BRPI0110312B1

BRPI0110312B1 - método para o preparo de colágeno bi-orientado, preparação de colágeno bi-orientado e matriz de colágeno bi-orientado fibrilar

Info

Publication number: BRPI0110312B1
Application number: BRPI0110312A
Authority: BR
Inventors: Matitiau Noff; Shahar Pitaru
Original assignee: Colbar R & D Ltd
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2015-10-06
Also published as: CA2406972C; BRPI0110312B8; DE60126757T2; US20020019516A1; AU784758B2; MXPA02010343A; JP2004515451A; EP1280545A2; DE60126757D1; EP1280545B1; CA2406972A1; JP4664568B2; EP1280545A4; BRPI0110312A; AU5250001A; US6682760B2; ATE354368T1; WO2001079342A3; WO2001079342A2

Abstract

"método para o preparo de colágeno bi-orientado, preparação de colágeno bi-orientado e matriz de colágeno bi-orientado fibrilar". a presente invenção se refere a matrizes de colágeno bi-orientadas e a um método para a bi-orientação de colágenos usando açúcares para bi-orientar matrizes. o método compreende a etapa de incubar o colágeno em uma solução compreendendo água, pelo menos um solvente polar e pelo menos um açúcar, para formar o colágeno bi-orientado.

Description

"MÉTODO PARA O PREPARO DE COLAGEM) BI-ORIENTADO, PREPARAÇÃO DE COLÁGENO BI-ORIENTADO E MATRIZ DE COLÁGENO BI-ORIENTADO FIBRILAR" Campo da Invenção A presente invenção se refere geralmente a matrizes de colágeno bi-orientadas e mais particularmente a um método inovador para a bi-orientação de colãgenos usando açúcares e para bi-orientar matrizes e preparações formadas pela utilização deste método.

Antecedentes da Invenção Colãgenos são moléculas chaves do reino animal contabilizando aproximadamente 25 a 30% de todas as proteínas de organismos mamíferos. Colãgenos são bio-polímeros naturais que são organizados como redes fibrilares e outras formas de superestruturas. Os colãgenos fibrilares e, particularmente, o colágeno do tipo I têm a mais alta incidência contabilizando 80% das proteínas de tecidos conectores. A alta incidência dos colãgenos fibrilares, a sua disponibilidade a partir de fontes animais e a habilidade de se extrair e preparar soluções monoméricas de colágeno purificado o qual pode ser polimerizado em matrizes fibrilares tridimensionais faz destes colãgenos candidatos ideais para biomateriais naturais. Adicionalmente, os colãgenos fibrilares exibem um alto grau de conservação e são portanto fracos antigenes. Os locais antigênicos principais das moléculas de colágeno fibrilar residem dentro dos telopeptídeos não helicoidais os quais flanqueiam a porção helicoidal da molécula. "In vivo", a estrutura polimérica dos colãgenos fibrilares é estabilizada por bí-orientações intramoleculares, as quais são formadas por um processo enzimãtico. Por causa da montagem escalonada das moléculas do colágeno, a maioria destas bi-orientações lançam uma ponte entre o domínio telopeptídeo de uma molécula e o domínio helicoidal de uma molécula adjacente. A formação adicional de bi-orientação pelo processo de glicoação ocorre como parte do envelhecimento do colágeno e dos tecidos conectores. A glicoação de proteínas, incluindo dos colãgenos, ocorre como um processo fisiológico de envelhecimento por sobre o curso de vida conseqüente a exposição de proteínas a glicose. Foi descoberto que colágenos fibrilares glicoagidos exibem um nível incrementado de bi-orientação e portanto eles são mais resistentes a degradação por colagenase, as enzimas específicas que degradam o colágeno. 0 processo de glicoação por glicose é lento devido a sua concentração fisiológica em soro ser relativamente baixa e apenas uma pequena proporção dela é encontrada na forma de aldeído acíclico o qual é o reativo. Foi descoberto que D(-) ribose é 100 vezes mais reativo do que glicose quando da indução da glicoação e bi-orientação de moléculas de colágeno em colágenos fibrilares. Por Exemplo, a incubação de colágeno fibrilar nativo em 0.2 M de D(-) ribose por 5 dias é o equivalente a exposição a concentração fisiológica de glicose por 20 anos. A bi-orientação produzida por ponte de glicoação se forma principalmente entre os domínios triplo helicoidais de moléculas adjacentes. 0 desempenho de bio-produtos com base em colágeno depende por um lado do controle da sua longevidade funcional dentro do hospedeiro e por outro lado da preservação das propriedades biológicas do componente de colágeno nativo. A longevidade funcional do componente de colágeno depende da capacidade de resistir a degradação enzimãtica específica por colagenase (metaloproteinases). Esta capacidade está diretamente relacionada ao número de bi-orientações intermoleculares e intermoleculares dentro do polímero de colágeno. Quanto mais alto o número de bi-orientações, mais alta a resistência a degradação por colagenase.

Agentes exemplares escolhidos de bi-orientação conhecidos na técnica foram os glutaraldeídos e outras agentes não fisiológicos relacionados. Estes agentes de bi-orientação reagem com resíduos de amino ácidos da molécula do colágeno para formar bi-orientação intermolecular. Entretanto, estes agentes dissonantes podem causar efeitos negativos na bio-compatibilidade e na atividade biológica dos bio-produtos com base em colágeno bi-oríentados que são causados por alterações na conformação da molécula do colágeno e lixiviagem dos agentes de bi-orientação. Assim sendo, produtos de colágeno bi-orientados por agentes não fisiológicos são pouco aceitos e pouco integrados no interior dos tecidos hospedeiros.Adicionalmente, inflamação localizada e reações sistêmicas mais complexas são efeitos colaterais desvantajosos dos produtos de colágeno bi-orientados de glutaraldeídos. A patente norte-americana No. 4.971,954 de Brodsky et al. revela o uso de D(-) ribose ou outros açúcares fisiológicos de redução como agentes fisiológicos para bi-orientação de matrizes de colágeno pelo processo de glicoação. Todavia, o método revelado por Brodsky et al. é eficiente quando o substrato colagenoso consiste de fibras de colágeno nativo, mas é apenas parcialmente eficaz para matrizes de colágeno produzidas a partir de colágeno fibrilar reconstituído, particularmente quando o colágeno é um colágeno atelopeptídeo. 0 colágeno atelopeptídeo é produzido por solubilidade de pepsina do colágeno nativo. Uma vez que a pepsina anula os telopeptídeos da molécula d colágeno que são antigênicos, colãgeno solubilidade de pepsina é a mais utilizada forma de colãgeno na indústria biomédica.

No método revelado por Brodsky et al na patente norte-americana No. 4,971,954, a bi-orientação ocorre por um processo de glicoação. Neste processo a forma acíclica do D(-) Riobose espontaneamente condensa com os grupos α-amino de resíduos de lisila e hidroxilisila localizados no domínio helicoidal triplo da molécula de colágeno. 0 produto de condensação é um produto com base em Schiff que sofre um rearranjo Arnadorí para formar um aduto acetoamino. Os acetoaminos localizados por sobre moléculas de colãgeno adjacentes condensam para formar bi-orientações covalentes, a natureza exata do qual ainda não foi determinada, embora estruturas heterociclicas fluorescentes e outros tipos jã foram recentemente propostas.

Brodsky et al revela o processo de glicoação para o colágeno fibrilar nativo do tipo I a partir do tendão de rato. Entretanto, a bi-orientação pelo método de glicoação de Brodsky et al é reversível. Por Exemplo, em um artigo intitulado "IS0LATI0N AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF COLAGEN CHAINS DIMERIZED BY SUGAR - DERIVED CROSS - LINKS", publicado no The Journal of Biologícal Chemistry, Vol. 263 (33), pp. 17650 - 17657, 1988, Tanaka et al mostra que colágeno de tendão de rato bi-orientado com D(-) ribose por um dia, está em uma faixa de 50% de reversibilidade no final de um período de 5 dias.

A patente norte-americana No. 5.955.438, de Pitaru et al, revela, inter alia, um método para a preparação de matrizes e membranas de colãgeno feitos a partir de colãgeno fibrilado de atelopeptídeo reconstituído formado em uma membrana e depois bi-orientado por um açúcar de redução tal como D(-) ribose. A membrana ou os implantes feitos do mesmo são então sujeitos ao ponto crítico de secagem para secagem e esterilização enquanto se preservando o formato tridimensional dos implantes. 0 procedimento de ponto crítico de secagem aperfeiçoa a resistência da matriz do colãgeno contra a degradação por colagenase. A bi-orientação de colágeno nativo com D(-) ribose faz com que as fibras de colãgeno nativo sejam resistentes a degradação por colagenase. Entretanto, a bi-orientação de colãgeno fibrilado de atelopeptídeo reconstituído por D(-) ribose tem apenas uma eficácia insignificante no aumento de sua resistência a degradação por colagenase. A razão para isto não é clara. Uma vez que os trabalhos de Tanaka et al (veja a lista de referências) indicam que a bi-orientação induzida por ribose entre moléculas de colágeno nativo ocorrem principalmente entre as porções triplas helicoidais das moléculas de colãgenos adjacentes, a remoção dos telopeptideos não deveríam afetar o grau de bi-orientação do colágeno de atelopeptídeo. Um explicação possível é que o envoltório das moléculas de colágeno de atelopeptídeo nos colãgenos fibris reconstituídos diferem do envoltório nos colãgenos fibris nativos (conforme argumentado na Ref. 16 da lista de referencias) . Esta diferença em envoltório, por sua vez, pode resultar em uma mudança na distância ou alinhamento intermolecular a qual pode causar um redução na força, potência ou número de bi-orientações covalentes formada por D(-) ribose.

Sumário da Invenção É então proporcionado, de acordo com uma realização preferida da presente invenção, um método para a preparação de colágeno bi-orientado. 0 método inclui a etapa de se incubar o colãgeno em uma solução incluindo água, pelo menos um solvente polar, e pelo menos um açúcar, para se formar um colãgeno bi- orientado.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o açúcar é um açúcar de redução.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o solvente polar é um solvente polar orgânico.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o solvente polar orgânico é um álcool.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o solvente polar orgânico é selecionado a partir do grupo que consiste de metanol, etanol, propanol, acetona isopropanol, tetraidrofurano, dimetilsulfóxido e combinações provenientes dos mesmos.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o solvente polar é miscível em água.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução é uma solução compensadora incluindo um compensador.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução inclui fosfato salino compensado.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução inclui água em uma faixa de 15% a 95% (v/v) , pelo menos um solvente polar em uma faixa de 5% a 85% (v/v), e um compensado.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o colágeno é selecionado a partir de, colágeno nativo, colágeno fibrilar, colágeno fibrilar atelopeptídeo, colágeno liofilizado, colágeno· obtido a partir de fontes animais, colágeno humano, colágeno recombinante, colágeno pepsinizado, colágeno· reconstituído, e combinação proveniente dos mesmos, Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o colágeno compreende um colágeno· fibrilar reconstituído a partir de um colágeno monomolecular atelopeptídeo, Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o colágeno é obtido pela reconstituição de colágeno monomolecular atelopeptídeo obtido por digestão proteolítica do· colágeno nativo.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o açúcar é um composto representado por uma das seguintes fórmulas 1 ou 11: (I) Λ1 l m nas quais R* é H ou aiquila mais baixa ou alquileno, um ácido amino, um peptídeo, um sacareto, uma purina ou uma base de pirimidina, uma purina fosforizada ou com base em pirimidína; n é um número· inteiro entre 2 - 9; e p e q são cada um independeutemente um número inteiro entre 0-8, e a soma de p e g é pelo menos 2 e não mais do que 8, Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o açúcar é um açúcar de redução ocorrendo nacuralmente.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o açúcar é um diose, um triose, um tetrose, um pentose, um hexose, um septose, um octose, um nanose, ou um decose.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo de glicerose, treose, eritrose, lixose, xilose, arabinose, ribose, alose, altrose, glicose, manose, gulose, idose, galactose e talose.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o açúcar é um dissacareto.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o dissacareto é selecionado a partir do grupo consistindo de maltose, sucrose, celobiose, gentíobiose, melibiose, turanose, e trealose.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, pelo menos uma substância é adicionada a solução na qual a referida etapa de incubação é executada, a substância tornando-se imobilizada no interior da referida matriz.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a substância é selecionada a partir do grupo consistindo de um agente anti microbial, um agente anti inflamatõrio, um fator tendo propriedades de tecido indutivas, e combinações provenientes dos mesmos.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o açúcar ê D(-) ribose, e o solvente polar é etanol.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução inclui água em uma faixa de 15% a 95% (v/v) e etanol em uma faixa de 51 a 851 (v/v).

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução inclui água em uma faixa de 251 a 50% (v/v) e etanol em uma faixa de 50% a 75% (v/v).

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução inclui aproximadamente 30% de água (v/v), e aproximadamente 70% etanol (v/v).

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a concentração de D(-) ribose na solução está em uma faixa de 0.1% a 5% (v/v).

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a concentração de D(-) ribose na solução está em uma faixa de 0.5% a 3% (v/v).

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o método adicionalmente inclui a etapa de lavar o referido colágeno bi-orientado depois da referida etapa de incubação para remover o solvente polar e o excesso do açúcar.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o método adicionalmente inclui a etapa de desidratar o colágeno bi-orientado.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o método adicionalmente inclui a etapa de sujeitar o colágeno bi-orientado a um ponto crítico de secagem.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o método adicionalmente inclui a etapa de secar ou secagem por congelamento do colágeno anteriormente a etapa de incubação.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o método adicionalmente inclui a etapa de secar ou secagem por congelamento do colágeno bi-orientado.

Também é proporcionado, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, uma preparação de um colágeno bi-orientado preparado pelo método revelado aqui e acima mencionado.

Também é proporcionado, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, um método para a preparação de um colágeno bi-orientado. 0 método inclui a etapa de incubar o colágeno em uma solução que inclui água, pelo menos um solvente hidrofílico e pelo menos um açúcar para formar o colágeno bi-orientado.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o método adicionalmente inclui a etapa de controlar a duração da incubação da etapa de incubação para controlar o grau de bi-orientação do colágeno bi-orientado.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o método adicionalmente inclui a etapa de controlar a concentração do açúcar usado na etapa de incubação para controlar o grau de bi-orientação do referido colágeno bi-orientado.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o método adicionalmente inclui a etapa de controlar a concentração do solvente hidrofílico usado na etapa de incubação para controlar o grau de bi-orientação do colágeno bi-orientado.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o método adicionalmente inclui a etapa de remover pelo menos alguma da quantidade do açúcar não reagido, e remover pelo menos algum do solvente hidrofílico.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o método adicionalmente inclui a etapa de lavar o colágeno bí-orientado para remover pelo menos alguma da quantidade não reagida do açúcar, e remover pelo menos algum do solvente hidrófilo.

Também é proporcionado, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, um método para a preparação de um colágeno bi-orientado. O método inclui a etapa de incubar o colágeno em uma solução que inclui água, em pelo menos um solvente polar e D(-) ribose.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o solvente polar é selecionado a partir do grupo consistindo de metanol, etanol, propanol, acetona isopropanol, tetrahidrofurano, dimetilsulfõxido, e combinações provenientes dos mesmos.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o colágeno é selecionado a partir de, colágeno nativo, colágeno fibrilar, colágeno fibrilar atelopeptídeo, colágeno liofilizado, colágeno obtido a partir de fontes animais, colágeno humano, colágeno recombinante, colágeno pepsinizado, colágeno reconstituído, e combinação proveniente dos mesmos.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o colágeno inclui um colágeno fibrilar reconstituído a partir de colágeno monomolecular atelopeptídeo.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o colágeno é um colágeno atelopeptídeo fibrilar obtido pela reconstituição do colágeno monomolecular atelopeptídeo obtido a partir da digestão proteolítica do colãgeno nativo.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a concentração de D(-) ribose na referida solução está na faixa de 0.1% a 5% (w/v).

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a concentração de D(-) ribose na referida solução está na faixa de 0.5% a 3% (w/v).

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução compreende água em uma faixa de 15% a 95% (v/v) e pelo menos um solvente polar na faixa de 5% a 85% (v/v).

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução inclui um fosfato compensador salino em uma faixa de 15% a 95% (v/v) e pelo menos um solvente polar na faixa de 5% a 85% (v/v).

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução inclui um fosfato compensador salino.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução inclui água em uma faixa de 15% a 95% (v/v), pelo menos um solvente polar na faixa de 5% a 85% (v/v), e um compensador.

Também é proporcionado, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, um método para a preparação de colágeno bi-orientado, o método incluindo a etapa de incubar o colãgeno atelopeptídeo fibrilar reconstituído em uma solução compreendendo água, pelo menos um solvente polar e pelo menos um açúcar de redução.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a solução é uma solução compensadora.

Também é proporcionado, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, um método para a preparação de colãgeno bi-orientado tendo uma resistência desejada contra a degradação. 0 método inclui as etapas de incubação do colãgeno em uma solução compreendendo água, pelo menos um solvente polar, e pelo menos um açúcar, e do controle da duração da incubação do colãgeno para obter o colãgeno bi-orientado tendo uma resistência desejada a degradação.

Também é proporcionado, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, um método para a preparação de colãgeno bi-orientado tendo uma resistência desejada contra a degradação. 0 método inclui as etapas da incubação do colãgeno em uma solução incluindo água, pelo menos um solvente polar, e pelo menos um açúcar, e a seleção da concentração do solvente polar para obter o colãgeno bi-orientado tendo uma resistência desejada a degradação.

Também é proporcionado, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, um método para a preparação de colãgeno bi-orientado tendo uma resistência desejada contra a degradação. 0 método inclui as etapas da incubação do colãgeno em uma solução incluindo água, pelo menos um solvente polar, e pelo menos um açúcar, e da seleção da concentração do açúcar usado na referida etapa de incubação para obter o colãgeno bi-orientado tendo uma resistência desejada a degradação.

Também é proporcionado, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, uma matriz de colãgeno bi-orientado fibrilar aperfeiçoada obtida por um processo da sua preparação a partir de colágeno fibrilar. 0 processo inclui as etapas de proporcionar uma matriz incluindo colãgeno fibrilar reconstituído, e incubar a matriz em uma solução incluindo água, pelo menos um solvente polar e pelo menos um açúcar, para a bi-orientação do colãgeno fibrilar para formar uma matriz de colãgeno bi-orientado fibrilar.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, a matriz é de uma forma de um dispositivo para um implante.

Adícionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o dispositivo para um implante é um colãgeno com base em uma barreira de membrana para a regeneração guiada de tecido.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o processo usado para a preparação da matriz adicionalmente inclui a etapa de lavar a referida matriz de colãgeno bi-orientado após a etapa de incubação para remover pelo menos algum do solvente polar e do excesso de açúcar não reagido.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o processo adicionalmente inclui a etapa de desidratação da matriz de colãgeno bi-orientado fibrilar.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o processo usado para a preparação da matriz adicionalmente inclui a etapa de sujeitar a matriz de colágeno bi-orientado fibrilar a um ponto crítico de secagem.

Adícionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o processo usado para a preparação da matriz adicionalmente inclui a etapa de secar ou secagem por congelamento da referida matriz de colãgeno bi-orientado fibrilar.

Adicionalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o colágeno fibrilar compreende um colãgeno fibrilar reconstituído a partir de um colãgeno monomolecular atelopeptídeo.

Finalmente, de acordo com uma outra realização preferida da presente invenção, o colãgeno fibrilar é preparado pela reconstituição do colãgeno monomolecular atelopeptídeo obtido pela digestão proteolítica do colãgeno nativo.

Breve Descrição dos Desenhos Com o intuito de se entender a invenção e ver como a mesma pode ser realizada em prática, várias realizações preferidas serão agora descritas, apenas por meio de Exemplos não limitantes, com referência aos desenhos anexos: a Fig. IA é um diagrama de barra esguemãtico ilustrando o nível de glicoação de quatro amostras de preparação específica de colãgenos com tratamentos diferentes experimentais; a Fig. 1B é um diagrama de barra esquemãtico ilustrando o percentual de degradação pela colagenase bacteriológica de quatro amostras de preparação específica de colãgenos sujeitos aos mesmos quatro tratamentos diferentes experimentais conforme as amostras correspondentes da Fig. IA; as Figs. 2A e 2B são gráficos esquemãticos ilustrando o efeito do tempo de incubação sobre o nível de glicoação e a resistência de degradação por colagenase, respectivamente, de matrizes de colãgeno incubadas em uma solução contendo etanol e D(-} ribose. a Fig. 3 é um gráfico esquemãtico ilustrando o efeito da concentração de etanol durante a bi-orientaçao sobre a degradação de colagenase bacteriológica de matrizes de colãgeno bi-orientadas por soluções de D(-) ribose contendo etanol; e a Fig. 4 ê um gráfico esquemãtico ilustrando o efeito da concentração de D(-) ribose durante a bi-orientação sobre a degradação de colagenase bacteriológica de matrizes de colãgeno bi-orientadas por soluções de D(-) ribose contendo etanol. Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção revela um método inovador para a preparação de colãgeno bi-orientado de atelopeptideo reconstituído com açúcares de redução tais como D(-) ribose. 0 método supera a inabilidade de D(-) ribose na indução de matrizes de colãgeno bi-orientado de atelopeptideo reconstituído estabilizadas e aperfeiçoa a capacidade do D(-) ribose de bi-orientar matrizes de colãgeno nativas ou reconstituídas. 0 método permite um controle preciso da taxa de bio degradação das matrizes de colãgeno bi-orientadas por D{-) ribose formadas pelo método.

No método revelado por Pitaru et al. na patente norte-americana No. 5.955,438, os inventores revelaram a bi-orientaçao de matrizes de colãgeno fibrilar em soluções aquosas de ribose compensadora pelo processo de ponto crítico de secagem para se preservar o formato tri dimensional dos implantes com base em matrizes de colãgeno bi-orientadas por D(-) ribose. Foi descoberto que o uso de uma etapa de ponto crítico de secagem depois da etapa de bi-orientação por incubação em uma solução aquosa de ribose aperfeiçoa a resistência das matrizes de colãgeno bi-orientadas resultantes contra a colagenase.

Os inventores da presente invenção descobriram que se um solvente polar, tal como mas não limitado a, etanol em uma faixa de concentração de aproximadamente 30 - 85% (v/v) é incluído na solução compensadora de D(-) ribose na qual o colãgeno fora incubado na etapa de bi-orientação, a resistência a degradação (determinada como a resistência a degradação por colagenase bacteriológica) do colágeno bi-orientado resultante era surpreendentemente e inesperadamente aperfeiçoada comparada a resistência a degradação da matriz de colágeno bi-orientada obtida pela incubação das matrizes de colágeno em D(-) ribose em fosfato compensador salino (PBS) .

Uma outra descoberta inesperada foi o fato que a resistência a degradação do colágeno bi-orientado incubado na solução alcoólica de D(-) ribose era significativamente mais alta que a resistência a degradação de uma matriz de colágeno bi-orientada obtida pela incubação das matrizes de colágeno em D(-) ribose em fosfato compensador salino (PBS) seguida pelo ponto crítico de secagem (preparado conforme revelado na patente norte-americana No. 5.955.438).

Exemplo 1 As matrizes de colágeno foram preparadas usando o método revelado na patente norte-americana No. 5,955,438. Brevemente, uma solução de colágeno molecular bovino purificado pepsinízado do Tipo I (1-10 miligrama/mililitro) preparada a partir de tendões bovinos comercialmente disponíveis a partir de Pel - Freez, AR, E.U.1, dissolvidos em 0.01 M HCl e mantidos a 4o C é neutralizado por 0.1 M NaOH em um pH de 7.2 - 7.4, dispensado dentro de um molde apropriado, e incubado por 24 horas em uraa temperatura com uma faixa entre 20 - 38° C. A matriz a qual é produzida é então compressa por um pistão para remover o excesso de solução. As membranas de colágeno resultantes foram então sujeitas aos cinco tipos de tratamento diferentes seguintes: Grupo de tratamento No. 1 - as membranas neste grupo foram incubadas por 11 dias em PBS.

Grupo de tratamento No. 2 - as membranas neste grupo foram incubadas por 11 dias em uma solução de 3% de D(-) ribose em PBS.

Grupo de tratamento No. 3 - as membranas neste grupo foram incubadas por 11 dias em uma solução de 3% de D(-) ribose em PBS. Depois da incubação, as membranas foram lavadas várias vezes com PBS para remover a D(-) ribose. As membranas foram então desidratadas em uma série de soluções de etanol com concentrações crescentes (30 - 100% etanol) e depois sujeitas ao ponto crítico de secagem conforme revelado em detalhe na coluna 7, linhas 4-15 da patente norte-americana No. 5,955,438.

Grupo de tratamento No. 4 - as membranas neste grupo foram incubadas por 11 dias em uma solução incluindo 30% (v/v] de PBS, 70% (v/v) de etanol, e 3% (w/v) de D{-) ribose.

Grupo de tratamento No. 5 - As membranas neste grupo foram incubadas por 11 dias em uma solução incluindo 30% (v/v) de PBS, 70% {v/v) de etanol, e 31 (w/v) de D(-) ribose. Depois da incubação, as membranas foram lavadas várias vezes com PBS para remover a D(-) ribose. As membranas foram então desidratadas em uma série de soluções de etanol com concentrações crescentes (70 -100% etanol) e depois sujeitas ao ponto crítico de secagem conforme revelado no Tratamento No. 3 acima mencionado.

Depois que os tratamentos acima revelados foram completados, todas as membranas foram testadas por resistência a digestão de colagenase bacteriológica. 0 teste foi executado pela incubação das membranas testadas em uma solução incluindo 350 unidades de colagenase bacteriológica por mililitro de degradação compensadora para a quantidade de tempo indicada. A degradação compensadora incluiu 111 mM NaCl, 5,4 mM KC1, 1,3 mM MgC12, 0,5 mM ZnC12 e 21,3 mM Tris-base a pH = 7.45. A colagenase bacteriológica é colagenase bacteriológica Cat. No. C - 9891, comercialmente disponível a partir da Sigma Chemical Co., MO, E.U.A. No final dos testes de colagenase a quantidade de colágeno digerido e não digerido no supernatante e pelota foram determinados por um método de Lowry modificado conforme revelado em um estudo de Komsa -Pekova R. et al, intitulado "MODIFICATION OF LOWRY'S METHOD FOR COLAGEN CONCENTRATION MEASUREMENT", publicado no J. Biochem, Métodos Vol. 32 pp. 33 - 43, 1996. A quantidade de colágeno digerido é apresentada como uma porcentagem do total de proteína em cada Exemplo.

Os resultados dos cinco tipos de tratamentos acima descritos são fornecidos na Tabela 1 abaixo. TABELA 1 GRUPO DE TEMPO DE DIGESTÃO DE COLAGENASE TRATAMENTO NO. 1 hora 3 horas 5 horas 1 77% 100% 100% 2 43% 80% 96% 3 11% 24% 33% 4 3% 13% 17% 5 0% 0% 3% Os valores na Tabela 1 representam a quantidade de colágeno digerido como um percentual da proteína total na amostra de membrana testada nos períodos de tempo especificados de incubação com colagenase. (100% indica a digestão total da amostra e 0% indica nenhuma digestão no tempo de digestão indicado).

Os resultados indicam que a resistência a degradação das membranas as quais foram bi-orientadas por incubação com 3% (w/v) de D(-) ribose em uma mistura de 70% etanol e 30% PBS (Grupo de tratamento No. 4) foi mais alta que a resistência a degradação das membranas que foram bi-orientadas por incubação com D(-) ribose em PBS (Grupo de tratamento No, 2) e também foi mais alta que a resistência a degradação das membranas que foram bi-orientadas por incubação com D(-) ribose em PBS e sujeitas a desidratação e ponto crítico de secagem (Grupo de tratamento No. 3).

Também foi notado que quando as membranas foram bi-orientadas pela incubação com 3% (w/v) de D(-) ribose em uma mistura de 70% de etanol e 30% de PBS e depois sujeita a desidratação e ponto crítico de secagem (Grupo de tratamento No. 5), a resistência a degradação foi adicionalmente aumentada.

Assim sendo, de acordo com uma realização preferida da presente invenção, um colãgeno, ou uma matriz de colãgeno, ou uma estrutura compreendendo um colãgeno ou uma matriz de colãgeno é incubado em uma solução compensadora compreendendo um açúcar de redução reativo e um álcool e/ou outro solvente hidrofílico. Preferivelmente, a incubação é executada em uma temperatura de 37° C. Entretanto, a temperatura de incubação pode variar entre 4o e 60° C. Preferivelmente, o tempo de incubação pode variar entre 1 e 28 dias, dependendo do grau desejado de bi-orientação. Entretanto, outros tempos diferentes de incubação também podem ser usados dependendo, inter alia, no grau desejado de resistência à degradação.

Preferivelmente, o açúcar ê introduzido no interior da mistura de incubação sendo dissolvido em uma solução compensadora salina, tal como, por Exemplo, PBS. Entretanto, pode ser possível usar outras soluções compensadoras ou soluções compensadoras salinas, conhecidas pela técnica, para se controlar o pH e/ou a potência iônica da solução de incubação.

Preferivelmente, a concentração de álcool na mistura de incubação ou solução é entre 50% a 75% (v/v). Entretanto, a concentração de álcool pode ser variada entre 5% a 85%. A concentração preferida do açúcar de redução é entre 0.5% a 3% (w/v). Entretanto, a concentração do açúcar de redução pode variar entre 15% a 6%. Todavia, outras concentrações diferentes de álcool e/ou açúcar de redução também podem ser usadas, dependendo, inter alia, da temperatura de incubação, e outras condições de reação, tias como o nível de pH e similares, e da resistência a degradação desejada do produto.

Geralmente, de acordo com uma realização da presente invenção, a bi-orientação da matriz de colãgeno da presente invenção é executada da seguinte maneira. Primeiro, uma preparação ou matriz de colãgeno fibrilar é preparada de acordo com um dos métodos de preparação de matrizes de colãgeno ou preparações de colãgeno fibrilar os quais são conhecidos pela técnica. 0 colãgeno pode ser preparado por qualquer um dos métodos conhecidos pela técnica ou pelos revelados em qualquer uma das patentes norte-americanas acima referenciadas para a preparação de colãgeno podem ser usados, incluindo os mostrados nos Exemplos descritos abaixo. A matriz de colãgeno é incubada em uma solução aquosa compensadora neutra incluindo etanol e D(-) ribose. A concentração de etanol é preferivelmente de aproximadamente 70% (v/v) , mas pode ser na faixa de aproximadamente 30% a 85% (v/v), e a concentração de D(-) ribose é de preferivelmente 1% (w/v) , mas pode ser na faixa de aproximadamente 0.5% a 3% (w/v). 0 tempo de incubação é determinado de acordo com o nível desejado de bi-orientação. Tipicamente um período de incubação de 14 dias pode ser usado, mas o tempo de incubação pode variar dentro de uma faixa de aproximadamente 1 a 21 dias.

Exemplo 2 Este Exemplo revela a preparação de matrizes de colãgeno injetável bi-orientadas por uma solução de etanol ribose.

Uma matriz de colãgeno fibrilar é preparada a partir de colãgeno de tendão bovino purificado pepsinizado do Tipo I conforme revelado em detalhe no Exemplo 1 acima mencionado. A solução acídica fria de colãgeno (em um pH 3 e uma concentração de colãgeno de 3 mg/ml} é neutralizada com um compensador de fosfato alcalino, aquecido até 37° C e vigorosamente misturado por 24 horas. A mistura contínua resulta em uma formação de pequenas partículas em uma faixa de 150 micron. A matriz de colãgeno fibrilar particulada obtida depois de 24 horas de incubação a 37° C é centrifugada para se precipitar as partículas de colãgeno. 0 supernatante é removido e a pelota é lavada varias vezes com um fosfato compensador salino (PBS) por centrifugação e re -suspensão repetida.

As amostras da matriz de colãgeno particulada preparadas conforme acima descrito foram divididas em quatro grupos. Cada grupo recebeu um dos quatro tratamentos diferentes: Grupo A - A matriz de colãgeno particulada foi incubada por 14 dias em uma solução incluindo 70% (v/v) de etanol, 30% (v/v) de PBS e 3% (w/v) de D(-) ribose.

Grupo B - A matriz de colãgeno particulada foi incubada por 14 dias em uma solução de 3% (w/v) de D(-) ribose dissolvida em PBS.

Grupo C - A matriz de colãgeno particulada foi incubada por 14 dias em uma solução incluindo 70% (v/v) de etanol, e 30% (v/v) de PBS.

Grupo D - A matriz de colãgeno particulada foi incubada por 14 dias em PBS.

Seguindo o período de incubação as amostras foram analisadas pelo nível de glicoação. O número de resíduos de ribose representa o número assumido de bi-orientação intermolecular e é expresso pela quantidade de formaldeído liberado pela redução de 1 mg do colãgeno bi-orientado. O método de teste foi usado conforme o descrito por Tanaka S., Avigad G., Eikenberry E.F., e Brodsky B., em um estudo intitulada "ISOLATION AND PARTIAL CHARACTERIΖΑΤION OF COLAGEN CHAINS DIMERIZED BY SUGAR-DERIVED CROSS-LINKS", publicado no The Journal of Blological Chemistry Vol. 263 (33), pp. 17650 - 17657, (1988) e por Avigad G. em um estudo intitulada "A SIMPLE SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF AND OTHER FORMALDEHYDE ALDEHYDES: APLICATION TO PERIODATE -OXIDIZED GLYCOL SYSTEMS" publicado no Anal. Biochem. Viol. 134, pp. 499 - 504 (1983).

As mesmas amostras também foram analisadas por degradação de colagenase bacteriológica conforme revelado em detalhes no Exemplo 1 acima mencionado. A concentração de colagenase usada nos testes foi de 300 unidades/ml de colagenase de compensador de degradação, e o tempo de incubação em colagenase foi de 3 horas.

Referência agora é feita a Fig. IA a qual é um diagrama de barra ilustrando o efeito dos quatro tratamentos diferentes de incubação dos grupos A - D sobre o número de bi-orientações intermoleculares nas amostras representadas como nanomoles de formaldeído formado por miligrama de amostra. A barra vertical denominada 1 representa os resultados para o Grupo A do Exemplo 2, a barra vertical denominada 2 representa os resultados para o Grupo B do Exemplo 2, a barra vertical denominada 3 representa os resultados para o Grupo C do Exemplo 2, a barra vertical denominada 4 representa os resultados para o Grupo D do Exemplo 2. Cada barra da Fig. IA representa a média de três medidas separadas e as barras com capa representam o desvio padrão da média. 0 número de bi-orientações da matriz de colágeno particulada incubada em etanol (Grupo C do Exemplo 2) foi praticamente similar ao número de bi-orientações observado para o controle de matriz particulada em PBS (Grupo D do Exemplo 2) . 0 número de bi-orientações da matriz de colágeno particulada incubada em uma solução de 3% de D(-) ribose dissolvida em PBS (Grupo B do Exemplo 2) foi aproximadamente duplamente mais alta do que o número de bi-orientações da matriz particulada incubada em apenas PBS (Grupo D do Exemplo 2) . 0 número de bi-orientações da matriz de colágeno particulada tratada com 3% de D(-) ribose dissolvida na solução incluindo 70¾ de etanol e 30% de PBS (Grupo A do Exemplo 2) foi aproximadamente guadruplamente mais alta do que aquele da matriz particulada incubada em apenas PBS (Grupos D e C, respectivamente, do Exemplo 2) e foi 2.26 mais alta do que o número de bi-orientações do colágeno particulado incubado em 3% de D(-) de ribose dissolvido em PBS (Grupo B do Exemplo 2).

Referência agora é feita a Fig, 1B a qual é um diagrama de barra esquemãtico ilustrando o efeito dos quatro tratamentos diferentes de incubação dos grupos A - D do Exemplo 2 revelado acima mencionado sobre a resistência do colágeno particulado a degradação por colagenase bacteriológica. A resistência a degradação por colagenase bacteriológica foi determinada conforme revelado para o Exemplo lAcima mencionado.

Na Fig. 1B, a barra vertical denominada 5 representa os resultados para o Grupo A do Exemplo 2, a barra vertical denominada 6 representa os resultados para o Grupo B do Exemplo 2, a barra vertical denominada 7 representa os resultados para o Grupo C do Exemplo 2, e a barra vertical denominada 8 representa os resultados para o Grupo D do Exemplo 2. Cada barra da Fig. 1B representa a média de três medidas separadas e as barras com capa representam o desvio padrão da média. 0 resultados ilustrados na Fig. 1B demonstram que a incubação em 70% de etanol e 30% de PBS (Grupo C do Exemplo 2) não teve efeito substancial sobre a resistência a degradação por colagenase bacteriológica a qual foi similar a resistência a degradação por colagenase bacteriológica da amostras de controle incubadas apenas em PBS (Grupo C do Exemplo 2) . Os resultados indicam que o colãgeno particulado incubado em 3% de ribose na presença de 70% de etanol e 30% de PBS (Grupo A do Exemplo 2) foi aproximadamente 20 vezes mais resistente a degradação por colagenase bacteriológica do que o colãgeno particulado incubado em 3% de D(-) de ribose na presença de PBS (Grupo B do Exemplo 2), e 35 a 45 vezes mais resistente a degradação por colagenase bacteriológica do que o colãgeno particulado incubado tanto apenas em PBS quanto em 7 0% de etanol e 30% em PBS (Grupos D e C, respectivamente, do Exemplo 2).

Quando a temperatura e as concentrações do açúcar de redução e do álcool são mantidas constantes, aumentar o tempo de incubação resulta em um aumento do número de bi-orientações e na resistência da matriz do colãgeno a degradação por colagenase bacteriológica.

Referência agora é feita as Figs. 2A e 2B as quais são gráficos esquemãticos que ilustram o efeito do tempo de incubação sobre o nível de glicoação e a degradação por colagenase, respectivamente, das matrizes de colãgeno incubadas em uma solução contendo etanol, PBS e D(-) de ribose.

Uma matriz de colãgeno particulado foi preparada conforme descrito no Exemplo 2 acima mencionado. A matriz de colágeno preparada foi então incubada em uma solução de 3% (w/v) de D(-) de ribose em uma solução incluindo 30% (v/v) de PBS, e 70% (v/v) de etanol durante 1, 3, 9 e 14 dias. A cada ponto de tempo a matriz foi testada para o nível de glicoação (Fig. 2A) e para a capacidade da matriz de resistir a digestão por colagenase bacteriológica (Fig. 2B) pelo uso do nível de glicoação e pelos testes de degradação por colagenase revelados acima mencionados.

Nas Figs. 2A e 2B, o eixo horizontal representa o tempo de incubação em dias. 0 eixo vertical da Fig. 2A representa o nível de glicoação (expressado em nanomoles de formaldeído liberado por redução a partir de um miligrama de colágeno). 0 eixo vertical da Fig. 2B representa a quantidade de colágeno digerido como uma porcentagem do total de proteína na amostra. Os pontos nas Figs. 2A e 2B representam o valor médio do nível de glicoação e os valores de degradação por colagenase, respectivamente, nos vários tempos de incubação. As barras com capa representam o desvio padrão da média (n = 3). Assim sendo, quando a temperatura, a concentração do açúcar e a concentração do etanol são mantidas constantes, aumentando o tempo de incubação, isto resulta em um aumento do número de bi-orientações e da resistência da matriz do colágeno a degradação por colagenase.

Referência agora é feita a Fig. 3 a qual ê um gráfico esquemãtico ilustrando o efeito da concentração de etanol durante a bi-orientação sobre a degradação por colagenase bacteriológica de matrizes de colágeno bi-orientadas por D(-) de ribose na presença de soluções incluindo PBS e várias concentrações de etanol. Amostras de matriz de colágeno particulada foram preparadas conforme descrito em detalhe no Exemplo 2Acíma mencionado e incubadas por 6 dias em soluções de 3% (w/v) de D(-) de ribose dissolvida em PBS contendo 0%, 3 0%, 50%, 70% e 85% (todas as concentrações são dadas como v/v) de etanol. No final do período de incubação as amostras de matriz foram testadas para a capacidade de resistir a digestão de colagenase bacteriológica conforme descrito em detalhe aqui acima. 0 eixo horizontal representa a concentração de etanol (% v/v) em PBS contendo uma incubação média. 0 eixo vertical representa o% de degradação expresso como a quantidade de colãgeno digerido como um percentual da amostra total de colágeno. Os resultados indicam que sob as condições de reação particulares de bi-crientaçao, a concentração de etanol produzindo a mais alta resistência a degradação por colagenase está em uma faixa entre aproximadamente 50% a 85%. Deve se notar que o aumento da concentração de etanol além de 70% reduz a resistência a degradação por colagenase como se pode ver pelos resultados da amostra incubada em 85% de etanol. Assim sendo, quando a temperatura, a concentração do açúcar e o tempo de incubação são mantidos constantes, o aumento da concentração do álcool até uma certa concentração otimizada, resulta em um aumento do número de bi-orientações e da resistência da matriz de colãgeno a degradação por colagenase.

Referência agora é feita a Fig. 4 a qual é um gráfico esquemãtico ilustrando o efeito da concentração de D(-) de ribose durante a bi-orientação sobre a degradação por colagenase bacteriológica de matrizes de colãgeno bi-orientadas por soluções de D(-) de ribose etanólicas. Amostras de matriz de colágeno particulada foram preparadas conforme descrito em detalhe no Exemplo 2Acima mencionado e incubadas por 14 dias em soluções tendo concentrações crescentes de D(-) de ribose em 70% [v/v) de etanol e 30% (v/v) de PBS. No final do período de incubação as amostras de matriz foram testadas para a capacidade de resistir a digestão de colagenase bacteriológica conforme descrito em detalhe aqui acima, 0 eixo horizontal representa a concentração de D(-) de ribose (% w/v) nas soluções de incubação. 0 eixo vertical representa o% de degradação expresso como a quantidade de colágeno digerido como um percentual da amostra total de colágeno. Os resultados demonstram que sob as condições de reação particulares de bi-orientação, aumentando a concentração de D(-) de ribose em uma faixa de 0,1% a 3%, aumenta a resistência a degradação por colagenase bacteriológica da matriz de colágeno bi-orientada. Assim sendo, quando a temperatura, o tempo de incubação e a concentração do etanol são mantidos constantes, o aumento da concentração do açúcar de redução resulta em um aumento do número de bi-orientações e da resistência da matriz de colágeno a degradação por colagenase. O método de bi-orientação revelado aqui acima mencionado também é eficiente no aumento do nível de bi-orientação e da resistência a degradação de uma preparação de colágeno comercialmente disponível que tem como intenção o aumento da pele conforme demonstrado no Exemplo 3 aqui abaixo.

Exemplo 3 Zyderm® é uma preparação injetável, altamente concentrada de derme bovina pepsinizada atelopéptida derivada a partir de pele dérmica bovina. 0 material de colágeno pode ser injetado e deve formar fibris "in vivo'' seguindo a injeção ou implantação.

Zyderm® é fabricado por Collagen Corporation, Paio Alto, CA, E.U.A., e é comercialmente disponível a partir de Collagen Esthetics Inc., CA, E.U.A. 0 material Zyderm® (em uma concentração de aproximadamente 35 miligramas por mililitro) foi dividido em três grupos de amostras que foram sujeitos ao seguinte tratamento: Grupo 1 - 1 mililitro de Zyderm® foi misturado com 20 mililitros de PBS e incubado por 14 dias (isto é um grupo de controle).

Grupo 2 - 1 mililitro de Zyderm® foi misturado com 20 mililitros de 3% de D(-) de ribose dissolvidos em PBS e incubado por 14 dias.

Grupo 3 - 1 mililitro de Zyderm® foi misturado com 20 mililitros de 3% de D{-) de ribose dissolvidos em uma solução incluindo 30% (v/v) de PBS, e 70% (v/v) de etanol e incubado por 14 dias.

Todos os grupos foram incubados a 37° C.

No final do período de incubação as amostras foram testadas para a resistência a degradação por colagenase conforme descrito em detalhe no Exemplo 2Aqui acima mencionado. A concentração de colagenase usada no teste foi de 300 unidades/ml de colagenase de degradação compensadora, e o tempo de incubação in colagenase foi de 3 horas.

Os resultados são dados na Tabela 2Abaixo, A quantidade de colãgeno (degradado) solubilisado é apresentado como um percentual do total de proteína em cada amostra. Os resultados são dados como Média + desvio padrão (n = 3). TABELA 2 TIPO DE TRATAMENTO Degradação de colagenase (% de colãgeno total) GRUPO 1 72+17 (Controle) GRUPO 2 54+16 (3% de ribose em PBS) GRUPO 3 14+11 (3% de ribose em 70% de etanol, e 30% de PBS) Os resultados na Tabela 2 são expressos como a quantidade de colágeno digerido como um percentual sobre o colágeno total na amostra testada. Os resultados demonstram que a incubação com 3% de D(-) de ribose dissolvidos em uma solução incluindo 3 0% de PBS e 70% de etanol é aproximadamente 4 vezes mais potente na bi-orientaçao do material de Zyderm® do que na incubação em 3% de D(-) de ribose dissolvido em PBS. 0 tratamento de Zyderm® 1 com 3% de D(-) de Ribnose dissolvido em uma solução incluindo 70% de etanol e 30% de PBS aumentou a capacidade deste material de suportar a degradação de colagenase bacteriológica em 5 vezes (TABELA 2).

As preparações de colágeno injetável preparadas pelo método da presente invenção, tais como mas limitadas ao material injetável preparado como descrito no Exemplo 3 acima, podem ser utilizadas com uma variedade de propósitos incluindo, inter alia, aumento de tecidos em cosmética, urologia, gastroenterologia, otolaringologia, ortopedia e outros campos da medicina, e na fornecimento controlado de drogas, proteínas, hormônios e material genômico. A presente invenção também pode ser aplicada para a utilização de matrizes de colágeno bi-orientadas por uma solução de etanol - ribose na preparação de matrizes de colágeno formatadas implantãveis.

Exemplo 4 Este Exemplo demonstra a aplicação do método de bi-orientação da presente invenção em matrizes de folhas de colágeno pré-formatadas. Folhas de colágeno foram preparadas a partir de uma solução de colágeno monomêrico bovino pepsinizado atelopeptídeo conforme revelado aqui acima. Brevemente, a matriz de colágeno fibrilar é preparada pela neutralização de uma solução acídica fria de colágeno ( em um pH 3; 3 mg/ml) com um compensador de fosfato alcalino e aquecendo a solução até 37° C em um molde apropriado. A trelíça de colágeno fibrilar formada pela polimerização da solução monomérica é então compressa pelo uso de um pistão adequado ou qualquer outro mecanismo de compressão, para se dar a forma desejada e o conteúdo de colágeno por unidade de volume enquanto o líquido é comprimido para fora da treliça. Discos de colágeno tendo um diâmetro de aproximadamente 3 centímetros e aproximadamente 0.5 milímetros de espessura, foram formados conforme descrito acima e foram incubados em três soluções de incubação diferentes por 11 dias. Um primeiro grupo de folhas pré-formadas de colágeno foi incubado em PBS. Um segundo grupo de folhas pré-formadas de colágeno foi incubado em uma solução de 3% de D(-) de ribose em PBS. Um terceiro grupo de folhas pré-formadas de colágeno foi incubado em uma solução de 3% (w/v) de D(-) de ribose em 701 (v/v) de etanol, e 30% (v/v) de PBS. No final do período de incubação os três grupos de folhas pré-formadas de colágeno foram desidratadas e sujeitas a ponto crítico de secagem conforme revelado aqui acima e testadas para a sua resistência a degradação por colagenase bacteriológica conforme revelado no Exemplo IAqui acima. A concentração de colagenase usada no teste foi de 350 Unidades/ml de colagenase de degradação compensadora, e o tempo de incubação em colagenase foi de 5 horas.

Os resultados são dados na Tabela 3 abaixo indicam que as folhas bi-orientadas em D(-) de ribose dissolvidas na mistura de etanol / PBS foram substancialmente mais resistentes a degradação por colagenase bacteriológica do que aquelas folhas incubadas em D(-) de ribose dissolvidas em PBS.

Tabela 3 Condições de bi-orientação Degradação por colagenase (% de colãgeno total) PBS 95 3 % D(-) de ribose em PBS 2 9 3% de ribose em 70% de etanol 18 + 30% de PBS

Geralmente, de acordo com uma realização preferida da invenção, um artigo formatado tal como uma folha, um tubo, ou qualquer outro artigo formatado é preparado a partir de uma matriz de colãgeno fibrilar conforme descrito em detalhe aqui acima. A matriz de colãgeno é gradualmente desidratada em uma série de soluções aquosas de etanol com concentrações crescentes de etanol a mais alta delas sendo 70% de etanol. 0 formatado em molde, ou de outra maneira artigo formatado de matriz de colãgeno é então incubado em uma solução aquosa de 3% D(-) de ribose contendo 70% de etanol. A quantidade desejada de bi-orientação é obtida pela faixa do tempo de incubação. Conforme descrito aqui acima e ilustrado nas Pigs. 2A e 2B, quanto mais longo o tempo de incubação mais alto é o grau de resistência da matriz de colãgeno a digestão de colagenase bacteriológica. Depois do grau desejado de bi-orientação ter sido obtido a matriz pode tanto ser hidratada em uma série de soluções de etanol de concentração decrescente. Alternativamente, a matriz de colãgeno formada pode ser adicionalmente desidratada e sujeita a ponto crítico de secagem conforme descrito em detalhe na patente norte-americana No. 5.955.438 de Pitaru et al. Se a primeira alternativa é a escolhida, a matriz pode ser preservada e armazenada em um ambiente úmido antes da implantação ou outros usos. Se a segunda alternativa é a escolhida então a matriz de colãgeno seca pode ser preservada e armazenada em um estado seco. A matriz de colágeno que pode ser bi-orientada pelo método aqui revelado pode assumir qualquer forma conhecida na técnica. Por Exemplo, folhas, tubos, esponjas, flocos, gels, contas, microesferas e qualquer outra forma geométrica relacionada feita de qualquer um dos tipos de colágeno revelados aqui acima pode ser bi-orientado pelo método da presente invenção. De acordo com uma realização desta invenção, o colágeno da matriz pode ser quimicamente e/ou fisicamente modificado com agentes tais como farmacêuticos, outras proteínas, ou polímeros sintéticos.

Deve se notar que a concentração exata de D(-) de ribose, a concentração de etanol, e de qualquer das outras condições de bi-orientação tal como mas não limitada ao tempo de incubação e a temperatura de incubação pode ser variada se desejado para o controle das propriedades finais de degradação do implante ou artigo feito a partir da matriz de colágeno. Tais variações controladas permitem, inter alia, a formação de implantes e outros artigos com base em colágeno tendo resistência a degradação controlada ia vivo.

Exemplo 5 Enquanto os Exemplos dos colãgenos bi-orientados revelados aqui acima preparados usando o método de bi-orientação da presente invenção, envolvem o uso de preparações de colágeno bovino, o colágeno bi-orientado da presente invenção pode ser aplicado a colãgenos a partir de outras fontes diferentes. Nos dois experimentos apresentados aqui abaixo o método de bi-orientação da presente invenção é aplicado a duas formas diferentes de colágeno humano.

Experimento 1 Um tendão de Aquiles humano foi tratado com ficin para remover proteínas não colagenosas como é de conhecimento na técnica. 0 tendão foi cortado em pequenas pedaços (1-2 mm2) e depois divididos em 4 grupos de amostras. Um primeiro grupo de amostras foi incubado em PBS por 14 dias como o grupo de controle. Um segundo grupo de amostras foi incubado em uma solução de 3% de D(-) de ribose em PBS por 14 dias. Um terceiro grupo de amostras foi incubado em uma solução de 3% (w/v) de D(-) de ribose em uma mistura de 30% (v/v) de PBS e 70% (v/v) de etanol por 6 dias. Um quarto grupo de amostras foi incubado em uma solução de 3% de D(-) de ribose em uma mistura de 3 0% (v/v) PBS e 70% (v/v) de etanol por 14 dias.

Experimento 2 Dertnalogen™ comercialmente disponível a partir de Collagenesis Inc, MA, E.U.A, é uma matriz de colãgeno injetável derivada a partir de pele humana depois da remoção das proteínas não colagenosas e é usada como um material de implante halogênico de fácil acesso. A matriz de colãgeno de Dermalogen™ foi dividida em 4 grupos de amostras. Um primeiro grupo de amostras de Dermalogen™ foi incubado em PBS por 14 dias como o grupo de controle. Um segundo grupo de amostras de Dermalogen™ foi incubado em uma solução de 3% de D(-) de ribose em PBS por 14 dias. Um terceiro grupo de amostras de Dermalogen™ foi incubado em uma solução de 3% (w/v) de D(-) de ribose em uma mistura de 30% (v/v) de PBS e 70% (v/v) de etanol por 6 dias. Um quarto grupo de amostras de Dermalogen™ foi incubado em uma solução de 3% de D(-) de ribose em uma mistura de 30% (v/v) PBS e 70% (v/v) de etanol por 14 dias.

No final do período de bi-orientação, todas as amostras do Experimento 1 e Experimento 2 foram testadas para a resistência a degradação de colãgeno por colagenase bacteriológica conforme revelado em detalhe no Exemplo IAqui acima. A concentração de colagenase usada no teste foi de 350 Unidades/ml de colagenase de degradação compensadora, e o tempo de incubação em colagenase foi de 5 horas.

Os resultados são dados na Tabela 4 abaixo. TABELA 4 Condições de Degradação de colagenase {% de colãgeno total) Bi-orientação EXPERIMENTO 1 EXPERIMENTO 2 (tendão de Aquiles humano) (Dermalogen™) PBS por 14 dias 38.2+0.7 79.5+2.6 (controle) 3% de D(-) de 13.1 ± 0.3 75.4 ± 1.0 Ribose em PBS por 14 dias 3% de D(-) de 14.5 ± 0.3 44.2 ± 1.2 Ribose em etanol (70%) e PBS (30 %) por 6 dias 3 % de D(-) de 0.8±0.2 11.2 ± 0.1 Ribose em etanol (70%) e PBS (30 %} por 14 dias Os resultados de degradação de colagenase na Tabela 4 é apresentado como a quantidade de colãgeno solubilizado como o percentual de proteína total em cada amostra. Os resultados apresentados como valores médios + o desvio padrão da média (n = 3) . Os resultados na Tabela 4 demonstra que o método de bi-orientação da invenção é aplicável a colãgeno obtido a partir de fontes diferentes. Os resultados na Tabela 4 também demonstram que a incubação de colãgeno humano nos 3% de D(-) de ribose em 70% de etanol, e 30% de PBS aumenta a capacidade das amostras de colãgeno humano desproteinizados bi-orientados para suportar degradação colagenolítica várias vezes em comparação com as amostras de colãgeno humano que foram incubadas pela mesma quantidade de tempo em 3% de D(-) de ribose em PBS. A quantidade de colãgeno degradado nas amostras de tendão de Aquiles humano incubadas em 3% de D(-) de ribose em 70% etanol e 30% de PBS foi aproximadamente 16 vezes menor do que a quantidade de colãgeno degradado nas amostras de tendão de Aquiles humano incubadas em 3% de D(~) de ribose em PBS. Similarmente, a quantidade de colãgeno nas amostras de Dermalogen™ incubadas em 3% de D(-) de ribose em 7 0% de etanol e 3 0% de PBS, foi aproximadamente 7 vezes menor do que a quantidade de colãgeno degradado nas amostras de Dermalogen™ incubadas em 3% de D(-) de ribose em PBS.

Geralmente, o método de bi-orientação da presente invenção pode ser aplicado a tipos diferentes de matrizes de colãgeno de fontes diferentes as quais podem ser preparadas a partir de soluções moleculares de colãgeno por reconstituição conforme descrito em detalhe aqui acima ou por remoção de proteínas não colagenosas e proteoglicanos a partir de tecido compreendendo matrizes de colãgeno. Exemplos de tais tecidos são vasos sanguíneos, pele, pericãrdio, tendões, ligamentos, ossos, faixas, cápsulas, córnea, esclera, intestinos e similares. Esses tecidos podem ser obtidos a partir de espécies diferentes, incluindo mas não se limitando a bovino, suíno, humano e os similares. A remoção de proteínas não colagenosas e proteoglicanos pode ser executada por digestão enzimãtica e extrações conforme é conhecido na técnica. Depois do processo de deproteinização, a matriz de colãgeno remanescente é bi-orientada em uma solução aquosa compensadora etanólica de D(-) de ribose de acordo com a metodologia descrita nos Exemplos revelados aqui acima. 0 colãgeno o qual pode ser bi-orientado pelo método da presente invenção pode ser fibras de colãgeno nativa que foram preparadas pela extração parcial ou completa dos componentes celulares e/ou proteínas não colagenosas a partir dos tecidos contendo colãgeno. 0 método também pode ser usado para bi-orientar fibrils reconstituídos de moléculas de colãgeno (não pepsinízado) nativo. 0 método também pode ser usado para a bi-orientação de fibrils de colãgeno atelopeptídeo reconstituído. Adicionalmente, combinações das formas de colãgeno acima reveladas também podem ser bi-orientadas pelo método da presente invenção.

De acordo com realizações preferidas diferentes da presente invenção, a matrizes de colãgeno podem ser bi-orientadas para que se tornem adequadas para aplicações diferentes tais como, mais limitada a, andaimes para matriz extracelulares em engenharia de tecido, sistemas de fornecimento controlado para produtos biológicos e farmacêuticos (proteínas ativas, genes e vetores de genes), membranas para a regeneração guiada de tecido e osso, agentes de volume ejetãveis ou implantãveis para o aumento de tecido, envelopes para ancorar órgãos naturais e/ou reconstruídos e/ou artificiais, material de enchimento para a preparação de tecidos ou órgão artificiais tais como por Exemplo, seio artificiais, e componentes de materiais de composições compreendendo colãgeno e outras estruturas poliméricas naturais ou artificiais ou compostos naturais ou sintéticos orgânicos e inorgânicos ou combinações destes.

Os Exemplos dos materiais iniciantes para a preparação das matrizes de colãgeno e preparações da presente invenção são tecidos de colãgeno rico animal e humano tais como pele, osso, tendões, ligamentos, placenta, e os similares, e colágenos recombinantes preparados ín vitro ou em orgânicos transgênicos. A matriz de colãgeno pode compreender um tipo único de colãgeno mas também pode compreender as misturas de uma variedade de tipos de colãgeno conhecidos na técnica. Exemplos de tipos de colãgeno que podem ser usados na preparação das preparações de colãgeno bi-orientado e/ou matrizes de colãgeno da presente invenção são colãgeno dos tipos I - XVIII os quais são conhecidos na técnica.

Outros Exemplos de outros tipos de moléculas de colãgeno as quais podem ser usadas na preparação de preparações de colãgeno bi-orientado e/ou matrizes de colãgeno da presente invenção são proteínas colagenosas tais como por Exemplo o cementum derivado da fixação de proteína (CAP) a qual promove a fixação e a distribuição de tipos de células periodontal, conforme revelado em um artigo de Komaki et al. intitulada "Role of MAP Kínases p42(erk-2)/p44(erk-1) in cementum derived attachment protein mediated cell attachment", publicado no Journal of Dental Research, Vol. 79 (10) pp. 1789 - 1793 (2000), e outras moléculas colagenosas conhecidas na técnica, ou peptídeos similares a colágenos modificados tais como, mas não limitados aos peptídeos similares a colágenos revelados por Kramer et al. no estudo intitulado "STAGGERED MOLECULAR PACKING IN CRYSTALS OF A COLLAGEN-LIKE PEPTIDE WITH A SINGLE CHARGED PAIR" publicado no J. Mol. Bíol·., 301 (5), pp. 1191 - 1205, Setembro 2000, ou os peptídeos similares a colágenos revelados por Kramer et al. no estudo intitulado "SEQUENCE DEPENDENT CONFORMATIONAL VARIATIONS OF COLLAGEN TRIPLE - HELICAL STRUCTURE" publicado na Nat. Struct. Biol., 6 (5), pp. 454 - 457, Maio de 1999. A preparação de soluções de colãgeno adequada para bi-orientação usando o método da presente invenção ê conhecido na técnica. Produtos comerciais de colãgeno tais como Zyderm®, Dermalogen™, ou outros produtos similares que tem a forma de soluções de colãgeno e/ou matrizes de colãgeno fibrilar reconstituído e/ou nativo também são de utilidade como material iniciante de colãgeno para a bi-orientação pelo método da presente invenção. Os métodos exemplares para a preparação dos vários tipos de matrizes de colãgeno os quais são adequados por serem bi-orientados pelo método da presente invenção são revelados, inter alia, na patente norte-americana No. 4.703.108, na patente norte-americana No. 4.060.091, na patente norte-americana No. 4.418.691, na patente norte-americana No. 4.374.121, na patente norte- americana No. 4.703.108, na patente norte-americana No. 4..409.332, e na patente norte-americana No. 4.971.954.

Preferivelmente, D(-) de ribose é usado para a bi-orientação de colãgeno. Entretanto, outros Exemplos de açúcares reativos os quais também podem ser usados para a bi-orientação de acordo com o método da presente invenção são glicerose, treose, eritrose, lixose, xilose, arabinose, alose, altose, glicose, manose, gilose, idose, galactose, fructose, talose ou qualquer outra diose, triose, tetrose, pentose, hexose,septose, octose, nanose, ou decose.

Deve se notar que outros ãlcoois diferentes de etanol, e outros solventes orgânicos polares ou hidrofílicos também podem ser usados no método de bi-orientação da presente invenção.

Exemplo 6 Experimentos adicionais foram executados para avaliar os efeitos de vários açúcares de redução diferentes sobre a resistência a degradação por colagenase de amostras de colãgeno bi-orientadas na presença de 70% de etanol, Uma matriz de colãgeno é preparada a partir de colãgeno do Tipo I, de tendão de bovino, pepsinizado conforme revelado em detalhe no Exemplo IAqui acima. A solução acídica fria de colãgeno (em um pH 3 e uma concentração de colãgeno de 3 mg/ml) é neutralizada com um compensador de fosfato alcalino, aquecido até 37° C e vigorosamente misturada por 24 horas, A mistura contínua resulta em uma formação de pequenas partículas em uma faixa de 150 micron. A matriz de colãgeno fibrilar particulada obtida depois de 24 horas de incubação a 37° C é centrifugada para se precipitar as partículas de colãgeno. 0 supernatante é removido e a pelota é lavada várias vezes com um fosfato compensador salino (PBS) por centrifugação e re - suspensão repetida. 5 porções iguais, cada uma incluindo 5 miligramas da matriz particulada de colãgeno fibrilar resuspenso foram incubados a 37° C por 11 dias em uma solução incluindo 70% de etanol (v/v), 30% de PBS (v/v), e 1% (w/v) de um açúcar de redução. Os açúcares de redução diferentes testados na presença de 70% de etanol foram de D(-) de ribose, comercialmente disponível como o Número de Catálogo R 7500 a partir da Sigma Chemical Co., MO. , E.U.A, D(-) de Glicose comercialmente disponível como Número de Catálogo 10117 a partir de BDH Chemicals, Poole, Reino Unido, D(-) de Fructose, comercialmente disponível como Número de Catálogo 47748 a partir de Fluka Chemle, AG, Suíça, Sucrose (a - D - glicopiranosila - β -D - fructose), comercialmente disponível como Número de Catálogo 10274 a partir de BDH Chemicals, Poole, Reino Unido, e Maltose (4 - O - aD - glicopiranosila D glicose) comercialmente disponível como Número de Catálogo M 5885 a partir de Sigma Chemical Co., MO, E.U.A.

No final do período de bi-orientação com os tipos diferentes de açúcares, as amostras de colãgeno tratadas foram coletadas por centrifugação, lavadas três vezes em PBS, e testadas para a resistência a degradação de colãgeno por colagenase bacteriológica conforme revelado em detalhe no Exemplo 2Aqui acima. A concentração de colagenase usada no teste foi de 300 Unidades/ml de colagenase de degradação compensadora, e o tempo de incubação em colagenase foi de 3 horas.

Os resultados do experimento são dados na Tabela 5 abaixo. A coluna da direita da Tabela 5 indica o tipo de açúcar na qual a amostra de colãgeno foi incubada. Os números na coluna da esquerda da Tabela 5 representa a quantidade de colãgeno (degradado) solubilizado, apresentado como um percentual do total de proteína em cada amostra. TABELA 5 Açúcar usado Degradação por colagenase (% de colãgeno total) D(-) de ribose 17 D(-) de Glicose 95 D(-) de Fructose 98 Sucrose 92 Maltose 95 Como se pode ver a partir dos resultados apresentados na Tabela 5, D(-) de ribose tinha a mais alta eficácia no aperfeiçoamento da resistência a degradação por colagenase do colãgeno fibrilar bi-orientado pelo açúcar. A eficácia dos outros açúcares é menor do que a eficácia do D(-) de ribose.

Deve se notar que enquanto apenas os dissacaretos de sucrose e de maltose foram testados no Exemplo 6, pode ser possível usar outros dissacaretos, tais como mas não limitados a, lactose, celobiose, gentiobiose, melibíose, turanose,e trealose, para a bi-orientação de colãgeno pelo uso apropriado do tempo e condições de incubação.

Exemplo 7 Experimentos adicionais foram executados para avaliar os efeitos de vários solventes orgânicos diferentes sobre a bi-orientação de colãgeno com vários açúcares de redução.

Uma suspensão de matriz de colãgeno fibrilar particulado foi preparada a partir de colãgeno do Tipo I, de tendão de bovino, pepsinizado conforme revelado em detalhe no Exemplo 6 aqui acima. Dez amostras de colãgeno (5 miligramas de colãgeno em cada amostra) foram preparadas. Cada uma das amostras de colãgeno foi incubada por 11 dias a 37° C em 30 mililitros de uma mistura de solvente contendo 30% (v/v) de PBS, 70% (v/v) de um solvente orgânico, e 1% (w/v) de D(-) de ribose. Os solventes orgânicos testados eram: etanol, metanol, 1 - propanol, 2 propanol (isopropanol), 1 - butanol, 1 - hexanol, acetona (acetona dimetila), sulfóxido de dimetila (DMSO), acetato de etila, e tetrahidrofurano (THF).

Em um experimento controlado, uma amostra de 5 miligramas de colãgeno foi incubada por 11 dias a 37° C em uma solução de 1% (w/v) de D(-) de ribose em PBS (amostra número 1 da Tabela 6 abaixo).

No final do período de incubação, as amostras de colãgeno incubadas na presença de 1 - butanol, 1 - hexanol, acetona e acetato de etila (amostras 6, 7, 8 e 10, respectivamente, da Tabela 6 abaixo) foram lavadas duas vezes com 70% de etanol em PBS para remover o solvente orgânico. O colãgeno de todas as amostras foi então coletado por centrifugação, e todas as amostras foram lavadas três vezes em PBS. Alíquotas de todas as amostras foram então testadas para a resistência a degradação por Tripsina conforme revelado em detalhe a partir daqui, e para resistência a degradação por colagenase conforme revelado em detalhe no Exemplo 2Aqui acima. A concentração de colagenase usada no teste de degradação por colagenase foi de 300 Unidades / ml de colagenase de degradação compensadora, e o tempo de incubação em colagenase foi de 3 horas. TABELA 6 Número da amostra Solvente usado Degradação por Resistência Colagenase Tripsina (% de colãgeno total) 1 PBS 72 Intacto 2 Etanol 17 Intacto 3 Metanol 22 Intacto 4 1 - Propanol 32 Intacto 5 2 - Propanol 37 Intacto 6 1 - Butanol ** Degradado 7 1 - Hexanol ** Degradado 8 Acetona 9 Intacto 9 DMSO 9 Intacto 10 Acetato de Etila ** Degradado 11 THF 43 Intacto Onde ** indica que durante o período de incubação, nas amostras números 6, 7 e 10 da Tabela 6 as quais incluem 1 -Butanol, 1 - Hexanol e Acetato de Etila, respectivamente, uma fase incluindo o solvente orgânico separado a partir da solução aquosa (o colágeno fibrilar apareceu como uma fase aquosa separada nas amostras, e algum sólido apareceu na interface entre a camada de solvente orgânico e a fase aquosa. Nas amostras 6, 7 e 10 da Tabela 6, depois solvente orgânico ser lavado com etanol e depositado por centrifugação, o colãgeno apareceu como um depósito empacotado amarelado, diferente na aparência a partir da emulsão esbranquiçada da pelota centrifugada das amostras de teste remanescentes (amostras 1-5, 8, 9 e 11 da Tabela 6), nas quais nenhuma fase de solvente orgânico foi observada durante o período de incubação. Assume-se que menos solventes polares 1 - Butanol, 1 - Hexanol, e Acetato de Etila, os quais tem um baixo poder miscível em água, provavelmente causaram a desnaturação do colágeno. Sendo isto assumido pode se corroborar com o fato de que os resultados dos testes de resistência a degradação de tripsina mostraram que as amostras de colágeno tratadas com 1 - Butanol, 1 - Hexanol, e Acetato de Etila (amostras números 6, 7 e 10, respectivamente da Tabela 6 foram degradadas por tripsina.

Tipicamente, colágeno não desnaturado, nativo, deveria ser resistente a digestão proteolítica não específica por tripsina, enquanto colágeno desnaturado é degradado por digestão por tripsina. Assim sendo, os resultados dos testes de resistência a tripsina da Tabela 6 pode indicar o grau de desnaturação das amostras de colágeno testadas.

Procedimento para o teste de digestão por tripsina 100 mililitros de uma solução de reação de estoque compensadora foram preparados pela mistura de 2 mililitros de 10 mM HC1 com 98 mililitros de um fosfato compensador incluindo uma 67 mM de fosfato de sódio ajustado a um pH de 7.6.

Tripsina (comercialmente disponível como Número de Catálogo T 8003 a partir de Sigma Chemical Co., MO, E.U.A.) foi dissolvido na solução de reação compensadora para produzir uma solução de tripsina tendo uma atividade de tripsina de 2000 unidades por mililitro de reação compensadora. O teste de resistência a tripsina foi executado da seguinte maneira: as amostras de colágeno tendo um volume de 100 microlitros foram colocadas em tubos de teste pré-pesados. O colágeno foi abarcado para baixo a 13,000g por dois minutos e o supernatante foi descartado. Os tubos de teste foram pesados uma outra vez e o peso da pelota foi determinado por subtração, e o volume da pelota foi rudemente determinado pela marcação da altura (nível) da pelota com uma marca no tubo de teste. A digestão foi iniciada pela adição de 0.5 mililitros da solução acima revelada de tripsina na reação compensadora a pelota de colágeno em cada um dos tubos de teste, e os tubos foram incubados a 25° C por 24 horas. Depois da incubação ter sido completada, os tubos de teste foram centrifugados a 13,000g por dois minutos e o volume da pelota foi rudemente determinada pela marcação conforme descrito aqui acima. Os tubos de teste foram pesados outra vez para determinar o peso das pelotas (por subtração). As pelotas também foram visualmente examinadas antes e depois da digestão para determinar sua aparência e tamanho.

Na coluna mais a direita da Tabela 6, a palavra "intacto" indica que o peso e o volume da pelota de colágeno abarcada para baixo a partir da amostra depois de 24 horas de digestão por tripsina não se diferenciou por mais do que + 25% a partir do peso e volume, respectivamente, da pelota de colágeno abarcada para baixo a partir da mesma amostra antes da adição da solução de tripsina. A palavra "degradado" indica que o peso e o volume da pelota de colágeno abarcada para baixo a partir da amostra depois de 24 horas de digestão por tripsina se diferenciou por mais do que 25% a partir do peso e volume, respectivamente, da pelota de colágeno abarcada para baixo a partir da mesma amostra antes da adição da solução de tripsina.

Deve se notar que as amostra de colágeno tratadas com 1-Butanol, 1-Hexanol, e Acetato de Etila (amostras números 6, 7 e 10, respectivamente, da Tabela 6) foram completamente degradadas por trípsína depois de 24 horas de incubação com a solução de tripsina, de tal maneira que depois de 24 horas na solução de tripsina nenhuma pelota observável foi abarcada para baixo.

Os resultados do teste de degradação por colagenase da Tabela 6 indicam que dos solventes que não causaram desnaturação substancial do colãgeno nas amostras, a ordem de eficácia no aumento da resistência a degradação por colagenase das amostras de colãgeno tratadas com D(-) de ribose foi DMSO Acetona > Etanol > Metanol > Propanol > Isopropanol > THF.

Aparentemente os solventes, tais como por Exemplo acetato de etila, 1 - butanol e 1 - hexanol, os quais eram menos polares e os quais foram separados como uma segunda fase distinta a partir da fase aquosa (por Exemplo, os solventes os quais não foram completamente miscíveis na fase aquosa, causaram a desnaturação do colãgeno.

Assim sendo, o solvente ou solventes usados na média de bi-orientação deveríam ser um solvente polar (ou uma mistura de solventes polares) o qual é completamente míscível na fase aquosa na qual o colãgeno é reagido com o açúcar.

Os resultados sumarizados na Tabela S indicam que a incubação do colãgeno com D (-} de ribose em soluções aquosas compensadoras contendo solventes polares aumentaram a resistência a degradação por colagenase dos colagenos resultantes em comparação com os colãgenos incubados apenas em PBS. Os resultados também indicam que enquanto ãlcoois miscíveis em água, relativamente polares (tais como por Exemplo, etanol, metanol, propanol e isopropanol) são de utilidade no aumento da resistência a degradação por colagenase das amostras de colãgeno incubadas com D(-) de ribose, outros solventes polares os quais são quimicamente diferentes dos ãlcoois também podem ser usados com eficácia similar ou até mesmo maior eficácia.

Exemplo 8 0 seguinte experimento foi executado para checar o efeito da concentração de ribose por sobre a resistência a degradação por colagenase de colágeno bi-orientado com D(-) de ribose na presença de 70% de acetona (acetona de dimetila) Uma suspensão de matriz de colágeno fibrilar particulado foi preparada a partir de colágeno do Tipo I, de tendão de bovino, pepsinizado conforme revelado em detalhe no Exemplo 6 aqui acima. Dez amostras de colágeno (5 miligramas de colágeno em cada amostra} foram preparadas. Cada uma das amostras de colágeno foi incubada por 11 dias a 37° C em 30 mililitros de uma solução compreendendo 70% (v/v) de acetona e 30% (v/v) de PBS, e uma concentração específica de D(-) de ribose. As concentrações finais de D(-) de ribose nas cinco diferentes soluções testadas foram 0,5%, 1%, 2%, 3%, e%% (as concentrações de D(-) de ribose são expressas como w/v) . No final do período de incubação o colágeno foi coletado por centrifugação, lavado três vezes em PBS, e as amostras foram testadas para a resistência a degradação de colágeno por colagenase bacteriológica conforme revelado em detalhe no Exemplo 2Aqui acima. A concentração de colagenase usada no teste foi de 300 Unidades/ml de colagenase de degradação compensadora, e o tempo de incubação em colagenase foi de 3 horas.

Os resultados do experimento do Exemplo 8 são dados na Tabela 7 abaixo. TABELA 7 Concentração de Degradação por colagenase D(-) de ribose (% de colágeno degradado) % (w/v) 0.5 11 1 9 2 2 3 1 4 4 Os resultados da Tabela 7 indicam que sob condições específicas de incubação usada, a resistência máxima a degradação do colãgeno bi-orientado, na presença de 70% de acetona ê atingida em uma concentração de D(-) de ribose na faixa aproximada de 1 -3% (w/v).

Exemplo 9 0 seguinte experimento foi executado para checar o efeito da concentração de D(-) de ribose por sobre a resistência a degradação por colagenase de colãgeno bi-orientado com D(-) de ribose na presença de 70% de dimetilasulfóxido DMSO) Uma suspensão de matriz de colãgeno fibrilar particulado foi preparada a partir de colãgeno do Tipo I, de tendão de bovino, pepsinizado conforme revelado era detalhe no Exemplo 6 aqui acima. Cinco amostras de colãgeno, cada amostra incluindo 5 miligramas de colãgeno foram preparadas. Cada uma das amostras de colãgeno foi incubada por 11 dias a 37° C em 3 0 mililitros de uma solução compreendendo 70% (v/v) de DMSO e 30% (v/v) de PBS, e uma concentração específica de D(-) de ribose. As concentrações finais de D(-) de ribose nas cinco diferentes soluções testadas foram 0,5%, 1%, 2%, 3%, e%% (as concentrações de D (-) de ribose são expressas como w/v) , No final do período de incubação o colãgeno foi coletado por centrifugação, lavado três vezes em PBS para remover o DMSO, e as amostras foram testadas para a resistência a degradação de colãgeno por colagenase bacteriológica conforme revelado em detalhe no Exemplo 2Aqui acima. A concentração de colagenase usada no teste foi de 300 Unidades/ml de colagenase de degradação compensadora, e o tempo de incubação em colagenase foi de 3 horas.

Os resultados do experimento do Exemplo 9 são dados na Tabela S abaixo. TABELA 8 Concentração de Degradação por colagenase D(-) de ribose (% de colágeno degradado) % (w/v) 0.5 11 1 9 2 14 5 20 6 59 Os resultados da Tabela 8 indicam que sob condições específicas de incubação usada, a resistência máxima a degradação do colágeno bi-orientado, na presença de 70% de HMSO é atingida em uma concentração de D(-) de ribose na faixa aproximada de 0.5% 2% (w/v).

Exemplo 10 Os experimentos do Exemplo 10 foram executados para determinar a relativa eficácia das concentrações de D(-) de ribose na bi-orientação de colágeno na presença de quatro solventes orgânicos polares diferentes.

Uma suspensão de matriz de colágeno fibrilar particulado foi preparada a partir de colágeno do Tipo I, de tendão de bovino, pepsinizado conforme revelado em detalhe no Exemplo 6 aqui acima. Quatro amostras de colágeno, cada amostra incluindo 5 miligramas de colágeno foram incubadas por 11 dias a 37° C em 30 mililitros de quatro misturas de incubação diferentes, cada mistura de incubação compreendendo 70% (v/v) de um solvente polar orgânico específico, 30% (v/v) de PBS, e um 1% de D(-) de ribose. As Os quatro solventes orgânicos diferentes eram etanol, metanol, acetona e DMSO.

Quatro amostras adicionais de colãgenos foram preparadas. Cada amostra incluindo 5 miligramas de colãgeno. As quatro amostras adicionais foram incubadas por 11 dias a 37° C em 30 mililitros de quatro misturas de incubação diferentes, cada mistura de incubação compreendendo 70% (v/v) de um solvente polar orgânico específico, 30% (v/v) de PBS, e um 51 de D(-) de glicose. Os quatro solventes orgânicos diferentes eram etanol, metanol, acetona e DMSO.

No final do período de incubação o colágeno de todas as oito amostras de colágeno foram coletadas por centrifugação, lavadas três vezes em PBS para remover o solvente orgânico, e as amostras foram testadas para a resistência a degradação de colãgeno por colagenase bacteriológica conforme revelado em detalhe no Exemplo 2Aqui acima. A concentração de colagenase usada no teste foi de 300 ünidades/ml de colagenase de degradação compensadora, e o tempo de incubação em colagenase foi de 3 horas.

Os resultados do experimento do Exemplo 9 são dados na Tabela 9 abaixo. TABELA 9 SOLVENTE Degradação por colagenase (% de colágeno total) amostra bi-oríentada amostra bi-orientada em uma concentração em uma concentração de D(-) glicose de D(-) glicose de 1% (w/v) de 5% (w/v) Etanol 97 95 Metanol 97 98 Acetona 95 98 DMSO 95 98 Como pode ser visto a partir dos resultados na Tabela 9, D(-) de glicose em concentrações de 1% e 5% na presença de 70% de um dos solventes polares etanol, metanol, acetona e HMSO, pode ser menos eficiente do que D{-) ribose no aumento da resistência a degradação do colãgeno. Entretanto, pode ser possível aumentar o período de incubação na presença de D(-) de glicose além dos 11 dias usados no Exemplo 10 para aumentar a resistência a degradação por colagenase.

Exemplo 11 Uma solução de colãgeno molecular purificado do Tipo I, pepsinizado (2.5 miligrama/mililitro) foi preparada a partir de tendões bovinos comercialmente disponíveis a partir de Pel-Freez, AR, E.U.A., dissolvida em 0.01M HCl e mantida a 4o C. Uma amostra de volume de 40 mililitros da solução incluindo 100 miligramas de colãgeno foi dializada em oposto a um volume de 4.0 litros de 0.1M de ácido acético por dois dias a 4o C. Kfo final do período de diãlise, a amostra de colãgeno dializada foi liofilizada (secagem por congelamento) em um Liofilizador comercial produzindo uma massa branca similar a uma esponja de colãgeno não fibrilar por secagem por congelamento.

Quatro amostras (amostra 1 - 4 da Tabela 10 abaixo) de aproximadamente 5 miligramas do colãgeno não fibrilar por secagem por congelamento foram colocados em tubos de teste, e tratados da seguinte maneira: Amostra 1 - foi incubada por 12 dias em uma mistura de solvente incluindo 70% (v/v) de etanol, e 30% (v/v) de PBS, Amostra 2 - foi incubada por 12 dias em uma mistura de solvente incluindo 70% (v/v) de etanol, 30% (v/v) de PBS, e 1% de D(-) de ribose (w/v).

Amostra 3 - foi incubada por 6 dias em uma mistura de solvente incluindo 70% (v/v) de etanol, 30% (v/v) de PBS, e 1% de D(-} de ribose (w/v).

Amostra 4 - foi deixada sem tratamento. Esta amostra foi usada como uma amostra de controle.

No final dos períodos de incubação especificados as amostras incubadas foram drenadas (com exceção da amostra 4 que não fora inicialmente incubada), e lavadas três vezes em PBS. Cada uma das quatro amostras foram então divididas em três porções aproximadamente iguais, e as três porções de cada uma das amostras foram então testadas para degradação por colagenase em tempos de incubação de 1 hora, 3 horas e 5 horas, conforme revelado em detalhe no Exemplo 1, acima mencionado. A concentração de colagenase usada no teste de degradação por colagenase foi de 350 unidades / ml de colagenase de degradação compensadora.

Os resultados dos experimentos do Exemplo 11 são dados na Tabela 10 abaixo. TABELA 10 NÚMERO DA AMOSTRA DEGRADAÇÃO POR COLAGENASE (%) E TIPO DE TRATAMENTO DIGESTÃO DIGESTÃO DIGESTÃO

1 HORA 3 HORAS 5 HORAS AMOSTRA 1 Etanol + PBS, 12 dias 42% 85% 100% AMOSTRA 2 Etanol + PBS + 1% de D (-) de ribose, 12 dias 12% 18% 28% AMOSTRA 3 Etanol + PBS + 1% de D(-) de ribose, 6 dias 10% 40% 63% AMOSTRA 4 Sem tratamento 84% 100% 100% Os números na Tabela 10 representam a quantidade de colágeno digerido como um percentual do peso inicial da amostra.

Os resultados do Exemplo 11 indicam que o colágeno não fibrilar também pode ser eficientemente bi-orientado pelo método da presente invenção. O colágeno liofilizado formado conforme revelado aqui acima não foi reconstituído em um colágeno fibrilar (como foi o caso com as membranas de colágeno descritas no Exemplo 1) devido a acidez da solução a qual foi mantida antes da liofilização. Todavia, o colágeno liofilizado não fibrilar preparado conforme revelado no Exemplo 11 também foi bi-orientado pelo método da presente invenção o qual significativamente aumentou sua resistência a degradação por colagenase. Isto indica que a presença de fibris de colágeno não é obrigatória, e que outras formas de colágeno além da forma fibrilar podem ser tratadas usando o método da presente invenção para aumentar sua resistência a degradação por colagenase.

Geralmente, o método da presente invenção pode ser implementado usando uma variedade de açúcares de redução diferentes ou derivados de açúcares de redução apresentados por uma da seguintes fórmulas I ou II (conforme revelado em detalhes na patente norte-americana No. 4.971.954 de Brodsky et al., e na patente norte-americana No. 5.955.438 de Pitaru et al.).

O (I) ou O (II) nas quais RI é H ou alquila mais baixa ou alquileno, um ácido amino, um peptídeo, um sacareto, uma purina ou uma base de pirímidina, uma purina fosforilada ou com base em pirimidina; n é um número inteiro entre 2-9; e p e q são cada um independentemente o número inteiro entre 0 - 8, e a soma de p e q é pelo menos 2 e não mais do que 8.

Deverá ser apreciado por aqueles com especialização na técnica que vários compostos tendo as fórmulas gerais I e II aqui acima mencionadas podem exibir taxas de reação diferentes na bi-orientação de colãgeno e que os produtos bi-orientados podem exibir vários graus diferentes de resistência a degradação.

Também deverá ser apreciado que várias modificações a realização acima mencionada será aparente para aqueles com especialização ordinária na técnica aqui demonstrada. As realizações são proporcionadas por meio de ilustração e não por meio de limitação. Por Exemplo, enquanto um único solvente é usado nos Exemplos e experimentos específicos revelados aqui acima mencionados, o método da presente invenção não está limitado ao uso de um único solvente polar. Várias combinações diferentes de vários solventes polares podem então ser usadas. Por Exemplo, pode ser possível executar a bi-orientação do colãgeno na presença de água e de mais do que um solvente polar. Em um Exemplo não limitante, uma mistura aquosa (compensadora ou não compensadora) de acetona e etanol pode ser usada, em um outro Exemplo não limitante, uma mistura quaternária de água (ou compensadora, ou salina), etanol, propanol e DMSO pode ser usada. 0 uso de misturas aquosas de uma pluralidade de solventes polares diferentes pode ser vantajoso em casos onde um indivíduo gostaria de ter uma boa sintonia da resistência a degradação da preparação de colágeno bi- orientado resultante, uma vez que o uso de uma mistura aquosa incluindo uma pluralidade de solventes polares pode facilitar a boa sintonia e controle do grau de resistência a degradação da preparação de colágeno bi-orientado.

Similarmente, aqueles com especialização na técnica deverão apreciar que a presente invenção não é limitada para o uso de um único açúcar ou derivado de açúcar de redução (tal como um ou mais compostos tendo as formulas I e II reveladas aqui acima) para a bi-orientação. Assim sendo, as preparações de colágeno fibrilar bi-orientados da presente invenção também podem ser produzidas por incubação do colágeno fibrilar com uma mistura de um ou mais açúcares de redução em uma mistura de água e um ou mais solventes polares. Por Exemplo, de acordo com um Exemplo não limitante, o colágeno fibrilar pode ser incubado com uma solução de 70% de etanol e3 30% de água incluindo 1.5% de D(-) de ribose e 3% de D{-) de glicose. Em um outro Exemplo não limitante o colágeno fibrilar pode ser incubado com uma solução de 35% etanol, 35% acetona e 30% PBS incluindo 1.0% de D(-) de ribose e 3% de D(-) de glicose. Deve se notar que o uso de combinações diferentes de açúcares de redução pode ser vantajoso uma vez que isto pode permitir um controle mais preciso da resistência a degradação da preparação final de colágeno bi-orientado. Assim sendo, o uso de tais misturas de açúcares e misturas de solventes não precisam necessariamente proporcionar uma resistência mais alta a degradação a preparação final do colágeno bi-orientado mas pode permitir um controle mais preciso das propriedades do produto.

Deve se notar adicionalmente que enquanto o fosfato compensador salino (PBS) era o compensador salino usado para executar a bi-orientação do colágeno nos experimentos, outros compensadores diferentes ou compensadores salinos ou soluções compensadoras para regular o pH e /ou a potência iônica das soluções de incubação de bi-orientação também podem ser usados para implementar os métodos da presente invenção.

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Claims

1. Método para o preparo de colágeno bi-orientado, caracterizado pelo fato que compreende a etapa de incubar o colágeno em uma solução compreendendo água, pelo menos um solvente polar miscível em água e pelo menos um açúcar de redução, para formar o colágeno bi-orientado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um solvente polar ser um solvente hidrofílico.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um solvente polar compreende pelo menos um solvente polar orgânico.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um solvente polar orgânico é um álcool.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um solvente polar orgânico é selecionado a partir do grupo que consiste de metanol, etanol, propanol, acetona, isopropanol, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido e combinações dos mesmos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um solvente polar é um álcool incluindo 1-3 átomos de carbono.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a referida solução é uma solução tamponante compreendendo um tampão.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a referida solução compreende um fosfato tamponante salino.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a referida solução compreende água em uma faixa de 15% a 95% (v/v) , no referido pelo menos um solvente polar na faixa de 5% a 85% (v/v) , e um tampão.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido colágeno é selecionado a partir de, colágeno nativo, colágeno fibrilar, colágeno fibrilar atelopeptídeo, colágeno liofilizado, colágeno obtido a partir de fontes animais, colágeno humano, colágeno recombinante, colágeno pepsinizado, colágeno reconstituído, e combinação dos mesmos.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido colágeno compreende um colágeno fibrilar reconstituído a partir de colágeno monomolecular atelopeptídeo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido colágeno é obtido pela reconstituição do colágeno monomolecular atelopeptídeo obtido a partir da digestão proteolítica do colágeno nativo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um açúcar é um composto representado por uma das seguintes fórmulas I ou II: (I) ou (Π) nas quais Rl é H ou alquila mais baixa ou alquileno, um ácido amino, um peptídeo, um sacareto, uma purina ou uma base de pirimidina, uma purina fosforizada ou com base em pirimidina; n é um número inteiro entre 2 - 9; e p e q são cada um independentemente um número inteiro entre 0-8, e a soma de p e q é pelo menos 2 e não mais do que 8.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um açúcar de redução o qual ocorre naturalmente.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um açúcar é um diose, um triose, um tetrose, um pentose, um hexose, um septose, um octose, um nanose, ou um decose.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo de glicerose, treose, eritrose, lixose, xilose, arabinose, ribose, alose, altrose, glicose, manose, gulose, idose, galactose e talose.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um açúcar é um dissacareto.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato que o referido dissacareto é selecionado a partir do grupo consistindo de maltose, sucrose, celobiose, gentiobiose, melibiose, turanose, e trealose.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que pelo menos uma substância é adicionada à solução quando a referida etapa de incubação é executada, a referida pelo menos uma substância tornando-se imobilizada no interior da referida matriz.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato que a referida pelo menos uma substância é selecionada a partir do grupo consistindo de um agente anti microbial, um agente anti inflamatório, um fator tendo propriedades de tecido indutivas, e combinações dos mesmos.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido pelo menos um açúcar é D(-) ribose, e o referido pelo menos um solvente polar é etanol.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato que a referida solução compreende água em uma faixa de 15% a 95% (v/v).

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato que a referida solução compreende água em uma faixa de 25% a 50% (v/v) e etanol em uma faixa de 50% - 75% (v/v).

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato que a referida solução compreende aproximadamente 30% de água (v/v) , e aproximadamente 7 0% etanol (v/v).

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato que a concentração de D (-) ribose na referida solução está em uma faixa de 0,1% a 5% (v/v).

26. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato que a concentração de D (-) ribose na referida solução está em uma faixa de 0,5 - 3% (v/v).

27. Método, de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente caracterizado pelo fato que inclui a etapa de lavar o referido colágeno bi-orientado depois da referida etapa de incubação para remover do referido pelo menos um solvente polar e no excesso do referido pelo menos um açúcar.

28. Método, de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente caracterizado pelo fato que inclui a etapa de desitratação do referido colágeno bi-orientado.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, adicionalmente caracterizado pelo fato que inclui a etapa de sujeitar o referido colágeno bi-orientado a um ponto crítico de secagem.

30. Método, de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente caracterizado pelo fato que inclui a etapa de secar ou secagem por congelamento do referido colágeno anteriormente a referida etapa de incubação.

31. Método, de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente caracterizado pelo fato que inclui a etapa de secar ou secagem por congelamento do referido colágeno bi-orientado.

32. Método, de acordo com as reivindicações 1-31, adicionalmente caracterizado pelo fato que inclui a etapa de remover pelo menos alguma da quantidade não reagida do referido um açúcar de redução, e remover pelo menos algum do referido pelo menos um solvente polar.

33. Matriz de colágeno bi-orientado fibrilar obtida por um processo da sua preparação a partir de colágeno fibrilar como definido no método das reivindicações 1 a 32, referido processo caracterizado pelo fato que compreende as seguintes etapas: proporcionar uma matriz compreendendo colágeno fibrilar reconstituído; e incubar a referida matriz em uma solução compreendendo água, pelo menos um solvente polar miscível em água e pelo menos um açúcar de redução para a bi-orientação do referido colágeno fibrilar para formar uma matriz de colágeno bi-orientado fibrilar.

34. Matriz, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de ser na forma de um dispositivo para um implante.

35. Matriz, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato que o referido dispositivo para um implante é um colágeno com base em uma barreira de membrana para a regeneração guiada de tecido.

36. Matriz, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato que o referido processo adicionalmente inclui a etapa de lavar a referida matriz de colágeno bi-orientado após a referida etapa de incubação para remover pelo menos alguma da referida em pelo menos um solvente polar e excesso não reagido do referido em pelo menos um açúcar de redução.

37. Matriz, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato que o referido processo adicionalmente inclui a etapa de desidratação da referida matriz de colágeno bi-orientado fibrilar.

38. Matriz, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato que o referido processo adicionalmente inclui a etapa de sujeitar a referida matriz de colágeno bi-orientado fibrilar a um ponto crítico de secagem.

39. Matriz, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato que o referido processo adicionalmente inclui a etapa de secar ou a secagem por congelamento da referida matriz de colágeno bi-orientado fibrilar.

40. Matriz, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato que o referido colágeno fibrilar compreende um colágeno fibrilar reconstituído a partir de um colágeno monomolecular atelopeptídeo.

41. Matriz, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato que o referido colágeno fibrilar é preparado pela reconstituição do colágeno monomolecular atelopeptídeo obtido pela digestão proteolítica do colágeno.