BRPI0015823B1

BRPI0015823B1 - Método para purificar proteínas

Info

Publication number: BRPI0015823B1
Application number: BRPI0015823-2A
Authority: BR
Inventors: Claus Lindvald Johansen; Søren Kj Aerulff; Susan Mampusti Madrid; Henrik Pedersen; Charlotte Horsmans Poulsen; Masoud Rajabi Zargahi
Original assignee: Dupont Nutrition Biosci Aps
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2015-08-04
Also published as: DE60041517D1; JP2011153152A; EP1944373A3; PL206561B1; PL356129A1; AU1877001A; JP4781588B2; AU783526B2; MXPA02005235A; BR0015823A; ATE422212T1; JP2003514563A; CA2391522A1; NZ518660A; DK1944373T3; EP1232269B1; WO2001038544A1; EP1944373A2; GB9927801D0; DK1232269T3

Description

"MÉTODO PARA PURIFICAR PROTEÍNAS" Campo Técnico da Invenção A presente invenção refere-se a um método para purificar uma proteína de interesse (POI) intracelular.

Particularmente, a presente invenção refere-se a um método para liberar uma proteína de interesse (POI) intracelular, solúvel ou associada a membrana, usando uma composição extratora de membrana que auxilia na liberação da POI.

Antecedentes da Invenção A maneira tradicional para recuperar uma POI intracelular, como uma enzima, tem sido usar um método de ruptura mecânica (Naglak et al., 1990), tal como um moinho de contas ou um hogeneizador celular que opera com um princípio de prensa francesa. Entretanto, esses métodos de ruptura mecânica padecem da desvantagem de que eles são métodos intensos em energia com uma baixa capacidade e os homogeneizadores celulares ou equipamentos similares necessários para a ruptura mecânica são caros. Além disso, os métodos mecânicos expõem as células, e consequentemente, a POI extraída, a condições muito severas, pois especialmente a maioria das proteínas serão desnaturadas pelo calor gerado, a menos que os dispositivo mecânico e/ou o homogeneizado seja resfriado eficientemente. Além disso, algumas células, tais como as células de leveduras (como aquelas de Hansernula), são difíceis de romper mecanicamente e mais do que uma passagem através do homogeneizador celular é necessária. O homogeneizado celular pode conter também fragmentos da parede celular e o DNA celular, o que resulta em uma alta viscosidade. Isto significa que a separação de fragmentos celulares da POI pode demonstrar ser uma operação difícil. Além disso, o homogeneizado isento de células resultante pode conter, não somente a POI intracelular, mas também um grande número (algumas vezes vários milhares) de proteínas intracelulares e enzimas diferentes associadas ao metabolismo geral das células. Isto significa que o homogeneizado isento de células resultante pode, não somente ser difícil de concentrar por ultrafiltração, mas pode apresentar também problemas com relação â obtenção da correta concentração industrial de uma dada POI.

Para minimizar o efeito detrimental potencial de alguns métodos de ruptura mecânica, foram desenvolvidos métodos químicos que utilizam, por exemplo, detergentes, para permeabilizar células de leveduras. A título exemplificativo, o detergente não-iônico, octil-fenóis polietoxilados, disponível comercialmente como Triton X-100, tem sido usado, seja sozinho ou em combinação com ciclos de congelamento/descongelamento (referidos em Naglak et al., 1990). Além disso, a patente n- US 5.124.256 (Crahay et al., 1992) descreve um método pelo qual proteínas foram extraídas de levedura Saccharomyces, tratando as leveduras em um meio aquoso com um sal mineral neutro solúvel em agua e um tensoativo de alquil-fenol polietoxilado não-iônico solúvel em água, tendo um Equilíbrio Hidrofílico-Lipofílico (HLB) entre 8 e 15. Entretanto, esses tensoativos de alquil-fenol polietoxilado não-iônicos solúveis em água, que incluem octil-fenóis, nonil-fenóis e tributil-fenóis polietoxilados {particularmente aqueles disponíveis comercialmente sob as marcas comerciais Triton X-100, Nonidet P-40 e Sapogenat T080), padecem de desvantagens de que (i) eles podem não ter um efeito extrator significativo quando usados sozinhos, e (ii) esses tensoativos podem interferir com as medições subseqüentes da atividade enzimática da POI. Vários solventes orgânicos também têm sido usados para permeabilizar as células de leveduras em ensaios enzimãticos in si tu e também para remover proteínas das células de leveduras. Os exemplos desses solventes incluem, mas não se limitam a tolueno, acetato de etila, sulfoxido de dimetila, e benzeno combinado com glicerina (Naglak et al. , 1990) . Entretanto, esses solventes não são atrativos para uso na produção em escala industrial quando são necessários volumes de fermentadores de até 200 m3. A digitonina e outras saponinas de ocorrência natural também têm demonstrado permeabilizar inúmeras células eucarióticas (vide Joshi et al., 1989). Embora o mecanismo exato da permeabilização por digitonina não seja conhecido, acredita-se que a digitonina forma uma complexo com o colesterol presente na membrana celular e torna a membrana mal vedada. A permeabilização com digitonina de células de leveduras pode ser também devido à formação de complexos de ergosteróis da membrana da levedura. Joshi et al. , 1989, usaram digitonina (0,1%) para permeabilizar a levedura Kluyveromyces, o que facilitou a catálise intracelular de lactose para glicose e galactose. A saponina detergente não-iônica, da casca de quilaia, é outro agente complexante de colesterol, que reconhecidamente permeabiliza pelo menos células de mamíferos (Naglak et al., 1990) . Novamente, da mesma forma que os detergentes não- iônicos, como delineado acima, o uso de digitonina e outras saponinas de ocorrência natural pode padecer da desvantagem de que, quando usada sozinha, ela pode não ter um efeito extrator significativo.

Os agentes caotrópicos também têm sido usados para facilitar a extração de enzimas intracelulares. A título exemplificativo, a patente n- 3.801.461 (Miyake e Shiosaka, 1974} descreve um processo para extrair enzimas intracelulares produzidas nos micélios ou células de fungos ou bactérias, usando uma solução caotrópica, como uma solução de uréia. A patente n2 US 4.683.293 (Craig, 1987) também descreve um método para extração seletiva de proteínas lipofílicas a partir de células transformadas do gênero Pychia por lise de células na presença de sais caotrópicos, tais como tiocianato de sódio, iodeto de sódio, hipoclorito de sódio, brometo de lítio, cloridrato de guanidío e uréia. Entretanto, os agentes caotrópicos padecem da desvantagem que a exposição da POI a um agente caotrópico, como a uréia, pode resultar em uma perda real de atividade enzimãtica através da desnaturação da POI.

Além das desvantagens citadas acima, as técnicas anteriores citadas acima referem-se somente â permeabilização de células hospedeiras para moléculas de baixo peso molecular, enquanto que a POI permanece inalterada dentro da célula. Particularmente, nenhuma das técnicas anteriores citadas acima refere-se a extração de uma POI associada a membrana sob condições que não afetam a natureza e/ou a atividade da POI. Mais particularmente, nenhuma das técnicas anteriores citadas acima refere-se a um método para auxiliar na liberação de uma POI intracelular associada a membrana, que esteja presa e seja incapaz de ser secretada de uma célula hospedeira. A presente invenção, portanto, procura superar os problemas associados aos métodos de extração das técnicas anteriores.

Assim sendo, a presente invenção fornece um método para liberar uma proteína de interesse (POI) intracelular solúvel ou associada a membrana a partir de um organismo hospedeiro.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a um método para auxiliar na liberação de uma POI intracelular solúvel ou associada a membrana, que esteja presa e seja incapaz de ser secretada de uma célula hospedeira. A extração de uma POI intracelular, usando o método da presente invenção, foi comparada com um método de ruptura celular tradicional e com os procedimentos de extração que usam outros detergentes e emulsificantes iônicos e não-iônicos. As combinações de detergentes com protease e sais também foram investigadas.

Os resultados da presente invenção indicam que a extração de uma POI intracelular solúvel ou associada a membrana, usando o método da presente invenção, é vantajosa porque: (i) as técnicas de ruptura celular tradicionais podem ser evitadas; (ii) a POI intracelular pode ser recuperada isenta de DNA e fragmentos de paredes celulares contaminantes; (iii) a POI intracelular pode ser recuperada a partir de um organismo hospedeiro eucariótico, como uma levedura, antes que a glicosilação ocorra, A superglicosilação de proteínas secretadas é um problema bem conhecido, especialmente em organismos hospedeiros eucarióticos, como uma levedura. Esta desvantagem associada aos sistemas de expressão de leveduras levou a uma relutância em usar levedura como um sistema de produção, muito embora os vetores de expressão de leveduras sejam capazes de produzir proteínas em altos níveis de expressão com uma grande quantidade de biomassa, e adicionalmente, a levedura tem uso aprovado em alimentos. Ao expressar a POI intracelularmente e depois extraindo a POI com o método da presente invenção, a POI estará não-glicosilada porque a POI não passou através de uma via de secreção onde a glicosilação ocorre; (iv) o procedimento de fermentação que precede o método da presente invenção pode ser conduzido em qualquer pH que seja apropriado para a célula hospedeira. É de pleno conhecimento nessas técnicas que uma POI secretada pode ser afetada pelo pH do seu meio de crescimento extracelular. Até agora, foi frequentemente necessário manter o pH de um meio de crescimento de um organismo hospedeiro em um pH aproximadamente neutro porque as fermentações nesse pH foram julgadas necessárias para manter a estabilidade de uma POI secretada, muito embora elas usualmente aumentavam o risco de contaminação bacteriana.

Com o método da presente invenção, a POI não ê secretada. Assim sendo, o pH do meio de crescimento do organismo hospedeiro é irrelevante, pois o pH intracelular permanece constante independentemente do pH do meio.

Consequentemente, a presente invenção permite o crescimento de um organismo hospedeiro (como uma levedura) em um pH inferior (como um pH 4,0) que reduz o risco de contaminação bacteriana, sem afetar a produção de biomassa ou da POI; e (v) o método da presente invenção pode ser usado para impedir o contato da POI intracelular com o meio de crescimento extracelular. Isso é vantajoso se a POI é instável no meio extracelular por causa da sensibilidade a proteases, por exemplo. Ao expressar a proteína intracelularmente e depois extrair com o método da presente invenção, o contato com o meio extracelular é evitado.

Aspectos Resumidos da Invenção Em um amplo aspecto, a presente invenção refere-se a um método para liberar uma proteína de interesse (POI) de uma célula. O método compreende as etapas de: disponibilizar uma célula que compreende uma POI intracelular solúvel ou associada a membrana; colocar a célula em contato com uma composição extratora de membrana; e fazer com que a POI seja liberada da célula sob condições suficientes para liberar a POI e em uma forma solúvel.

Nesta invenção, a POI pode ser uma proteína de interesse intracelular e/ou a POI pode ser uma hexose oxidase (D- hexose; 02-oxidorredutase, EC 1.1.3.5).

Aspectos Detalhados da Invenção De acordo com um aspecto da presente invenção, fornece-se um método para liberar uma proteína de interesse (POI) intracelular solúvel ou associada a membrana a partir de uma célula transformada, compreendendo as etapas de: disponibilizar uma célula transformada que compreende uma POI intracelular solúvel ou associada a membrana; colocar a célula transformada em contato com uma composição extratora de membrana; e fazer com que a POI seja liberada da célula transformada sob condições suficientes para a liberação específica da POI e em uma forma solúvel.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornece-se ura método para liberar uma enzima HOX de uma célula transformada, compreendendo as etapas de: disponibilizar uma célula transformada que compreende uma enzima HOX; colocar a célula transformada em contato com uma composição extratora de membrana; e fazer com que a enzima HOX seja liberada da célula transformada sob condições suficientes para a liberação especifica da enzima HOX e em uma forma solúvel.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornece-se um método para liberar um antagonista do receptor de interleucina 1 (IL-lra) de uma célula transformada, compreendendo as etapas de: disponibilizar uma célula transformada que compreende IL-lra; colocar a célula transformada em contato com uma composição extratora de membrana; e fazer com que IL-lra seja liberado da célula transformada sob condições suficientes para a liberação específica de IL-lra e em uma forma solúvel.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornece-se um método para triar mutantes que produzem níveis elevados de uma POI intracelular solúvel ou associada a membrana, compreendendo as etapas de: cultivar as células mutadas a 30 °C; incubar as células mutadas com a composição extratora de membrana; recuperar a célula isenta de meio; triar a célula isenta de meio quanto a níveis elevados da POI intracelular; de tal modo que a presença do meio da POI

intracelular isento de células seja indicativo de que a POI intracelular foi liberada.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornece-se uma composição extratora de membrana apropriada para liberar uma POI intracelular solúvel ou associada a membrana, onde a composição é colocada em contato com a célula sob as seguintes condições: uma porcentagem em peso de composto de amônio quaternário entre cerca de 0,05% e cerca de 0,6% (mais especialmente entre cerca de 0,1% e cerca de 0,5%, mais especialmente entre cerca de 0,2% e cerca de 0,45%, e mais especialmente ainda, cerca de 0,4%); um pH ótimo entre cerca de 2,0 e cerca de 11,0 (mais especialmente entre cerca de 5,0 e cerca de 7,0, e mais especialmente ainda, cerca de 6,3); e uma temperatura ótima entre cerca de 4 °C e cerca de 4 0 °C (mais especialmente entre cerca de 20 °C e cerca de 30 °C, e mais especialmente ainda, cerca de 25 °C) .

De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornece-se uma composição extratora de membrana, compreendendo um composto de amônio quaternário apropriado para liberar uma POI intracelular solúvel ou associada a membrana.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornece-se uma POI substancialmente não-glicosilada liberada de um organismo hospedeiro eucariótico.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção estão apresentadas nas reivindicações apensadas e na descrição e discussão que se seguem. Esses aspectos estão apresentados sob títulos de seção separados. Entretanto, deve-se entender que os ensinamentos sob cada titulo de seção não estão necessariamente limitados a esse título de seção específico.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção demonstra a descoberta altamente surpreendente que uma composição extratora de membrana, compreendendo compostos de amônio quaternário, pode ser usada para obter uma extração rápida, específica e economicamente eficiente de uma POI intracelular solúvel ou associada a membrana, sem recorrer ao uso das técnicas tradicionais de ruptura celular. Com vantagens e inesperadamente, o extrato celular resultante contém muito pouco DNA intracelular contaminante e é relativamente isento de fragmentos de parede celular, simplificando dessa forma quaisquer etapas de purificação posteriores âs quais a POI pode ser submetida. Isto contradiz os métodos de extração mecânica das técnicas anteriores.

Proteína Intracelular Como aqui utilizado, o termo POI "intracelular" significa uma POI que é encontrada dentro ou no interior de uma célula ou células. A POI intracelular pode estar localizada dentro de uma célula (como no citoplasma da célula), muito embora ela tenha um mecanismo secretor de sinais. A este respeito, a POI intracelular pode ser uma POI que não é ativamente secretada de uma célula ou é incapaz de ser secretada pela célula, muito embora ela tenha um mecanismo secretor de sinais. Alternativamente, a POI intracelular pode ser uma POI secretada naturalmente, que foi projetada para impedir sua secreção de uma célula.

Alternativamente, a POI pode ser uma proteína quimérica que compreende um domínio ligante de membrana. 0 método da presente invenção contrasta com o método descrito em Ahlstrom e Edebo, FEMS Microbiology Letters 119:7-12 (1994), que relatam sobre a liberação da β- lactamase periplasmática de E. coli com betainato de tetradecila. 0 periplasma é a região em uma célula bacteriana entre a membrana celular e a parede celular.

Assim sendo, a β-lactamase periplasmática de E. coli está localizada fora da membrana celular e não é uma enzima citoplasmática. Em contraste, a POI da presente invenção é uma POI intracelular que encontra-se dentro ou no interior de uma célula ou células. POI Associada a Membrana Como aqui utilizado, o termo "POI associada a membrana" significa uma POI que pode estar localizada na proximidade, mas pode não estar substancialmente associada a uma célula ou membrana plasmática. Assim sendo, a enzima associada a membrana não é uma proteína substancialmente ligada â membrana ou a enzima associada a membrana não está substancialmente ligada a uma membrana celular. A POI associada a membrana pode ser solubilizada por um tratamento mecânico com um homogeneizador de células. POI Ligada a Membrana Como aqui utilizado, o termo "POI ligada a membrana" significa uma proteína que não é tornada solúvel por tratamento mecânico com um homogeneizador de células.

Liberação Específica 0 termo "liberação específica" significa que a atividade específica da POI é mais alta do que quando ela foi extraída por meios mecânicos, como pelo uso de um moinho de contas ou um homogeneízador de células que opera com um princípio de prensa francesa. Célula Transformada O termo "célula transformada" inclui células que foram transformadas pelo uso de técnicas de DNA recombinante. A transformação ocorre tipicamente pela inserção de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma célula que vai ser transformada. A seqüência de nucleotídeos inserida pode ser uma seqüência de nucleotídeos heteróloga (isto é, uma seqüência que não ê natural para a célula que vai ser transformada) . Além disso, ou alternativamente, a seqüência de nucleotídeos inserida pode ser uma seqüência de nucleotídeos homóloga (isto é, uma seqüência que é natural para a célula que vai ser transformada) , de tal modo que a célula receba uma ou mais cópias extras de uma seqüência de nucleotídeos já presente nela.

Composição Extratora de Membrana Como aqui utilizado, o termo "composição extratora de membrana" significa uma composição capaz de afetar os componentes em uma membrana celular, de tal modo que a POI intracelular associada a membrana e/ou ligada a membrana seja suficientemente dissociada e/ou liberada do componente da membrana, e a POI seja essencialmente recuperada e/ou colhida da composição extratora de membrana. A POI pode ser também uma POI solúvel. Em uma modalidade altamente preferida, a composição extratora de membrana da presente invenção compreende um ou mais compostos de amonio quaternário ou combinações deles.

Compostos de Amônio Quaternário Como aqui utilizado, o termo "composto de amônio quaternário" significa um composto que pode ser derivado a partir de hidróxido de amônio ou um sal de amonio pela substituição de todos os quatro átomos de hidrogênio do £on NH4+ por grupos orgânicos que podem ser iguais ou diferentes. Tipicamente, um dos grupos orgânicos é um grupo alquila de cadeia longa (C8-Ci3) e os outros três são grupos alquila mais curtos ou outros grupos.

Em uma modalidade preferida, esses compostos têm a estrutura: CH3- (CH2)n-N(CH3)3+ onde n é o número de grupos metileno na cadeia e onde o contra-íon pode ser um halogênio, como o íon cloreto ou brometo. Esses compostos têm as propriedades de detergentes catiônicos e são agentes antimicrobianos potentes.

Os exemplos desses compostos de amônio quaternário incluem mas não se limitam a brometo de lauroil-trimetil- amônio (LTAB), cloreto de miristil-trimetil-amônio (MTAC), cloreto de cetil-trimetil-amônio (CTAC), brometo de cetil- trimetil-amônio (CTAB), Cetrimida (ou Cetrimídio que compreende uma mistura de brometos de alquil-amônio, principalmente CTAB), cloreto de estearoil-trimetil-amônio (STAC), brometo de estearoil-trimetil-amônio (STAB), cloreto de benzalcônio (cloreto de alquil-dimetil-benzil-amônio), brometo de N-cetil-piridínio (brometo de N-hexadecil- piridínio), cloreto de N-cetil-piridínio (cloreto de N- hexadecil-piridínio) , cloreto de benzil-dimetil-tetradecil- amônio, e cloreto de benzil-dimetil-hexadecil-amônio. A título exemplificativo, a estrutura de alguns desses compostos está ilustrada abaixo. Os compostos estão listados na ordem crescente de grupos metileno: LTAB ê H3C- (CH2) u-NtCHshBr MTAC é H3C-(CH2)13-N(CH3)3C1 CTAC é H3C- (CH2)15-N(CH3)3C1 CTAB é H3C- (CH2)15-N(CH3)3Br STAC é H3C-(CH2)17-N(CH3)3C1 STAB é H3C-(CH2) 17-N(CH3)3Br De preferência, o composto de amônio quaternário é cloreto de cetil-piridínio (CPC, C21H38NC1) . A estrutura de CPC é ilustrada da seguinte forma: C2iH38NC1 De preferência, o composto de amônio quaternário é brometo de cetil-piridínio (CPB, C2iH38NBr) . A estrutura de CPB é ilustrada da seguinte forma: C21H38NBr De preferência, o composto de amônio quaternário é cloreto de benzil-dimetil-tetradecil-amônio (BDTAC, C23H42NCI) . A estrutura de BDTAC é ilustrada da seguinte forma: De preferência, o composto de amônio quaternário é cloreto de benzil-dimetil-hexadecil-amônio (BDHAC, C25H46NCI) . A estrutura de BDHAC é ilustrada da seguinte forma: De preferência, o composto de amônio quaternário é cloreto de benzalcônio (cloreto de alquil-dimetil-benzil- amônio) . A estrutura do cloreto de benzalcônio é ilustrada da seguinte forma: C12H25N(CH3)2C7H7C1 Uma comparação da estrutura de CTAB com cloreto de benzalcônio (também conhecido como cloreto de alquil- dimetil-amônio, e aqui doravante referido sob a marca registrada Rodalon) está ilustrada abaixo: De preferência, o composto de amônio quaternário é brometo de lauroil-trimetil-amônio (LTAB).

De preferência, o composto de amônio quaternário é cloreto de cetil-trimetil-amônio (CTAC).

De preferência, o composto de amônio quaternário é brometo de cetil-trimetil-amônio (CTAB). 0 detergente CTAB demonstrou ser capaz de alterar a permeabilidade de levedura, provavelmente por causar a formação de poros transmembrana, mecanismo similar ao sugerido para dois outros detergentes nãoOiônicos, como Pluronic F-68 e Triton X-100 (King et al., 1991) . A alteração da permeabilidade celular usando detergentes, como o CTAB, possibilitou a medição de atividades de enzimas intracelulares em células integrais (Sekhar et al. , 1999).

Além disso, a descoberta de que CTAB permeabilízava células demonstrou ser útil para a catálise de enzimas intracelulares em, por exemplo cepas de leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae (Gowda et al., 1991) e Kluyveromyces fragilis (Joshi et al., 1987). Nesses estudos, é importante assinalar que o detergente CTAB tornou as células permeáveis a moléculas de baixo peso molecular (tais como substratos, produtos, co-fatores), enquanto que as enzimas intracelulares e outras POIs permaneceram inalteradas dentro da célula. Em contraste com a presente invenção, nenhum dos estudos mencionados acima descreveu ou sugeriu que o detergente CTAB (ou compostos de amônio quaternário afins, tais como LTAB ou CTAC) pode ser usado para auxiliar na liberação de uma POI intracelular solúvel ou associado a membrana a partir de uma célula hospedeira. 0 detergente catiônico CTAB tem sido comumente usados em métodos para isolar moléculas de DNA/RNA. A título exemplificativo, as moléculas de DNA podem ser isoladas tratando as células com CTAB em altas temperaturas (cerca de 65 °C) e baixas concentrações de um sal (NaCl a menos do que 0,6 M), de tal modo que um precipitado DNA-CTAB seja formado e facilmente recuperado. O detergente CTAB é usado também frequentemente para extrair ácidos nucléicos de plantas, onde a co-precipitação de polissacarídeos neutros, seja em etanol ou isopropanol, pode representar um problema importante. 0 CTAB foi usado também na lise direta e precipitação do DNA a partir do sobrenadante de culturas de E. coli infectadas com fagos filamentosos (vide Ishaq et al., Biotechniques 9(1):19-20, 22, 24, 1990; Kambouris et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 25(3):255-64, 1999;

Kuipers et al., Ann. Rheum. Dis. 58(2):103-108, 1999;

Velegraki et al., Med. Mycol. 37(1):69-73, 1999; White et ai., Med. Micol. 36(5):299-303, 1998; Woodhead et ai., Mol.

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Res. 84 (7) :596-7, 1998; Zhang et ai., J. Virol. Methods 71(1):45-50, 1998; Reineke et al., Insect Mol. Biol. 7(1):95-9, 1998). Todos estes métodos baseados em CTAB para isolamento de moléculas de DNA baseiam-se na exploração das propriedades de CTAB para precipitar ácidos nucléicos e polissacarídeos, e ao mesmo tempo mantendo as proteínas remanescentes e polissacrídeos neutros em solução.

Surpreendentemente e inesperadamente, o método da presente invenção possibilita, não somente a precipitação, mas também a retenção de DNA intracelular. Consequentemente, o método da presente invenção facilita a liberação seletiva de uma POI intracelular.

Liberação De acordo com o método da presente invenção, a POI intracelular solúvel ou associada a membrana é liberada de uma célula ou células hospedeiras colocando as células em contato com uma composição extratora de membrana sob condições suficientes para a liberação da POI intracelular.

Condições Preferíveis Suficientes para Liberar a POI (I) Porcentagem do Composto de Amônio Quaternário De preferência, a composição extratora de membrana compreende entre cerca de 0,05% e cerca de 0,6% em peso de um composto de amônio quaternário, de preferência entre cerca de 0,1% e cerca de 0,5% em peso de um composto de amônio quaternário, mais preferivelmente entre cerca de 0,2% e cerca de 0,45% em peso de um composto de amônio quaternário, e ainda mais preferivelmente, cerca de 0,4% em peso de um composto de amônio quaternário.

De preferência, o composto de amônio quaternário é LTAB.

De preferência, o composto de amônio quaternário é CTAC.

De preferência, o composto de amônio quaternário é CTAB.

De preferência, o composto de amônio quaternário é cloreto de benzalcônio (Ci2H2sN (CH3) 2C7H7CI) .

De preferência, o composto de amônio quaternário é cloreto de cetil-piridínio (CPC, C2iH38NCl) .

De preferência, o composto de amônio quaternário é brometo de cetil-piridínio (CPB, C2iH38NBr) .

De preferência, o composto de amônio quaternário é cloreto de benzil-dimetil-tetradecil-amônio (BDTAC, C23H42NC1) .

De preferência, o composto de amônio quaternário é cloreto de benzil-dimetil-hexadecil-amônio (BDHAC, C25H46NC1) . (II) Temperatura De preferência, a célula hospedeira é colocada em contato com a composição extratora de membrana em temperaturas entre cerca de 4 °C e cerca de 40 °C.

De preferência, a célula hospedeira é colocada em contato com a composição extratora de membrana em temperaturas entre cerca de 20 °C e cerca de 30 °C.

De preferência, a célula hospedeira é colocada em contato com a composição extratora de membrana em temperaturas de cerca de 25 °C.

De preferência, as faixas de temperatura são mais altas se a POI é uma POI termoestãvel.

(IIP pH

De preferência, a célula hospedeira é colocada em contato com a composição extratora de membrana em um pH entre cerca de 2,0 e cerca de 11,0.

De preferência, a célula hospedeira é colocada em contato com a composição extratora de membrana em um pH entre cerca de 5,0 e cerca de 7,0.

De preferência, a célula hospedeira é colocada em contato com a composição extratora de membrana em um pH de cerca de 6,3. É altamente vantajoso que o procedimento de fermentação, que precede o método da presente invenção, possa ser conduzido em qualquer pH que seja apropriado para a célula hospedeira. É de pleno conhecimento nessas técnicas que uma POI secretada pode ser afetada pelo pH de seu meio de crescimento extracelular. Até agora, foi freqüent emente necessário manter o pH de um meio de crescimento de um organismo hospedeiro em um pH aproximadamente neutro porque as fermentações nesse pH foram julgadas necessárias para manter a estabilidade de uma POI secretada, muito embora elas usualmente aumentavam o risco de contaminação bacteriana. Com o método da presente invenção, a POI não é secretada. Assim sendo, o pH do meio de crescimento do organismo hospedeiro é irrelevante, pois o pH intracelular permanece constante independentemente do pH do meio. Consequentemente, a presente invenção permite o crescimento de um organismo hospedeiro (como uma levedura) em um pH inferior (como um pH 4,0) que reduz o risco de contaminação bacteriana, sem afetar a produção de biomassa ou da POI.

Uma vantagem adicional do método da presente invenção é que ele pode ser usado para impedir o contato da POI intracelular com o meio de crescimento extracelular.

Isso é vantajoso se a POI é instável no meio extracelular por causa da sensibilidade a proteases, por exemplo. Ao expressar a proteína intracelularmente e depois extrair com o método da presente invenção, o contato com o meio extracelular é evitado.

Recuperação da POI A POI intracelular, que foi extraída de acordo com o método da presente invenção, pode ser tratada ainda empregando técnicas conhecidas pelos versados nessa área, para concentrar ainda mais e purificar a POI. Assim sendo, a POI intracelular extraída pode ser concentrada, por exemplo, por ultrafiltração, passagem através de uma resina em fase reversa, seguido de eluição com um volume mínimo de solvente, precipitação, ultrafiltração e liofilização. As técnicas disponíveis para a purificação adicional da POI incluem, mas não se limitam a fracionamento dimensional, empregando resinas de exclusão dimensional, cromatografia de líquido de alto desempenho, cromatografia de troca iônica e hidrofóbica.

POI

Como aqui utilizado, o termo "POI" inclui, mas não se limita a uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo, inclusive, mas não limitado a uma proteína estrutural, uma enzima, uma citocina (como um interferon e/ou uma interleucina) , um antagonista de receptor de interleucina (como IL-lra) , um antibiótico, um anticorpo policlonal ou monoclonal, ou uma parte eficaz dele, como um fragmento Fv, anticorpo ou parte dele que pode ser natural, sintética ou humanizada, um hormônio peptídico, um antígeno (como um antígeno bacteriano/viral/protozoário/parasítico), um antígeno tumoral, um recpetor, um ligante, um fator regulador, uma molécula sinalizadora, um neurotransmissor, um fator coagulante, ou qualquer outra proteína, inclusive mas não limitado a uma proteína ligada a membrana e/ou uma proteína associada a membrana.

No método da presente invenção, a POI é expressada intracelularmente, isto é, ela ê uma POI intracelular.

A POI pode ser produzida por técnicas de DNA recombinante, usando uma seqüência de nucleotídeos de interesse (NOI). ΝΟΙ Como aqui utilizado, o termo "NOI" é definido para englobar DNA e RNA de origem sintética e também natural, DNA ou RNA este que pode conter desoxinucleotídeos ou didesoxinucleotídeos modificados ou não-modifiçados, ou seus análogos. 0 ácido nuclêico pode existir como DNA ou RNA

monofilamentar ou de duplo filamento, um RNA/DNA heteroduplex ou um copolímero de RNA/DNA, onde o termo "copolímero" refere-se a um único filamento de ácido nuclêico, que compreende ribonucleotídeos e também desoxirribonucleotídeos. O NOI pode ainda ser Codon otimizado para adicionar o aumento da expressão Sintético O termo "sintético", como aqui utilizado, é definido como o que é produzido por síntese química ou enzimática in vitro. Isto inclui, mas não se limita a NOIs produzidas com ótimo uso de códons para organismos hospedeiros, tais como as leveduras metilotróficas Pichia e Hansenula.

Construções A NOI pode estar ligada operacionalmente a elementos reguladores de transcrição e tradução ativos em uma célula hospedeira de interesse. A NOI pode também codificar uma proteína de fusão que compreende sequências sinalizadoras, tais como por exemplo, aquelas derivadas do gene glicoamilase de Schwanniomyces occidentalis, gene do tipo que encaixa no fator α de Saccharomyces cerevisiae e a amilase TAKA de Aspergillus oryzae. Alternativamente, a NOI pode codificar uma proteína de fusão que compreende um domínio ligante de membrana.

Vetor de Expressão A NOI pode ser expressada nos níveis desejados em um organismo hospedeiro usando um vetor de expressão.

Um vetor de expressão, que compreende a NOI de acordo com a presente invenção, pode ser qualquer vetor que seja capaz de expressar o gene que codifica a NOI no organismo hospedeiro selecionado, e a escolha do vetor dependerá da célula hospedeira para dentro da qual ele vai ser introduzido. Assim sendo, o vetor pode ser vetor replicador autônomo, isto é, um vetor que existe como uma entidade epissômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, como por exemplo, um plasmídeo, um bacteriófago ou um elemento epissômico, um minicromossoma ou um cromossoma artificial. Alternativamente, o vetor de acordo com a presente invenção é um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado dentro do genoma da célula hospedeira e replicado junto com o cromossoma.

Componentes do Vetor de Expressão 0 vetor de expressão inclui tipicamente os componentes de um vetor de clonagem, como por exemplo, um elemento que permite a replicação autônoma do vetor no organismo hospedeiro selecionado e um ou mais marcadores fenotipicamente detectãveis com propósitos de seleção. O vetor de expressão compreende normalmente seqüências de nucleotídeos de controle que codificam um promotor, operador, sítio de ligação de ribossoma, sinal de iniciação da tradução, e opcionalmente, um gene repressor ou um ou mais genes ativadores. Adicionalmente, o vetor de expressão pode compreender uma seqüência que codifica uma sequência de aminoãcidos capaz de direcionar a POI até uma organela da célula hospedeira, como um peroxissoma, ou até um compartimento específico da célula hospedeira. Esta seqüência direcionadora inclui mas não se limita à seqüência SKL. No presente contexto, o termo "sinal de expressão" inclui qualquer uma das seqüências de controle, repressoras ou ativadoras. Para a expressão sob a orientação de seqüências de controle, a NOI que codifica a POI está ligada operacionalmente às seqüências de controle de maneira apropriada com relação à expressão.

Promotor No vetor, a NOI que codifica a POI está combinada operacionalmente a uma seqüência promotora apropriada. 0 promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que tenha atividade de transcrição no organismo hospedeiro de escolha e pode ser derivada de genes que são homólogos ou heterólogos ao organismo hospedeiro.

Promotores Bacterianos Os exemplos de promotores apropriados para direcionar a transcrição da seqüência de nucleotídeos modificada da invenção em um hospedeiro bacteriano incluem o promotor opéron lac de E. coli, os promotores dagA do gene de agarase de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene de α-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, os promotores do gene de amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, os promotores do gene de a-amilase (amyL) de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilis e um promotor derivado de um promotor derivado de Lactococcus sp., inclusive o promotor P170. Quando o gene que codifica a POI da presente invenção é expressado em uma espécie bacteriana, como E. coli, um promotor apropriado pode ser selecionado, por exemplo, a partir de um promotor bacteriófago, inclusive um promotor de T7 e um promotor de fago lambda.

Promotores Fúngicos ) Para transcrição em uma espécie fúngica, os exemplos de promotores úteis são aqueles derivados dos genes que codificam a amilase de Aspergillus oryzae TAKA, a proteinase aspãrtica de Rhizomucor mieheí, a a-amilase neutra de Aspergillus niger, a α-amilase estável em acido de 5 Aspergillus niger, a glicoamilase de Aspergillus niger, a lipase de Rhizomucor miehei, a protease alcalina de Aspergillus oryzae, a triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, ou a acetamidase de Aspergillus nidulans. 0 Promotores de Leveduras Os exemplos de promotores apropriados para a expressão em uma espécie de levedura incluem, mas não se limitam aos promotores Gal 1 e Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae e os promotores A0X1 e A0X2 de Pichia pastoris. >5 Organismos Hospedeiros m Organismos Hospedeiros Bacterianos.

Os exemplos de organismos hospedeiros apropriados são espécies bacterianas gram-positivas, tais como Bacillus, inclusive Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefacienSf Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium e Bacillus thuringiensis, a espécie Streptomyces, como Streptomyces murinus, as espécies bacterianas do ácido lãtico, inclusive Lactococcus spp,, como Lactococcus lactis, Lactobacillus spp., inclusive Lactobacillus reuteri, Leuconostoc spp., Pediococcus spp., e Streptococcus spp. Alternativamente, as cepas de uma espécie bacteriana gram-negativa pertencente a Enterobacteriaceae, inclusive E. coli, ou pertencente a Pseudomonadaceae, pode ser selecionada como organismo hospedeiro. (II) Leveduras como Organismos Hospedeiros Uma levedura apropriada como organismo hospedeiro pode ser selecionada entre as espécies de leveduras relevantes do ponto de vista biotecnológico, tais como, sem limitação, as espécies de leveduras tais como Pichia sp., Hansenula sp. ou Kluyveromyces, e a espécie Yarrowinia ou uma espécie de Saccharomyces, inclusive Saccharomyces cerevisiae ou uma espécie pertencente a Schizosaccharomyces, como por exemplo, a espécie S. pombe.

De preferência, uma cepa da espécie de levedura metilotrófica Pichia pastoris, é usada como organismo hospedeiro.

De preferência, o organismo hospedeiro é uma espécie Hansenula. É altamente vantajoso usar o método da presente invenção para recuperar uma POI intracelular a partir de um organismo hospedeiro eucariótico, como uma levedura, antes que a glicosilação ocorra. A superglicosilação de proteínas secretadas é um problema bem conhecido, especialmente em organismos hospedeiros eucarióticos, como as leveduras.

Esta desvantagem associada aos sistemas de expressão de leveduras levou a uma relutância em usar levedura como sistema de produção, muito embora os vetores de expressão em leveduras sejam capazes de produzir proteínas em altos níveis d expressão com uma grande quantidade de biomassa, e adicionalmente, as leveduras têm uso aprovado em alimentos.

Ao expressar a POI intracelularmente e depois extraindo a POI com o método da presente invenção, a POI estará não- glicosilada porque a POI não passou através de uma via de secreção onde a glicosilação ocorre. (III) Organismos Hospedeiros Fúngicos Os organismos hospedeiros apropriados entre fungos filamentosos incluem as espécies de Aspergillus, como por exemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori ou Aspergillus nidulans.

Alternativamente, as cepas de uma espécie Fusarium, como por exemplo, Fusarium oxysporum ou de uma espécie Rhizomucor, como Rhizomucor miehei, pode ser usada como organismo hospedeiro. Outras cepas apropriadas incluem as espécies Thermomyces e Mucor.

Aplicação em Larga Escala Em uma modalidade preferida da presente invenção, a POI ê usada para aplicações em larga escala.

De preferência, a POI é produzida em uma quantidade entre 1 grama por litro e cerca de 2 gramas por litro do volume total da cultura de células, depois da cultura do organismo hospedeiro.

De preferência, a POI é produzida em uma quantidade entre 100 miligramas por litro e cerca de 900 miligramas por litro do volume total da cultura de células, depois da cultura do organismo hospedeiro.

De preferência, a POI é produzida em uma quantidade entre 250 miligramas por litro e cerca de 500 miligramas por litro do volume total da cultura de células, depois da cultura do organismo hospedeiro.

Aplicações Alimentícias Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção ê usado para liberar uma POI para uso na fabricação de produtos alimentícios, como bebidas.

Em outra modalidade preferida, o método da presente invenção é usado para liberar uma POI para uso na preparação de detergentes.

Em outra modalidade preferida, o método da presente invenção é usado para liberar uma POI apropriada para uso em panificação.

Em outra modalidade preferida, o método da presente invenção é usado para liberar uma POI apropriada para uso como um agente para melhorar massas.

Em outra modalidade preferida, o método da presente invenção e usado para liberar uma POI apropriada para melhorar as propriedades de uma massa de farinha de trigo, uma composição para melhorar massas de farinha de trigo e produtos alimentícios aperfeiçoados (vide documentos n— WO 96/39851 e EP-B-0 833 563).

Em uma modalidade preferida, a POI liberada é uma hexose oxidase (D-hexose: 02-oxidorredutase, EC 1.1.3.5).

Enzima HOX

A hexose oxidase (D-hexose: 02-oxidorredutase, EC 1.1.3.5) (também referida como HOX) é uma enzima que, na presença de oxigênio, é capaz de oxidar D-glicose e vários outros açúcares redutores, inclusive maltose, lactose e celobiose, para suas lactonas correspondentes, com subsequente hidrólise para os ácidos aldobiônicos respectivos. Consequentemente, HOX difere de outra oxidorredutase, a glicose oxidase, que pode somente converter D-glicose, pelo fato de que a enzima pode utilizar uma faixa mais ampla de substratos de açúcares. A oxidação catalisada por HOX pode ser ilustrada da seguinte maneira: D-glicose + 02 γ-D-gliconolactona + H202 ou D-galactose + 02 -> γ-D-galactonolactona + H202 HOX é produzida naturalmente por várias espécies marinhas algáceas. Essas espécies são encontradas inter alia. na família Gigartinaceae. Como aqui utilizado, o termo "HOX" denota uma enzima que é capaz de oxidar os substratos selecionados no grupo que consiste de D-glicose, D- galactose, D-manose, maltose, lactose e celobiose.

Produção de HOX 0 gene que codifica a enzima HOX foi clonado a partir da alga marinha Chondrus crispus (Stougaard e Hansen, 1996, Hansen e Stougaard, 1997). Alevedura metiltrófica Hansenula polymorpha (desenvolvida na Rhein Biotech, Düsseldorf, Alemanha, como um sistema de expressão para proteínas heterólogas) também foi usada para produzir a enzima HOX (a proteína nativa foi purificada a partir de alga (Poulsen e Hostrup, 1998)). Os documentos n— WO 96/40935 e WO 98/13478 também descrevem a clonagem e expressão em organismos hospedeiros recombinantes de um gene que codifica uma proteína com atividade de HOX.

Em uma modalidade preferida, a enzima HOX compreende a sequência enunciada em SEQ ID NO: 22.

Em uma modalidade preferida, a enzima HOX compreende a seqüência enunciada em SEQ ID NO: 22, ou suas variantes, homólogos, derivados ou fragmentos.

Variantes /Homólogos/Derivados____(Sequência______de Aminoácidos) As sequências de aminoácidos preferidas da presente invenção estão enunciadas em SEQ ID NO: 22 ou são sequências que podem obtidas a partir da enzima HOX da presente invenção, porém incluem também seqüencias homologas obtidas a partir de qualquer origem, como por exemplo, proteínas virais/bacterianas afins, homólogos celulares e peptídeos sintéticos, bem como suas variantes ou derivados.

Assim sendo, a presente invenção cobre variantes, homólogos ou derivados das sequências de aminoácidos aqui apresentadas, bem como variantes, homólogos ou derivados da seqüência de nucleotídeos que codifica aquelas seqüencias de aminoãcidos.

No contexto da presente invenção, uma seqüência homóloga engloba uma seqüência de aminoãcidos que é pelo menos 75, 85 ou 90% idêntica, de preferência pelo menos 95 ou 98% idêntica, a nível de aminoãcidos, pelo menos, por exemplo, â seqüência de aminoãcidos enunciada em SEQ ID NO: 22 entre a lista de seqüências aqui enunciada.

Particularmente, a homologia deve ser considerada tipicamente em relação àquelas regiões da seqüência reconhecidamente essenciais para a atividade da enzima, ao invés das seqüências vizinhas não essenciais. Essas regiões incluem mas não se limitam aos domínios ligantes de FAD putativos na HOX, tais como SGGH79C, LGGHi46l, e LGGH320A.

Embora a homologia possa ser também considerada em termos de similaridade (isto é, resíduos de aminoãcidos que têm propriedades/funções químicas similares), no contexto da presente invenção prefere-se expressar homologia em termos de identidade de seqüência.

As comparações de homologia podem ser conduzidas a olho nu, ou mais usualmente, com o auxílio de programas de comparação de seqüências facilmente disponíveis. Estes programas de computador disponíveis no mercado podem calcular a homologia percentual entre duas ou mais seqüências. A homologia percentual pode ser calculada sobre seqüências contíguas, isto é, uma seqüência é emparelhada com a outra seqüência e cada aminoãcido em uma seqüência é comparado diretamente com o aminoãcido correspondente na outra seqüência, um resíduo de cada vez. Isso é denominado um emparelhamento "sem intervalo". Tipicamente, esses emparelhamentos sem intervalos são realizados somente em um número relativamente pequeno de resíduos.

Embora este seja um método muito simples e consistente, ele malogra ao nao levar em consideração que, por exemplo, em um par de sequências idênticas por outro motivo, uma inserção ou deleção fará com que os resíduos de aminoácidos seguintes sejam colocados fora do emparelhamento, resultando potencialmente dessa forma em uma grande redução na homologia percentual quando em emparelhamento global é realizado. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de seqüências são desenhados para produzir emparelhamentos ótimos que levem em consideração possíveis inserções e deleções, sem penalizar indevidamente a pontuação da homologia global. Isso é alcançado inserindo "intervalos" no emparelhamento de seqüências, para tentar maximizar a homologia local.

Entretanto, esses métodos mais complexos designam "penalidades a intervalos" para cada intervalo que ocorre no emparelhamento, de tal modo que, para o mesmo numero de aminoácidos idênticos, um emparelhamento de seqüências com um número de intervalos tao pequeno quanto possível, refletindo o relacionamento mais alto entre duas seqüências comparadas, atingirá uma pontuação mais alta do que com muitos intervalos. São usadas tipicamente "ônus de intervalos afins" que debitam um ônus relativamente alto pela existência de um intervalo e uma penalidade menor para cada resíduo subseqüente no intervalo. Este ê o sistema de pontuação para intervalos mais comumente usado. Altas penalidades por intervalos produzirão evidentemente emparelhamentos otimizados com menos intervalos. A maioria dos programas de empareihamento permitem que as penalidades por intervalos sejam modificadas. Entretanto, prefere-se usar valores de omissão quando se usa esse software para comparações de seqüências. Por exemplo, quando se usa o pacote GCG Wisconsin Bestfit (vide abaixo) a penalidade por intervalo de omissão para seqüências de aminoácidos é -12 para um intervalo e -4 para cada prolongamento. O cálculo da homologia percentual, portanto, primeiramente requer a produção de um empareihamento ótimo, levando em consideração penalidades por intervalos. Um programa de computador apropriado para conduzir esse emparelhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Universidade de Wisconsin, E.U.A.; Devereux et al., Nucleic Acids Research 12:387, 1984). Os exemplos de outros softwares que podem realizar as comparações de seqüências incluem mas não se limitam ao pacote BLAST (vide Ausubel et al., 1999 ibidem - Capítulo 18) , FASTA (Atschul et al., J.

Mol. Biol., 403-410, 1990) e o conjunto de ferramentas de comparação GENEWORKS. 0 BLAST e também o FASTA estão disponíveis para pesquisa fora de linha e em linha (vide Ausubel et al., 1999 ibidem, páginas 7-58 até 7-60).

Entretanto, prefere-se usar o programa GCG Bestfit.

Embora a homologia percentual final possa ser medida em termos de identidade, o processo de emparelhamento em si tipicamente não baseia-se em comparação de pares tudo ou nada. Ao invés disso, usa-se genericamente uma matriz de pontuação de similaridade com escala, que designa pontuações para cada comparação na forma de pares baseadas na similaridade química ou na distância evolutiva. Um exemplo dessa matriz comumente usada é a matriz BL0SUM62, a matriz de omissão do conjunto de programas BLAST, Os programas GCG

Wisconsin usam os valores de omissão à disposição do público ou uma tabela de comparações de símbolos individualizados, caso fornecida (vide manual do usuário para obter mais detalhes). Prefere-se usar os valores de omissão â disposição do público para o pacote GCG, ou no caso de outro software, a matriz de omissão, como a BL0SUM62.

Uma vez produzido um emparelhamento ótimo pelo software, ê possível calcular a homologia percentual, de preferência, a identidade percentual entre seqüências. O software tipicamente não faz isto como parte da comparação de seqüências e gera um resultado numérico. O termo "variante" ou "derivado" com relação às seqüências de aminoácidos da presente invenção inclui qualquer substituição, variação, troca, deleção ou adição de um ou mais aminoácidos na seqüência, desde que a seqüência de aminoácidos resultante tenha uma atividade enzimática, e de preferência pelo menos a mesma atividade enzimatica que a seqüência de aminoácidos enunciada em SEQ ID NO: 22. SEQ ID NO: 22 pode ser modificada para uso na presente invenção. Tipicamente, sao feitas modificações que mantenham a atividade enzimática da seqüência. Podem ser feitas substituições, por exemplo, entre 1, 2 ou 3 até 10 ou 20 substituições, desde que a seqüência modificada retenha a atividade enzimãtica requerida. As substituições de aminoácidos podem incluir o uso de análogos de ocorrência não-natural. SEQ ID NO: 22 da presente invenção pode ter também deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos, que produzam uma mudança silenciosa e resultem em uma enzima funcionalmente equivalente. Podem ser feitas substituições de aminoácidos deliberadas baseado na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, caráter hidrofóbico, caráter hidrofílico, e/ou natureza anfifática dos resíduos, desde que a atividade enzimática da enzima HOX seja retida. Por exemplo, os aminoácidos com carga negativa incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; os aminoácidos com carga positiva incluem lisina e arginina; e os aminoácidos com grupos de cabeça polar sem carga que têm valores valores de caráter hidrofílico similares incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, aspargina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

Podem ser feitas substituições conservativas, como por exemplo, de acordo com a tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna, e de preferência, na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos entre si: Variantes/Homólogos/Derivados______(Seqüência-----de Nucleotídeos) Os versados nessas técnicas devem entender que inúmeras sequências de nucleotídeos diferentes podem codificar a mesma enzima HOX como resultado da degeneração do código genético. Além disso, deve-se entender que os versados nessas técnicas, usando técnicas rotineiras, podem fazer substituições de nucleotídeos que não afetam a enzima HOX codificada pela seqüência de nucleotídeos da invenção para refletir o uso de códons de qualquer organismo hospedeiro específico no qual a enzima HOX da presente invenção vai ser expressada.

Os termos "variante", "homólogo" ou "derivado" com relação à seqüência de nucleotídeos enunciada em SEQ ID NO: 22 da presente invenção inclui qualquer substituição, variação, troca, deleção ou adição de um ou mais ácidos NUCLÉICOS na seqüência, desde que a seqüência de nucleotídeos resultante codifique uma enzima HOX que tenha pelo menos a mesma atividade enzimãtica que a seqüência de nucleotídeos enunciada em SEQ ID NO: 22 das listagens de sequências.

Como indicado acima com relaçao a homologia de seqüências, de preferência, há pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% de homologia entre as seqüências indicadas na listagem de seqüências aqui fornecida. Mais preferivelmente, há pelo menos 95%, e mais preferivelmente pelo menos 98% de homologia. As comparações da homologia de nucleotideos podem ser conduzidas como descrito acima. Um programa de comparação de seqüências preferido é o programa GCG Wisconsin Bestfit descrito acima. A matriz de pontuação de omissão tem um valor de combinação de 10 para cada nucleotideo idêntico e -9 para cada desemparelhamento. A penalidade pela criação de intervalo de omissão é -50 e a penalidade pelo prolongamento de intervalo de omissão é de - 3 para cada nucleotideo. A presente invenção engloba também seqüências de nucleotideos que são capazes de hibridizar seletivamente para as seqüências aqui apresentadas, ou qualquer variante, fragmento ou derivado delas, ou para o complemento de qualquer uma das acima. As seqüências de nucleotideos têm, de preferência, pelo menos 15 nucleotideos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 20, 30, 4 0 ou 50 nucleotideos de comprimento.

Hibridização O termo "hibridização", como aqui utilizado, deve incluir "o processo pelo qual um filamento de ácidos nuclêicos se une com um filamento complementar através de emparelhamento de bases", bem como o processo de ampliação conduzido por tecnologias de reação de polimerase em cadeia (PCR) .

As seqüências de nucleotídeos da invenção, capazes de hibridizar seletivamente para a as seqüências de nucleotídeos aqui apresentadas, ou seu complemento, devem ser genericamente pelo menos 75%, de preferência pelo menos 85% ou 90%, e mais preferivelmente pelo menos 95% ou 98% homólogas às seqüências de nucleotídeos aqui apresentadas por uma região de pelo menos 20, de preferência pelo menos 25 ou 30, por exemplo, pelo menos 40, 60 ou 100 ou mais nucleotídeos contíguos. As seqüências de nucleotídeos preferidas da invenção devem compreender regiões homólogas à seqüência de nucleotídeos enunciada em SEQ ID NO: 22, de preferência pelo menos 80 ou 90%, e mais preferivelmente pelo menos 95% homólogas a seqüencia de nucleotídeos enunciada em SEQ ID NO: 22. 0 termo "seletivamente hibridizãvel" significa que a seqüência de nucleotídeos usada como sonda e usada sob condições nas quais uma seqüência de nucleotídeos-alvo da invenção é constatada hibridizando para a sonda em um nível significativamente acima do secundário. A hibridização secundária pode ocorrer por causa das outras seqüências de nucleotídeos presentes, por exemplo, na biblioteca de DNAc ou DNA genômico que está sendo triada. Neste caso, secundário infere um nível de sinal gerado por interação entre a sonda e um membro inespecífico do DNA da biblioteca, que é menor do que 10 vezes, de preferência menor do que 100 vezes a intensidade da interação específica observada com o DNA-alvo. A intensidade da interação pode ser medida, por exemplo, marcando a sonda com radioatividade, por exemplo, como 32P.

As condições da hibridização baseiam-se na temperatura de fusão (Tf) do complexo ligante de ácidos nucléicos, como enunciado em Berger e Kimmel (1987, : Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in Enzymology, Volume 52, Academic Press, San Diego, CA, E.U.A.), e confere uma "severidade" definida, como explicado abaixo. A severidade máxima ocorre tipicamente em uma Tf de cerca de 5 °C menos (5 °C abaixo da Tf da sonda) ; severidade máxima em cerca de 5 °C a 10 °C abaixo da Tf; severidade intermediária em cerca de 10 °C a 20 °C abaixo da Tf; e baixa severidade em cerca de 2 0 °C a 2 5 °C abaixo da Tf. Como deve ser entendido pelos versados nessas técnicas, uma hibridização com máxima severidade pode ser usada para identificar ou detectar seqüências de nucleotídeos idênticas, enquanto que uma hibridização de severidade intermediária (ou baixa) pode ser usada para identificar ou detectar seqüências de polinucleotideos similares ou afins.

Em um aspecto preferido, a presente invenção cobre seqüências de nucleotídeos que podem hibridizar para a seqüência de nucleotídeos da presente invenção sob condições severas (como por exemplo, 65 °C e 0,1 x SSC (1 x SSC = NaCl 0,15 M, Citrato de Na3 0,015 M, pH 7,0). Quando a seqüência de nucleotídeos da invenção é de filamento duplo, ambos filamentos do dúplex, seja individualmente ou em combinação, estão englobados pela presente invenção. Quando a seqüência de nucleotídeos é monofilamentar, deve-se entender que a seqüêncía complementar dessa seqüência de nucleotídeos também está incluída no âmbito da presente invenção.

As seqüências de nucleotídeos que não são 100% homólogas âs seqüências da presente invenção, mas caem dentro do âmbito da invenção, podem ser obtidas de inúmeras maneiras. Outras variantes das seqüências aqui descritas podem ser obtidas, por exemplo, sondando bibliotecas de DNA produzidas a partir de uma ampla faixa de origens. Além disso, outros homólogos virais/bacterianos ou celulares, particularmente homólogos celulares encontrados em células de mamíferos (como por exemplo, células de ratos, camundongos, de bovinos e primatas), podem ser obtidos, e esses homólogos e seus fragmentos em geral serão capazes de hibridizar seletivamente para as seqüências indicadas aqui na listagem de seqüências. Essas seqüências podem ser obtidas sondando bibliotecas de DNAc produzidas a partir de bibliotecas de DNA genômico ou mesmo bibliotecas de DNA genômico de outras espécies de animais, e sondando essas bibliotecas com sondas que compreendem toda a seqüência de nucleotídeos, ou parte dela, indicada em SEQ ID NO: 22 sob condições de média a alta severidade. Considerações similares aplicam-se para obter espécies homólogas e variantes alélicas das seqüência de aminoãcidos e/ou aminoácidos da presente invenção.

As variantes e cepas/espécies homólogas podem ser obtidas também usando PCR degenerada que deve usar desencadeadores projetados para almejar seqüências-alvo dentro das variantes e homólogos que codificam seqüências de aminoácidos conservadas dentro das seqüências da presente invenção. As seqüências conservadas podem ser previstas, por exemplo, emparelhando as seqüências de aminoácidos de várias variantes/homólogos. Os emparelhamentos de seqüências podem ser realizados usando vários softwares de computador conhecidos nessas técnicas. Por exemplo, o programa GCG Wisconsin PileUp é amplamente utilizado. 0 desencadeadores usados para a PCR degenerada devem conter uma ou mais posições degeneradas e devem ser usados em condições de severidade menores do que aquelas usadas para clonar seqüências com desencadeadores de seqüências únicas contra seqüências conhecidas.

Alternativamente, essas seqüências de nucleotídeos podem ser obtidas por mutagênese direcionada a sítios de seqüências caracterizadas, como a seqüência de nucleotídeos enunciada em SEQ ID NO: 22. Isto pode ser útil quando, por exemplo, mudanças silenciosas de códons são necessárias para que as seqüências otimizem as preferências de códons quanto a uma célula hospedeira específica na qual as seqüências de nucleotídeos estão sendo expressadas. Outras mudanças nas seqüências podem ser desejadas para introduzir sítios de reconhecimento de enzimas de restrição, ou para alterar a atividade enzimática da enzima HOX codificada pelas seqüências de nucleotídeos.

As seqüências de nucleotídeos da presente invenção podem ser usadas para produzir um desencadeador, como por exemplo, um desencadeador de PCR, um desencadeador para uma reação de ampliação alternativa, uma sonda, por exemplo, marcada com um marcador revelador por meios convencionais, usando marcadores radioativos ou não-radioativos, ou as sequências de nucleotídeos podem ser clonadas em vetores.

Esses desencadeadores, sondas e outros fragmentos devem ter pelos menos 15, de preferência pelo menos 20, por exemplo, pelo menos 25, 3 0 ou 40 nucleotídeos de comprimento, e também estão englobados pelo termo "seqüência de nucleotídeos da presente invenção", como aqui utilizado.

As seqüências de nucleotídeos, como os polinucleot ídeos de DNA, e as sondas de acordo com a invenção podem ser produzidas por via recombinante, sintética ou qualquer meio disponível para os versados nestas técnicas. Elas podem ser também clonadas por técnicas padronizadas.

Genericamente, os desencadeadores devem ser produzidos por meios sintéticos que envolvem uma fabricação escalonada da seqüência de nucleotídeos desejada, um nucleotídeo de cada vez. As técnicas para realizar isto usando técnicas automatizadas estão facilmente disponíveis nesta área científica.

As seqüências de nucleotídeos mais longas devem ser genericamente produzidas usando meios recombinantes, por exemplo, usando técnicas de clonagem por PCR (reação de polimerase em cadeia) . Isto envolverá produzir um par de desencadeadores (como por exemplo, com cerca de 15 a 30 nucleotídeos) que flanqueiam uma região da seqüência orientadora que se deseja clonar, colocar os desencadadores em contato com o RNAm ou o DNAc, realizar uma reação de polimerase em cadeia (PCR) sob condições que criem a ampliação da região desejada, isolar o fragmento ampliado (como por exemplo, purificando a mistura da reação em um gel de agarose), e recuperar o DNA ampliado. Os desencadeadores podem ser projetados para conter sítios apropriados de reconhecimento de enzimas de restrição, de tal modo que o DNA ampliado possa ser clonado em um vetor de clonagem apropriado.

Devido â degeneração inerente do código genético, outras sequências de DNA, que codificam substancialmente a mesma seqüência de aminoãcidos ou uma funcionalmente equivalente, podem ser usadas para clonar e expressar a enzima HOX. Como deve ser entendido pelos versados nessas técnicas, pode ser vantajoso produzir sequências de nucleotídeos que codificam a enzima HOX e possuem códons de ocorrência não-natural. Os códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico específico (Murray, E. et al. , Nucleic Acids Res. 17:477-508, 1989) podem ser selecionados, por exemplo, para aumentar a taxa da expressão da enzima HOX ou para produzir transcritos de RNA recombinante, que têm propriedades desejáveis, como uma meia-vida mais longa do que os transcritos produzidos a partir da seqüência de ocorrência natural.

Triagens O método da presente invenção pode ser usado para triar quanto a níveis elevados da POI intracelular em organismos de células hospedeiras mutadas. As células empregadas nesta triagem podem ser fixadas sobre um suporte sólido ou sobre um substrato sólido, como pinos de plástico ou alguma outra superfície. As células podem ser colocadas em contato com a composição extratora de membrana da presente invenção e o nível da POI liberada pode ser medido usando métodos conhecidos nessas técnicas.

Triagens de Alta Produção (HTS) 0 método da presente invenção pode ser usado em sistemas de triagem de alta produção (HTS), onde as células- alvo são desenvolvidas e tríadas em placas de microtitulação (10.000 mutantes por dia) por sistemas robóticos. A título exemplificativo, quando se faz novas cepas de produção recombinantes, usualmente é necessário conduzir uma ou várias corridas de mutagênese tradicional, para aumentar a produtividade. Isso é feito mais eficientemente usando triagem de alta produção das células mutadas. O método da presente invenção é altamente vantajoso porque ele permite a triagem de alta produção quanto a níveis aumentados de POIs intracelulares. Até agora, esses sistemas eram somente capazes de triar quanto a níveis mais elevados de POIs secretadas.

Introdução â Seção de Exemplos e Descrição das Figuras A presente invenção será agora descrita, somente a título exemplificativo, fazendo referência as seguintes figuras: A Figura 1 fornece uma construção genética; A Figura 2A fornece construções genéticas; A Figura 2B fornece uma representação fotográfica;

As Figuras 3A e 3B fornecem representações fotográficas; A Figura 4 fornece um gráfico; A Figura 5 fornece uma listagem de seqüências; A Figura 6 fornece uma listagem de seqüências;

As Figuras 7A-7D fornecem uma representação fotográfica; A Figura 8 fornece um gráfico; A Figura 9 fornece um gráfico;

As Figuras 10A-10B fornecem uma representação fotográfica;

As Figuras 11A-11B fornecem um gráfico;

As Figuras 12A-12B fornecem uma representação fotográfica;

As Figuras 13A-13B fornecem uma representação fotográfica; e As Figuras 14A-14B fornecem uma representação fotográfica.

Um pouco mais detalhadamente: A Figura 1 fornece um mapa físico do vetor de expressão para produção de HOX em Hansenula. polymorpha. Os fragmentos cegos EcoRl/Notl que abrigam a região codificadora do gene de HOX sintético fundido a seqüências de sinais opcionais foram clonados para o sítio de múltiplas clonagens de um vetor de expressão padrão de Hansenula. Os vetores de expressão contêm o promotor do gene de formato desidrogenase (FMD) e o terminador (MOX-T) do gene de metanol oxidase separado pelo sítio de múltiplas clonagens para inserção dos fragmentos, ori e bla (ampR) para propagação e seleção em E. coli, a sequência de ARS (HARS) para replicação em H. polymorpha, o gene URA3 para seleção. A Figura 2A ilustra um diagrama do gene genuíno de > FMS de 1,4 kb (esquema superior) e o promotor de FMD com o DNA heterólogo clonado (esquema inferior). Os sítios de restrição são Asp718, Ncol. A Figura 2B ilustra as cópias gênicas do gene de HOX integrado. As fileiras 1-12 ilustram diferentes isolados recombinantes e sua diluição de DNA correspondente. A- fileira 13 ilustra uma cepa hospedeira não transformada e a fileira 14 ilustra um marcador de tamanho (M).

As Figuras 3A e 3B fornecem uma análise SDS-PAGE da expressão de HOX do filtrado da cultura da fermentação em glicerina da cepa mutageneizada DK8-27KanII3-mut25. A fileira 1 ilustra uma proteína marcadora, a fileira 2 ilustra um padrão de HOX (0,03 U/ml; 18 ul) , a fileira 3 ilustra um sobrenadante da sonda 3 (18 ul) , a fileira 4 ilustra um sobrenadante da sonda 4 (18 ul) , a fileira 5 ilustra um sobrenadante da sonda 5 (18 ul) , a fileira 6 ilustra um sobrenadante da sonda 6 (18 ul) , a fileira 7 ilustra um sobrenadante da sonda 7 (18 ul) , a fileira 8 ilustra um sobrenadante da sonda 8 918 ul) , a fileira 9 ilustra um sobrenadante da sonda 9 (18 ul) , a fileira 10 ilustra um sobrenadante da sonda 10 (18 ul). A Figura 3B fornece uma análise da mancha ocidental de cepas recombinantes que expressam HOX. As amostras aplicadas nas fileiras são as mesmas que as da Figura 3A. A membrana foi sondada com um anticorpo policlonal de HOX. A Figura 4 ilustra o crescimento e produtividade de uma cultura de fermentação de 10 litros de uma cepa em secreção DK8-27KanII3-mut25. A fermentação foi realizada a 25 °C e pH 5,0 com glicerina e controle com p02. A Figura 5 fornece os oligonucleotídeos individuais usados para sintetizar o gene de HOX com otimização de códons. A Figura 6 fornece uma seqüência de nucleotídeos de um gene sintético de HOX e a seqüência de aminoãcidos correspondente.

As Figuras 7A-7D a localização da enzima HOX em H.

polymorpha, determinada por imunofluorescência. A superposição da localização da enzima HOX (sinal verde) com a localização nuclear {sinal azul) está ilustrada. Vide: A) cepa RB11 sem gene de HOX; B) DK8-27; C) DK8-27 mut 25; D) DK2II-I. A Figura 8 fornece um gráfico indicando a atividade de HOX em função do número de ciclos através de um homogeneizador de células. A Figura 9 fornece um gráfico que indica as células de Hansenula polymorpha extraídas com diferentes concentrações de CTAB e Triton X-100. A Figura 10A ilustra uma análise SDS-PAGE dos níveis da enzima HOX no sobrenadadante de células (fileiras 7-10) e pelota de células (fileiras 2-5) depois do tratamento com CTAB. A enzima HOX foi liberada das pelotas por extração mecânica. As amostras foram analisadas em géis de NuPAGE a 4-12% de MES, Novex e amostras de 10 μΐ foram carregadas em cada fileira na seguinte ordem: Fileiras 2-5: HOX residual na pelota de célula; Fileiras 7-10: HOX liberada no sobrenadante; Fileiras 1 e 6: padrão "Novex See Blue"; Fileira 2: controle; Fileira 3: 0,1% de CTAB; Fileira 4: 0,2% de CTAB; Fileira 5: 0,4% de CTAB; Fileira 7: controle; Fileira 8: 0,1% de CTAB; Fileira 9: 0,2% de CTAB; e Fileira 10: 0,4% de CTAB. A Figura 10B ilustra uma análise da mancha ocidental dos níveis da enzima HOX no sobrenadadante de células (fileiras 7-10) e pelota de células (fileiras 2-5) depois do tratamento com CTAB. A enzima HOX foi liberada das pelotas por extração mecânica. As amostras foram analisadas em géis de NuPAGE a 4-12% de MES, Novex e amostras de 5 μΐ foram carregadas em cada fileira na seguinte ordem: Fileiras 2-5: HOX residual na pelota de célula; Fileiras 7-10: HOX liberada no sobrenadante;

Fileiras 1 e 6: padrão "Novex See Blue",- Fileira 2: controle; Fileira 3: 0,1% de CTAB; Fileira 4: 0,2% de CTAB;

Fileira 5: 0,4% de CTAB; Fileira 7: controle; Fileira 8: 0,1% de CTAB; Fileira 9: 0,2% de CTAB; e Fileira 10: 0,4% de CTAB.

A Figura 11A ilustra o perfil de eluição para HOX extraída com CTAB.

A Figura 11B ilustra o perfil de eluição para HOX extraída mecanicamente.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos Produtos Químicos Todos os produtos químicos usados foram do grau de reagente analítico. A lecitina (3-sn-fosfatidilcolina) foi adquirida no mercado como Sternpur PM da Stern (Alemanha). A pronase E (uma marca registrada de uma mistura de várias exopeptidases e endopeptidases, obtida a partir de Streptomyces griseus, que é capaz de hidrolisar virtualmente qualquer proteína quase completamente para aminoãcidos livres). A lisolecitina (lisofatidilcolina), D-glicose, o- dianisidina, peroxidase (P-8125), ácido cãprico (ácido decanóico), saponina (qualquer membro de um grande grupo de glicosídeos, amplamente distribuído em plantas, que são tensoativos potentes) , e CTAB (brometo de cetil-trimetil- amônio, também conhecido como brometo de hexadecil-trimetil- amônio) (H-5882) , foram todos adquiridos na Sigma Chemical Co., E.U.A. 0 metanol (HPLC) foi da Lab-Scan Ltd. 0 peróxido de hidrogênio e Triton X-100 (uma marca registrada de octil-fenol polietoxilado) foram da Merck, Alemanha. O emulsificante ΎΝ, também conhecido como Palsgaard 4445 foi da Palsgaard, Dinamarca. Os compostos de amônio quaternário, tais como LTAB (brometo de lauroil-trimetil- amônio) , Cetrimide-40 (também conhecido como cetrimídio, que é um desinfetante detergente que consiste de uma mistura de brometos de alquil-amônio, principalmente CTAB), CTAB (brometo de cetil-trimetil-amônio), STAB (brometo de estearoil-trimetil-amônio), MTAC (cloreto de miristil- trimetil-amônio), CTAC (cloreto de cetil-trimetil-amônio), STAC (cloreto de estearoil-trimetil-amônio), foram todos adquiridos na FeF, Dinamarca. Rodalon compreende cerca de 9,5% (95 g/1) de cloreto de alquil-dimetil-benzil-amônio (Ci2H25N(CH3)2C7HvC1) foi obtido na Superfos Biosector, 2950 Vedbaek, Dinamarca. O cloreto de alquil-dimetil-benzil- amônio é conhecido também como cloreto de benzalconio. O emulsificante lauroil-lactilato de sódio (SLL) foi adquirido na Danisco Cultor, Grindsted, Dinamarca.

Fermentação da Levedura A cultura da levedura foi realizada em um fermentador de 6 litros ou 100 litros, de acordo com o manual de fermentação da Rhein Biotech para uma escala de 10 litros. EXEMPLO 1 Montagem de um Gene de HOX Sintético com Codons Otimizados Desenho do Gene A seqüência de nucleotídeos do gene nativo de HOX foi alterada, resultando em um gene sintético. O gene sintético de HOX (Figura 6) foi desenhado de tal modo que o uso de códons fosse precisamente equiparado às preferencias de códons de leveduras relevantes do ponto de vista biotecnológico, tais como Pichia sp., Hansenula sp., Kluyveromyces, Yarrowinia, S. pombe, para facilitar a produção em altos níveis nestes organismos. O gene foi dividido em três fragmentos montados e/ou clonados separadamente. Os subconjuntos, designados como metade proximal de 5' eram constituídos dos seguintes oligonucleotídeos, como estabelecido na Figura 5, como pares complementares: H0Xla/H0X2b, HOX3a/HOX4b, HOX5a/HOX6b, HOX7a/HOX8b, HOX9a/HOX10b; metade distai A de 3', usando os desencadeadores 1-6, e metade distai B de 3', usando os desencadeadores 6-10.

Gene Sintético de HQX Proximal de 5' A metade proximal de 5' do gene sintético de HOX foi sintetizada usando dez oligonucleotídeos, H0X1A até HOXIOB. Os oligonucleotídeos que têm comprimentos na faixa entre 100 e 12 0 pares de bases foram usados como desencadeadores (concentração = 0,1 μΜ cada) em uma reação de PCR com partida a quente de 10 0 μΐ (usando a DNA polimerase termoestãvel Pwo da Boehringer). A partida a quente foi realizada aquecendo a mistura de oligonucleotídeos, tampão, e MgS04, até 90 °C, antes que dNTP (250 μΜ) e a polimerase Pwo (2,5 unidades) fossem aquecidas. Quarenta ciclos de PCR, usando o perfil de PCR: 94 °C por 3 0 segundos, 57 °C por 1 minuto e 72 °C por 1 minuto. Uma etapa de alongamento de 10 minutos a 72 °C foi incluída no final dos 40 ciclos. A análise dos produtos desta PCR por eletroforese em gel de agarose apresentou um esfregaço de bandas de DNA na faixa de tamanho entre 100 e 850 pares de bases. A primeira PCR foi reampliada usando 2 ul da reação acima como modelo e os desencadeadores flanqueadores (1 μΜ cada), HOX1A e HOXIOB. A reação continha dNTP 200 μΜ, MgCl2 2,5 mM e 2 unidades de AmpliTaq® (perkin-Elmer Cetus). As condições da PCR foram: 94 °C por 2 min, depois 30 ciclos de PCR com o perfil 94 °C por 30 segundos, 60 °C por 1 min e 72 °C por 45 segundos. Uma etapa de alongamento de 10 min a 72 °C foi incluída no final da reação acima. A análise do segundo produto da PCR por eletroforese em gel de agarose apresentou a presença de uma banda de DNA com 850 pares de bases, que foi subsequentemente purificada a partir do gel e clonada no vetor pCR® (Invitrogen).

Gene Sintético de HOX distai de 3' Dez desencadeadores com comprimentos entre 90 e 126 pares de bases foram desenhados para sintetizar a parte distai do gene de HOX. Os desencadeadores continham regiões sobrepostas (complementares) com 16-21 pares de bases, com uma temperatura de fusão calculada de aproximadamente 60 °C. A parte distai do gene de HOX foi sintetizada como dois fragmentos (A e B) , cada um com um tamanho de 53 0 pares de bases. As reações de PCR foram realizadas usando 6 desencadeadores de cada vez. A reação de PCR 1 continha os desencadeadores 1-6 e a reação de PCR 2 continha os desencadeadores 5-10. As reação de ampliação de PCR foram realizadas 0,1 μΜ de cada um dos desencadeadores, 250 μΜ cada de dNTP, 2 mM de MgS04 e 2,5 unidades da DNA polimerase Pfu a partir de Pyrococcus furiosus (Stratagene) em um volume de reação de 100 μΐ. Os parâmetro dos ciclos para as 2 reações de PCR, usando a DNA polimerase Pfu, incluíram uma desnaturação de 1 min a 95 °C, seguido de 3 0 ciclos de PCR: 94 °C por 1 min, 55 °C por 1 min e 72 °C por 1 min. Isto foi seguido de uma etapa de alongamento a 72 °C por 3 min. A análise dos produtos da PCR das duas reações de PCR por eletroforese em gel de agarose apresentou em ambos os casos a síntese de uma banda de DNA específica do tamanho correto com aproximadamente 530 pares de bases de comprimento. Os produtos da PCR foram clonados no vetor pCR®-Blunt (Invitrogen). Os genes sintéticos de HOX clonados parciais foram seqüenciados usando desencadeadores que flanqueiam os múltiplos sítios de clonagem (desencadeador reverso M13 e desencadeador do promotor T7) . Os resultados do seqüenciamento verificaram que os genes parciais sintetizados continham a seqüência correta.

Montagem do Gene de HOX Final com Códons Otimizados As três partes do gene sintético de HOX foram combinadas por ligação dos fragmentos purificados em gel, compreendendo o fragmento A e B proximal de 5' Ncol/PvuII, o distai de 3' Pvull/Spel de HOX, cortados com Spel/NotI. O gene de HOX sintético completo com códons otimizados (Figura 6) foi montado no vetor de expressão Hansenula, que foi desenvolvido para mediar a expressão e secreção de proteínas estranhas a partir de Hansenula. O vetor de expressão baseia-se no promotor formiato desidrogenase (FMD), no terminador de MOX, com e sem um sinal de secreção em levedura.

Resultados 1 Expressão da HOX Recombinante em H. oolvmorpha A Tabela 1 indica as várias construções de fusão da secreção de HOX que foram inseridas como fragmentos cegos EcoRI/Notl no sítio de clonagem múltipla do vetor de expressão/integração de H. polymorpha. As diferentes seqüências de sinais foram derivadas do gene de glicoamilase de Schwanniomyces occidentalis, gene do tipo acasalador do fator α de Saccharomyces cerevisiae e a TAKA-amilase de Aspergillus oryzae. Uma construção de HOX Ncol/Notl sem uma seqüência de sinais também foi clonada no vetor. TABELA 1 0 termo sintética mutante refere-se a um sítio de divagem da protease KEX 2 putativa, R33i_K332 até R331-P332· EXEMPLO 2 Transformação e Passagem Os diferentes plasmídeos de expressão de HOX foram usados para transformar a cepa RB11 de H. polymorpha de uracil auxotrófica para uridina prototrófica. Os transformantes de HOX que acolhem os diferentes plasmídeos de expressão foram cultivados sob condições seletivas por 30 gerações, para ampliar o DNA plasmídico e permitir a integração dentro do genoma. Os transformantes foram desenvolvidos em meio completo não seletivo por 20 gerações.

Além da seleção, usou-se PCR e análise da mancha do Sul para caracterizar os transformantes.

Determinação do Número de Cópias do DNA Heterólogo Integrado O DNA genômico da cepa hospedeira não transformada e os vários isolados recombinantes de uma construção específica de HOX foram digeridos com as enzimas de restrição, Asp718/NcoI. O DNA restrito foi separado em 0,8% de géis de agarose, transferido para a membrana (nitrocelulose) e hibridizado para um fragmento marcado com 32p do promotor FMD clonado. O padrão de hibridização revela dois sinais, um para o gene de FMD de única cópia genuína com 1,4 kb, e um originário da fusão heteróloga ligeiramente menor. Uma série de diluições permitiu estimar a intensidade dos sinais do DNA integrado comparado com o controle intrínseco de cópia única.

Resultados 2 Triagem quanto à Expressão de HOX

Os transformantes foram desenvolvidos em tubos de cultura de 3 ml e cultivados sob condições depressoras, suplementando o meio com 1% de glicerina. A expressão de HOX foi analisada por análise SDS-PAGE das culturas a partir da fermentação com glicerina. A análise da mancha ocidental, usando um anticorpo policlonal de HOX, foi usada para detectar a presença da proteína HOX. TABELA 2 Características de Transformantes Selecionados que Expressam HOX __________________________________________________________ * A cepa DK8-27 foi submetida a mutagênese química (NTG- nitrosoguanidina) . EXEMPLO 3 Localização de HOX Recombinante em H. volvmorjpha Para a microscopia de imunof luorescência de H. polymorpha recombinante, as células foram pré-cultivadas em Base de Nitrogênio de Levedura (YNB) + glicose a uma densidade de 108 células/ml. Para induzir a expressão, 3 x 10® células forma deslocadas para culturas em frasco vascole jante de 100 ml suplementadas com YNB + 1% de glicerina. Depois de 1, 2 ou 3 dias de crescimento sob condição depressora, 5 x 108 células foram fixadas por um tratamento combinado de para-formaldeído (4%) e glutaraldeído (0,2%) (Hagen e Hyam, 1988). Depois de três lavagens com 1 ml de PEM (100 mM de Pipes, 1 mM de EGTA, 1 mM de MgS04, pH 6,9), as paredes celulares foram parcialmente removidas em PEMS (PEM + 1 M de sorbitol) suplementado com 0,5 mg/ml de Zymolase-100T. Depois de aproximadamente 60 min de digestão, as células foram deslocadas para PEMS + 1% de Triton X-100, incubadas por 30 segundos e lavadas três vezes com 0,5 ml de PEM. Para interromper rapidamente o gluraralderdo não reagido, as células foram recolocadas em suspensão em PEM + 1 mg/ml de boro-hidreto de sódio. Imediatamente após isto, as células foram lavadas duas vezes em PEM, recolocadas em suspensão em PEMBAL (PEM + 1% de BSA (isento de globulina) , 1 mM de cloridrato de lisina, 0,1% de NaN3) , e incubadas em uma roda giratória por 30 min. 25% da suspensão de células, equivalendo a 108 células, foram suplementados com 10 μ3/τη1 de anticorpos anti-HOX policlonais purificados por afinidade e incubados por toda a noite â temperatura ambiente.

Depois de três lavagens em 0,5 ml de PEMBAL, as células foram recolocadas em suspensão em PEMBAL e incubadas 5-20 horas no escuro com 0,5% de anticorpos anti-coelho caprinos conjugados com FITC (Sigma) . Depois da lavagem em PEMBAL, as células foram lavadas uma vez em PBS, uma vez em PBS + μg/ml de diamidino-fenil-indol (DAPI), e finalmente recolocadas em suspensão em PBS + 0,1% de NaN3. Para observação microscópica, pequenas amostras de suspensões de células foram secadas sobre lamínulas revestidas com poli-L- lisina e invertidas para dentro de glicerina a 100% contendo 1 mg/ml de para-fenileno-diamina. As células foram examinadas com um microscópio Zeiss equipado para imunofluorescencia indireta a 1.000 X e as imagens foram captadas por uma câmera CCD (Kodak MicroMAX) e processadas usando o software MetaMorph.

Resultados 3 A microscopia de imunofluorescência do transformante de DK8-27 revelou que a proteína HOX recombinante localiza-se principalmente na periferia da célula como agregados (Figura 7B). Combinados com os dados bioquímicos, esses resultados indicam que HOX, em algum grau, pode ser uma proteína associada a membrana (ao invés de uma proteína substancialmente ligada a membrana). É mais provável que HOX localize-se na membrana plasmãtica em H. polymorpha. Além disso, na cepa DK8-2 7 mut25, que é derivada de DK8-27, HOX está associada à membrana plasmática (Figura 7C) . A proteína, entretanto, não se acumula em agregados, mas está mais uniformemente distribuída. Quando fundida a vários peptídeos líderes, HOX acumula-se em enormes agregados intracelulares (Figura 7D). EXEMPLO 4 Extração de HOX a partir de Células de Hansenula Recombinantes por Meio de Diferentes Detergentes e Proteases O experimento foi conduzido usando 5,0 ml de suspensão de células (células = sobrenadante) em um tubo de centrifugação de 15 ml (HOX9926-7, 317 gramas de células por litro de peso seco, 0,3 U/ml de atividade de HOX extracelular). As células foram separadas por centrifugação a 4.000 x g por 10 min. Para os experimentos de permeabilização, o sobrenadante foi então suplementado com CTAB, ou CTAB+Pronase E, ou Pronase E, ou Tween 2 0 (uma marca registrada de monolaurato de sorbitano polioxietilênico) e Tween 80 (uma marca registrada de monooletato de sorbitano). As células foram então recolocadas em suspensão em 4,0 ml de sobrenadante e incubadas por 23 horas a 25 °C (50 0 rpm) . Para examinar o efeito do tempo com CTAB, as células em um dos tubos foram incubadas somente por 7 min a 25 °C em 4 ml de CTAB a 0,4%.

As células foram então separadas por centrifugação. Depois, as células foram novamente recolocadas em suspensão no sobrenadante original sem CTAB adicionado e depois incubadas por 23 horas com acima. Depois da incubação, a HOX extracelular nos extratos isentos de células foi medida pelo ensaio de HOX. Método de Ensaio para Determinação da Atividade de HOX (Ensaio de HOX) A atividade de HOX foi estimada pelo ensaio de Sullivan e Ikawa (1973). O ensaio foi reduzido em escala para ser realizado em placas de microtitulação.

Princípio 0 ensaio de HOX baseia-se na medição do peróxido de hidrogênio gerado na oxidação de glicose. O peróxido de hidrogênio oxida o-dianisidina na presença de peroxidase (POD), para formar um corante.

HOX β-D-glicose + H20 + 02 —> D-glicono-delta-lactona + H202 POD H202 + o-dianisidinared. 2 H20 + o-dianisidinaoxid.

Reagentes 1. Tampão de fosfato 100 mM, pH 6,3 2 . D-glicose 100 mM em tampão de fosfato 100 mM, pH 6,3 3. o-Dianisidina, 3,0 mg/ml em água destilada 4. Peroxidase, 0,10 mg/ml em tampão de fosfato 100 mM, pH 6,3 Ensaio 120 μΐ de reagente 1 150 μΐ de reagente 2 10 μΐ de reagente 3 10 μΐ de reagente 4 e 10 μΐ de solução de enzima (em diluição apropriada) O ensaio é realizado em uma placa de microtitulação. A reação é iniciada pela adição de solução de enzima. A mistura é incubada a 25 °C por 10 min sob vascolejamento. A corrida cega contém todos os componentes com água ao invés da solução de enzima. A formação do corante ê medida em uma leitora de placas de microtitulação a 405 nm. A linearidade da reação é checada usando um programa de cinética na leitora de microplacas.

Curva-padrão de Peróxido de Hidrogênio Uma curva-padrão de peróxido de hidrogênio é construída usando concentrações variadas de H202 fresco.

Uma unidade de atividade de enzima é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de H202 por minuto a 25 °C.

Resultados 4 Os dados apresentados na Tabela 3 indicam que CTAB é muito eficiente em extrair HOX. CTAB e também muito eficiente do que Tween 20 e Tween 80. Não há qualquer benefício significativo em adicionar uma protease. É muito interessante que exerce seu efeito positivo mesmo quando usado somente por uma pré-incubação de 7 min, e isto indica que CTAB liga-se muito rapidamente à parede celular de Hansenula. e permeabiliza-a. Isso é fundamentado pela análise do sobrenadante isento de células quanto a CTAB (vide abaixo), que indica que somente 50-100 ppm dos 4.000 ppm de CTAB adicionados estão presentes no sobrenadante isento de células.

Uma comparação do sedimento nos tubos de centrifugação para cada teste indica também que o volume celular compactado das células tratadas com CTAB é menor do que o volume das células de controle ou das células tratadas com detergentes diferentes de CTAB. Este encolhimento das células indica que as células foram realmente permeabilizadas e despojadas de uma parte do seu teor solúvel. TABELA 3 Efeito de Detergente, Detergente em Combinação com Protease, e Pré-incubação, sobre a Extração de HOX Intracelular EXEMPLO 5 Extração de HQX Usando CTAB e Cloreto de Benzalcônio (BAC) O experimento foi conduzido usando 5,0 ml de suspensão de células (células + sobrenadante) em um tubo de centrifugação de 15 ml (HOX9959, Mut 45) . A suspensão de células foi então suplementada com CTAB (a partir de uma solução de insumo a 10%) ou cloreto de benzalcônio (Rodalon, cloreto de benzalcônio a 9,5%) e incubada por 22 h a 25 °C (2 00 rpm) . Depois da incubação, a HOX extracelular (as células foram removidas por 10 min de centrifugação a 4.000 x g) foi medida pelo ensaio de HOX.

Resultados 5 Os dados apresentados na Tabela 4 indicam que o cloreto de benzalcônio (BAC) é muito eficaz em liberar a enzima HOX das células. TABELA 4 Efeito de CTAB e Cloreto de Benzalcônio (BAC) sobre a Liberação de HOX das Células EXEMPLO 6 Extração de HOX por CBAT Combinado com Sais e em Diferentes Temperaturas Para examinar o mecanismo do efeito de CTAB, CTAB foi combinado com sais caotrópicos e não-caotrópicos. Cinco mililitros da suspensão de células (células + sobrenadante) foram adicionados a um tubo de centrif ugação de 15 ml (XOX9926-7, 317 g de células/litro peso seco, 0,3 U/ml de atividade de HOX extracelular). As células foram separadas por centrif ugação a 4.000 g por 10 min. O sobrenadante foi então suplementado com CTAB, ou CTAB+NaCl, ou CTAB+uréia, ou CTAB+sulfato de amônio, ou o detergente não-iônico, octil- glicosídeo. As células foram então recolocadas em suspensão em 4,0 ml de sobrenadante e incubadas por 26 h a 25 °C (500 rpm) . Neste exprimento, o efeito do vascolej amento e da temperatura também foi investigado. Depois da incubação, o extrato isento de células foi usado para estimar a atividade de HOX, usando o ensaio de HOX delineado no Exemplo 4.

Resultados 6 Os resultados estão indicados na Tabela 5. É evidente que o vascolej amento não é necessário para se ter extração de HOX na presença de CTAB. Existe um efeito evidente da temperatura, significando que a extração a 4 °C

resulta em somente metade da atividade extraída a 25 °C. A adição de cloreto de sódio e sulfato de amônio diminui o efeito do tratamento com CTAB, o que pode indicar que a natureza iônica de CTAB é importante. A adição de uréia teve um efeito menos drástico, mas ainda reduziu a quantidade de HOX extraída ate aproximadamente a metade da quantidade extraída com 0,4% de CTAB. Embora a uréia seja não-iônica, ela pode interferir com a interação hidrofóbica. A uréia foi relatada nas técnicas anteriores como um meio para permeabilizar células de Píchia quanto à extração de proteínas lipofílicas (Craig, 1987) . O detergente não- iônico, octil-glicosídeo, não tem qualquer efeito extrator significativo. TABELA 5 Efeito de Detergente, Detergente em Combinação com Sal, e Temperatura, sobre a Extração de HOX Intracelular EXEMPLO 7 Determinação de CTAB e LTAB por LC-ESI-MS em Extratos Celulares crue Contêm HOX

As amostras de HOX extraída do Exemplo 5 foram analisadas quanto ao seu teor de CTAB por meio de LC-ECI-MS em um sistema de HPLC-MS Hewlett-Packard 1100, que consiste das seguintes unidades: a) Bomba binária gradiente, HP 1100 b) Auto-amostrador, HP 1100 c) Compartimento de Coluna com Termostato, HP 1100 d) Detector Seletivo de Massas, HP 1100 e) Sistema de Dados Cromatogrãficos, HP

ChemStation, Versão 6.01 0 sistema foi equipado com uma coluna Zorbax Eclipse® XDB-C8, 5 μΜ, 150 x 4,6 mM id. {Hewlett-Packard) . A temperatura da coluna foi de 25 °C.

As condições cromatográficas foram uma fase móvel consistindo de dois solvente. Solvente A: NH4OAc/Água 1 mM;

Solvente B: NH4OAc/Metanol 1 mM. A coluna foi operada com condições isocrãticas (isto é, usando condições nas quais a composição do eluente é mantida constante durante o período cromatogrãfico) : 5% de A + 95% de B, com uma vazão de solvente de 0,80 ml/min e um volume de injeção de 10 μΐ. As amostras foram injetadas diretamente.

As condições da espectrometria de massas foram com os seguintes ajustes da câmara de spray: Modo de Ionização: Eletrospray em modo positivo Temperatura do gás de secagem (N2) : 350 °C

Vazão do gás de secagem: 5,0 1/min Pressão do nebulizador: 4,08 atra (50 psi) Voltagem capilar: -4.000 volts Voltagem do fragmentador: 100 volts Os ajustes do detector foram os seguintes: parâmetros SIM: m/z 284,1 (cátion de hexadecil-trimetil- amônio). Uma solução de insumo contendo 500 μg de CTAB/ml de água (índice de concentração 1.000) foi diluída com água para obter soluções-padrão com os seguintes índices de concentração: 300 - 100 - 30 - 10. Adicionou-se às amostras 0,4% de CTAB, o que daria 4.000 μφ/πιΐ se todo CTAB estivesse presente no extrato. O método de análise para os compostos de amônio quaternário foi otimizado usando uma coluna diferente, e usando uma fase móvel diferente. Adicionou-se LTAB até uma concentração de 0,20% (p/v) a duas fermentações em escala de 90 litros (Vest0002b com uma concentração de biomassa de 332 g/1 células úmidas) , e a HOX foi extraída por 24 h. Uma amostra de cada fermentação foi centrifugada a 10.000 x g por 10 min, e os sobrenadantes resultantes foram retirados para análise de LTAB. 0 seguinte método foi usado para quantificar o teor de LTAB nos sobrenadantes por meio de LC- ESI-MS em um sistema de HPLC-MS Hewlett-Packard 1100, que consiste das seguintes unidades: a) Bomba binária gradiente, HP 1100 b) Auto-amostrador, HP 1100 c) Compartimento de Coluna com Termostato, HP 1100 d) Detector Seletivo de Massas, HP 1100 e) Sistema de Dados Cromatográficos, HP

ChemStation, Versão 6.01 0 sistema foi equipado com uma coluna PLRP-S, 100 Á, 5 μητι, 250 x 4,6 mM id. (Polymer Laboratories) . A temperatura da coluna foi de 25 °C.

As condições cromatográficas foram uma fase móvel consistindo de 0,1% de ácido heptaflúor-butírico em metanol. A coluna foi operada com uma vazão de solvente de 1,00 ml/min e um volume de injeção de 5 μΐ. As amostras foram diluídas 25 vezes com metanol e filtradas através de "Gelman GHP Acrodisc 13 mM Minispike 0,45 μΜ, antes da injeção.

Vazão do gás de secagem: 13,0 1/min Pressão do nebulizador: 4,08 atm (60 psi) Voltagem capilar: -4.000 volts Voltagem do fragmentador: 150 volts Os ajustes do detector foram os seguintes: parâmetros SIM: m/z 228,1 (cátion de lauroil-trimetil- atnônio) . Uma solução de insumo contendo 2 50 μ9 de LTAB/ml de metanol (índice de concentração 1.000) foi diluída com metanol para obter soluções-padrão com os seguintes índices de concentração: 400 - 200 - 120 - 80 -36-10,8-5,4- 2,16 - 0,864 .

Resultados 7 Fica evidente a partir da Tabela 6 que o nível de CTAB nos extratos celulares que contêm a enzima HOX é muito menor do que a quantidade adicionada âs células. Isso é explicado pela ligação, e portanto, imobilização de CTAB às paredes das células da levedura. Isto significa que a enzima HOX resultante contém somente um nível de CTAB muito baixo. TABELA 6 Teor de CTAB nos Sobrenadantes de HOX Extraída no Exemplo 6 1Analisado pelo primeiro método Os obtidos sobre LTAB no sobrenadante (vide Tabela 6a) indicam que somente cerca de 27% do LTAB adicionado encontram-se na fração isenta de células. Este resultado indica a mesma tendência que os resultados com CTAB na Tabela 6. TABELA 6a Teor de LTAB nos Sobrenadantes Extraídos da Fermentação Vest0002 e Vest0003 do Exemplo 6 ■'Analisado pelo método otimizado EXEMPLO 8 Efeito da Temperatura sobre a Eficiência de Tempo Final da Extração de HOX por CTAB O efeito da temperatura sobre a eficiência do tempo final da extração de HOX por CTAB foi examinado em uma amostra de Hansenula: Mut 45, HOX9949, 282 g/1, 2,6 U/ml.

Adicionou-se 0,2% ou 0,4% de CTAB (de uma solução de insumo de CTAB a 10%) a 5 ml de fermento (células + sobrenadante) em um tubo de centrifugação. Os tubos foram incubados a 25, 30, 35 e 40 °C, respectivamente (200 rpm).

Nos tempos indicados, as amostras foram retiradas e depois de centrifugar por 5 min a 10.000 g, o sobrenadante foi testado quanto à atividade de HOX. Os resultados estão indicados na Tabela 7. TABELA 7 Decurso de Tempo da Extração de HOX a Partir de H.

Polymorpha em Diferentes Temperaturas Resultados 8 E evidente que a extração com CTAB ê dependente da temperatura e que uma extração mais rápida pode ser alcançada usando uma temperatura mais alta. Este é, entretanto, um parâmetro que deve ser equilibrado com a estabilidade da proteína extraída. Neste experimento, nenhuma diferença significativa parece existir entre usar 0,2% ou 0,4% de CTAB. Entretanto, isto depende da concentração de células no experimento específico. EXEMPLO 9 Extração de HOX com Diferentes Compostos de Amônio Quaternário Vários compostos de amônio quaternário foram testados com relação à extração da enzima intracelular HOX a partir de Hansenula polymorpha. Uma amoqtra do caldo de fermentação foi retirada de uma fermentação com escala de 6 litros, onde a concentração de biomassa era de aproximadamente 340 g peso seco por litro. Um mililitro de uma solução a 4% (p/v) de cada um dos compostos de amônio quaternário listados na Tabela 8 foi adicionado a 9 ml de caldo de fermentação em tubos de plástico. Depois de incubar a 25 °C a 200 rpm, os tubos foram centrifugados por 10 mm a 12.000 g. Os sobrenadantes foram analisados quanto à atividade de HOX, usando o ensaio de HOX descrito anteriormente. 0 decurso de tempo da extração de HOX foi estudado com CTAB, LTAB e CTAC. Uma amostra de fermentação contendo 280 g peso seco de Hansenula polymorpha por litro foi retirada do fermentador. Uma solução a 4% (p/v) de CTAB, LTAB e CTAC foi adicionada até uma concentração final de 0,2-s ou 0,4% (p/v) aos tubos de plástico contendo 9 ml de caldo de fermentação. Depois de 0, 7, 17, 24 e 48 horas de incubação a 25 °C e 200 rpm, os tubos foram centrifugados por 10 min a 12.000 g. Os sobrenadantes foram analisados quanto à atividade de HOX, usando o ensaio de HOX descrito anteriormente. O efeito extrator de LTAB foi testado na cepa n2 349 de Pichia pastoris, que produz HOX intracelularmente.

Uma amostra do caldo de fermentação foi retirada de uma fermentação em escala de 6 litros, onde a concentração de biomassa era de aproximadamente 232 g peso úmido por litro.

Nove militros do caldo de fermentação foram adicionados aos tubos de plástico junto com 0 (controle) ou 180 μΐ de uma solução de LTAB a 10% (p/v) . Depois de 24 h de incubação a 30 °C e 2 0 rpm, os tubos foram centrifugados por 5 min a 9.000 g. Os sobrenadantes foram analisados quanto à atividade de HOX, usando o ensaio de HOX descrito anteriormente.

Resultados 9 HOX pôde ser extraída com todos os compostos de amônio quaternário testados (vide Tabela 8) , quando adicionados a uma amostra de fermentação em uma concentração final de 0,4% (p/v) . Depois de 24 h de incubação a 2 5 °C, LTAB foi superior aos outros compostos testados com relação à extração de HOX. A quantidade de HOX extraída pareceu diminuir com o comprimento de cadeia crescente do composto de amônio quaternário. O decurso de tempo da extração de HOX com CTAB, LTAB ou CTAC está indicado na Tabela 9. É evidente que o tempo de incubação e também a concentração do reagente de extração influenciam a quantidade de atividade de HOX extraída. LTAB demonstrou ser o melhor agente extrator em todos os tempos de incubação analisados, o que e consistente com os resultados indicados na Tabela 8. A extração de HOX com LTAB parece prosseguir em um compasso mais lento em uma concentração de 0,2% (p/v) de LTAB, do que em uma concentração de 0,4% (p/v) de LTAB. Parece existir pouca diferença entre usar 0,2 ou 0,4% (p/v) de CTAB em termos de extração da enzima HOX.

Os níveis de HOX extracelular no caldo de fermentação, antes da adição dos reagentes extratores era de cerca de 9% da atividade extraída com LTAB após 24 h. a0s compostos são todos da estrutura: CH3-(CH2)n” N(CH3)+3 com cloreto ou brometo como contra-íon. bTodos experimentos foram realizados em duplicata. °0s resultados de Pichia pastoris foram normalizados em relação à HOX extraída no tubo de controle, sem qualquer adição de LTAB. 0 nível de HOX extracelular na fermentação antes do início da extração era cerca de 24% do nível extraído no controle, isto é, o tubo de plástico sem qualquer adição de LTAB. TABELA 9 Decurso do Tempo de Extração da Enzima HOX com CTAB, LTAB e CTAC 0 nível de HOX extracelular no caldo de fermentação antes da adição dos reagentes extratores era de cerca de 4% da atividade de HOX extraída com 0,4% (p/v) de LTAB depois de 48 h. Os valores estão fornecidos com desvio padrão de ± 1; n = número de experimentos.

Todos os valores estão normalizados para os níveis extraídos com 0,4% (p/v) de LTAB depois de 48 h. EXEMPLO 10 Comparação entre CTAB e Outros Emulsificantes quanto à Extração de HOX

Sabe-se que a lisolecitina (lisofosfatidilcolina) pode permeabilizar pelo menos células de mamíferos, com liberação seletiva de macromoléculas. Para testar o efeito da lisolecitina em inúmeros outros emulsificantes e ácidos graxos de cadeia curta, sua capacidade de extrair HOX foi examinada e comparada com CTAB.

Cinco militros da suspensão de células (células + sobrenadante) foram adicionados a um tubo de centrifugação de 15 ml (HOX9910B, 305 g de células/litro peso úmido, 1,6 U/ml de atividade de HOX extracelular) . As células foram separadas por centrifugação a 4.000 g por 10 min. As células foram então recolocadas em suspensão em 4,0 ml de ácido cítrico 25 mM, pH 6,3, suplementado com CTAB, ou emulsificantes SLL, ou YN, ou ácido cáprico, ou lisolecitina, ou lecitina. As células foram então incubadas por 20 h a 25 °C (500 rpm).

Resultados 10 Depois da incubação, o nível da atividade de HOX no extrato isento de células foi medido pelo ensaio de HOX.

Os dados apresentados na Tabela 10 indicam que os emulsificantes testados, diferentes de CTAB, são somente capazes de liberar níveis muito baixos de enzima ativa. Os resultados indicam também que CTAB é capaz de ativar enzima latente no sobrenadante, possivelmente pela liberação da enzima dos fragmentos ligados à membrana. TABELA 10 Efeito de Detergente, Emulsificante o Fosfolipídeos sobre a Extração de HOX EXEMPLO 1 1 Comparação entre CTAB e Saponina quanto à Extração de HQX

Para estabelecer se saponina funciona como a digitonina, o efeito da saponina sobre a extração da enzima HOX a partir de Hansenula foi examinado. O experimento foi conduzido com 5,0 ml de suspensão de células (células + sobrenadante) em um tubo de centrifugação de 15 ml (HOX190799, 340 g de células/litro peso úmido, 0,5 U/ml de atividade de HOX extracelular). As células foram separadas por centrifugação a 4.000 g por 10 min. As células foram então recolocadas em suspensão em 4,0 ml de sobrenadante suplementado com CTAB, ou saponina, ou recolocadas em suspensão em ácido cítrico 25 mM, pH 6,3, suplementado com CTAB ou saponina.

Para confirmar que a atividade de HOX medida no extrato isento de células (depois do tratamento com CTAB) era realmente o resultado da extração e não somente o resultado da ativação de HOX no sobrenadante (podería ser que HOX jã existia no sobrenadante, mas estivesse inativa), o sobrenadante isento de células (depois da suplementação com CTAB ou saponina) foi também incubado e analisado quanto à atividade de HOX. Os tubos foram incubados por 19 h a 25 °C (500 rpm) . Depois da incubação, a HOX extracelular no extrato isento de células foi medida pelo ensaio de HOX.

Resultados 11 Os resultados na Tabela 11 indicam que a saponina tem uma capacidade desprezível para extrair HOX das células.

Além disso, não há qualquer indicação da ativação de HOX, nem por saponina nem por CTAB. TABELA 11 Extração/Ativação Comparativa de HOX, Usando Diferentes Agentes Permeabilizadores EXEMPLO 1Ρ Extração de HOX com CTAB em Fermentador de 100 Litros Depois de 120 h de fermentação (FermlD Vest9910b), uma solução de CTAB (360 g de CTAB dissolvidos ei 3,6 litros de água a 40 °C) foi adicionada diretamente ao caldo através de um orifício de entrada no fermentador de 100 litros. A concentração final de CTAB no caldo da fermentação foi de aproximadamente 4 g/1, pois o volume útil do fermentador era de aproximadamente 90 1. Simultaneamente, interrompeu-se a agitação, aeração, controle de pH e alimentação. A temperatura foi controlada em 25 °C, e depois de 22 h do tratamento com CTAB, o teor de HOX do caldo tinha aumentado de 1,6 U/ml para 30 U/ml. EXEMPLO 13 Homogeneização de Hansenula DolvmorOha Produtora de HOX em Escala Laboratorial Para testar a eficiência da extração de HOX como resultado do tratamento com CTAB, as células de dois experimentos de fermentação diferentes foram rompidas, usando um equipamento de ruptura de células "Z Plus" de 2,2 kw (Constant Systems Ltd., Reino Unido). As células (5 ml) foram rompidas usando um cabeçote de bomba de uma só injeção em várias pressões. Depois de abrir, o detrito de células foi separado do sobrenadante por centrifugação (5 min a 10.000 g) e o nível de HOX intracelular no sobrenadante isento de células foi medido, usando o ensaio de HOX descrito anteriormente. As mesmas células foram tratadas também com 0,2% de CTAB (2 5 °C, 5 00 rpm, 2 0 h) e o extrato isento de células foi usado como matéria comparável.

Resultados 15 Os dados apresentados na Tabela 12 indicam que a quantidade total de HOX intracelular é extraída por tratamento com 0,2% de CTAB. TABELA 12 Eficiência do Tratamento com CTAB EXEMPLO Ί 4 Homogeneização de Hansenula polvmorOha. Produtora de HOX em Larga Escala Dez litros de caldo de fermentação {fermID

Vast9907b) foram homogeneizados em um homogeneizador a alta pressão APV Gaulin modelo 30 CD. O homogeneizador foi operado em vazão máxima (100 1/min) e em uma pressão de 987 atml.000 bars. Durante o processo de homogeneização, o caldo foi resfriado com água gelada, e a temperatura do produto nunca excedeu 20 °C. Um rápido aumento na atividade de HOX foi observado durante os primeiros três ciclos, seguido de um nível quase constante depois de 5-7 ciclos.

Resultados 14 Os resultados estão apresentados na Tabela 13 e na Figura 8. TABELA 13 Extração Mecânica de HOX a Partir de Hansenula. polymorphis EXEMPLO 15 Efeito de Triton X-1QQ sobre a Extração de HOX a Partir de Hansenula polyyhorifía CTAB ou Triton X-100 foi adicionado a 5 ml de fermento (amostra HOX9954, Mut 45, 18.10,99, HVP) em um tubo de centrifugação. Adicionou-se água ao controle. As amostras foram incubadas a 25 °C por 22 h a 20 0 rpm. Depois da incubação, as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi analisado quanto à atividade de HOX, como descrito anteriormente.

Resultados 15 Os resultados estão indicados na Tabela 14 e na Figura 9. O detergente não-iônico Triton X-100 foi usado para permeabilizar as células de levedura (vide Naglak et al. , 1990, patente n2 US 5.124.256), porém é evidente a partir deste experimento que Triton X-100 não tem qualquer efeito extrator, contrário a CTAB, que não foi descrito nas técnicas anteriores como sendo capaz de extrair uma enzima intracelular, como HOX, embora ele tenha sido descrito como sendo permeabilizador de células. TABELA 14 Extração de HOX com CTAB, Comparado com Triton X-100 EXEMPLO 16 Mancha Ocidental A mancha ocidental foi usada para testar a eficiência da secreção de HOX, analisando as quantidades de enzima HOX residual (pelota) e liberada (sobrenadante). As células foram tratadas com 0,1, 0, e 0,4% de CTAB, respectivamente, por 20 h. Depois da incubação, as células foram separadas por centrif ugação a 4.000 g por 10 min. SDS-PAGE (4-12% de Mes Nus-Page) do sobrenadante resultante está ilustrada na fileira 7-10 da Figura 10A. As pelotas foram lavadas duas vezes com tampão, e depois recolocadas em suspensão em tampão e rompidas em um rompedor de células FastPrep. Os extratos das pelotas também foram aplicados a uma SDS-PAGE (vide fileiras 2-5 na Figura 10A), usando géis Novax pré-fundidos, de acordo com as instruções do fabricante (Novex, SanDiego, E.U.A.). O gel de SDS-PAGE foi usado para manchar uma membrana de nitrocelulose, de acordo com as instruções do fabricante (Novex, SanDiego, E.U.A.). A mancha foi incubada com anticorpos (anti-soro de coelho n- 4364 BI/OCH 190797) criados contra a enzima HOX, cuja preparação está descrita abaixo.

Produção de Anticorpos Específicos de HOX

Uma enzima HOX recombinante foi produzida em Eschericchia. coli a partir do plasmídeo de expressão PUP0181, como descrito no documento n- WO 96/40935. O

extrato bruto de células de E. coli que expressam HOX recombinante foi analisado por SDS-PAGE. Uma banda proeminente de proteína no peso molecular relativo (Mr) de 62 kD correspondente a HOX foi transferida para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) e submetida à análise de seqüências de aminoãcidos de terminal N, como descrito no documento n- 96/40935. A sequência de aminoãcidos identificada foi: Ala-Thr-Leu-Pro-Gln-Lys-Asp-Pro-Gly-Tyr- (SEQ ID NO: 1). Esta sequência correspondeu aos aminoãcidos n— 2-11 na sequência publicada para HOX (Hansen e Stougaard, 1997). Portanto, concluiu-se que a proteína de 62 kD expressada foi HOX recombinante sem o aminoãcido metionína, Metí, do terminal N. A banda de HOX com 62 kD observada na SDS-PAGE foi purificada por SDS-PAGE preparatória e a eletroeluição a partir do gel foi realizada como descrito por Hunkapiller et al. (1983) . A pureza da banda de HOX com 62 kD eletroeluída foi analisada por SDS-PAGE e por análise de seqüências de aminoãcidos como descrito acima. A HOX purificada foi usada para produção de anticorpos em coelhos. As partes com aproximadamente 50 μ9 foram misturadas com um volume igual de adjuvante de Freund incompleto e usadas para imunização.

Os anticorpos policlonais específicos de HOX, produzidos nos coelhos, foram usados por todo este estudo em análises da mancha ocidental. As proteínas a serem analisadas por análise da mancha ocidental passaram por eletroforese como descrito acima e transferidas para um filtro de nitrocelulose, de acordo com procedimentos padronizados. A membrana de nitrocelulose foi bloqueada por 1 hora em uma solução de TBS-T (Tris 50 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM; 0,1% de Tween-20) contendo 3% de leite desnatado em pó.

Os anticorpos específicos de HOX diluídos 1:10.000 em TBS-T contendo 1,5% de leite desnatado em pó foram adicionados e a mancha foi incubada por toda a noite. A mancha foi lavada três vezes em TBS-T antes da incubação (1 a 2 horas) com o anticorpo secundário (imunoglobulinas anti-coelho caprinas conjugadas com fosfatase alcalina, DAKO, n- de catálogo D0487), diluída 1:1.000 em TBS-T contendo 1,5% de leite desnatado em pó. A mancha foi subsequentemente lavada em TBS-T (2 x 20 min) e em TBS (Tris 5 0 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM; 1x5 min) antes da revelação em tampão de azul de nitrogênio tetrazólio/5-bromo-4-cloro-3 -indolil- fosfato (NBT/BCIP), de acordo com procedimentos padronizados. A especificidade dos anticorpos foi investigada em uma série de manchas ocidentais com extratos contendo HOX a partir de Chondrus crispus, E. coli e Pichia pastoris, respectivamente. A análise da mancha ocidental de extratos contendo HOX de P. pastoris apresentou uma intensa banda específica de HOX em Mr 62 kD, além de duas bandas mais fracas em peso moleculares inferiores.

Resultados 16 Os resultados da mancha ocidental estão indicados na Figura 10B. A mancha ocidental confirma que praticamente nenhuma quantidade de HOX é deixada nas células após o tratamento com 0,4% de CTAB. EXEMPLO 17 Descrição da Triagem de Alta Produção (HTS) quanto a Níveis Aumentados de Enzimas Intracelulares Uma cepa de Hansenula polymorpha que expressa a enzima HOX intracelular foi mutada com luz UV em um comprimento de onde de 254 nm. A cepa mutada foi colocada sobre placas de ãgar (1,4 g/1 de Base de Nitrogênio de Levedura (YNB) da Gibco, 5 g/1 de (NH4)2S04, 1 g/1 de glicerina e 2% (p/v) de ãgar) e incubada a 30 °C até que colônias sejam formadas. As colônias foram inoculadas com uma colhedora de colônias robotizada (Q-Pick, da Genetix, de Christchurch Dorsett, Reino Unido) em placas de microtitulação com 96 furos. Cada furo de microtitulação continha 200 μΐ de meio YNB (MES 100 mM, pH 6,1, 1,4 g/1 de YNB da Gibco, 5 g/1 de (NH4)2S04, e 10 g/1 de glicerina). As placas de microtitulação foram incubadas a 25 °C com vascolejamento por 7 dias em uma incubadora vascolejante IOC400.XX2.C (SANYO Gallenkamp BV, Breda, Holanda). As atividades de HOX foram medidas no caldo de fermentação de 10 μΐ com o ensaio de HOX modificado para conter somente 105 μΐ de reagente 1, e adicionou-se 15 μΐ de CTAB a 0,4% (p/v) ao ensaio. 0 tempo de reação foi de 60 min a 30 °C. 0 ensaio de HOX foi conduzido com um robô para pipetar Plato 7 (da Rosys, de Hombrechtikon, Suíça) e as absordâncias foram medidas em um Spectramax mais leitora de placas (Molecular Devices, Reino Unido) . O crescimento em cada furo de microtitulação individual foi medido transferindo 10 μΐ de caldo de fermentação para uma nova placa de microtitulação, adicionando 100 μΐ de tampão de fosfato 100 mM, pH 6,3, e medindo a absorbância a 60 0 nm. As medições de HOX foram noramlizadas com relação à absorbância a 600 nm, a fim de levar em consideração o fraco crescimento.

Resultados 17 Os resultados demonstram que é possível triar quanto a mutantes de Hansenula polymorpha que produzem níveis elevados de enzima HOX intracelular. EXEMPLO 18 Comparação da atividade específica a partir de HOX extraída com CTAB (vide Tabela 12 exemplificativa) e enzimas HOX "extraídas mecanicamente" (vide, por exemplo, Tabela 13 e Figura 8).

Resultados 18 Os resultados demonstram que a atividade específica de HOX extraída com CTAB é mais alta do que a atividade específica de HOX "extraída mecanicamente". Esses resultados indicam que o CTAB não extrai todas as proteínas intracelulares localizadas na organela, mas principalmente as proteínas citosólicas. EXEMPLO 19 Caracterização de HOX Extraída com CTAB e Extraída Mecanicamente por Cromatocrafia de Troca Aniônica Para analisar a pureza da HOX extraída com CTAB, ela foi comparada com a HOX extraída usando ruptura celular. A atividade específica foi determinada e comparada, e os teores de ácidos nucléicos dos extratos foram comparados.

Alem disso, a pureza foi examinada por cromatografia de troca aniônica.

Sete mililitros de suspensão de células (células + sobrenadante) foram adicionados a um tubo de centrifugação de 15 ml (HOX9957, Mut 45). Após a adição de 0,4% de CTAB, a suspensão de células foi incubada por 23 h a 30 °C (200 rpm). As células foram removidas por centrifugação (10.000 g e 10 min) e o sobrenadante isento de células foi usado como fonte de HOX extraída com CTAB. Outros 7 ml da mesma suspensão de células (sem adição de CTAB) foram rompidos usando um cabeçote de bom com injeção única a 2 x 2368 atm (2.400 bar) (Z Plus, 2,2 kW, Constant Systems Ltd., Reino Unido). Os resíduos de células foram então separados por centrifugação (10.000 g e 10 min), e o sobrenadante foi usado como uma fonte de HOX extraída mecanicamente.

Ambas amostras foram dessalinizadas em uma coluna PD10 (Pharmacia Biotech) em tampão de TEA 20 mM (trietanol- araina, Merck), pH 7,3. As amostras foram analisadas quanto à atividade de HOX e contração de proteína (o ensaio de proteína baseia-se no método de ensaio descrito por Schleif e Wensink, 1981). O teor de ácidos nuclêicos foi determinado pela medição da absorção a 260 e 280 nm (Bollag e Edelstein, 1991). A cromatografia de troca iônica foi conduzida usando um sistema de Fluxo Duplo Biológico (Bio-Rad, CA, E.U.A.). Aplicou-se 500 μΐ de amostra dessanilizada a uma coluna de Fonte Q 15 (HR5/5, Pharmacia Biotec.) equilibrada em tampão de TEA (tampão A, 20 mM, pH 7,3) . A HOX foi eluída com um gradiente linear de 2 0 ml entre 0 e 0,5 M de NaCl em tampão A com uma vazão de 1,5 ml/min, durante a qual frações de 1,5 ml foram coletadas e testadas quanto à atividade de HOX.

Resultado 19 A determinação da atividade especifica indica que a HOX extraída com CTAB é muito mais pura comparado com a HOX extraída mecanicamente (Tabela 15) . Além disso, o teor de ácidos nuclêicos é muito mais baixo na HOX extraída com CTAB do que na HOX extraída mecanicamente (Tabela 15). TABELA 15 Concentração de HOX e Proteína em HOX Extraída com CTAB e Extraída Mecanicamente As análises por cromatografia de troca aniônica nas Figuras 11A e 11B, que ilustram os cromatogramas das análises por Fonte Q para a HOX extraída com CTAB e extraída mecanicamente, também confirmam firmemente este resultado.

EXPERIMENTOS COM CTAB EXEMPLO 20 1. Experimentos com Frasco Vascolejante Dois meios diferentes foram escolhidos para os experimentos com CTAB: • YP/1% de glicerina • YNB/1% de glicerina + NaPi 0,1 M pH 6,0 a) Cultura em YP/1% de glicerina 50 ml do meio foram inoculados com 2,5 ml de uma pré-cultura em YPD e cultivados a 37 °C, 160 rpm.

Depois de 28 h de cultura, adicionou-se 1% (v/v) de metanol e incubou-se por mais 18 h a 37 °C, 160 rpm. A D060onm foi medida para calcular a quantidade de CTAB necessária.

Alíquotas do sobrenadante (SN) e da pelota de células de 1,5 ml da cultura foram retiradas.

Depois da ruptura mecânica das células, a fração solúvel (CX) foi isolada.

=> SN destas condições foi designado A

CX destas condições foi designada D

Os mesmos volumes da cultura (2 0 ml) foram fracionados em dois frascos de vascolejaraento. 20 ml da cultura foram suplementados com 0,005 g de CTAB. (CTAB - solução de insumo: 0,02 g/ml; DANISCO: 0,4% na cultura do fermentador (D06oonm - 300) . => experimentos com frasco vascolejante, D06oonm~20 => 0,027 g de CTAB/100 ml de cultura) incubação da cultura: 24 h, 4 °C sem vascolejar => SN destas condições designado C

CX destas condições designada F 0 segundo frasco vascolejante sem CTAB foi incubado sob as mesmas condições que o frasco com CTAB e serviu como cultura de referência.

=> SN destas condições designado B

CX destas condições designada E

Foram cultivadas cepas que portam cinco construções de IL-lra diferentes. As cepas 4-17, AL 9/2 e II 3-1 continham três construções diferentes sem uma sequência de sinais, enquanto que as cepas MFa 2 e MFa AL7/1 representavam duas construções diferentes com a sequência pre-pro MFa. A cepa FPMT 8 foi cultivada sob as mesmas condições que as cepas recombinantes. Esta cepa é um integrante de RB11 com quase 3 0 cópias do vetor de Hansenula vazio pFPMT121 e serviu como controle negativo.

Depois do tratamento com CTAB, um aumento de 4 0 vezes (20 vezes) até 110 vezes da concentração de IL-lra foi detectado no sobrenadante das cepas que portam construções sem seqüências de sinais.

Para as cepas MFa tratadas com CTAB, um aumento menor (2 a 5 vezes) da concentração de IL-lra foi medido.

Resultados 20 Os resultados estão resumidos na Tabela 16. TABELA 16 Experimentos com CTAB em YP/glicerina/metanol A: sobrenadante depois de cultivar por 4 6 h em YP/glicerina/metanol B: sobrenadante depois de cultivar por 4 6 h em YP/glicerina/metanol, e depois incubado por 24 h sem CTAB C: Sobrenadante filtrado estéril depois de cultivar por 46 h em YP/glicerina/metanol, e depois incubado por 24 h com CTAB * Notas: A concentração de IL-lra no sobrenadante da cepa AL 9/2 foi incomumente baixa. Nos quatro experimentos foram detectadas concentrações entre 0,6 e 0,7 μ9/ιη1. A razão do baixo rendimento não é conhecida. EXEMPLO 21 b) Cultura em YNB/l% de glicerina + NaPi 0,1 M pH 6,0 Para experimentos adicionais com CTAB, três cepas portadoras de três construções diferentes sem seqüências de sinais foram selecionadas {cepa 4-17; AL 9/2; II 3-1). 4 5 ml do meio foram inoculados com 5 ml de uma pré-cultura em YPD e cultivados a 37 °C, 160 rpm.

Depois de 28 h de cultura, adicionou-se 1% (v/v) de metanol e incubou-se por mais 18 h a 37 °C, 160 rpm. A D06oonm foi medida para calcular a quantidade de CTAB necessária.

Alíquotas do sobrenadante (SN) e da pelota de células de 3 ml da cultura foram retiradas.

Depois da ruptura mecânica das células, a fração solúvel (CX) foi isolada.

=> SN destas condições foi designado A

CX destas condições foi designada D

Os mesmos volumes da cultura (2 0 ml) foram fracionados em dois frascos de vascolejamento. 20 ml da cultura foram suplementados com 0,003 g de CTAB. incubação da cultura: 24 h, 4 °C, sem vascolejamento.

=> SN destas condições designado C

CX destas condições designada F O segundo frasco vascolejante sem CTAB foi incubado sob as mesmas condições que o frasco com CTAB e serviu como cultura de referência.

=> SN destas condições designado B

CX destas condições designada E

Em todos os casos, a incubação com CTAB levou a um aumento significativo da concentração de IL-lra no sobrenadante (100 a 130 vezes).

Resultados 21 Os resultados da ELISA dos experimentos com CTAB depois de cultivar em dois meios diferentes estão comparados na Tabela 17 que se segue. TABELA 17 Comparação de Experimentos com CTAB em YP/glicerina/metanol e YNB/glicerina/metanol A: sobrenadante depois de cultivar por 46 h em YP/glicerina/metanol (ou YNB/glicerina/metanol) B: sobrenadante depois de cultivar por 46 h em YP/glicerina/metanol (ou YNB/glicerina/metanol), e depois incubado por 24 h sem CTAB C: Sobrenadante filtrado estéril depois de cultivar por 46 h em YP/glicerina/metanol (ou YNB/glicerina/metanol), e depois incubado por 24 h com CTAB EXEMPLO 22 Teste de Diferentes Condições de Incubação No caso da cepa II 3/1, cultivada em YP/glicerina/metanol (vide l.a), diferentes condições de incubação, depois da adição de CTAB, foram tetadas.

Condições: ® 24 h com CTAB, 4 °C sem vascolejamento (condição "padrão") ® 24 h com CTAB, 4 °C vascolejando suavemente ® 24 h com CTAB, 37 °C sem vascolej amento ® 24 h com CTAB, 37 °C vascolejando suavemente Resultados 22 A concentração de IL-lra no sobrenadante foi medida por ELISA. Os resultados estão resumidos na Tabela 18. TABELA 18 Diferentes Condições de Incubação com CTAB (Resultados ELISA) A: sobrenadante depois de cultivar por 4 6 h em YP/glicerina/metanol B: sobrenadante depois de cultivar por 46 h em YP/glicerina/metanol, e depois incubado por 24 h sem CTAB C: Sobrenadante filtrado estéril depois de cultivar por 46 h em YP/glicerina/metanol, e depois incubado por 24 h com CTAB 0 maior aumento de XL-lra no sobrenadante foi medido depois da incubação com CTAB a 37 °C sem vascolejar (76 vezes) e depois da incubação com CTAB a 4 °C sem vascolejar {49 vezes). A concentração mais alta de IL-lra foi detectada a 37 °C, mas a concentração na amostra de referência incubada sem CTAB também aumentou (16 vezes). A alta concentração na amostra de referência poderia ser causada por lise de células. => Melhores Condições; 4 °C (para evitar lise de células) sem vascolejar EXEMPLO 23 SDS-PAGE, Mancha Ocidental e Coloração com Coomassie 0 sobrenadante e a fração solúvel do extrato bruto isolado a partir dos experimentos com frascos vascolejantes foram analisados por SDS-PAGE sob condições redutoras. gel: 16% de gel Novex TG de lmm; condições redutora coloração coomassie coloidal {BIO-SAFE Coomassie, Biorad) amostras: A: sobrenadante da cultura por 4 6 h em YP/glicerina/metanol B: sobrenadante de referência sem CTAB D: fração solúvel (CX) do extrato bruto diluída 1:3 E: fração solúvel (CX) da cultura de referência do extrato bruto diluída 1:3 F: fração solúvel (CX) do extrato bruto, depois do tratamento com CTAB, diluída 1:3 Resultados 23 * WB 33 e Coo2 Cepas: 4-17 pFPMT icIL Irai Al 9/2pFPMT icIL Irai + Al CTAB: incubação por 24 h; 4 °C sem vascolejar Os resultados da mancha ocidental (WB33) estão apresentados na Figura 12A.

As amostras dos testes e as quantidades adicionadas estão apresentadas na seguinte legenda da Figura 12A.

Os resultados demonstram que, no caso de ambas cepas, um aumento de IL-lra no sobrenadante (SN) (fileira 4, fileira 9) e um decréscimo na fação solúvel (CX) (fileira 5, fileira 10) foi detectado depois do tratamento com CTAB. A coloração com azul de coomassie coloidal está ilustrada na Figura 12B.

As amostras dos testes e as quantidades adicionadas estão apresentadas na seguinte legenda da Figura 12B. * WB 34 e Coo3 cepas: MF a2 pFPMT MFa IL-lral MFctAL 7/lpFPMT MFa IL-lral + Al CTAB: incubação por 24 h; 4 °C sem vascolejar Os resultados da mancha ocidental (WB34) estão apresentados na Figura 13A.

As amostras dos testes e as quantidades adicionadas estão apresentadas na seguinte legenda da Figura 13A.

Os resultados demonstram que, depois do tratamento com CTAB, uma mistura de IL-lra intracelular e secretada foi detectada nos sobrenadantes C na fileira 4 e 9. MFa 2: banda adicional de ~2 0 kDa e 34 kDa derivada de II)-Ira intracelular MFa 7/1: banda adicional de < 17 kDa derivada de IL-lra intracelular, intensidade do sinal de 18 kDa aumentada.

Os resultados de coomassie coloidal (Coo 3) estão apresentados na Figura 13B.

As amostras dos testes e as quantidades adicionadas estão apresentadas na seguinte legenda da Figura 13B. * WB 35 e Coo4 Cepa: II 3/1 pFPMT icIL-lra tipo II diferentes condições de incubação após adição de CTAB: ® 24 h de CTAB, 4 °C sem vascolejamento {condição "padrão") ® 24 h com CTAB, 3 7 °C sem vascolejar Os resultados da mancha ocidental (WB35) estão apresentados na Figura 14A.

As amostras dos testes e as quantidades adicionadas estão apresentadas na seguinte legenda da Figura 14A.

Os resultados de coomassie coloidal (Coo 4) estão apresentados na Figura 14B.

As amostras dos testes e as quantidades adicionadas estão apresentadas na seguinte legenda da Figura 14B.

Os resultados demonstram que depois da incubação com CTAB a 4 °C, bem como a 37 °C, um aumento de IL-lra no sobrenadante (SN) (WB 35: fileira 4, fileira 8) e um decréscimo na fração solúvel (CX) (WB 35: fileira 5, fileira 9) foram detectados.

No CTAB do sobrenadante (SN) a 37 °C (fileira 8) a quantidade mais alta de IL-lralI foi obtida. Este resultado está de acordo com os resultados de ELISA (vide Tabela 3}.

Neste sobrenadante, não somente mais IL-lralI, porém mais outras proteínas (> 35 kDa) foram coloridas (Coo 4: fileira 8). Esta observação confirmou a suposição de que uma lise significativa de células ocorreu a 37 °C, comparado com 4 °C.

Discussão 0 uso de códons do gene de HOX de Chondrus crispus (Stougaard e Hansen, 1996, Stougaard e Hansen, 1997) foi modificado pela substituição dos códons de baixo uso por aqueles entre os códons mais freqüentemente usados do organismo hospedeiro Hansenula. Um transformante do sitema de expressão da levedura metilotrófica, Hansenula polymoipha, desenvolvido em Rhein Biotech, Düsseldorf, Alemanha, contendo um fragmento do DNA de HOX com códons otimizados para a expressão de HOX, foi preparado. A otimização de códons do gene que codifica a enzima HOX resultou em altos níveis de expressão (em termos de altos níveis de atividade da enzima) da enzima HOX nos organismos hospedeiros, levedura Hansenula polymorpha.

Quando uma seqüência de sinais não estava presente, a enzima HOX estava localizada intracelularmente. Entretanto, mesmo quando inúmeras seqüências de sinais foram usadas em diferentes construções, pouca ou nenhuma atividade de HOX pôde ser medida no meio extracelular. Esses resultados indicaram que a enzima HOX é incapaz de ser secretada, mesmo a partir de cepas hospedeiras que expressam uma enzima HOX que compreende uma seqüência de sinais. As manchas ocidentais também confirmaram que a enzima HOX pode estar localizada em uma fração associada a membrana, mesmo quando uma seqüência de sinais estava presente, indicando que, embora haja transcrição e tradução do gene de HOX, a enzima HOX não foi secretada e parecia ficar alojada na via de secreção . A extração da enzima HOX intracelular enzimaticamente ativa, usando o método da presente invenção, foi comparada com um método de ruptura celular tradicional e com procedimentos de extração que usam outros detergentes e emulsificantes iônicos/não-iônicos. As combinações de detergentes com protease e sais também foram investigadas.

Sumário Em um amplo aspecto da presente invenção, fornece- se um método para liberar uma proteína de interesse (POI) intracelular solúvel ou associada a membrana, compreendendo as etapas de: disponibilizar uma célula que compreende uma POI intracelular solúvel ou associada a membrana; colocar a célula em contato com uma composição extratora de membrana; e fazer com que a POI seja liberada da célula sob condições suficientes para liberar a POI e em uma forma solúvel.

Em um outro aspecto amplo da presente invenção, fornece-se um método para liberar especificamente uma proteína de interesse (POI) intracelular solúvel ou associada a membrana, compreendendo as etapas de: disponibilizar uma célula que compreende uma POI intracelular solúvel ou associada a membrana; colocar a célula em contato com uma composição extratora de membrana; e fazer com que a POI seja liberada da célula sob condições suficientes para liberar a POI, porém insuficientes para liberar outras proteínas contaminantes.

Todas as publicações mencionadas na especificação acima são aqui incorporadas como referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos da invenção devem ficar evidentes para os versados nessas técnicas, sem fugir do âmbito e do espírito da invenção.

Embora a invenção tenha sido descrita com relação a modalidades preferidas específicas, deve-se entender que a invenção, conforme reivindicada, não deve estar indevidamente limitada a essas modalidades específicas. Na realidade, pretende-se que várias modificações dos modos descritos para conduzir a invenção, que são óbvios para os versados em biologia molecular ou campos afins, estejam dentro do âmbito das reivindicações que se seguem.

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Claims

1. Método para extrair uma proteína recombinante intracelular de interesse (POI) solúvel ou associada a membrana, a partir de uma célula de bactéria, levedura ou fungo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer uma célula de bactéria, levedura ou fungo que compreende uma POI recombinante intracelular solúvel ou associada a membrana; (b) liberar a POI recombinante da célula, colocando a célula em contato com uma composição extratora de membrana compreendendo um composto de amônio quaternário em uma concentração de 0,05% a 0,6% em peso, sob condições suficientes para a liberação da POI recombinante e em uma forma solúvel; e (c) recuperar a POI recombinante da composição extratora de membrana, em que o composto de amônio quaternário é selecionado do grupo que consiste em brometo de lauroil- trimetil-amônio (LTAB), cloreto de miristil-trimetil-amônio (MTAC), cloreto de cetil-trimetil-amônio (CTAC), Cetrimida, brometo de cetil-trimetil-amônio (CTAB), cloreto de estearoil-trimetil-amônio (STAC), brometo de estearoil- trimetil-amônio (STAB), cloreto de benzalcônio (cloreto de alquil-dimetil-benzil-amônio), brometo de N-cetil-piridínio (brometo de N-hexadecil-piridinio), cloreto de N-cetil- piridínio (cloreto de N-hexadecil-piridínio), cloreto de benzil-dimetil-tetradecil-amônio, cloreto de benzil-dimetil- hexadecil-amônio, e uma combinação de quaisquer dois ou mais deles, e em que a POI recombinante é uma hexose oxidase (HOX) compreendendo a sequencia de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 23.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula de bactéria, levedura ou funqo é uma célula transformada.

3. Método, de acordo a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a POI recombinante intracelular é produzida por técnicas de DNA recombinante.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é uma célula de levedura.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula de bactéria, levedura ou funqo é colocada em contato com a composição extratora de membrana em temperaturas de 4 °C a 40 °C.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula de bactéria, levedura ou funqo é colocada em contato com a composição extratora de membrana em um pH entre 2,0 e 11, 0.

7. Método para triaqem de células mutadas ou células transformadas que produzem niveis elevados de uma POI recombinante intracelular solúvel ou associada a membrana, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) desenvolver as células mutadas ou células transformadas que produzem níveis elevados de uma POI recombinante intracelular solúvel ou associada à membrana a 30 °C; (b) incubar as células mutadas ou células transformadas com a composição extratora de membrana em um método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; (c) recuperar o meio isento de células; (d) triar o meio isento de células quanto a níveis elevados da POI recombinante intracelular; de tal modo que a presença da POI recombinante intracelular no meio isento de células seja indicativo de que a POI recombinante intracelular foi liberada, em que a célula mutada ou transformada é uma célula de bactéria, levedura ou fungo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima hexose oxidase (HOX) é codificada por uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 22.