BRPI0115859B1

BRPI0115859B1 - método de obtenção de estruturas antigênicas agregadas de alta imunogenicidade, estrutura antigênica agregada, formulação de vacina e usos de uma estrutura antigênica e de formulações de vacina

Info

Publication number: BRPI0115859B1
Application number: BRPI0115859-7A
Authority: BR
Inventors: Julio César Aguilar Rubido; Eduardo Pentón Arias; Dina Tleugabulova; Minerva Sewer Mensies; Verena Lucila Muzio González; Gerard Enrique Guillén Nieto; Iioki Assanga Simon Bernard; Luis Javier Cruz Ricondo; Viviana Falcón Cama; Yanet Támbara Hernández
Original assignee: Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2020-10-13
Also published as: KR100873675B1; CN1253206C; JP2004529861A; KR20030068161A; EP1346727A2; CA2429543A1; JP4974441B2; BRPI0115859B8; ZA200303948B; WO2002043756A2; CA2429543C; PT1346727E; ES2342150T3; AU2002221518B2; EP1346727B1; US20090104223A1; CN1477972A; AU2151802A; RU2266754C2; DE60141978D1

Abstract

"MÉTODO DE OBTENÇÃO DE ESTRUTURAS ANTIGÊNICAS AGREGADAS DE ALTA IMUNOGENICIDADE, ESTRUTURA ANTIGÊNICA AGREGADA, FORMULAÇÃO DE VACINA E USOS DE UMA ESTRUTURA ANTIGÊNICA E DE FORMULAÇÕES DE VACINA". Esta invenção refere-se a um método de obtenção de estruturas antigênicas agregadas, capazes de potenciar a resposta imunológica a antígenos agregados administrados por via sistêmica e/ou mucosal, bem como às estruturas químicas, formulações de referidas estruturas e a seu uso. A partir do uso de agentes ou compostos agregadores, delipidantes ou oxidantes, permite-se a liberação de lipídeos das partículas e a agregação das mesmas. O estado de agregação pode ser provocado no interior da levedura variando-se as condições de incubação. As estruturas resultantes podem ser utilizadas adjuvadas e/ou com vários antígenos, produzindo-se sinergismo entre os componentes com relação à resposta imunogênica, podendo conter estabilizadores e conservantes. Estas novas estruturas antigênicas são aplicáveis na indústria como formulações de vacina, preventivas ou terapêuticas, para uso humano, veterinário e/ou diagnóstico.

Description

Setor Técnico

[0001] A presente invenção está relacionada com o ramo da medicina, particularmente com o uso de novas formulações de vacina.

[0002] O objetivo técnico perseguido com a invenção proposta é o desenvolvimento de um método de obtenção de estruturas antigênicas agregadas e suas formulações, capazes de potenciar a imunogenicidade dos antígenos contidos a partir da imunização sistêmica e/ou mucosal dos mesmos.

[0003] O método descrito na presente invenção gera estruturas antigênicas de natureza agregada de antígenos particulados, a adição de outros antígenos, compostos com características agregadoras, delipidantes ou oxidantes, a seleção posterior de partículas agregadas com tamanhos entre 30 e 500 nm, e a formulação de referidos agregados convenientemente adjuvados favorecem a imunogenicidade da composição antigênica resultante.

Técnica Anterior

[0004] Dado que o HBsAg é um imunógeno eficiente, converteu-se no primeiro candidato a vacina de amplo uso em humanos e na primeira vacina anti-hepatite B recombinante licenciada para uso universal. As proteínas do HBsAg se autoagrupam em partículas de 22 nm (Heerman KH, Gerlich WH, 1991 Surface protein of Hepatitis B virus. A. McLachlan, ed. CRC Press, Boca Raton, Ann Harbor, Boston, London, p.109). As bases moleculares, celulares e genéticas da resposta imunológica ao HBsAg foram estudadas extensivamente utilizando-se o modelo murino (Milich, DR. 1987. Genetic and molecular basis for T- and B- cell recognition of hepatitis B viral antigens. Immunol Rev. 99: 71). Anteriormente havia-se estudado como as alterações nas propriedades físico-químicas do antígeno de superfície afetam sua imunogenicidade para células T restringidas à MHC classe I. Evidenciou- se que, com uma única injeção de uma dose baixa de antígeno particulado de 22 nm (nativo) ou com monômeros de antígeno desnaturado por detergentes, sem adjuvantes, gera-se uma resposta primária CTL eficiente, restringida a MHC classe 1 (Schirmbeck, R. et al. 1994. Eur J Immunol. 24: 1088). Também se investigou a imunogenicidade de uma preparação de agregados do antígeno de superfície, obtidos por meio de desnaturação com calor até produzir partículas com aproximadamente 1 pm de diâmetro.

[0005] O tipo de processamento antigênico in vivo tem uma influência fundamental na eficiência da resposta primária de células T bem como no espectro de subclasses de células T involucradas. Na apresentação de peptídios no MHC operam aparentemente processos alternativos para as células T CD4+ restringidas a MHC classe II e para células T CD8+ restringidas a MHC classe I (Germain, RN. et al. 1993. Annu Rev Immunol. 11: 403). Descreveu-se uma nova via endosômica para o processamento de partículas de HBsAg exógenas para a apresentação de epítopos restringidos ao MHC classe I. Este processamento de HBsAg exógeno, desnaturado com calor e com diâmetro de Ipm, ocorre em macrófagos, porém não em outros tipos de células e está acompanhado de regurgitação de peptídeos antigênicos desde o macrófago processador. Este processo de geração de peptídeos de antígenos exógenos para apresentação restringida a MHC classe I foi designado tentativamente coma a via fagocítica. As partículas de HBsAg nativas com 22 nm são processadas fundamentalmente por via endocítica e os agregados de 1 pm por via fagocítica. Além do processamento diferente in vitro destas duas preparações exógenas do HBsAg, sua imunogenicidade in vivo para CTL classe I foi marcantemente diferente quando foram enviadas sem adjuvantes. A partícula de HBsAg nativa foi de alta imunogenicidade, enquanto que os agregados desnaturados do antígeno de superfície foram de baixa imunogenicidade (Schirmbeck, R. et al. 1995. J Immunol 155: 4676- 4684).

[0006] Outros estudos realizados utilizando a polarização da fluorescência sugerem que a partícula de HBsAg está organizada como uma bicapa lipídica que interage com agregados de proteínas (Sonveaux N. 1995 Res Virol 146 (1):43-51).

[0007] O tratamento do HBsAg com clorofórmio-metanol (2:1, v/v) ou com 50 % de l,l’,3,3’-tetrametiluréia não afetou a integridade morfológica das partículas (conservaram seu diâmetro médio), embora fosse liberada uma porção majoritária de seus lipídeos. A antigenicidade e composição polipeptídica do HBsAg não foi alterada pela delipidação (Neurath AR et al 1978 Intervirology 10(5): 265-75).

[0008] Considerando que as agregações de partículas não são produzidas nas condições de estresse em que se desenvolve o processo de produção, como a presença de agentes caotrópicos, temperaturas moderadas e soluções altamente concentradas, utilizando-se a fonte de agregação das partículas do antígeno de superfície de hepatite B recombinante utilizando-se uma combinação de técnicas de imunoafinidade e cromatografia de exclusão molecular. A investigação dos fatores que conduzem a um incremento na base do pico correspondente ao HBsAg em cromatografia de exclusão molecular proporcionou como resultado o fato de que existem agregados de partículas, além da variabilidade no tamanho da partícula do HbsAg (Tleugabulova D. 1998 J Chromatogr B Biomed Sei Appl 707(1-2):267-73, Tleugabulova D. 1997 Chromatographia 45: 317-320). Como resultado obtém-se o antígeno agregado da fração correspondente aos grandes agregados de partículas, e não na fração onde se encontrava a proteína HBsAg nativa, outro resultado deste trabalho corrobora que os agregados são formados de partículas de 22 nm que migram como monômeros e dímeros em SDS-PAGE como o antígeno de superfície corretamente dobrado (Tleugabulova D, et a/. 1998 J Chromatogr B Biomed Sei Appl 25;716(1-2): 209-19).

Descrição Detalhada da Invenção

[0009] Um dos objetos da presente invenção é um método de obtenção de estruturas antigênicas agregadas com maior imunogenicidade do que os antígenos que lhes deram origem. Referido método compreende os seguintes passos: A) Seleção dos antígenos de interesse; B) Adição de um ou de vários antígenos da mistura em um meio que favorece o processo de agregação, sendo que referido meio pode consistir de agentes químicos, agentes oxidantes ou outros componentes com capacidade agregadora C) Incubação da mistura D) Seleção dos agregados de partículas com tamanho entre 30 e 500 nm por meio de um processo que permita a retenção de referidos tamanhos moleculares, como cromatografias de exclusão molecular, diafiltração e diálise. E) Obtenção das formulações a partir da mistura das estruturas antigênicas selecionadas no passo (C) mediante a adição do adjuvante de escol, e, além disso, a potencial adição de outros antígenos, estabilizadores e conservantes.

[00010] No método da presente invenção é possível obter agregados que contêm apenas o antígeno de superfície do VHB, também com combinações do antígeno de superfície e outros antígenos homólogos ou heterólogos de natureza lipoprotéica, lipopeptídica ou lípidica, de qualquer patógeno virai, bacteriano, unicelular ou multicelular.

[00011] No método da invenção, os antígenos que fazem parte das estruturas obtidas no passo (B) podem agregar-se ao antígeno de superfície do vírus da hepatite B por meio de interações hidrofóbicas, eletrostáticas ou covalentes, gerando agregados de diversos tamanhos.

[00012] O método de obtenção de estruturas antigênicas permite a agregação do antígeno do nucleocapsídeo do vírus da Hepatite B, C, ou HIV e o antígeno de superfície do Vírus da Hepatite B, sendo que também é possível agregar antígenos procedentes de vírus e bactérias como os vírus inativados e as proteínas de membrana externa de patógenos bacterianos, como Neisseria meningitidis.

[00013] No método de obtenção das estruturas antigênicas agregadas é possível utilizar as β-ciclodextrinas como um agente químico que favorece a delipidação, associação de membranas e agregação entre as partículas presentes, sendo que outros agentes químicos são os sais de amónio a concentrações entre 10 e 50 mM, potenciados por sais metálicos de cobre e ferro, ou outros que permitem a agregação.

[00014] Outros elementos do método que apresentam atividade agregadora espontânea e que podem ser usados em conjunto ou sozinhos com esta finalidade são os antígenos homólogos ou heterólogos que evidenciaram atividade agregadora sobre o HBsAg, entre eles os antígenos de nucleocapsídeos virais e também derivados de membranas externas de bactérias ou invólucros virais de natureza lipoprotéica ou hidrofóbica. Também se verificou que adjuvantes de mesma natureza favoreceram a agregação do HBsAg e do HBsAg entre si.

[00015] Em geral, o método da presente invenção permite a agregação do HBsAg ou do HBsAg com outros antígenos ou adjuvantes a partir do desenvolvimento de interações hidrofóbicas, uniões eletrostáticas ou covalentes, em períodos de incubação numa faixa de entre 10 minutos e uma semana dependendo dos constituintes selecionados.

[00016] A separação dos agregados é realizada por meio de um método de peneiração de acordo com o tamanho molecular, compreendendo o método de cromatografia de exclusão molecular, a diálise, a diafiltração ou outro método que permita a retenção dos tamanhos moleculares entre 30 e 500 nm.

[00017] Além disso, demonstramos que, embora seja possível gerar, através de métodos não desnaturadores (temperatura máxima de 28°C), agregados com tamanhos que se encontram próximos do micrômetro, semelhantes àqueles obtidos por Schirmbeck (Schirmbeck, R. et al. 1995. J Immunol 155: 46764684), estes continuam sendo menos imunogênicos ao se avaliar a resposta humoral e DTH. Apenas os agregados de partículas com um tamanho entre 30 e 500 nm, adjuvados com alumina, mostraram gerar níveis de IgG significativamente superiores ao controle de antígeno nativo, além de um incremento significativo na resposta DTH, e de um efeito significativo no incremento da resposta IgG2a. Tudo isto evidencia a importância da seleção ulterior do antígeno por meio de cromatografia de exclusão molecular. A causa deste comportamento poderia ser dada pela diferente apresentação e/ou processamento pelo sistema imunológico daquele dos antígenos de interesse.

[00018] Posteriormente o método da presente invenção prevê a adjuvância das estruturas resultantes a adjuvantes como os sais de alumínio, cálcio, oleosos, ou outro adjuvante comercialmente utilizado, além disso é possível adicionar outros antígenos, estabilizadores e conservantes na formulação final.

[00019] Outro objeto da presente invenção consiste da estrutura antigênica agregada obtida de acordo com o método previamente descrito, o que favorece um incremento na imunogenicidade da formulação resultante e um reconhecimento diferencial pelo sistema imunológico dos epítopos involucrados. Referidas estruturas antigênicas agregadas caracterizam-se porque contêm o antígeno [de] superfície do Vírus da Hepatite B, sozinho ou em combinação com outros antígenos formando o agregado. Estes outros antígenos são lipoprotéicos ou têm caráter hidrofóbico, entre eles o HBcAg, e apresentam adicionalmente a propriedade intrínseca de favorecer o estado agregado entre si por meio de uniões hidrofóbicas. Outros antígenos de capsideo viral e lipoprotéicos ou de natureza hidrofóbica demonstraram apresentar esta capacidade, entre eles os antígenos de nucleocapsídeo do Vírus da Hepatite C, do papiloma humano e da Imunodeficiência Humana 1 e 2, além de antígenos de membrana externa de Neisseria meningitidisem vesículas proteoliposômicas e alguns antígenos de invólucros virais.

[00020] Entre as estruturas antigênicas objeto da presente invenção encontram-se as associações do HBsAg com adjuvantes de natureza hidrofóbica que podem fazer parte do agregado pelo mesmo método previamente descrito. Em geral as estruturas antigênicas objeto da presente invenção podem ser obtidas a partir da agregação de acordo com o método anteriormente descrito a partir de uma, duas ou mais partículas de natureza hidrofóbica e de pelo menos uma com caráter particulado, e são visíveis por meio de microscopia eletrônica como se descreve nos exemplos. A agregação destas estruturas favorece a modulação imunológica, o reconhecimento diferencial e o incremento da imunogenicidade de maneira geral. Considerando-se estas características das estruturas antigênicas objeto da presente invenção, é possível o uso das mesmas para o desenho racional de vacinas humanas e veterinárias, tanto preventivas como terapêuticas, através de vias sistêmicas e mucosais e seu uso em sistemas diagnósticos.

[00021] Entre as vantagens dos novos preparados resultantes mediante a utilização do método de obtenção deste tipo de antígenos encontram-se: o incremento da imunogenicidade, a possibilidade de co-aprisionamento de novos adjuvantes, imunomoduladores e antígenos durante a agregação.

[00022] Os preparados resultantes do método objeto desta invenção podem apresentar, dependendo da via de inoculação e das espécies a imunizar, volumes de 0,01 até 10 ml e a dose de antígeno pode variar entre 0,001 a 1 mg na formulação de vacina final.

Exemplos de realização Exemplo 1. Obtenção de formulações de vacina de agregados do antígeno de superfície do Vírus da Hepatite B obtidos com o uso de ciclodextrinas.

[00023] As partículas foram obtidas a partir do antígeno nativo com 22 nm por meio de tratamento controlado do antígeno com compostos químicos com atividade subtrativa de lipídeos da partícula, neste caso utilizaram as ciclodextrinas em concentrações superiores a 1 mg/ml e, dependendo, da concentração das mesmas, o tempo de incubação variou, de 24 horas a 7 dias. A temperatura de incubação utilizada neste ensaio foi de 28 °C, embora tenhamos observado que é possível obter os agregados a temperaturas maiores ou menores. A temperatura é um fator que favoreceu o processo de delipidação parcial através da oxidação e subtração de lipídeos. Posteriormente realizou-se análise por filtração em gel e microscopia eletrônica dos diferentes agregados, encontrando-se tamanhos que variaram desde as dezenas de nanômetros até partículas que precipitaram devido a seu tamanho. Logo após a centrifugação para eliminar todos os restos precipitados, o antígeno foi selecionado dependendo de seu tamanho para análise do ponto de vista imuno-químicos. Estas análises demonstraram uma diminuição do nível de lipídios com relação ao nível de proteínas. Demonstrou-se por meio de HPLC que estes agregados apresentam uma elevada estabilidade no decorrer do tempo. O tratamento controlado do antígeno com β-ciclodextrinas, entre 5-100 mg/ml durante 1-240 horas a temperaturas que oscilam entre 20-37°C, permitiu obter-se uma faixa de tamanhos que possibilitou a seleção posterior dos tempos de eluição para análises imunoquímicas.

[00024] Posteriormente, o antígeno agregado foi adsorvido em alumina à concentração final entre 0,002 mg/ml e 0,1 mg/ml e foi utilizado em ensaios de imunogenicidade.

[00025] Uma variante de incubação com ciclodextrinas em diferentes tempos e temperaturas envolveu adicionar à amostra compostos imunomoduladores, como os lipopolisacarídeos e saponinas, os quais integraram o agregado final que foi adsorvido em alumina para formar a formulação de vacina final.

Exemplo 2. Obtenção de formulações de vacina de agregados do antígeno de superfície do Vírus da Hepatite B utilizando-se agentes oxidantes.

[00026] Com a adição de substâncias químicas oxidantes ao antígeno normal possibilitou-se a delipidação de maneira controlada por tempo, concentração e temperatura do mesmo modo que as ciclodextrinas. Sais, como peroxidissulfato de amónio entre 9 e 44 mM, permitiram a geração dos antígenos delipidados a partir do antígeno de 22 nm, possibilitando um incremento de tamanho por fusão de partículas. Os tamanhos ótimos foram selecionados por meio de filtração por gel. A adjuvação foi realizada sobre alumina.

[00027] Como no exemplo 1, conseguiu-se embutir no agregado diferentes quantidades de outros adjuvantes e imunomoduladores durante a incubação.

Exemplo 3. Obtenção de formulações de vacina com estruturas químicas sobreparticuladas, obtidas por meio de modificação das condições de incubação da levedura.

[00028] As partículas foram obtidas naturalmente da levedura Picchia pastoris,selecionando-se o antígeno durante o processo de purificação com base em suas características físico-químicas. O processo de produção do antígeno é submetido a amplos tempos de cultivo, superiores a 100 horas, e a condições de estresse oxidativo. Este processo possibilita que uma parte do antígeno seja mantida em seu estado nativo de 22 nm porém uma parte importante, através do incremento das condições intracelulares de oxidação, é agregada e delipidada, como foi demonstrado com as análises de lipídeos e proteínas efetuadas nas amostras dos diferentes picos obtidos na filtração com gel. Ulteriormente separa-se a fração por meio de HPLC [lacuna] filtração com gel em colunas TSK G5000. Este material chega a constituir 10 % de todo o antígeno, e efetivamente é descartado. A adjuvação é produzida por meio de adsorção a alumina em condições semelhantes àquelas do antígeno normal. A análise de ambos antígenos demostrou que o HBsAg agrega-se num processo em que se perde uma quantidade significativa de lipídeos de todos os tipos, e na tabela a seguir analisa-se os fosfolipídeos de ambos antígenos.Composição de fosfolipídeos (FL) do HBsAg separados por sílica-gel

[00029] Com este exemplo evidencia-se que é possível obter um novo antígeno sobreparticulado com um processo de oxidação e delipidação natural. A estabilidade destes agregados estaria baseada em processos de agregação que podem ocorrer durante a eliminação de lipídeos das partículas, o que poderia expor regiões hidrofóbicas, e por meio de processos de polimerizações de proteínas entre partículas ao se expor grupos sulfidrila.

Exemplo 4. Evaluação da imunogenicidade do HBsAg agregado.

[00030] Com o objetivo de avaliar a imunogenicidade do HBsAg agregado resultante do exemplo 3, adsorvido sobre alúmina ou em PBS para a via mucosal, realizou-se um esquema de imunização com inoculações nos dias 0, 14 e 28 e extraiu-se o soro por via retroorbital no dia 42. Imunizou-se camundongos Balb/c fêmeas de 10 a 15 semanas de idade por vias intranasal e intramuscular. As doses para cada camundongo são apresentadas na tabela ao final do exemplo e os resultados na figura 1 A, a figura 1 B apresenta uma amostra dos agregados do HBsAg.

[00031] A análise estatística dos resultados foi realizada com o teste de Student: p<0,05 foi considerado diferença significativa.

[00032] Com este experimento demonstrou-se que é possível gerar uma resposta superior de IgG anti HBsAg quando se imunizou por via mucosal ou por via sistêmica, com relação ao antígeno normal, em igualdade de condições. Na mesma figura representa-se a comparação deste efeito a nível de resposta DTH (barras), que também mostrou ser significativamente superior para a variante agregada.

[00033] Os grupos de imunização são mostrados na tabela a seguir:

Exemplo 5. Cinética da resposta de IgG anti-HBsAg.

[00034] Com o objetivo de estudar a cinética da resposta de anticorpos IgG anti-HBsAg, imunizou-se 10 grupos de camundongos Balb/c fêmeas com 10-15 semanas de idade. O esquema seguido foi o seguinte: inoculação nas semanas 0, 2 e 18 e extrações pré-imunes e nas semanas 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 20. Os grupos experimentados foram correspondidos com os que são descritos na tabela a seguir:

[00035] Os antígenos dos grupos 5 e 6, 7 e 8 e 9 e 10 foram obtidos incubando-se com diferentes tempos e concentrações de ciclodextrina obtendo-se diferentes graus de agregação.

[00036] Para o experimento de DTH realizou-se as medições nos dias: 1(1,3), 2(1’, 3’), 3(1", 3") e 5(1’”, 3’”)

[00037] A análise estatística dos resultados foi realizada com o teste de Student: p<0,05 foi considerado diferença significativa.

[00038] Neste experimento confirmou-se que o antígeno de superfície do vírus da hepatite B delipidado, com graus distintos de agregação, apresenta características imunológicas que os diferenciam entre si. A maior imunogenicidade e resposta DTH não apresentou-se no antígeno de maior tamanho, mas para tamanhos embora de acordo com o comportamento da cinética de aparição dos anticorpos, [sendo que] a maior imunogenicidade ao final do experimento correspondeu à variante de maior grau de agregação. Embora se tenha observado um incremento significativo da resposta DTH nos grupos imunizados com alumina como adjuvante, em comparação com seus correspondentes imunizados em PBS, o grupo do antígeno agregado de tamanho intermediário gerou os maiores incrementos, que chegaram a ser significativos no dia 56. Na figura 2a representa-se as titulações individuais no dia 56 para todos os grupos imunizados. Também se representa nesta figura os resultados do experimento de DTH que foi realizado durante 5 dias na semana 22, utilizando-se 20 pg de HBsAg na pata direita e PBS na pata esquerda com um volume de inoculação de 20 pl. Todos os demais grupos também apresentaram uma resposta significativamente inferior quanto a diferenças de diâmetro entre a pata direita e a pata esquerda relativamente ao grupo 3 em que se inoculou o HBsAg com um nível intermediário de agregação adjuvado com alumina, sendo que sua obtenção é descrita no exemplo 3. É bom considerar que em exemplos ulteriores demonstra-se que o reconhecimento no caso das estruturas sobreparticuladas é mais amplo relativamente aos epitopos que são reconhecidos no HBsAg, de modo que este aspecto proporciona superioridade para este tipo de estruturas já que, ainda que, do grupo 5 a 10, a reatividade anti HBsAg nativo seja semelhante àquela obtida imunizando-se com o HBsAg nativo durante grande parte do tempo, também se obtém uma forte resposta contra outros epitopos presentes no antígeno agregado, ver exemplo 8, figura 4.

Exemplo 6. Avaliação da relação IgGl/IgG2a.

[00039] Com o objetivo de estudar se existiu variação na relação IgGl/IgG2a dada a relação existente com a resposta TH1/TH2, aos soros dos grupos D e E do esquema de imunização do exemplo 4, determinou-se os níveis de anticorpos anti IgGl e anti IgG2a gerados. Esta análise foi realizada para os soros da extração do dia 42. Os níveis de IgG2a foram significativamente incrementados no grupo imunizado com o antígeno sobreparticulado (50-500 nm) até se alcançar uma relação IgGl/IgG2a mais próxima a 1 com respeito ao HBsAg normal também adjuvado com alumina (Figura 4).

[00040] A relação IgGl/2a para o grupo do HBsAg normal imunizado con alumina foi 6,2 vezes superior à encontrado para o grupo do HBsAg delipidado de tamanho intermediário. Deste experimento e possível concluir que a diferente apresentação do antígeno de superfície não só gera uma alteração quantitativa, mas também qualitativa, com relação ao tipo de IgG que se potência e com relação à correlação destas variações no padrão de subclasses de IgG com incrementos na resposta celular, o que confirma as descobertas na avaliação da resposta DTH.

Exemplo 7. Estudo da reatividade anti-HBsAg nativa dos soros de camundongos imunizados com diferentes variantes antigênicas.

[00041] Logo após a imunização de camundongos com os antígenos delipidados obtidos de acordo com os exemplos 1, 2 e 3 comparou-se a reatividade destes soros com os soros de camundongo imunizados com o antígeno normal. Como resultado deste experimento observou-se que a resposta imunológica gerada por soros de camundongos imunizados com as diferentes variantes apresentaram uma reatividade diferente contra o HBsAg normal (22 nm), sendo que a maior reatividade foi apresentada pelos soros de camundongos imunizados com antígeno normal, enquanto que, a diferentes graus de delipidação, a reatividade contra o HBsAg variou. Embora existindo altas titulações contra os próprios imunógenos, soros obtidos a partir de imunização com variantes de alto grau de oxidação não reconheceram o HBsAg, o que evidenciou um reconhecimento diferente dos anticorpos gerados com os diferentes imunógenos e demonstra a diferentes natureza antigênica das novas estruturas geradas. Portanto, os resultados do exemplo 5 devem ser analisados considerando que embora se obtenha respostas semelhantes anti HBsAg nativo para as últimas três variantes de antígenos agregados, nestas também está presente a resposta contra outros epitopos que não são reconhecidos imunizando-se com HBsAg nativo e que pertencem à proteína HBsAg.

Exemplo 8. Reconhecimento de epitopos lineares de soros de antígenos imunizados com variantes diferentes.

[00042] Com o objetivo de comparar o reconhecimento dos anticorpos gerados por um antígeno sobreparticulado do HBsAg obtido pela variante de oxidação do método descrito no exemplo 2, realizou-se um mapeamento sobre membrana de celulose contendo as seqüências lineares do HBsAg (região S). Sintetizou-se 37 peptideos de 12 aminoácidos sobrepostos cada um em 6 até completar a seqüência da proteína.

[00043] O mapeamento epitópico sobre suporte de celulose foi realizado de acordo como descrito por Ronald Frank (Frank, R. 1992 Tetrahedron 48: 9217-9232) As misturas de soros foram ensaiadas a uma diluição de 1/100.

[00044] O resultado da exposição dos soros dos camundongos inoculados ao antígeno normal e às diferentes variantes agregadas do mesmo antígeno evidenciou que não existe um padrão semelhante de reconhecimento linear entre ambos os antígenos, o que permite concluir que se produz uma apresentação diferente dos epitopos B presentes na superfície do HBsAg e as variantes agregadas do mesmo (figura 4).

Exemplo 9. Formação de agregados entre o HBsAg e antígenos de nucleocapsídeo. Avaliação imunológica.

[00045] Incubou-se volumes iguais de 2 preparados contendo 0,1 mg/ml de HBsAg e HBcAg, sendo que ambos antígenos foram incubados de um dia para o outro a 4°C, posteriormente obteve-se os agregados por meio de cromatografia de exclusão molecular HPLC TSK G6000. Uma amostra destes agregados foi processada com técnicas para sua visualização por meio de microscopia eletrônica, a outra amostra foi utilizada para sua avaliação imunológica em um esquema de imunização em que camundongos Balb/C foram inoculados por via intranasal com ambos os antígenos em separado e com o agregado cuja presença foi comprovada por meio de microscopia eletrônica (Fig. 5A).

[00046] Os resultados evidenciaram que a união de ambos os antígenos agregados pela via nasal permitiu a potenciação da resposta contra o antígeno de superfície do Vírus da Hepatite B(Fig. 5B). Os grupos da figura são aqueles representados na tabela a seguir.

[00047] Obteve-se resultados semelhantes quando se utilizou para a preparação da mistura outros antígenos de capsídeos virais, como os da Hepatite C e os do Vírus da Imunodeficiência Humana.

Breve descrição das figuras

[00048] Figura 1: (A) Esquema de 3 doses (0, 2 e 4 semanas). As extrações foram realizadas na semana 6. Os três primeiros grupos foram inoculados com 50 pl por via intranasal. Os dois grupos restantes foram inoculados por via intramuscular em alumina com 100 pl. (B) HBsAg agregado (barra: 200 nm).

[00049] Figura 2: Esquema de 3 doses (0, 2 e 18 semanas). Todos os grupos foram inoculados por via intramuscular com um volume de 100 pl. Os valores de anticorpos correspondem aos da semana 8 (fig. 2a). Durante a semana 22 realizou-se a prova de DTH. A figura 2b representa o valor da DTH para os grupos 1 e 3 durante 5 dias. A figura 2c representa a cinética de incremento das titulações durante o transcurso do esquema.

[00050] Figura 3: O mesmo esquema de 3 doses (0, 2 e 4 semanas) da figura 1. Análise dos soros dos grupos D e E da extração da semana 6. Ambos os grupos foram inoculados por via intramuscular em alumina com 100 pl, o grupo D com HBsAg delipidado (50-500 nm) e o grupo E com HBsAg normal em doses iguais. No gráfico representa-se a média geométrica e intervalo da razão IgGl/IgG2a de cada camundongo de ambos os grupos.

[00051] Figura 4: Mapeamento sobre membrana de celulose contendo as seqüências lineares de peptídeos sobrepostos da região S do HBsAg. Analisaram-se combinados de soros a uma diluição de 1/100: 1, HBsAg (normal); 2, HBsAg (agregado); (3-5: anticorpos monoclonais obtidos imunizando-se com antígeno agregado; 3, clone 6; 4, clone 7; 5, clone 8); 6, soro não relacionado; 7, AcM (Hep 1). Quatro intensidades de cor representam a resposta contra os peptídeos. Branco: resposta negativa, cinza claro: resposta ligeiramente positiva, cinza escuro: resposta positiva, preto: resposta muito positiva.

[00052] Figura 5: (A) Microscopia eletrônica de agregados do HBsAg e do HBcAg, as partículas com maior densidade eletrônica no centro correspondem àquelas com o HBcAg, as outras são o HBsAg. (B) Esquema de 2 doses (0,14 dias). Análise dos soros no dia 26.

Claims

1. Método de obtenção de estruturas antigênicas agregadas de alta imunogenicidade caracterizadopelo fato de que o referido método compreende os seguintes passos: A) seleção dos antígenos de interesse, B) adição de um ou vários antígenos da mistura em um meio que favorece o processo de agregação, como agentes químicos, agentes oxidantes ou outros componentes com capacidade agregadora, C) incubação da mistura, D) delipidação da mistura, E) seleção dos agregados de partículas de tamanho entre 30 e 500 nm por meio de um processo que permita a retenção de referidos tamanhos moleculares como cromatografias de exclusão molecular, diafiltração e diálise, e F) obtenção das formulações a partir da mistura das estruturas antigênicas selecionadas no passo (E) mediante a adição do adjuvante de escol, e, adicionalmente, a adição potencial de outros antígenos, estabilizadores e conservantes.

2. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que entre os antígenos que fazem parte das estruturas obtidas no passo (B) está um antígeno de natureza lipoprotéica, lipopeptídica ou lipídica de qualquer patógeno virai, bacteriano, unicelular ou multicelular.

3. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que um antígeno que faz parte da estrutura obtida no passo (B) é o antígeno de superfície do Vírus da Hepatite B, formando um agregado constituído apenas deste antígeno.

4. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que entre os antígenos que fazem parte das estruturas obtidas no passo (B) estão 2 ou mais antígenos homólogos ou heterólogos capazes de agregarem-se ao antígeno de superfície do vírus da hepatite B por meio de interações hidrofóbicas ou covalentes, gerando agregados de diversos antígenos.

5. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que entre os antígenos que fazem parte das estruturas obtidas no passo (B) estão o antígeno do nucleocapsídeo do vírus da Hepatite B e o antígeno de superfície do Vírus da Hepatite B.

6. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que entre os antígenos que fazem parte das estruturas obtidas no passo (B) está o antígeno do nucleocapsídeo do vírus da Hepatite Ceo antígeno de superfície do Vírus da Hepatite B.

7. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que entre os antígenos que fazem parte das estruturas obtidas no passo (B) está o antígeno do nucleocapsídeo do vírus da Imunodeficiência Humana tipos 1 ou 2 e o antígeno de superfície do Vírus da Hepatite B.

8. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que entre os antígenos que fazem parte das estruturas obtidas no passo (B) estão as proteínas de membrana externa de Neisseria meningitidis e o antígeno de superfície do Vírus da Hepatite B.

9. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que entre os componentes que fazem parte do meio em que se associam os antígenos no passo (B) encontram-se as β-ciclodextrinas.

10. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que entre os componentes que fazem parte do meio em que se associam os antígenos no passo (B) encontram-se os sais de amónio a concentrações entre 10 e 50 rnM, potenciados com sais metálicos de cobre e ferro, ou outros com a mesma finalidade agregadora.

11. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que entre os componentes que fazem parte do meio em que se associam os antígenos no passo (B) encontram-se antígenos que evidenciaram capacidade agregadora como o HBcAg, e outros antígenos de nucleocapsídeo viral com capacidade para promover uma agregação espontânea.

12. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que entre os componentes que fazem parte do meio em que se associam os antígenos no passo (B) encontram-se antígenos de natureza hidrofóbica, como derivados de antígenos de superfície virais, de membrana externa de bactérias ou derivados lipídicos com capacidade para promover uma agregação espontânea ao HBsAg.

13. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que entre os componentes que fazem parte do meio em que se associam os antígenos no passo (B) encontram-se adjuvantes de natureza hidrofóbica total ou parcial com capacidade para promover a agregação espontânea ao HBsAg.

14. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que entre os componentes que fazem parte do meio em que se associam os antígenos no passo (B) encontram-se compostos químicos de qualquer natureza capazes de favorecer a agregação do HBsAg ou deste com outras estruturas químicas por meio de hidrofobicidade, ligações co valentes ou ligações eletrostáticas.

15. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o tempo de incubação do passo (C) encontra-se entre 10 minutos e uma semana dependendo do método de agregação selecionado.

16. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que no passo (E) a seleção dos agregados de partículas de tamanho entre 30 e 500 nm realiza-se por meio de cromatografia de exclusão molecular, diálise, diafiltração ou outro método que permita a retenção de referidos tamanhos moleculares entre 30 e 500 nm.

17. Método de obtenção de estruturas antigênicas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que no passo (F) obtém-se formulações a partir da mistura das estruturas antigênicas selecionadas no passo (E) com um adjuvante de escol que pode ser um sal de alumínio, de cálcio, um oleoso ou outro adjuvante utilizado comercialmente, adicionalmente é possível adicionar outros antígenos, estabilizadores e conservantes.

18. Estrutura antigênica agregada obtida pelo método como definido na reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que favorece um incremento da imunogenicidade da formulação resultante e um reconhecimento diferencial por parte do sistema imunológico.

19. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 18 caracterizadapelo fato de que o antígeno contido nos agregados é o antígeno de superfície do vírus da Hepatite B.

20. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 18, caracterizadapelo fato de que pode conter dois ou mais antígenos de forma agregada.

21. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 18, caracterizadapelo fato de que os antígenos podem ser misturas do HBsAg e outros antígenos de caráter hidrofóbico, particulados.

22. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 21, caracterizadapelo fato de que os antígenos podem ser misturas do HBsAg e do HBsAg.

23. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 21, caracterizadapelo fato de que os antígenos podem ser misturas do HBsAg e o antígeno do nucleocapsídeo do HCV.

24. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 21, caracterizadapelo fato de que os antígenos podem ser misturas do HBsAg e o antígeno de nucleocapsídeo do HPV, HCV e HIV 1 ou 2.

25. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 21, caracterizadapelo fato de que os antígenos podem ser misturas do HBsAg e outros antígenos de superfície virais.

26. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 21, caracterizadapelo fato de que os antígenos podem ser misturas do HBsAg e adjuvantes de natureza hidrofóbica.

27. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 21, caracterizadapelo fato de que os antígenos podem ser misturas do HBsAg e antígenos de natureza virai, bacteriana ou seus derivados.

28. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 21, caracterizadapelo fato de que os antígenos podem ser misturas do HBsAg e adjuvantes de natureza hidrofóbica.

29. Estrutura antigênica agregada de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de conter estruturas particuladas de forma agregada contendo uma partícula virai ou semelhante a vírus agregada a outra partícula, proteína ou adjuvante.

30. Uso de uma estrutura antigênica como definida em qualquer uma das reivindicações 18a 29, caracterizadopelo fato de que é em um sistema de diagnóstico.

31. Formulação de vacina caracterizada pelo fato de que compreende a estrutura antigênica como definida em qualquer uma das reivindicações 18 a 29, e também um adjuvante, estabilizadores e conservantes apropriados.

32. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que é de aplicação sistêmica ou mucosal.

33. Uso de formulações de vacina como definidas nas reivindicações 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que é para a prevenção de doenças infecciosas, autoimunes e câncer.

34. Uso de formulações de vacina como definidas nas reivindicações 31 e 32, caracterizado pelo fato de que é para a terapia de doenças infecciosas, autoimunes e câncer.