presente invenção incluem: herbicidas de amida como alidrique, beflubutamida, benzadox, benzipram, bromobutida, cafenstrole, CDEA, clortiamida, ciprazole, dimetenamida, dimetenamida-P, difenamida, epronaz, etnipromida, fentrazamida, flupoxam, fomesafen, halosafen, isocarbamida, isoxabeno, napropamida, naptalam, pethoxamid, propyzamide, quinonamid e tebutam; herbicidas de anilida tais como cloranocrilo, cisanilida, clomeprop, cipromida, diflufenica, etobenzanida, fenasulame, flufenacete, flufenico, mefenaceto, mefluida, metamifope, monalida, naproanilida, pentanoclor, picolinafena e propanil; herbicidas de arilalanina tais como benzoilprop, flamprop e flamprop-M; herbicidas de cloroacetanilida tais como acetocloro, alacloro, butaclor, butenacloro, delacloro, dietaquilo, dimetacloro, metazacloro, metolacloro, S- metolacloro, pretilacloro, propacloro, propisoclor, prinacloro, terbúclor, depois cloro e xilaclor; herbicidas desulfonanilida tais como benzofluor, perfluidona, pirimisulfan e profluazole; herbicidas de sulfonamida tais como asulame, carbasulame, fenasulame e orizalina; herbicidas antibiicos tais como bilanafos; herbicidas de ido benzco tais como clorambeno, dicamba, 2,3,6-TBA e tricamba; herbicidas de ido pirimidiniloxibenzco, tais como bispiribac e piriminobac; herbicidas de ácido pirimidiniltiobenzóico tais como piritiobac; herbicidas de ácido ftálico tais como clortal; herbicidas de ido picolico tais como aminopiride, clopiralide e picloram; herbicidas de ido quinolinacarboxico, tais como quinclorac e quinmerac; herbicidas arsénicos tais como o ácido cacodílico, CMA, DSMA, hexaflurato, MAA, MAMA, MSMA, arsenito de potássio e arsenito de sódio; herbicidas de benzoilciclohexanodiona tais como mesotriona, sulcotriona, tefuriltriona e tembotriona; herbicidas de alquilsulfonato de benzofuranilo tais como benfeturas e etofumesato; herbicidas de carbamato tais como asulame, carboxazol, clorprocarbe, dicloroato, fenasulame, karbutilato e terbucarb; herbicidas de carbanilato tais como barban, BCPC, carbasulam, carbetamida, CEPC, clorobufam, clorpropam, CPPC, desmedifame, fenisopham, fenmedifam, fenmedifametilo, prophum e swep;herbicidas de oxima ciclohexeno tais como aloxidim, butroxidim, cletodime, cloproxidim, cicloxidim, profoxidim, sethoxydim, tepraloxydim e tralcoxidim; herbicidas de ciclopropilisoxazole tais como isoxaclortole e isoxaflutole; herbicidas de dicarboximida tais como benzfendizona, cinidon- etilo, flumezina, flumiclorac, flumioxazina e flumipropina; herbicidas de dinitroanilina tais 42/69 como benfluralina, butralina, dinitramina, etalfluralina, flucloralina, isopropalina, metalopralina, nitralina, orizalina, pendimetalina, prodiamina, profluralina e trifluralina; herbicidas de dinitrofenol tais como dinofenato, dinoprop, dinosam, dinoseb, dinoterb, DNOC, etinofen e medinoterb; herbicidas de éter difenílico, tais como etoxifena; herbicidas de éter nitrofenílico, tais como acifluorfen, aclonifen, bifenox, clomometoxifen, clomitrofen, etnipromid, fluorodifen, fluoroglicofen, fluoronitrofen, fomesafen, furiloxifen, halosafen, lactofen, nitrofen, nitrofluorfen e oxyfluorfen; herbicidas de ditiocarbamatos tais como dazomet e metam; herbicidas alifáticos halogenados tais como alorac, cloropon, dalapon, flupropanato, hexacloroacetona, iodometano, brometo de metilo, ácido monocloroacético, SMA e TCA; herbicidas de imidazolinona tais como imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin e imazethapyr; herbicidas inorgânicos tais como sulfamato de amónio, bórax, clorato de cálcio, sulfato de cobre, sulfato ferroso, azida de potássio, cianato de potássio, azida de sódio, clorato de sódio e ácido sulfúrico; herbicidas de nitrilo tais como bromobonil, bromoxinil, cloroxinil, diclobenil, iodobonil, ioxinil e piraclonil; herbicidas organofosforados tais como amiprofos-metilo, anilofos, bensulida, bilanafos, butamifos, 2,4-DEP, DMPA, EBEP, fosamina, glifosato e piperfo; herbicidas fenoxi tais como bromofenoxim, clomeprop, 2,4-DEB, 2,4-DEP, difenopenten, dissulf, erbon, etnipromid, fenteracol e trifopsime; herbicidas fenoxiacéticos tais como 4-CPA, 2,4-D, 3,4-DA, MCPA, MCPA-tioetil e 2,4,5-T; herbicidas fenoxibutiricos tais como 4-CPB, 2,4-DB, 3,4-DB, MCPB e 2,4,5-TB; herbicidas fenoxipropiônicos tais como cloprop, 4-CPP, diclorprope, diclorprop-P, 3,4-DP, fenoprop, mecoprope e mecoprope-P; herbicidas ariloxifenoxipropiónicos, tais como clorazifop, clodinafop, clofop, cyhalofop, diclofop, fenoxaprop, fenoxaprop-P, fenthiaprop, fluazifop, fluazifop- P, haloxifop, haloxifop-P, isoxapirifop, metamifop, propaquizafop, quizalofop, quizalofop- P e trifop; herbicidas de fenilenodiamina tais como dinitramina e prodiamina; herbicidas de pirazolilo, tais como benzofenap, pirazolinato, pirrasulfotole, pirazoxif eno, piroxasulfona e topramezona; herbicidas de pirazolilfenilo tais como fluazolato e piraflufena; herbicidas de piridazina tais como a credazina, piridafol e piridato; herbicidas de piridazinona tais como brompirazona, cloridazona, dimidazona, flufenpir, metflurazona, norflurazona, oxapirazona e piranona; herbicidas de piridina, tais como aminopiride, cliodinato, clopiralide, ditiopir, fluroxipir, haloxidina, picloram, picolinafena, pirinil, tiazopir e triclopir; herbicidas de pirimidinodiamina tais como iprimidam e tioclorim; herbicidasde amônio quaternário, como cyperquat, diethamquat,difenzoquat, diquat, morfamquat e paraquat; herbicidas de tiocarbamato tais como butilato, cicloato, di-alato, EPTC, esprocarb, etiolato, isopolinato, metiobencarb, molinato, orbencarb, pebulado, prosulfocarb, piributicarb, sulfato, tiobencarb, tiocarbazil, tri-alato e vemolato; herbicidas de tiocarbonato tais como dimexano, EXD e proxano; herbicidas de tioureia tais como methiuron; herbicidas de triazina tais como dipropetrina, triaziflam e tri- hidroxitriazina; herbicidas de clorotriazina tais como atrazina, cloroazina, cianazina, ciprazina, eglinazina, ipazina, mesoprazina, procyazina, proglinazina, propazina, 44/69 sebutilazina, simazina, terbutilazina e trietazina; herbicidas de metoxitriazina tais como atraton, metometona, prometona, secbumeton, simeton e terbumeton; herbicidas de metiltiotriazina tais como ametrina, aziprotrina, cianatria, desmetria, dimetametria, metotrofina, prometrina, simetrina e terbutrina; herbicidas triazinona tais como ametridiona, amibuzina, hexazinona,isometiozina, metamitrona e metribuzina; herbicidas de triazole tais como amitrole, cafenstrole, epronaz e flupoxam; herbicidas triazolona tais como amicarbazona, bencarbazona, carfentrazona, flucarbazona, propoxicarbazona, sulfentrazonae tiencarbazona-metilo; herbicidas de triazolopirimidina taiscomo cloransulame, diclosulame, florasulame, flumetsulame, metosulame, penoxsulame e piroxsulame; herbicidas de uracilo tais como butafenacilo, bromacil, flupropacil, isocil, lenacil e terbacil; 3-feniluracilos; herbicidas de ureia tais como benzotiazuron, cumiluron, cicluron, dicloralureia, diflufenzopir, isonoruron, isouron, methabenztiazuron, monisouron e noruron; herbicidas de feniluréia, tais como anisuron, buturon, chlorbromuron, chloreturon, chlorotoluron, chloroxuron, daimuron, difenoxuron, dimefuron, diuron, fenuron, fluometuron, fluothiuron, isoproturon, linuron, methiuron, metildinron, metobenzuron, metobromuron, metoxuron, monolinuron, monuron, neburon, parafluron, fenobenzuron, siduron, tetrafluron e thidiazuron; herbicidas pyrimidinylsulfonylurea tal como amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, chlorimuron, ciclosulfamuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flucetosulfuron, flupirsulfurão, foramsulfuron, halosulfuron, imazosulfuron, mesossulfurão, nicossulfurão, ortossulfamurão, oxasulfuron, primi sul furão, 45/69 pirazossulfuron, rimsulfurão, sulfometurão, sulfossulfur e trifloxisulfuron; herbicidas de triazinilsulfonilureia tais como clorsulfuron, cinossulfuron, etametsulfuron, iodossulfuron, metsulfuron, prosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, triflusulfuron e tritosulfuron; herbicidas de tiadiazolilureia, tais como buthiuron, etidimuron, tebuthiuron, tiazafluron e thidiazuron; Herbicidas não classificados como acroleína, álcool alílico, aminociclopiraclor, azafenidina, benazolina, bentazona, benzobiciclon, butidazol, cianamida de cálcio, cambendicloro, clorfenac, clorfenprop, clorflurazol, clorofurenol, cinmetilina, clomazona, CPMF, cresol, orto- diclorobenzeno, dimepiperato, endotal , fluoromidina, fluridona, flurocloridona, flurtamona, flutiaceto, indanofan, metazole, isotiocianato de metilo, nipiraclofeno, OCH, oxadiargil, oxadiazona, oxaziclomefona, pentaclorofenol, pentoxazona, acetato de fenilmercúrio, pinoxaden, prosulfalina, piribenzoxim, piriftalide, quinoclamina, rodetanil, sulglicapina, tidiazimina , tridiphane, trimeturon, tripropindan e tritac. As composições herbicidas da presente invenção podem, além disso, ser usadas em conjunto com o glifosato ou 2,4-D em culturas tolerantes ao glifosato ou tolerantes ao 2,4-D. É geralmente preferido utilizar as composições da invenção em combinação com herbicidas que são seletivos para a cultura a ser tratada e que complementam o espectro de ervas daninhas controladas por estas composições à taxa de aplicação utilizada. É ainda geralmente preferido aplicar as composições da invenção e outros herbicidas complementares ao mesmo tempo, seja como uma formulação de combinação ou como uma mistura de tanque.

III. Métodos de Uso de Composições de L-glufosinato

[00105] As composições aqui descritas podem ser utilizadas em métodos para controlar seletivamente ervas daninhas em um campo ouem qualquer outra área, incluindo, por exemplo, um caminho de ferro, relvado, campo de golfe e outros onde o controle de ervas daninhas é desejado. Opcionalmente, o campo ou outra área pode conter sementes plantadas ou culturas resistentes ao glufosinato. Os métodos podem incluir a aplicação de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo L- glufosinato como aqui descrito ao campo.

[00106] As composições aqui descritas são úteis para aplicação em um campo de plantas cultivadas para a prevenção ou controle de ervas daninhas. A composição pode ser formulada como um líquido para pulverização em um campo. O L-glufosinato é fornecido na composição em quantidades eficazes. Como usado aqui, a quantidade efetiva significa de aproximadamente 10 gramas ingrediente ativo por hectare a aproximadamente 1,500 gramas ingrediente ativo por hectare, por exemplo, de aproximadamente 50 gramas a aproximadamente 400 gramas ou de aproximadamente 100 gramas a aproximadamente 350 gramas. Em algumas formas de realização, o ingrediente ativo es L-glufosinato. Por exemplo, a quantidade de L- glufosinato na composição pode ser aproximadamente 10 gramas, aproximadamente 50 gramas, aproximadamente 100 gramas, aproximadamente 150 gramas, aproximadamente 200 gramas, aproximadamente 250 gramas, aproximadamente 300 gramas, aproximadamente 350 gramas, aproximadamente 400 gramas, aproximadamente 500 gramas, aproximadamente 550 gramas, aproximadamente 600 gramas, aproximadamente 650 gramas, aproximadamente 700 gramas, aproximadamente 750 gramas, aproximadamente 800 gramas, aproximadamente 850 gramas, ou aproximadamente 1,500 gramas L-glufosinato por hectare.

IV. Exemplos de formas de realização

[00107] As formas de realização não limitativas incluem: 1. Método para a produção de L-glufosinato, que compreende: - reação de D-glufosinato com uma enzima D-aminoácido oxidase (DAAO) para formar PPO ácido (2-oxo-4- (hidroxi (metil) fosfinoílo) butírico); e - aminação de PPO em L-glufosinato por uma enzima transaminase (TA), utilizando um grupo amina de um ou mais dadores de amina, -onde ao menos 70% do D-glufosinato é convertido em L- glufosinato. 2. Método de acordo com a forma de realização 1, onde o doador de amina é selecionado do grupo que consiste em glutamato, L- glutamato, alanina, sec-butilamina, feniletilamina, glicina, lisina, valina, serina, glutamina, isopropilamina, etanolamina, ácido 2-aminobutírico, ácido diamino proprionico, ou qualquer amina secundária ou aminoácido. 3. Método de acordo com a forma de realização 1, onde o D- glufosinato está originalmente presente em uma mistura racêmica de D- e L-glufosinato ou seus sais. 4. Método de acordo com a forma de realização 1, onde a enzima DAAO é selecionada a partir da enzima de Rhodosporidium toruloides (UniProt P80324), Trigonopsis variabilis (UniProt Q99042), Neolentinus lepideus (KZT28066.1), Trichoderma reesei (XP_006968548.1), ou Trichosporon oleaginosus (KLT40252.1). 5. Método de acordo com a forma de realização 1, onde a enzima DAAO é um mutante DAAO. 6. Método de acordo com a forma de realização 5, onde o mutante DAAO é um DAAO mutante com base na sequência de Rhodosporidium toruloides. 7. Método de acordo com a forma de realização 5, onde o mutante DAAO compreende uma ou mais mutações nas posições 54, 56, 58, 213, e 238. 8. Método de acordo com a forma de realização 7, onde a mutação na posição 54 é selecionada do grupo que consiste em N54C, N54L, N54T, e N54V. 9. Método de acordo com a forma de realização 7, onde a mutação na posição 56 é T56M. 10. Método de acordo com a forma de realização 7, onde a mutação na posição 58 é selecionada do grupo que consiste em F58A, F58G, F58H, F58K, F58N, F58Q, F58R, F58S, e F58T. 11. Método de acordo com a forma de realização 7, onde a mutação na posição 213 é M213S. 12. Método de acordo com a forma de realização 5, onde o mutante DAAO compreende mutações F58K e M213S. 13. Método de acordo com a forma de realização 5, onde o mutante DAAO compreende mutações nas posições 54 e 56. 14. Método de acordo com a forma de realização 5, onde o mutante DAAO compreende mutações N54T e T56M. 15. Método de acordo com a forma de realização 5, onde o mutante DAAO compreende mutações F58Q ou F58H. 16. Método de acordo com a forma de realização 5, onde o mutante DAAO compreende mutações N54V e F58Q. 17. Método de acordo com a forma de realização 5, onde o mutante DAAO compreende mutações N54V, F58Q, e M213S. 18. Método de acordo com a forma de realização 1, onde a enzima TA é uma transaminase gabT de Escherichia coli( UniProt P22256). 19. Método de acordo com a forma de realização 1, onde a enzima TA é uma enzima codificada pela SEQ ID NO: 1. 20. Método de acordo com a forma de realização 1, onde a etapa de reação e a etapa de aminação são realizadas em um único recipiente. 21. Método de acordo com a forma de realização 20, onde todos os reagentes são substancialmente adicionados no inícioda reação. 22. Método de acordo com a forma de realização 20, onde os reagentes para a etapa de reação e os reagentes para a etapa de aminação são adicionados ao recipiente único em momentos diferentes. 23. Método de acordo com a forma de realização 1, onde a etapa de reação e a etapa de aminação são realizadas em recipientes separados. 24. Composição compreendendo D-glufosinato, PPO e L- glufosinato. 25. A composição de acordo com a forma de realização 24, onde a quantidade de L-glufosinato é 90% ou mais com base na quantidade total de D-glufosinato, PPO e L-glufosinato. 26. Método de acordo com a forma de realização 1, onde um sólido é obtido tendo a composição de acordo com a reivindicação 25. 27. Método de acordo com a forma de realização 1, onde uma solução de L-glufosinato é obtida para uso em uma formulação que possui atividade herbicida. 28. Formulação, que compreende: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 10-30% em pesoda formulação; - um ou mais componentes adicionais selecionados do grupo que consiste em sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidadede 10-40% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 0.5-2% em peso da formulação; dipropileno glicol em uma quantidade de 4-18% em peso da formulação; e - alquil polissacarídeo em uma quantidade de 4-20% em peso da formulação; e - água como o resto da formulação. 29. Formulação de acordo com a forma de realização 28, onde a formulação compreende: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 12.25% em peso da formulação; - sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 31.6%em peso da formulação; - 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; - dipropileno glicol em uma quantidade de 8.6% em peso da formulação; - alquil polissacarídeo em uma quantidade de 9.8% em peso da formulação; e - água em uma quantidade de 36.75% em peso da formulação. 30. Formulação de acordo com a forma de realização 28, ondea formulação compreende: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 24.5% em pesoda formulação; - sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 31.6%em peso da formulação; - 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; - dipropileno glicol em uma quantidade de 8.6% em peso da formulação; - alquil polissacarídeo em uma quantidade de 9.8% em peso da formulação; e - água em uma quantidade de 24.5% em peso da formulação. 31. Formulação de acordo com a forma de realização 28, ondea formulação compreende: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 12.25% em pesoda formulação; - sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 15.8%em peso da formulação; - 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 0.5% em peso da formulação; - dipropileno glicol em uma quantidade de 4.3% em peso da formulação; - alquil polissacarídeo em uma quantidade de 4.9% em peso da formulação; e - água em uma quantidade de 62.25% em peso da formulação. 32. Formulação, que compreende: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 10-30% em pesoda formulação; - um ou mais componentes adicionais selecionados do grupo que consiste em sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidadede 10-40% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 0.5-2% em peso da formulação; e alquil polissacarídeo em uma quantidade de 3-10% em peso da formulação; e - água como o resto da formulação. 33. Formulação de acordo com a forma de realização 32, onde a formulação compreende: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 12.25% em peso da formulação; - sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 22.1%em peso da formulação; - 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; - alquil polissacarídeo em uma quantidade de 6.2% em peso da formulação; e - água em uma quantidade de 58.45% em peso da formulação. 34. Formulação de acordo com a forma de realização 32, ondea formulação compreende: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 24.5% em pesoda formulação; - sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 22.1%em peso da formulação; - 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; - alquil polissacarídeo em uma quantidade de 6.2% em peso da formulação; e - água em uma quantidade de 46.2% em peso da formulação. 35. Formulação de acordo com a forma de realização 32, ondea formulação compreende: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 12.25% em peso da formulação; - sulfato de alquil éter de sódio em uma quantidade de 11.05%em peso da formulação; - 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 0.5% em peso da formulação; - alquil polissacarídeo em uma quantidade de 3.1% em peso da formulação; e - água em uma quantidade de 73.1% em peso da formulação. 36. Método para controlar seletivamente ervas daninhas emuma área que compreende: - aplicação de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo L-glufosinato em um excesso enantiomico superior a 90% em relação à D-glufosinato no área. 37. Método de acordo com a forma de realização 36, onde a quantidade de a composição é aplicada a menos de 400 gramasda soma de L-glufosinato e D-glufosinato por hectare. 38. Método para controlar seletivamente ervas daninhas emuma área que compreende: - aplicação de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo L-glufosinato em um excesso enantiomico superior a 90% em relação à D-glufosinato no área e mais de 0,01%, mas menos de 10% PPO no área. 39. Método de acordo com a forma de realização 38, onde a quantidade de a composição é aplicada a menos de 400 gramasda soma de L-glufosinato e D-glufosinato por hectare. 40. Método para controlar seletivamente ervas daninhas em uma área contendo uma colheita de sementes ou culturas plantadas que sejam resistentes ao glufosinato, que compreende: - aplicação de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo L-glufosinato em um excesso enantiomico superior a 90% em relação à D-glufosinato no área e mais de 0,01%, mas menos de 10% PPO no campo.

[00108] Os exemplos seguintes são oferecidos a título de ilustração e não como limitação.

EXEMPLOS Exemplo 1: purificação da enzima DAAO

[00109] A sequência de codificação de um DAAO mutante de Rhodosporidium toruloides (por exemplo, consistindo de uma sequência líder de MMARIRL e as mutações F58Ke M213S) foi clonado no vector pET14b para permitir a expressão de uma proteína marcada com 6xHis N-terminal. Este plasmídeo pET14b-RgDAAO foi transformado em células BL21 (BE3) trxB pLysS. A sequência do DAAO do tipo selvagem de Rhodosporidium toruloides, à qual corresponde toda a em numeração aqui descrita, é: MHSQKRVVVLGSGVIGLSSALILARKGYSVHILARDLPEDVSSQTFASPWAGANWT PFMTLTDGPRQAKWEESTFKKWVELVPTGHAMWLKGTRRFAQNEDGLLGHWYKDITPNYRP LPSSECPPGAIGVTYDTLSVHAPKYCQYLARELQKLGATFERRTVTSLEQAFDGADLVVNA TGLGAKSIAGIDDQAAEPIRGQTVLVKSPCKRCTMDSSDPASPAYIIPRPGGEVICGGTYG VGDWDLSVNPETVQRILKHCLRLDPTISSDGTIEGIEVLRHNVGLRPARRGGPRVEAERIV LPLDRTKSPLSLGRGSARAAKEKEVTLVHAYGFSSAGYQQSWGAAEDVAQLVDEAFQRYHG AARESKL (SEQ ID NO: 2).

[00110] Para purificar a enzima DAAO, as células foram cultivadas em meio de autoindução de 400 mL (base de caldo LB com oligoelementos, Formedium) a 30°C durante 20 a 24 horas. As células foram colhidas em centrífugas e baldes pré- resfriados, lavadas com água fria, novamente centrifugadas e armazenadas a -80°C até purificação.

[00111] Os sedimentos celulares foram depois descongelados em tampão de lise (fosfato de potássio 50 mM, pH 8,0, imidazole 20 mM e 1% de cocktail inibidor de protease Sigma (PIC) sem EDTA) a um volume de 5 mL de tampão de lise por 1 gde sedimento celular. Enquanto no gelo, as células foram sonicadas 4 vezes durante 30 segundos a uma amplitude de 10. O ligado celular foi clarificado por centrifugação e depois adicionado a resina de cobalto (HisPur Cobalt, ThermoScientific) a 4 vezes o volume do leito. O lisado celular foi incubado durante 1 hora, com agitação suave, à temperatura ambiente. A resina foi adicionada a uma coluna e lavada duas vezes com volumes de 5 leitos de tampão delavagem (Kpi 50 mM, pH 8,0, imidazole 20 mM). A eluição foi realizada 4 vezes com 1 volume de leito de tampão de eluição (50 mM Kpi, 200 mM de imidazole).

Exemplo 2: Determinação colorimétrica da atividade de DAAO

[00112] A atividade de DAAO foi determinada similarmente a Berneman et al. Em resumo, 100 μl de substrato e HRP (0,1 mg/mL de HRP, Sigma P8375 e a quantidade desejada de D- glufosinato ou D/L-glufosinato racêmico em fosfato de potássio 50 mM, pH 8) foram adicionados a um micro-cuvette marca UV. A isso, 50 μl de corantes (60 μg/mL de TBHBA, Sigma 439533 e 1 mg/mL de 4-aminoantipirina, Sigma A4382, em fosfato de potássio 50 mM, pH 8) foram adicionados e então 50 μl de mistura enzimática (concentração de DAAO como desejado em 100 mM de fosfato de potsio, pH 8). A reaco foi monitorizada em um espectrofotetro a 510 nm ao longo de um tempo apropriado para determinar a cinética enzimática. Embora não tenha sido adicionado dinucleótido de flavina adenina (FAD) para a purificação do DAAO nem para a reação, este reagente pode opcionalmente ser incluído. Duas variantesmutantes exemplificativas de Rhodosporidium toruloides DAAO, AC201 (contendo F58K e M213S) e AC263 (contendo N54T, T56M, F58K e M213S), purificadas como no Exemplo 1, foram testadas utilizando este ensaio e mostraram produzir peróxido de hidrogénio, demonstrando a sua atividade na oxidação do D- glufosinato. O AC201 e o AC263 têm Vmax similar, mas o AC263 tem um KM menor.

Exemplo 3: Purificação de transaminases

[00113] Para purificar, por exemplo, a Escherichia coli gabam transaminase (http://www.uniprot.org/uniprot/P22256), ogene foi amplificado a partir da cepa ER2925 de E. coli K12 e clonado em pET-14b para gerar uma versão marcada 6xHis no terminal N. Este plasmídeo foi então transformado em células BL21 (DE3) para indução. Após indução no meio de autoindução,as células foram lisadas por sonicação e a enzima marcada com 6xHis foi purificada como descrito no Exemplo 1. Este plasmídeo foi então transformado em células BL21 (DE3) para indução. Após indução no meio de autoindução, as células foram lisadas por sonicação e a enzima marcada com 6xHis foi purificada como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 4: Demonstração da atividade das transaminases

[00114] Em um exemplo não limitativo, a fonte de PPO para um ensaio de transaminação pode ser D-glufosinato ou D/L- glufosinato racémico que foi convertido por um DAAO em PPO.Na primeira etapa, incubou-se 39 mM de D/L-glufosinatoracémico com 0,5 mg/mL de Rhodosporidium toruloides DAAO F58KM213S e 10 ug/mL de catalase em tampão fosfato de potássio 50mM, pH 8 durante 20 horas a 30°C. Isso resultou na conversão da maioria do D-glufosinato em PPO. Subsequentemente, foi adicionado gabi de E. coli purificado a 20 ug/mL e foi adicionado L- glutamato a 50 mM como o doador de amina. Em pontos relevantes, as amostras foram paradas por ebulição durante 10 minutos, seguido de precipitação com um volume igual de acetonitrilo. As espécies químicas individuais foram resolvidas em um HPLC com coluna Chirobiotic T2 e quantificadas por comparação com padrões autênticos.

[00115] A combinação de uma variante mutante de DAAO e uma transaminase resultou em uma melhora de um enriquecimento enantiomérico que começou em 0% de L-glufosinato sobre D- glufosinato (isto é, representação igual de D-glufosinato e L- glufosinato) a um enriquecimento enantiomeric de 92%. Estes resultados demonstram que a E. coli gabT possui atividade transaminase e este ensaio pode ser utilizado para determinara atividade de qualquer número de transaminases potenciais mutantes e/ou selvagens.

Exemplo 5: Desracemização de D/L-glufosinato racêmico em um único vaso

[00116] As reações foram preparadas de forma semelhante àdo Exemplo 4. O sistema (5,45 mL, 30°C) foi corrido em tampãofosfato a um pH de 7,3. Notou-se que 50 mM de tampão fosfato a um pH de 8,0 era inadequado para tamponar as adições de aminoácidos e que o pH não ajustado após as adições de aminoácidos neste sistema era pH 6,4. O pH foi ajustado usando 1M do sal de base K2HPO4 para um volume de 5,45 mL, o que significa que a concentração inicial real do substrato por adição foi de 275 mM. Os reagentes seguintes foram adicionados essencialmente simultaneamente no inicio da reação: 271 mg de D, L-glufosinato, 420 mg de glutamato, 15mg de AC263 DAAO, 50 de catalase e 1,0 mg de E. coli TAG transaminase. A Figura 2 mostra que, quando todos os reagentes foram adicionados, uma quantidade de D-PPT (D- glufosinato) diminuiu com apenas uma modesta acumulação de PPO. Este resultado indica uma deracemização eficiente de D/L-glufosinato em L- glufosinato pelo par de enzimas RgDAAO/EcgabT.

Exemplo 6: Demonstração de enzimas DAAO aprimoradas

[00117] Utilizando as estratégias de mutagénese proteica como delineado acima, foram identificadas enzimas DAAO melhoradas e variantes. As enzimas foram analisadas de acordo com os procedimentos descritos abaixo.

Solução mãe:

[00118] As seguintes soluções de corantes foram preparadas: uma 20 mg/mL solução mãe de ácido 2,4,6-tribromo-3- hidroxibenzóico (TBHBA) em DMSO; e uma 100 mg/mL solução mãede 4-aminoantipirina (4-AAP) em água. A seguinte solução mãe de enzima foi preparada: 1 mg/mL solução mãe de peróxido de rábano (HRP) tipo 6 em tampão de fosfato de potássio pH 8,0. A seguinte solução mãe de substrato foi preparada: concentrações variáveis do aminoácido D ou DL em um tampão de fosfato de potássio a pH 8,0.

Misturas de reação:

[00119] A seguinte misturas de reação foram preparadas:

[00120] A mistura A é uma combinação do substrato e da enzima HRP. As soluções foram preparadas para cada concentração de substrato a ser testada usando o tampão dereação. As soluções foram duas vezes a concentração final do substrato e 0,2 mg/mL para a solução HRP. 59/69

[00121] A mistura B é uma mistura de corante. A 5 mL de tampão de reação foram adicionados 120 μl de TBHBA solução e 400 μL de 4-AAP solução.

[00122] A mistura C é uma mistura de enzimas. A 0.1 mg/mL DAAO solução em tampão de reação foi preparado. A concentração final da reação foi de 25 μg/mL.

Protocolo:

[00123] Um espectrofotômetro foi utilizado em um comprimento de onda de 510 nm, o que corresponde à absorbância máxima para 4-AAP/TBHBA e é o ponto em que o coeficiente de extinção é 29400 M-1 cm-1. A temperatura para realização dos ensaios foi de 30°C. A cinética da reação foi obtida medindo a cada minuto por 15 minutos. Entre as medidas, foram realizados 20 segundos de agitação orbital em intensidade normal, seguidos de 10 segundos de tempo de estabilização.

[00124] Utilizando uma placa de 96 cavidades, as seguintes misturas (com replicados) foram adicionadas na seguinte ordem utilizando multi-canal: 100 de mistura A, 50 de mistura B e 50 de mistura C. As medições foram iniciadas imediatamente após a adição da enzima.

[00125] A cinética enzimática foi medida como descrito acima, plotada em um gráfico de Michaelis Menten e usada paracalcular Vmax e KM. Para a variante Ac302 (54V, 58Q, 213S), oVmax foi de 4,2 umol/min * mg.

[00126] Esta análise foi completada para um número de variantes das enzimas DAAO como acima, excepto que o stock daMistura C foi solução DAAO, 0,2 mg/mL, e esta concentração final da reação de DAAO foi 50 ug/mL.

[00127] Como mostrado no Quadro 1, as enzimas variantesDAAO mostraram uma gama de atividades: Quadro 1:

Exemplo 7: Des-racemização de D/L-glufosinato racémico a um tamanho de reação de 5 L

[00128] A escala da des-racemização é aumentada usando abordagens familiares aos especialistas na técnica. Os reagentes e as suas razões relativas são substancialmentesemelhantes ao Exemplo 5, mas as quantidades são significativamente maiores. Em vez de tubos em agitadores, as reações são realizadas em reatores encamisados agitados, incluindo, opcionalmente, ar ou oxigénio do caldo ou cabeça. Esses reatores variam em tamanho, de menos de 10 mL de reaçãoa dezenas ou centenas de milhares de litros. As taxas de agitação são escolhidas para aumentar a mistura de reação e a taxa, minimizando o consumo de energia e o cisalhamento.

[00129] Em um exemplo, a reação foi executada na escala de 5 L. O sistema (5 L, 30°C) foi corrido em tampão fosfato 200 mM a um pH de 8,0 em um reator encamisado agitado. Um reagente seguinte foi adicionado essencialmente simultaneamente no inicio da reação: 300 mM de D, L- glufosinato, 900 mM de glutamato, 7,5 g de AC302 DAAO, 0,2 g de catalase e 1,0 g de E. coli gab T transaminase. Além disso, 500 mL de isopropanol foram adicionados para controlar a formação de espuma. Durante o curso da reação, o ar foi introduzido a 0,3 VVM (volumes de ar por volume de mistura de reação por minuto).

[00130] A análise por HPLC da reação demonstrou que o equilíbrio foi alcançado em 8 horas, com o excesso enantiomérico de L- glufosinato sobre D-glufosinato maior que 99% e a relação de L- glufosinato para PPO de 90% a 10%. Este resultado indica uma deracremização eficiente de D/L- glufosinato em L-glufosinato pelo par de enzimas RgDAAO/EcgabT em maior escala.

Exemplo 8: Impacto do oxigênio na taxa de reação

[00131] Embora reatores encamisados, agitados ou colunas imobilizadas tipicamente permitem alguma transferência de oxigênio, a taxa de absorção de oxigênio proporcionada pela aeração passiva não é suficiente para um processo eficiente. Em um exemplo, uma reação foi realizada no mesmo recipiente que o Exemplo 7 em substancialmente as mesmas condições, mas em reduzido (0,01 VVM), com o dobro de AC302 DAAO em uma base volumétrica (3 g/L versus 1,5 g/L), e sem o isopropanol. Neste caso, a reação levou mais de 60 horas para atingir o equilíbrio, demonstrando a importância crítica da aeração para uma reação eficiente.

Exemplo 9: Co-imobilização de DAAO e TA

[00132] As enzimas DAAO e TA foram co-imobilizadas em contas de vidro de poros controlados EziG (EnginZyme). 100 mgde esferas EziG tipo 3 foram agitadas temperatura ambientecom 3 mL de solução contendo 16 mg de AC302 DAAO purificado e 1,6 mg de gabT purificado em 50 mM de tampão de fosfato de potássio pH 7,5, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazole em um tubo Falcon de 50 mL. Após 30 minutos, as esferas foram centrifugadas, a solução imobilizante foi removida e as contas foram lavadas 3 vezes com 10 ml de tampão de fosfato de potássio 100 mM, pH 7,5.

[00133] A reação foi iniciada adicionando todos os outros componentes às contas lavadas. A mistura de reação continha 300 mM de D/L-glufosinato, 900 mM de ácido L-glutâmico, 50 ugde catalase, 198 mM de fosfato de potássio em 2,5 mL. Areação foi incubada a 3°C com agitação (250 rpm) em um tubode 50 mL coberto por parafilme com orifícios perfurados para troca de gás.

[00134] Após 1 hora, a depleção de D-glufosinato e a formação de L-glufosinato foram determinadas por HPLC e estas taxas foram calculadas. Após 6 horas, as contas foram centrifugadas, a mistura reacional foi removida e as contas foram lavadas 3 vezes com 10 ml de tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,5. As contas foram então armazenadas a 4°C durante 18 a 72 horas antes da reação ser repetida, em um total de 15 vezes, após o que a atividade retida foi superior a 50% da atividade inicial.

Exemplo 10: Efeito do tampão na reação

[00135] Quando as enzimas solúveis AC302 DAAO e E. coligabT TA são utilizadas, o tampão fosfato a > 50 mM é necessário para a atividade completa. Uma reação de 100 mL foi incubada a 30°C com agitação (250 rpm) em um frasco de 500 mL coberto com parafilme. Uma bomba de ar foi usada para borbulhar ar através da reação durante as primeiras 5 horas.A bomba de ar foi removida para incubação durante a noite para que a reação não borbulhe e novos parafilmes com furos de ar fossem usados para troca de gás. A mistura de reação continha 300 mM de D/L-glufosinato, 905 mM de ácido L- glutámico, 80 mg de AC302 DAAO (0,8 mg/mL), 14,5 mg de gabT (0,145 mg/mL), 2 mg de catalase e isopropanol como reagente antiespuma (concentração inicial de 10%, isopropanol foi adicionalmente adicionado a 2 h (2 mL), 3 h (1 mL), 3,5 h (1mL) e a 4 h (2 mL)). 500 uL de NaOH IN foram utilizados (adicionado antes das enzimas) para ajustar o pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 7.0. pH permaneceu em aproximadamente 7 para a reação completa sem ajuste adicional. Devido ao tampão fosfato de potássio no tampão de enzima, a mistura final foi de 45 mM de tampão fosfato.Comparado com uma reação similar com tampão fosfato 200 mM, ataxa de reação foi 50-60% da reação com o tampão 200 mM.

[00136] Quando as enzimas AC302 DOOA e E. coli gatT TA imobilizadas são utilizadas, o tampão fosfato de menos de 1mM é suficiente para a atividade completa. Proteínasimobilizadas foram preparadas e a reação realizada como no Exemplo 9 para a reação “Tamponada”. Adicionalmente, prepararam-se proteínas imobilizadas e realizaram-se asreações como no Exemplo 9 para a reação "pH 7", exceto que foi utilizado hidróxido de sódio para ajustar o pH a pH 7 enão foi adicionado tampão fosfato (o tampão fosfato residual do tampão de armazenamento enzimático é inferior a 1 mM).Este trabalho demonstrou que a taxa de reação inicial para asreações DAAO e DAAO e gabT combinadas é muito semelhante come sem a adição de tampão fosfato quando enzimas imobilizadas são utilizadas.

Exemplo 11: Isopropilamina como doador de amina

[00137] A isopropilamina pode ser usada como um doador de amina para conversão de PPO em L-glufosinato com o uso de um TA apropriado. A PPO foi convertida em L-glufosinato em reação com os seguintes componentes: • 0.25 mg/mL TA codificada por SEQ ID NO: 1 • 25 mM PPO • 0.2 mM fosfato de piridoxal • 250 mM isopropylamine (pH 8 com H3PO4) • 100 mM tampão Kphos pH 8.0

[00138] A reação foi incubada a 25 a 30°C durante 30 horas com agitação suave (250 rpm). Às 0 horas, a quantidade de L- glufosinato medida por HPLC foi 0 mM, às 20 horas era 14 mM e às 30 horas era 18 mM. Isto demonstra que a enzima codificadapela SEQ ID NO: 1 pode converter a PPO em L-glufosinato.

Exemplo 12: Lisina como doador de amina

[00139] Lisina pode ser usada como um doador de amina para conversão de PPO em L-glufosinato com o uso de um TA apropriado. A PPO foi convertida em L-glufosinato em reação com os seguintes componentes: • 0.4 mg/mL gabT (purificado como no exemplo 3) • 25 mM PPO (pH 8 com H3PO4) • 0.2 mM fosfato de piridoxal • 75 mM L-Dicloridrato de lisina (pH 8 com NaOH) • 100 mM tampão Kphos pH 8.0 A reação foi incubada a 30°C durante 30 horas com agitação (250 rpm). O L-glufosinato foi formado a uma taxa de 0,4 mM/h durante as 20 horas. Isto demonstra que a L-lisina pode ser utilizada para converter o PPO em L-glufosinato.

Exemplo 13: Purificação e isolamento de L-glufosinato

[00140] Vários lotes preparados seguindo o procedimento descrito no Exemplo 9, mas em escala maior, foram gerados. Após as contas terem sido removidas, cada lote foi aquecido a 90 ° C durante pelo menos 10 minutos, e após arrefecimento a 2025 ° C, filtrado para remover uma pequena quantidade de sólidos. A cada lote individual foi adicionado HCl a 37%, gota a gota, para efetuar a precipitação do ácido glutâmico.A quantidade de 37% de HCl adicionado foi de aproximadamente 10% do volume do lote. O sólido branco resultante foiremovido por filtração. Os lotes foram combinados e concentrados sob vácuo até um óleo; o óleo continha aproximadamente 153 gramas de L- glufosinato. O óleo foi diluído com cinco volumes de água e 37% de HCl foi adicionado para ajustar a solução ao pH 1. A solução foi tratada sequencialmente com duas porções de aproximadamente 3,0 kg deresina de troca catiônica DOWEX 50WX8 pré-lavada. Em cada tratamento, a solução foi deixada a misturar com a resina durante 30 minutos após o que a resina foi isolada em um filtro. Ambas as porções de resinas foram combinadas e lavadas primeiro com água e depois eluídas comh 4M NH4OH. O eluente foi concentrado sob vácuo até um óleo; PPO e 2- oxoglutarato não estavam presentes no óleo. Aproximadamente 100 gramas do óleo foram diluídos com água e o hidróxido de amônio aquoso foi adicionado até o pH ser de aproximadamente 9. O lote foi adicionado 1,0 kg de resina de troca aniônica DOWEX Monosphere (forma de hidróxido) prélavada e a mistura foi agitada durante aproximadamente 40 minutos. Uma 66/69 quantidade igual de resina DOWEX Monosphere, pré-lavada, foi carregada em uma coluna de vidro. A pasta de resina DOWEX em água foi adicionada à coluna no topo da resina pré-lavada. Adicionou-se 800 mL de água à coluna seguida por 0,1 N de ácido acético, o qual foi mantido a fluir através da coluna até todo o ácido glutâmico ter sido eluído como determinado por HPLC. 4 N ácido acético foi alimentado à coluna até todo o L-glufosinato ter sido eluído da coluna como determinado por HPLC. A solução de L-glufosinato foi concentrada sob vácuo. O óleo resultante foi diluído com água e concentrado sob vácuo até ao volume mínimo duas vezes. O metanol foi adicionado até que uma solução clara fosse obtida e um volumeigual de heptano fosse adicionado. A mistura foi concentrada sob vácuo até ao volume mínimo e o procedimento foi repetido. Os 168 gramas restantes de óleo recuperado do tratamento de troca catiônica foram tratados de maneira similar para obter um total geral de 108 gramas de L- glufosinato bruto. A proporção de L-glufosinato para ácido glutâmico foi superior a 99: 1, conforme determinado por RMN. O sido resultante foi misturado com hidróxido de amônio aquoso e concentrado até a secura para proporcionar 111 gramas de L- glufosinato de amonio. Nem o metanol nem o ácido acético foram detectadospor análise de RMN do produto.

[00141] Entende-se que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever apenas formas de realização particulares, e a terminologia não se destina a ser limitativa. O âmbito da invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um especialista na técnica à qual esta invenção pertence. Quando um intervalo de valores é fornecido, entende-se que cada valor interveniente, para o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto indique claramente o contrário, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor declarado ou interveniente esse intervalo declarado, é abrangido pela invenção. Os limites superior e inferior destes intervalos menores podem, independentemente, ser incluídos nos intervalos menores e estão também abrangidos no âmbito do invento, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicado. Onde o intervalo declarado inclui um ou ambos os limites, intervalos excluindo qualquer um dos dois limites incluídos são também incluídos na invenção. Certos intervalos são apresentados aqui com valores numéricos sendo precedidos pelo termo "aproximadamente". O termo "aproximadamente"é usado aqui para fornecer suporte literal para o número exato que ele precede, bem como um número que esteja próximo de aproximadamente o número que o termo precede. Ao determinar se um número está próximo de aproximadamente um número especificamente recitado, o número próximo ou próximo de não-recitado pode ser um número, o qual, no contexto em que é apresentado, fornece o equivalentesubstancial do número especificamente recitado.

[00142] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados nesta especificação são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para serincorporado por referência. Além disso, cada publicação, patente ou pedido 68/69 de patente citada é aqui incorporada por referência a divulgar e descrever o assunto em conexão com o qual as publicações são citadas. A citação de qualquer publicação é para a sua divulgação antes da data de apresentação e não deve ser interpretada como uma admissão deque a invenção aqui descrita não tem o direito de antedatar tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas reais de publicação, que podem precisar ser confirmadasindependentemente.

[00143] Note-se que as reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração destina-se a servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como "somente", e similares em conexão com os elementos de recitação de acordo com a reivindicação, ou uso de uma limitação "negativa". Como será evidente pelos especialistas na técnica ao ler esta descrição, cada uma das formas de realização individuais descritas e ilustradas aqui tem componentes e característicasdiscretas que podem ser prontamente separadas de ou combinadas com as características de qualquer uma das outras várias formas de realização sem sair do escopo ou espírito dainvenção. Qualquer método recitado pode ser executado na ordem dos eventos recitados ou em qualquer outra ordem que seja logicamente possível. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam também ser utilizados na prática ou teste da invenção, métodos e materiais ilustrativos representativos são agora descritos. SEQUÊNCIAS SEQ ID NO. 1: MNIAAQSWERREATSFFHTFTDLPSLKTDGPVIIDHGEGPYIIDTVGRRYFEGNSGLWNMT LGFSERRLSDAALKQYQEFPGYHTFFGRNSKPTVELAERMLKLAPAPMSRVFFTNSGSEAN ESIVKLLWMMWAAEGRPERRKLLTRKNAYHGATVMASALTGKDYVKAFGLPGPEIVTLDCP HAWRFALPGEGDDEFAARLAANLETRILQEGPETIAGMFAEPVMGAGGVIVPPATYFAKIQ PVLQRYGIPLIADEVICGFGRTGSLWGTLAVGQQPDIIVASKSMSAGYFPMGAVMLSADID KRATAASEVWEEFPHGFTTGGHPVGCAISLEAIRIITEEGVFENVKSVSETFQSGLRALAD HPMIGEARGMGLMGALETVADKKTKQSFSGDLRIGERISKEARDRGFIIRPLGSSVVLAPP FISTHGQIEELLAVLKEVLDVVYGTVKGEVA SEQ ID NO. 2: MHSQKRVVVLGSGVIGLSSALILARKGYSVHILARDLPEDVSSQTFASPWAGANWTPFMTL TDGPRQAKWEESTFKKWVELVPTGHAMWLKGTRRFAQNEDGLLGHWYKDITPNYRPLPSSE CPPGAIGVTYDTLSVHAPKYCQYLARELQKLGATFERRTVTSLEQAFDGADLVVNATGLGA KSIAGIDDQAAEPIRGQTVLVKSPCKRCTMDSSDPASPAYIIPRPGGEVICGGTYGVGDWD LSVNPETVQRILKHCLRLDPTISSDGTIEGIEVLRHNVGLRPARRGGPRVEAERIVLPLDR TKSPLSLGRGSARAAKEKEVTLVHAYGFSSAGYQQSWGAAEDVAQLVDEAFQRYHGAARESKL SEQ ID NO. 3: MNSNKELMQRRSQAIPRGVGQIHPIFADRAENCRVWDVEGREYLDFAGGI AVLNTGHLHPKVVAAVEAQLKKLSHTCFQVLAYEPYLELCEIMNQKVPGD FAKKTLLVTTGSEAVENAVKIARAATKRSGTIAFSGAYHGRTHYTLALTG KVNPYSAGMGLMPGHVYRALYPCPI.HGISEDDAIASIHRIFKNDAAPED IAAIVIEPVQGEGGFYASSPAFMQRLRALCDEHGIMLIADEVQSGAGRTG TLFAMEQMGVAPDLTTFAKSIAGGFPLAGVTGRAEVMDAVAPGGLGGTYA GNPIACVAALEVLKVFEQENLLQKANDLGQKLKDGLLAIAEKHPEIGDVR GLGAMIAIELFEDGDIINKPDAKLTAEIVARARDKGLILLSCGPYYNVLR ILVPLTIEDAQIRQGLEIISQCFDEAKQ

Claims (4)

1. Formulação, caracterizada por compreender: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 10-30% em peso da formulação; - um ou mais componentes adicionais selecionados do grupo que consiste em alquil éter sulfato de sódio em uma quantidade de 1040% em peso da formulação; 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 0,5-2% em peso da formulação; dipropilenoglicol em uma quantidade de 4-18% em peso da formulação; e alquil polissacarídeo em uma quantidade de 4-20% em peso da formulação; e água como o equilíbrio da formulação.

2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 12,25% em peso da formulação; - alquil éter sulfato de sódio em uma quantidade de 31,6% em peso da formulação; - 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; - dipropilenoglicol em uma quantidade de 8,6% em peso da formulação; - alquil polissacarídeo em uma quantidade de 9,8% em peso da formulação; e - água em uma quantidade de 36,75% em peso da formulação.

3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 24,5% em peso da formulação; - alquil éter sulfato de sódio em uma quantidade de 31,6% em peso da formulação; - 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 1% em peso da formulação; - dipropilenoglicol em uma quantidade de 8,6% em peso da formulação; - alquil polissacarídeo em uma quantidade de 9,8% em peso da formulação; e - água em uma quantidade de 24,5% em peso da formulação.

4. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender: - L-glufosinato de amônio em uma quantidade de 12,25% em peso da formulação; - alquil éter sulfato de sódio em uma quantidade de 15,8% em peso da formulação; - 1-metoxi-2-propanol em uma quantidade de 0,5% em peso da formulação; - dipropilenoglicol em uma quantidade de 4,3% em peso da formulação; - alquil polissacarídeo em uma quantidade de 4,9% em peso da formulação; e - água em uma quantidade de 62,25% em peso da formulação.