BRPI0116199B1 - método para concentração de gene - Google Patents

Abstract

"método para concentração de gene". a presente invenção se refere a um método onde é possível se concentrar um gene que é expresso apenas em pequena quantidade, a partir de uma mistura do gene que está sendo expresso em grande quantidade e do gene que está sendo expresso em pequena quantidade, mesmo que o gene que está sendo expresso em grande quantidade seja desconhecido.

Description

(54) Título: MÉTODO PARA CONCENTRAÇÃO DE GENE (51) Int.CI.: C12N 15/10; C12Q 1/68; C12N 1/00 (30) Prioridade Unionista: 19/12/2000 JP 2000-386025 (73) Titular(es): SUNTORY HOLDINGS LIMITED (72) Inventor(es): NAKAZATO, HIROSHI (85) Data do Início da Fase Nacional: 16/06/2003

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MÉTODO PARA CONCENTRAÇÃO DE GENE.

Campo Técnico

A presente invenção se refere a um método para concentração de um gene raro, derivado de micróbios minúsculos de amostras de DNA preparadas a partir de uma mistura de micróbios ou derivado de micróbios que são impróprios para cultura ou para concentração de um- gene raro, que é expresso em células de animais e plantas apenas em pequena quantidade, também a um gene raro obtido pelo dito método de concentração, a um método para análise , do dito gene raro, a um aparelho para concentração do gene raro e a um kit para concentração do gene raro.

Fundamentos da Técnica

Substâncias úteis produzidas pelos micróbios têm sido amplamente usadas como enzimas industriais, antibióticos, etc., enquanto 95-99% dos micróbios presentes no ambiente natural são impróprios para cultura e esses micróbios em que a cultura é impossível não foram até agora industrializados. Entretanto, substâncias úteis, como novas enzimas e antibióticos industriais, podem ser produzidos em grandes quantidades se o gene de enzimas industrialmente úteis for obtido a partir de micróbios que são impróprios para cultura ou se o gene bios sintético de substâncias úteis, tal como antibióticos produzidos pelos micróbios e o dito gene, puderem ser expressos em um hospedeiro adequado. Portanto, sua utilidade na indústria é bastante significativa.

A preparação do gene que apresenta utilidade acima mencionado a partir de micróbios, normalmente se inicia pelo procedimento em que o micróbio possuindo o gene de utilidade é isolado e cultivado, de modo a extrair o DNA do dito micróbio, após o que é preparado um acervo de genes. Principalmente, o dito acervo de genes é introduzido e expresso em um adequado hospedeiro e um transformante ativo é separado e selecionado por meio de um método apropriado. No entanto, em tal método, se consome demasiado tempo e trabalho para a preparação do gene de utilidade proveniente do micróbio que ocupa apenas uma parte de uma amostra, onde diversos micróbios são misturados> ou do micróbio que é impróprio para ser isolado e cultivado. Especialmente, quando a quantidade de micróbio tendo o gene de utilidade na mistura é pequena e ainda quando o dito micróbio é impróprio para ser cultivado, a preparação do gene de utilidade a partir do dito micróbio é substancialmente impossível. Se o gene derivado do micróbio que está presente apenas em pequena quantidade na amostra de gene ou que é derivado de micróbio que é impróprio para ser cultivado na amostra ou, em outras palavras, se o gene raro ou traço do gene puder ser relativamente concentrado, a seleção do gene de utilidade se torna diante disso eficiente, pelo que o tempo e trabalho podem ser acentuadamente economizados.

Nesse meio tempo, foi acreditado que as células que constituem o corpo humano são classificadas em 200 ou mais tipos, que cada uma dessas células apresenta um genoma comum tendo cerca de 100.000 tipos de genes e que diversas dezenas de milhares de genes são expressos, dependendo do tipo de célula.

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A pesquisa da expressão de tal gene está se tornando cada vez mais importante, não apenas para obtenção da informação concernente à função de cada gene, como também para tornar mais claro o processo da vida. Além * 5 disso, como resultado da análise detalhada que foi conduzida até agora para uma pequena quantidade de gene relativamente limitada, foi descoberto que os genes plurais atuam de uma maneira cooperativa em muitos processos de vida.

A expressão do gene é grosseiramente classificada em três classes, de acordo com a quantidade expressa. Eles constituem uma classe abundante, de cerca de 10³“⁴ cópias por célula, uma classe intermediária de cerca de 10² cópias e uma classe rara de apenas cerca de 10 cópias. Por outro lado, com relação ao tipo de gene expresso, existem cerca de dezenas de milhares de tipos por célula nos mamíferos, em que a maioria dos genes pertence a uma classe rara. Portanto, com relação ao gene expresso na célula, existem apenas poucos tipos de gene de uma classe abundante que apresenta uma quantidade bastante expressa (10³’⁴ cópias) e Cí existem muitos tipos de gene de uma classe rara tendo apenas pouca quantidade expressa (10 cópias) (ver, por exemplo, Alberts B. e outros, (1989), Molecular Bíology of the Cell, 2^a. Edição, Garland Publishing Inc.). Sob tais circunstâncias, tem havido necessidade para uma técnica, onde muitos tipos de genes, incluindo o gene raro, sejam analisados em maiores detalhes e, como resultado da condução dessa análise, sua utilização em um campo médico, tal como diagnóstico genético, tem sido esperado.

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Com relação à atual análise do gene raro, é conhecido, por exemplo, um método em que um procedimento PCR tipo multiplex é uma base que inclui um método, de canonização (Minoru S. Ητ Ko ' (199Θ-) , Nucleic Acids Res., 18, 5705-5711), um método de exibição diferencial (Liang P. e Pardee A.B.(1992), Science, 257 (967-971) e um método de índice molecular (Kikuya Kato (5), Nucleic Acids Res., 23, 3685-3690, etc) e também um método usando chips de DNA. Em um método de canonização, uma mistura de ácido nucléico de alto índice molecular é colocada sob uma condição de hibrídização e após um período adequado, o ácido nucléico ao se tornar em um estado de duplo filamento é separado daquele que permaneceu no estado de único filamento, após o que o gene raro pode ser concentrado numa quantidade do mesmo grau que o gene abundante. Entretanto, num método de canonização, não acontece após o tratamento que elementos do gene raro sejam em maior quantidade que aqueles do gene abundante e, portanto, o efeito da concentração é limitativo. No caso de análise usando um PCR multiplex, tal como é realizado o método de exibição diferencial, é conhecido que ocorre um PCR competitivo, sendo aplicado uma forte polarização à quantidade existente do gene, pelo que a sensibilidade à detecção diminui, quando comparado com o PCR comum e, consequentemente, aquela detecção do gene da classe rara se torna difícil (David J. Bertioli e outros (1995), Nucleic Acids Res., 23, 4520-4523). Como um método para superação de tais desvantagens, é divulgado um método na Patente Japonesa Publicada No. 2000/37.193, onde um gene desconhecido, presente de forma abundante em uma amostra de

5/62 ácido nucléico é removido e o gene raro é concentrado. Entretanto, tal método não é aplicável, a menos que o gene que se encontra presente de forma abundante seja um gene conhecido.

. 5 Por outro lado, o assim chamado método de subtração e os métodos modificados do mesmo, são disponíveis para identificação de gene mutante de algumas espécies de organismo (Ellen E. Lamer e E. Palmer (1984) , Cell, 37, 171-177; Ilse Wieland e outros (1990), Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 87, 2720-2724; Anne Kallioniemi e outros (1992), Science, 258, 818-821; e Nikolai Lisitsyn e outros, (1993), Science, 259, 946-951). Estes métodos são tais que entre os genes (isto é, A e B), em que a maioria dos mesmos são idênticos em dois indivíduos da mesma espécie de organismo, o gene que é diferente em termos de qualidade ou quantidade é concentrado e separado ou onde em um cDNA, preparado a partir de mRNA, nas células de mesmo tipo em dois estados·· diferentes, os genes (isto é, A e B) tendo diferentes quantidades existentes são concentrados e separados. Seus princípios se baseiam em que quando os genes em A(B), que são idênticos a Β(A) são removidos pelos genes de Β (A) por quaisquer meios, o gene específico que está presente apenas em A(B) pode ser preparado.

Consequentemente, no dito método, dois tipos de amostras de

DNA, em que a maioria dos genes ali contidos são idênticos, são inevitavelmente necessários.

Entretanto, em algumas amostras no ambiente natural (tal como, solo, água de lagos, água de rios) inúmeros tipos de micróbios estão presentes, sendo normal que a composição de micróbios varie em cada amostra, onde cada amostra possui sua composição inerente. Consequentemente, quando o gene raro derivado de um minúsculo micróbio é ai concentrado, se torna impossível preparar dois tipos de amostras de DNA, em que a maioria dos genes aí contidos - aqueles que subtraem e são subtraídos - são os mesmos, pelo que a concentração do dito gene raro usando o método de subtração acima mencionado não é possível. Uma vez que o gene raro é concentrado na amostra de cDNA, é também bastante difícil se preparar dois tipos de amostras de cDNA, em que uma amostra de cDNA contém o dito gene raro e a outra não contém o dito gene raro, onde a maioria dos genes aí contidos são idênticos. Consequentemente, é difícil se concentrar o dito gene raro através do método de subtração acima mencionado.

Divulgação da Invenção

Um objetivo da presente invenção é fornecer um método para concentração de gene raro, derivado de minúsculos micróbios que se encontram pouco presentes em uma amostra ou derivado de um micróbio que é impróprio para cultura; também um método em que o gene raro é capaz de ser concentrado a partir de diversos tipos de genes expressos em corpos de organismos, tecidos ou células de organismos, mesmo quando um gene abundante for conhecido; e ainda um aparelho e um kit para concentração do dito gene raro.

Os presentes inventores repetiram intensas pesquisas e, como resultado, imaginaram que em uma análise de Cot, usada para análise de tamanho de genoma e análise de seqüência repetitiva, a velocidade de reação para

7/62 **♦ reformatação de um duplo filamento é inversamente proporcional ao tamanho do genoma, sendo proporcional à concentração da mesma seqüência, pelo que o gene raro em uma amostra de DNA contendo gene raro e gene abundante, pode ser concentrado e confirmaram que o gene raro pode ser concentrado a partir de uma solução de mistura de DNA de Escherichia coli, DNA de Bacillus pumilus e DNA de timo de bezerro, pelo que a presente invenção foi bem sucedida.

Portanto, a presente invenção se refere ao seguinte:

(1) Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade, caracterizado em que uma amostra de DNA contendo gene que está presente em pequena quantidade e gene que está presente em grande quantidade é submetida às seguintes operações, de modo que o gene que está presente em pequena quantidade é separado do gene que está presente em grande quantidade:

(a) A amostra de DNA é dividida em duas partes iguais. Uma amostra de DNA é chamada de fração de DNA condutor, enquanto a outra amostra de DNA é chamada de fração de DNA ^Balvo;

(b) 0 DNA alvo e o DNA condutor são misturados e o DNA na solução misturada é tornado de filamento único. Alternativamente, o DNA alvo e o DNA condutor são tornados de filamento único e depois misturados.

(c) A hibridização é realizada e o DNA de filamento duplo formado pelo DNA condutor e pelo DNA alvo é removido da solução de mistura acima mencionada; e (d) As operações de (b) e (c) são realizadas uma ou

8/62 mais vezes, em que, ao invés do DNA alvo, é usada uma solução de DNA obtida em (c) , de onde o DNA de filamento duplo é removido.

’ (2) Método para concentração de gene que está presente—em pequena quantidade, caracterizado em que uma amostra de DNA contendo gene que está presente em pequena quantidade e gene que está presente em grande quantidade é submetida às seguintes operações, de modo que o gene que está presente em pequena quantidade é separado do gene que está presente lj^^em grande quantidade:

(a) A amostra de DNA é dividida em duas partes iguais. Uma amostra de DNA é chamada de fração de DNA condutor, enquanto a outra amostra de DNA é chamada de fração de DNA alvo;

(b) A fração de DNA é clivada em cada uma das frações de DNA condutor e DNA alvo. Nesse momento, o peso molecular do DNA condutor é tornado menor que o peso molecular do DNA alvo;

(c) 0 DNA condutor é rotulado. Se dese j ado, um adaptador de ligação é aderido ao DNA alvo;

(d) O DNA alvo é misturado com uma excessiva quantidade do DNA condutor rotulado, depois, o DNA na solução de mistura é tornado de filamento único, sendo realizada uma hibridização;

(e) Por meio de uma rotulação do DNA condutor, um DNA de filamento duplo, formado pelo DNA condutor e DNA alvo é removido da solução de mistura acima mencionada; e » (f) As operações de (d) e (e) são realizadas uma ou mais vezes, em que, ao invés do DNA alvo, é usada uma

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solução de DNA obtida em (e), de onde o DNA de filamento duplo é removido.

(3) Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade de acordo com os itens. _(1) ou (2) acima, em que a proporção (d/t) da quantidade misturada (d) do DNA condutor para a quantidade misturada (t) do DNA alvo é maior que 1, tal proporção sendo até de 1000.

(4) Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade de acordo com os itens <2) ou (3) acima, em que o DNA condutor é rotulado com biotina, digoxina, fluoresceína ou rodamina.

(5) Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade de acordo com os itens (2) a (4) acima, em que a extensão média de cadeia do DNA condutor é de 200300 pares de base e a extensão média de cadeia do DNA alvo é de 1000 ou mais pares de base.

(6) Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade de acordo com os itens (2) a (5) acima, em que a divagem do DNA é realizada por meio de uma enzima de restrição de reconhecimento de quatro bases para a fração do DNA condutor, e por meio de uma enzima de restrição de reconhecimento de 5-8 bases para a fração de DNA alvo.

(7) Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade de acordo com o item (6) acima, em que a divagem do DNA é realizada por meio de MspI para a fração de DNA condutor e por meio de Sse8387I para a fração de DNA alvo.

(8) Método para concentração de gene que está presente em

10/62 pequena quantidade de acordo com os itens (2) a (5) acima, em que a divagem do DNA é realizada por meio de onda ultra-sônica ou por força de cisalhamento mecânica.

(9) Método para concentração de gene que _está __p_resente em pequena quantidade, caracterizado em que uma amostra de DNA contendo gene que está presente em pequena quantidade e gene que está presente em grande quantidade é submetida às seguintes operações, de modo que o gene que está presente em pequena quantidade é separado do gene que está presente em grande quantidade:

(a) A amostra de DNA é dividida em duas. Uma amostra de DNA é chamada de fração de DNA condutor, enquanto a outra amostra de DNA é chamada de fração de DNA alvo;

(b) O DNA é clivado em cada uma das frações de DNA condutor e DNA alvo. Nesse momento, o peso molecular do DNA condutor é tornado menor que o peso molecular do DNA alvo. Se desejado, um adaptador de ligação é aderido ao DNA alvo;

(c) O DNA é tornado de filamento único em cada uma das frações de DNA condutor e DNA alvo;

(d) 0 DNA condutor que é tornado de filamento único, (como tal, é fixado sobre um veículo;

(e) O veículo onde o DNA condutor de filamento único é fixado, é contatado ou misturado com uma solução do DNA alvo tornada de filamento único, para realização de uma hibridização;

(f) O veículo e a solução são separados e o DNA alvo formador de um duplo filamento com o DNA condutor é removido; e (g) As operações de (e) e (f) são realizadas uma ou

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mais vezes, usando a solução de DNA alvo obtida em (f), ao invés da solução de DNA alvo.

(10) Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade de acordo com os itens (1) a (9) acima, em que a amostra de DNA é uma amostra de DNA que é preparada a partir de uma amostra onde pelo menos dois tipos de micróbios, corpos de organismos, tecidos ou células de organismos, são misturados ou é um ácido nucléico extraído de organismos individuais, o tecido ou ^célula de organismos e/ou amostra de DNA sendo preparados a partir do dito ácido nucléico.

(11) Amostra de DNA preparada pelo método mencionado nos itens (1) a (10) acima, caracterizada em que a proporção que existe de gene raro tendo pequena quantidade existente antes do tratamento, para o gene tendo muita quantidade existente antes do tratamento, aumenta após o tratamento.

(12) Método para análise de gene raro, caracterizado por compreender uma etapa onde o gene que existe em pequena quantidade (daqui em diante referido como gene raro) é concentrado pelo método mencionado nos itens (1) a (10)

Jpima, uma etapa em que o gene raro é obtido da amostra de DNA resultante onde o gene raro é concentrado e uma etapa em que a sequência básica do gene raro é analisada.

(13) Gene obtido a partir da amostra de DNA obtida pelo método mencionado nos itens (1) a (10) acima, onde o gene que está presente em pequena quantidade é concentrado.

(14) Aparelho para concentração de gene raro, caracterizado por compreender:

(a) um meio, através do qual o DNA em uma solução

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'f mista de DNA alvo e DNA condutor rotulado, é tornado de filamento único;

(b) um meio, através do qual a hibridização é realizada;

(c) um meio, através do qual o DNA de filamento duplo formado pelo DNA condutor e DNA alvo é removido por meio de rotulação do DNA condutor; e (d) um meio, através do qual a solução de DNA obtida em (c) , de onde o DNA de filamento duplo é removido, é usada no lugar do DNA alvo e as operações de (b) e (c) são repetidas.

(15) Aparelho para concentração de gene raro, caracterizado por compreender:

(a) um meio, através do qual o DNA condutor tornado de 15 filamento único é fixado a um veículo;

(b) um meio, através do qual o veículo ao qual o DNA condutor de filamento único é fixado, é contatado ou misturado com uma solução de DNA alvo tornada de filamento único, para realizar uma hibridização;

(c) um meio, através do qual o veículo e a solução são separados, de modo a remover o DNA alvo que forma um filamento duplo com o DNA condutor; e (d) um meio, através do qual as operações de (b) e (c) são repetidas, usando a solução de DNA alvo obtida em (c), ao invés da solução de DNA alvo.

(16) Kit para concentração de gene raro, caracterizado por compreender um meio para divagem do DNA, uma substância ou veículo rotulados, um reagente para rotulação do DNA ou para fixação do DNA ao veículo, um reagente para

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hibridização e um meio para remover um DNA de filamento duplo do DNA condutor com o DNA alvo.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra a relação entre o tamanho do genoma e Coti/2. Para ser mais específico, a figura mostra a reformatação de diversos ácidos nucléicos de filamento duplo. 0 tamanho do genoma é mostrado na parte superior do desenho em termos de proporção para os pares de nucleotídios (Shin Seikagaku Jikken Kosa, Kakusan I, página 200) .

A figura 2 mostra uma reformatação do DNA de timo de bezerro. Um Δ (triângulo aberto) mostra uma amostra onde a concentração do DNA do timo de bezerro é de 2 gg/ml;

o símbolo · mostra uma amostra onde a concentração do DNA do timo de bezerro é de 10 μg/ml; o símbolo O mostra uma amostra onde a concentração do DNA do timo de bezerro é de

600 gg/ml; O símbolo ▲ (triângulo preto) mostra uma amostra onde a concentração do DNA do timo de bezerro é de 8600 gg/ml e + mostra uma amostra onde 8.600 gg/ml de DNA de timo de bezerro são adicionados, usando 43 μg/ml de DNA de Escherichia colo rotulado por rádio como padrão interno (Shin Seikagaku Jikken Kosa, Kakusan I, página 199).

A figura 3 mostra como as operações dos Exemplos se processam.

A figura 4 (A) mostra um gel eletroforético onde μΐ da fração E/B de DNA alvo, tratada com Sse8387I foram submetidos a um procedimento de PCR, de modo que cada gene foi ampliado e 10 μΐ foram submetidos à eletroforese de gel de agarose a 3%, sob uma tensão de 100 volts, durante 40

14/62 minutos, por meio de um modo convencional, sendo manchado com brometo de etídio. Raia 1: gene de Escherichia coli; paia 2: gene de Bacillus pumilus; raia 3: gene de levedura (para referência); raia 4: DNA marcador de tamanho (100,

200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200 e 1500 pares de base da base; também idêntico daqui em diante).

A figura 4 (B) mostra um gel eletroforético onde 4 μΐ de da fração H/E/B de DNA alvo, tratada com Sse8387I foram submetidos a um procedimento de PCR, de modo que cada gene foi ampliado e 10 μΐ foram submetidos à eletroforese de gel de agarose a 3%, sob uma tensão de 100 volts, durante 40 minutos, por meio de um modo convencional, sendo manchado com brometo de etidio. Raia 1: DNA marcador de tamanho; raia 2: gene humano; raia 3: gene de Eschetichia coli; e raia 4: gene de Bacillus pumilus.

A figura 5 (A) mostra um gel eletroforético onde ácido nucléico que foi tratado com álcali e precipitado com etanol foi dissolvido em 18 μΐ de água e 1 μΐ de TE, depois foram adicionados 10 x tampão de PCR, BxlO, dNTP, rTaq e um conjunto de primers, para preparar 25 μΐ de uma solução ireacional, sendo realizado um procedimento de PCR e uma parte da solução reacional sendo submetida à eletroforese de gel de agarose a 3%, sob uma tensão de 100 volts, durante 40 minutos, por meio de um modo convencional, sendo manchada com brometo de etidio. Uma parte da solução reacional (3 μΐ) foi usada nas raias 1, 2, 4, 5, 7 e 8, enquanto para as raias 3 e 6, foi usada outra parte da solução reacional (9 μΐ) . Raia 1: 1° gene de Escherichia coli; raia 2: 1° gene de Bacillus pumilus; raia 3: 2° gene

15/62 de Escherichia coli; raia 4: 2 gene de Escherichia coli;

raia 5: 2° gene de Bacillus pumilus; raia 6: 3° gene de

Escherichia coli; raia 7; 3° gene de Escherichia coli; raia 8: 3° gene de Bacillus pumilus; e raia 9: DNA_marcador de tamanho.

A figura 5 (B) mostra um gel eletroforético onde ácido nucléico que foi tratado com álcali e precipitado com etanol foi dissolvido em 18 μΐ de água e 1 μΐ de TE, depois foram adicionados 10 x tampão de PCR, BxlO, dNTP, rTaq e um conjunto de primers, para preparar 25 μΐ de uma solução reacional, sendo realizado um procedimento de PCR e uma alíquota da solução reacional em uma quantidade equivalente sendo submetida à eletrof ore se de gel de agarose a 3%, sob uma tensão de 100 volts, durante 40 minutos, por meio de um modo convencional, sendo manchada com brometo de etídio. Raia 1: DNA marcador de tamanho; raia 2: 3° gene humano; raia 3: 3° gene de Escherichia coli; raia 4: 3° gene de

Bacillus pumilus;

A figura 6 mostra um fluxo de operações em uma modalidade do método para concentração de gene raro, de ^^acordo com a presente invenção. As linhas pontilhadas mostram o fluxo de operações no caso de identificação do estado de remoção do gene abundante.

A figura 7 mostra o resultado do

Exemplo de Teste 1 do Exemplo 2. Cada gene foi ampliado pelo DNA alvo (0°), 1°, 2° e 3° por meio de um procedimento de PCR. O gene (8 μΐ) foi submetido à eletroforese a 100

V durante 30 minutos, usando agarose 0,8% (fabricada por K.K. Nippon Gene) e manchado com brometo de etídio. Como marcador de tamanho, foi usado λ-Hind III digerido. Raia 1: DNA marcador de tamanho (λ-Hind III); raia 2: gene 0° de Escherichia coli; raia 3: gene 0° de S. shibatae; raia 4; gene 2 ° de Escherichia coli; raia 5: gene 1° de S. shibatae; raia 6: gene 2° de Escherichia coli; raia 7: gene 2° de S. shibatae; raia 8: gene 3° de Escherichia coli; raia 9; gene 3° de S. shibatae; raia 10: solução reacional de PCR não contendo nenhum DNA de molde de Escherichia coli; e raia 11: solução reacional de PCR não contendo nenhum DNA de molde de 5. shibatae.

Melhor Modo de Realização da Invenção

A presente invenção será agora ilustrada em maiores detalhes. Inicialmente, será mencionado uma análise de Cot (Koji Sawada e outros: Shin Seikagaku Jikken Koza, Kakusan I, Capítulo 10, Fractionation of Nucleic Acid by Hybridization, páginas 193-238) que se constituiu no fundamento teórico da presente invenção.

A reação de formação híbrida de um ácido nucléico de alto peso molecular segue a seguinte fórmula de reação de segunda ordem, onde uma efetiva colisão entre cadeias complementares constitui um fator de determinação de velocidade e a velocidade da reação é proporcional ao quadrado da concentração [C] do DNA de filamento único. d[C]/dt = -k[C]² (1) onde [C] é a concentração do DNA de filamento único, t é o tempo de reação e k é a constante de velocidade de reação).

Quando uma seqüência repetitiva estiver contida, como no caso de DNA de células de animais, a concentração inicial é diferente para cada seqüência, portanto, o

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progresso da reação é do tipo de fase múltipla. Quando uma das cadeias complementares se apresentar em grande excesso (20 vezes ou mais), é possível tratar como uma reação de falsa primeira ordem. .

Usando consideração cinética na reação de hibridização do ácido nucléico em fase líquida, pode ser analisada a estrutura primária do ácido nucléico, isto é, as análises de Cot e Crt. Análise de Cot é uma análise de hibridização de DNA-DNA, enquanto análise de Crt é uma análise de hibridização de DNA-DNA ou RNA-RNA, sendo esta última também chamada análise de Rot. Em 1968, Britten e Kohne analisaram cineticamente a reação de reformatação do DNA de filamento duplo do DNA de célula de animal, tendo sido inicialmente mostrado que a análise de Cot foi possível de ser utilizada para: (1) análise do tamanho do genoma (multiplicidade da seqüência básica do DNA genômico); e (2) análise de repetição da seqüência básica (R.J. Britten e D.E. Kohne, Science, 161, 529). As análises de Cot e Crt são também usadas como índices para fracionamento do ácido nucléico.

(1) Análise de Cot e tamanho do genoma

Quando a fórmula (1) é integrada e a concentração inicial é [C_o], se estabelece então:

[C]/[C_o] = 1 / d + k[C₀]t) (2) onde [C_o] é a concentração inicial do DNA de filamento único e t e k possuem o mesmo significado definido acima), e quando [C₀]t for plotado na abcissa e [C]/[C₀] for plotado na ordenada, será obtida uma curva de Cot (figura 1).

Com referência à unidade de Cot, é usado

18/62 nucleotídio mol.s/litro. Quando o peso molecular médio do nucleotídio for de 314,1 μς/κιΐ, o DNA é 3,19 x IO⁶ nucleotídio mol./litro, e portanto, [C₀]t = DNA(gg/ml) x 1,15 x IO^-2 x tempo (hr)____(3) quando isso for aproximado:

[C₀]t = DNA(A2 60) x tempo (hr)/2 (4) (na fórmula, A2 60 representa uma absorvência de 260 nm).

Quando não houver seqüência repetitiva na molécula de DNA, a curva de Cot se torna uma curva sigmóide de primeira ordem (figura 1) .

Da figura 2 é estabelecido:

([Co] - [C]J/ [C] = k[C₀]t (5) onde ( [Co], [C], t e k possuem o mesmo significado definido acima), e quando [C₀]t for plotado na abcissa e ( [Co] [C]/[C]) for plotado na ordenada, será obtida uma linha reta. A reciproca de seu gradiente é [C₀]ti/2.

[Co]ti/2 - 1/k (6) onde ti/2 mostra o tempo quando 50% do DNA de filamento único de torna um DNA de filamento duplo. [C_o] e k possuem o mesmo significado que foi definido acima.

Quando a concentração de DNA é dada em termos de concentração de nucleotídio mol, a velocidade da reação para reformatação do filamento duplo é inversamente proporcional ao tamanho do genoma e, portanto, é proporcional a [Cò] ti/₂. A partir destas fórmulas, os tamanhos de genomas de diversos organismos podem ser calculados (figura 1).

¹¹ (2) Seqüência Repetitiva (Repetida)

Quando existem seqüências repetitivas na molécula

19/62 * » * ♦ • * ♦ * de DNA, sua curva de Cot é um resultado da síntese da curva sigmóide principal para uma única seqüência e da curva sigmóide principal para cada seqüência repetitiva. No caso do DNA de timo de bezerro, a reação pode—ser—dividida em dois estágios, sendo aproximada como uma síntese de curva sigmóide principal, em que o valor de [C₀]ti/2 é de 0,03 para cerca de 4 0%, enquanto que para cerca de 60% o valor de [C_o] ti/2 é de 3000. Pode ser dito que este último é de uma seqüência única, enquanto o anterior é de uma seqüência altamente repetitiva, tendo 100.000 cópias (figura 2). Quando a reação é interrompida em um tempo apropriado e são separados o DNA de filamento único e o DNA de filamento duplo, é possível que a seqüência única e a seqüência repetitiva sejam separadas.

Agora, o DNA que é extraído de uma amostra, tal como o solo, água de lago ou água de rio, onde pelo menos dois tipos de micróbios, corpos de organismo, tecidos ou células de organismos se encontram presentes em um estado de mistura, pode ser considerado como equivalente ao genoma de um animal superior, sendo definido como metagenoma. No metagenoma, o gene derivado de micróbios, etc., que existem numa mínima quantidade, pode ser considerado como seqüência única, enquanto que o gene derivado de micróbios que existem em maiores quantidades pode ser considerado como seqüência repetitiva. A dita seqüência repetitiva é classificada em seqüência repetitiva de alto grau, seqüência repetitiva de médio grau e seqüência repetitiva 'de baixo grau, dependendo dos números existentes.

Além disso, na molécula de ácido nucléico

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extraída de organismos individuais, tecidos ou células de organismos e/ou de DNAs preparados a partir do dito ácido nucléico, ocorre também muita multiplicidade em suas quantidades existentes, como no caso do cDNA preparado a partir de mRNA e a classificação em seqüência única e seqüência repetitiva também é possível.

De acordo com a teoria acima mencionada para a análise de Cot, quanto maior for o número de cópias no DNA, mais rápida será a formação do filamento duplo e, portanto, quando uma amostra de DNA usada na presente invenção é tornada de filamento único sob uma apropriada condição, então o filamento duplo é reformatado e o DNA de filamento duplo resultante é separado e removido mediante um método adequado, pelo que o gene raro é relativamente concentrado na amostra restante de DNA de filamento único. Entretanto, o que deve ser observado é que a concentração em tal caso é

apenas relativa	e o	gene raro nunca se	torna maioria	no
final, mas, no	seu	estado mais alto,	a quantidade,	no
máximo, é quase	que	a mesma. Conforme	mencionado acima,
este é o método	que	atualmente é usado	como um método	de

canonização.

	Entretanto,	foi imaginado	que	ao seguir esse
método,	a quantidade	existente de	gene	raro pode ser
tornada	maior que a de	gene abundante	após	o tratamento, em

conseqüência do que a presente invenção foi executada.

Para ser mais específico, o método para concentração do gene de acordo com a presente invenção, é caracterizado em que uma amostra de DNA contendo gene raro e gene abundante é submetida aos seguintes tratamentos para

21/62

ΙΟ separação do gene raro do gene abundante, de modo a concentrar o gene raro. Assim, (a) a amostra de DNA é dividida em duas. Uma amostra de DNA é chamada de fração de DNA condutor, enquanto a õütra amostra de DNA é chamada de fração de DNA alvo; (b) o DNA alvo e o DNA condutor são misturados e o DNA na solução misturada é tornado de filamento único. Alternativamente, o DNA alvo e o DNA condutor são tornados de filamento único e depois misturados; (c) a hibridização é realizada e o DNA de filamento duplo formado pelo DNA condutor e DNA alvo é removido da solução de mistura acima mencionada; e (d) as operações de (b) e (c) são realizadas uma ou mais vezes, e ao invés do DNA alvo é utilizado uma solução de DNA obtida em (c), de onde o DNA de filamento duplo é removido.

Tais princípios serão ilustrados a seguir. No presente caso, o gene abundante é chamado de gene A, enquanto o gene raro é chamado de gene B. A seqüência parcial do gene A no DNA condutor e/ou seqüência específica, incluindo a seqüência envolvente da mesma, é chamada de A, enquanto a seqüência parcial do gene B e/ou seqüência específica, incluindo a seqüência envolvente da mesma é chamada de B. Com relação à A e B, a mesma seqüência está também presente nos fragmentos do DNA alvo. [Xn] significa a concentração de X quando a separação por hibridização e não-hibridização são realizadas durante n vezes. A simbologia significa a mesma quantidade ou a quantidade na mesma proporção.

Nas operações da primeira hibridização e separações por hibridização e não-hibridização, A é

22/62 acentuadamente removido e sua concentração se torna [alvo A¹] ([alvo A°] > [alvo A¹]). Por outro lado, [alvo A° + condutor A°] » [alvo B° + condutor B°] e, portanto, quando Cot for apropriado, não existirá quase nenhuma modificação no [alvo B¹] . Na hibridização seguinte, [alvo A¹ + condutor A°] [condutor A°] » [alvo B¹ + condutor B°] e, portanto, a reação é uma reação de falsa primeira ordem, que depende apenas da concentração do DNA condutor. Portanto, quando comparado com (A) , a hibridização de (B) pode ser bastante desprezível e, após a operação de separação por hibridização e não-hibridização, o alvo A será ainda removido para proporcionar [alvo A²] ([alvo A¹] > [alvo

A²]), mas não existe quase nenhuma modificação em [alvo B²] . Quando isso é repetido, irá resultar [alvo Aⁿ] « [alvo Bⁿ] [alvo B°] , em consequência do que apenas o gene B tendo B, permanece no DNA alvo.

Portanto,- a característica do método para concentração de gene raro de acordo com a presente que o condutor A recém suprido a cada invenção, é hibridização esteja sempre em uma concentração significativamente alta no sistema de hibridização e, consequentemente, que a velocidade de hibridização de A seja significativamente alta. Quando as concentrações de A e B se eqüivalem no método de canonização convencional, a probabilidade de hibridização de cada uma se torna idêntica e, portanto, não é possível que uma delas sej a posteriormente concentrada tendo prioridade sobre a outra.

* No entanto, em conformidade com a presente invenção, uma vez que a concentração do condutor A é significativamente

23/62

/] • · · · · · * · · • ··· ··♦ · ··· ·· ·· superior em todas as vezes, é possível se concentrar até que o gene B se torne numa maior quantidade que o gene A, conforme mostrado abaixo.

(i) No caso [alvo A] » [alvo B] (no caso da primeira 5 operação)

Nesse caso, o condutor A está presente em grande quantidade em um sistema de hibridização em que o DNA alvo e o DNA condutor são misturados e, portanto, a possibilidade de que o condutor A efetivamente colida com o alvo A para hibridizar é bastante superior que no caso de B. Quando o DNA de filamento duplo formado pelo DNA condutor e DNA alvo é seletivamente removido, o alvo A pode ser eficientemente removido, enquanto o alvo B é raramente removido, porém permanece no sistema. Consequentemente, é possível de separar o gene A (gene abundante) e o gene B (gene raro) , de modo a concentrar o gene B (gene raro) .

(íi) [alvo A] = ~ [alvo B] (quando a operação é repetida).

Mesmo que a concentração repetida seja ainda realizada e o alvo Aⁿ e alvo Bⁿ sejam equivalentes, a concentração do condutor A recém fornecido é i significativamente maior no novo sistema de hibridização, em que essa solução e o DNA condutor são misturados e, portanto, a possibilidade de uma efetiva colisão do alvo A com o condutor A é bastante superior que a probabilidade de uma efetiva colisão do alvo B com o condutor B. Consequentemente, o alvo A que é hibridizado com o condutor A é removido e a maior parte do alvo B permanece no sistema. Portanto, o gene B (gene raro) pode ser concentrado até que sua quantidade se torne maior que a

24/62 quantidade do gene A (gene abundante).

Com relação à amostra de DNA usada na presente invenção, não existe uma particular limitação, podendo ser usada qualquer amostra. Exemplo disso é uma amostra de DNA que é extraída de uma amostra onde pelo menos dois ou mais tipos de micróbios, organismos, tecidos ou células de organismos, são misturados. Portanto, é possível se utilizar o DNA extraído de uma amostra que apresenta uma composição de micróbio inerente, obtida do ambiente natural, como o solo, água de lagos ou água de rios, sem separação da cultura do micróbio. O método para concentração de minúsculos micróbios de acordo com a presente invenção, apresenta uma tal vantagem, que o mesmo é aplicável a uma amostra tendo também tal composição intrínseca de micróbio.

A amostra de DNA usada na presente invenção pode ser uma amostra de DNA que se constitui de ácido nucleico extraído de organismos individuais, tecidos ou células de organismos e/ou uma amostra de DNA preparada a partir do dito ácido nucléico. Como exemplos se incluem os tecidos, onde um tecido inflamado e um tecido normal são misturados; células ou micróbios, onde células cancerosas e células normais são misturadas; e -uma amostra de cDNA, preparada a partir de mRNA e/ou de DNA extraído de uma mistura de células infectadas por vírus e células não-infectadas. Além disso, a amostra de DNA pode ser uma amostra de cDNA preparada a partir de mRNA, onde diversos tipos de genes são expressos nas células.

Com relação a um método para extração de DNA,

25/62 • « · · · · · · · · ···«»··»* ·«···· ····· « ·« ♦ · · · · • ··» ··· « ··· ·· ·· /p pode ser usado um método que seja conhecido per si, como um método de SDS alcalino, um método centrífugo e uma combinação dos mesmos. É também possível apropriadamente se usar um kit de extração de DNA comercialmente disponível.

Como modalidade da presente invenção pode ser exemplificado um método, em que: (la) uma amostra de DNA é dividida em duas (onde uma amostra de DNA é chamada de fração de DNA condutor e a outra é chamada de fração de DNA alvo) ; (lb) o DNA alvo e o DNA condutor são misturados e o DNA na solução misturada é tornado de filamento único ou, alternativamente, o DNA alvo e o DNA condutor são tornados de filamento único e depois misturados; (1c) é realizada a hibridização e o DNA de filamento duplo formado pelo DNA condutor e DNA alvo é removido da solução misturada acima mencionada; e (ld) as operações de (lb) e (1c) são realizadas uma ou mais vezes, e ao invés do DNA alvo é usado uma solução de DNA obtida em (lc), de onde o DNA de filamento duplo é removido, pelo que o gene abundante é separado do gene raro e o gene raro é assim concentrado.

Na operação (la) acima, a amostra de DNA pode ser livremente dividida em duas. Uma das amostras de DNA é chamada de uma fração de DNA condutor, enquanto a outra amostra de DNA é chamada de fração de DNA alvo. Entretanto, quando a amostra de DNA é apenas um pouco disponível, é preferido que, levando em consideração a proporção de mistura do DNA alvo e do DNA condutor na operação (lb) , a divisão em dois é conduzida de modo a fazer com que a quantidade da fração de DNA condutor seja maior. Além disso, quando a quantidade total de DNA não é suficiente, é

26/62 * * * * L 7 | • ·· ·· I j também possível que a mesma sej a previamente ampliada por meio de um procedimento de PCR, separada na fração de DNA alvo e fração de DNA condutor e submetidas às operações seguintes. Quando em tal caso apenas a fração de DNA condutor é ampliada pelo procedimento de PCR, a diferença do grau ampliado, dependendo da seqüência, irá proporcionar uma inclinação complicada para a seqüência que será concentrada posteriormente.

Na operação (lb), é preferido se misturar uma excessiva quantidade do DNA condutor ao DNA alvo. Isso se deve ao fato de que quando uma excessiva quantidade do DNA condutor é adicionada, o gene abundante pode ser eficientemente removido. Para ser mais específico, é apropriado que a proporção (d/t) da quantidade de mistura (d) do DNA condutor para a quantidade de mistura (t) do DNA alvo seja maior que 1 mas inferior a 1000, preferencialmente cerca de 10-1000, mais preferencialmente de cerca de 100-1000. Quando, especialmente, a quantidade de mistura do DNA condutor for maior, o tempo para hibridização poderá ser mais curto. Consequentemente, no caso em que, por exemplo, a amostra de DNA não for suficientemente disponível na presente invenção, é ainda apropriado que a proporção de mistura acima mencionada (d/t) seja maior que 1 mas inferior a 10 ou, mais preferencialmente, que seja cerca de 10.

Com relação ao método para fabricação de DNA de filamento duplo, pode ser usado um método que seja conhecido per si, por exemplo, ser aplicado um aquecimento de cerca de 94 °C durante cerca de 1 minuto ou ser aplicado

27/62 um tratamento alcalino, pelo que é preparado um produto de filamento único, embora as condições mencionadas nos Exemplos sejam preferidas. Alternativamente, é também possível que um produto de filamento único sej a preparado após mistura do DNA alvo e DNA condutor ou que, antes da mistura, cada DNA condutor e DNA alvo sejam tornados de filamento único.

Na operação (lc) acima mencionada, o DNA alvo e o DNA condutor são hibridizados. As condições de hibridização podem ser conforme um método que seja conhecido per si, embora as condições mencionadas nos Exemplos sejam preferidas. Na presente invenção, a hibridização do DNA alvo com o DNA condutor também inclui um estado em que o DNA condutor é hibridizado a uma parte do DNA alvo e um estado em que diversos DNAs condutores são hibridizados ao DNA alvo.

Após isso, um DNA de filamento duplo em que o DNA alvo e o DNA condutor são hibridizados, é removido. Ao me smo t empo, um DNA de f i 1 amento dup 1 o, em que o s DNAs condutores são hibridizados, também pode ser removido. Com relação ao método para remoção do DNA de filamento duplo em que o DNA alvo e o DNA condutor são hibridizados, pode ser usado um método que seja conhecido per si, tal como, por exemplo, um método de batelada usando hidroxiapatita, um método de coluna cromatográfica e um método específico de gravidade centrífuga, usando CsCJ. ou similar.

Como resultado da operação (lc) acima mencionada, o. gene abundante é removido e o gene raro é concentrado. Entretanto, é preferido que, a fim de remover totalmente o

28/62 t ♦· • ♦ · » · · • »<· ·

2) gene abundante, que as operações de (lb) e (lc) sejam realizadas usando uma solução de DNA, da qual um DNA de filamento duplo obtido em (lc) seja removido, ao invés da operação de (ld) , onde é usado o DNA alvo, sendo mais preferido repetidamente realizar pelo menos a operação (ld) uma ou mais vezes.

Outra modalidade preferida da presente invenção consiste em um método para concentração de gene raro, mediante separação de gene raro de gene abundante, compreendendo o exposto a seguir. Assim, (2a) uma amostra de DNA é dividida em duas partes iguais (em que uma amostra de DNA é chamada de uma fração de DNA condutor e a outra amostra de DNA é chamada de uma fração de DNA alvo); (2b) o

DNA é clivado em cada uma das frações de DNA condutor e DNA alvo, de modo que o peso molecular do DNA condutor seja tonado inferior ao peso molecular do DNA alvo; (2c) o DNA condutor é rotulado e, se desejado, um adaptador de ligação é aderido ao DNA alvo; (2d) o DNA alvo é misturado com uma excessiva quantidade do DNA condutor rotulado, então o DNA na solução misturada é tornado de filamento único, sendo realizado uma hibridização; (2e) por meio de rotulação do DNA condutor, um DNA de filamento duplo, formado pelo DNA alvo e DNA condutor é removido da solução misturada acima. Ao mesmo tempo, um DNA de filamento duplo formado pelos DNAs condutores e um DNA condutor de filamento único são também removidos. Após isso, (2 f) as operações de (2d) e (2e) são realizadas uma ou mais vezes, onde, ao invés do DNA alvo, é usada uma solução de DNA obtida em (2e) , de onde o DNA de filamento duplo é removido.

29/62

Com relação a um método para divagem do DNA na operação (2b) acima mencionada, pode ser usado um método que seja conhecido per si, tal como, por exemplo, o tratamento com enzima de restrição, tratamento com onda ultra-sônica e força de cisalhamento físico. Quando a divagem é realizada usando uma enzima de restrição, é possível se clivar em fragmentos de DNA de um desejado tamanho mediante uso de enzimas de restrição, onde o reconhecimento dos pares de base é diferente. Por exemplo,

quando é usado um	reconhecimento	Not I de 8	bases,	a
extensão presumível	de fragmentos	é de 65.536	pares	de
base, correspondendo	em média a	cerca de 60	genes	do
micróbio. Quando se	deseja uma divagem um pouco	menor,	é

usado um reconhecimento Cpo I de 7 bases e, uma vez que um 15 par de base é A ou T, uma extensão média presumida é de 4⁶ x 2 = 8.192 pares de base, a resultante extensão contendo

7-8 genes.

Geralmente, quando o DNA alvo é tornado maior, pode ser obtido um produto em que os genes são conectados em grandes quantidades. Consequentemente, com relação ao ^^DNA alvo, é preferido aquele em que uma extensão de cadeia média é de cerca de 1000 pares de base ou mais. É freqüente que o gene correlacionado a um certo sistema metabólico prepara um agrupamento de genes, em que os ditos genes são conectados em grandes quantidades e, portanto, o método de acordo com a presente invenção é de utilidade para a preparação de agrupamentos de genes. Nesse momento, embora o, tamanho do DNA condutor possa ser equivalente ao do DNA alvo, é preferido que seja pequeno, uma vez que a

30/62 eficiência e especificidade da hibridização são melhoradas devido a isso. Para ser mais específico, o tamanho deve ser de cerca de 200-300 pares de base, que é o tamanho (extensão da cadeia) do DNA comumente usado para realização da análise de Cot. Quando o tamanho (extensão da cadeia) do DNA é demasiadamente longo, a constituição da seqüência no DNA de filamento único se torna de tal modo complicada que em algumas partes existe uma seqüência similar, enquanto que em outras partes, existe uma seqüência única. Consequentemente, o tamanho mencionado acima é o tamanho preferido.

A fim de tornar o peso molecular do DNA condutor inferior ao do DNA alvo, é preferido que a divagem de DNA seja realizada na operação (3a), em que a enzima de restrição que reconhece 4 bases seja usada para a fração do DNA condutor, enquanto que para a fração do DNA alvo seja usada uma enzima de restrição que reconhece 5-8 bases. Na fração de DNA condutor é mais preferido clivar o DNA por meio de um Msp I que reconhece 4 bases, enquanto que para a fração de DNA alvo é preferido um Sse8387I que reconhece 8 bases.

É preferido que o DNA condutor sej a previamente rotulado, antes que a hibridização sej a realizada (operação (2c) ) . Como resultado da rotulação, existe uma vantagem de que um DNA de filamento duplo, em que o DNA condutor e o DNA alvo são hibridizados, pode ser eficientemente removido. Para a rotulação do DNA condutor, qualquer método conhecido per si pode ser usado, desde que sej a capaz de separar o DNA rotulado e o DNA não-rotulado. Além da

31/62 avidina que é usada no Exemplo, é também possível se usar, por exemplo, digoxina, fluoresceína, rodamina, etc.

Na remoção do DNA de filamento duplo, formado a partir do DNA condutor e DNA alvo, da solução mista (operação (2e), a remoção poderá ser realizada por um método que se j a conhecido per si, dependendo do rótulo. Quando, por exemplo, é usada a biotina como rótulo, Dynabeads, a qual a avidina está ligada, é capaz de remover um DNA de filamento dup 1 o em que o DNA alvo e o DNA condutor são hibridizados. Um método em que um anticorpo antirotulado é usado, pode também ser aqui exemplificado.

É também possível que, após o DNA alvo ser fragmentado, ser adicionado um adaptador de ligação ao mesmo (operação (2c)). Como resultado disso, a ampliação por meio de um procedimento de PCR e integração em um vetor de clonagem após a operação de concentração, pode ser feita de modo mais fácil.

No contexto geral, com relação a outras operações, elas são idênticas que as acima mencionadas (la)-(ld).

Ainda outra modalidade preferida da presente invenção, é um método para concentração de gene raro, em que o gene raro é separado do gene abundante de uma maneira tal que: (3a) a amostra de DNA é dividida em duas (em que uma amostra de DNA é chamada de fração de DNA condutor, enquanto a outra amostra de DNA é chamada de fração de DNA alvo; (3b) o DNA é clivado em cada uma das frações de DNA condutor e DNA alvo, de modo que o peso molecular do DNA condutor é tornado inferior ao do DNA alvo e, se desejado,

4?

32/62 um adaptador de ligação é aderido ao DNA alvo; (3c) o DNA é tornado de filamento único em cada uma das frações de DNA condutor e DNA alvo; (3d) o DNA condutor que é tornado de filamento único, como tal, é fixado sobre um veículo; (3e) o veículo onde o DNA condutor de filamento único é fixado, é contactado ou misturado com uma solução de DNA alvo, feita em filamento único, para realizar uma hibridização;

(3f) o veículo e a solução são separados e o DNA alvo que

O forma um filamento duplo com o DNA condutor é removido; e 10 (3g) as operações de (3e) e (3f) são realizadas uma ou mais vezes, usando uma solução de DNA alvo obtida em (3f) , ao invés da solução de DNA alvo.

A fim de eficientemente remover o DNA de filamento duplo, no qual o DNA condutor e o DNA alvo são hibridizados, é também preferido que o DNA condutor seja previamente fixado ao veículo, antes da hibridização, ao invés da rotulação com o DNA condutor (operação (3f) . Com relação a um método para fixação do DNA condutor ao veículo, pode ser usado um método que seja conhecido per si. Exemplos de tais métodos incluem o método em que a fixação é adsorvida com uma membrana de nitrocelulose ou náilon e um método em que a fixação seja fisicamente adsorvida sobre a superfície de vidro, a qual é tratada com silano. Outro exemplo é um método em que o DNA condutor acima, rotulado com biotina é fixado sobre um veículo em que a estreptavidina é feita numa fase sólida.

Quando o DNA condutor é fixado ao veículo como tal, é possível que a maior parte do DNA de filamento duplo formado pelo DNA condutor e DNA alvo, ou, em outras

33/62 palavras, um gene abundante, seja facilmente removido da solução de DNA alvo pela separação do veículo e da solução de DNA alvo (operação (3f)).

A fim de remover o gene abundante com uma satisfatória precisão nesse momento, é também efetivo que a remoção sej a realizada junto com o exame do estado de remoção do gene abundante. Portanto, na presente invenção, é também possível se usar, por exemplo, um método em que o grau de remoção do gene abundante seja monitorado, usando uma solução de DNA de filamento duplo removida ou usando uma solução de DNA de filamento duplo recuperada e, se desejado, pode ser realizada uma operação (2f) ou (3g), onde o gene abundante restante é removido. Tal método pode ser uma combinação de um método conhecido per si e uma modalidade específica é mostrada na figura 6. Até que o DNA de filamento duplo hibridizado seja removido, a mesma operação que a descrita acima, é realizada. É usada a solução de DNA de filamento duplo removida e o gene abundante é então detectado por meio de um método que é conhecido per si. Quando resulta em que o gene abundante mão é substancialmente detectado ou que a dita quantidade é suficientemente diminuída quando comparado com a concentração do gene abundante na solução de DNA de filamento duplo inicialmente removida, isso significa que o gene abundante na solução se encontra em pequena quantidade, não sendo, portanto, necessário realizar a posterior operação (2f) ou (3g), mas, é possível realizar a etapa, para obtenção do gene raro. Ao contrário, quando o resultado inverso é obtido, é preferido realizar as

34/62

*	» ♦ ···»·· · ·'
operações (2f) ou (3g) acima mencionadas.
A fim de monitorar o grau de	eficiência	de
remoção de tal gene abundante, é possível	se estimar	a
quantidade de gene abundante que usa	uma seqüência
(seqüência comum), que é comum aos genomas	de espécies	de
organismos que existem em grande quantidade como	um
marcador. A fim de medir a quantidade	existente	da
seqüência comum, é possível se utilizar	um método	de

hibridização em que a seqüência comum é uma sonda ou um PCR, onde a seqüência comum é um primer. Com relação à seqüência comum, uma seqüência comum que existe no gene codificador de rRNA (rDNA) é preferido, no caso do DNA que é extraído de uma amostra onde vários tipos de organismos são misturados. Isso é porque, pelo fato das seqüências básicas de rDNA serem conhecidas para muitas espécies de organismo, é fácil descobrir a seqüência comum para rDNA e, além disso, uma vez que os números de cópias de rDNA por genoma são altos, a seqüência comum no rRNA é vantajosa como marcador. Quando as espécies de organismos que existem em grandes quantidades são limitadas, tais como aquelas que são limitadas aos procariotos, ocorrerá a existência de muito mais seqüências comuns. Quando as espécies de organismos são ainda limitadas, como para os actinomices, ocorrerão ainda mais seqüências comuns. Não há nenhuma necessidade de que a seqüência comum seja limitada ao rDNA, mas pode ser uma seqüência comum no genoma de espécies de organismos que existem em grandes quantidades, tal como a seqüência comum que existe no gene codificador da proteína que se encontra comumente presente nas ditas espécies

35/62 ··«··· « · · · · · · · orgânicas. Por exemplo, uma vez que o gene citocromo C está presente em todas as espécies de organismos e sua seqüência básica é conhecida na maioria das espécies de organismos, a seqüência comum que existe no gene de e-i-toc-romo C é apropriada como marcador.

Quando o gene abundante na amostra de DNA é derivado de organismos individuais, tecidos ou células de organismos de idênticas espécies de organismos, o gene que é específico às ditas espécies de organismos pode ser usado como marcador para estimar a quantidade de gene abundante. Quando a amostra de DNA é derivada de cDNA proveniente de organismos individuais, tecidos ou células de organismos de espécies idênticas de organismos, o gene tendo uma quantidade acentuadamente expressa, pode ser usado como marcador.

É preferido que o número de repetição das operações (2 f) ou (3g) não sej a decidido uniformemente, mas, levando em consideração o valor de Cot, frações de diversos DNAs recuperados nas frações de DNA que são recuperadas pelas operações para N vezes, são submetidas às operações de preparação do gene. Isso é devido ao fato de que como resultado de tal situação, existe a possibilidade de obtenção de gene útil proveniente de diversas frações de DNA, tendo diferentes concentrações existentes para cada um dos genes dos micróbios/organismos, em que os números existentes na primeira amostra, são diferentes. Como a repetição da operação continua, o gene em quantidade mínima pode ser obtido mais facilmente.

Uma modalidade mais preferida da presente

36/62

invenção é um método que será mencionado a seguir. Assim, (4a) a amostra de DNA é dividida em duas partes iguais (em que, uma amostra de DNA é chamada de fração de DNA condutor, enquanto a outra amostra de DNA é chamada-- de— fração de DNA alvo); e (4b) é usada uma enzima de restrição e no caso da fração de DNA alvo, a mesma é clivada dentro de um DNA longo (DNA alvo) , em que a extensão média de cadeia é de cerca de 1000 pares de base ou mais e de um DNA curto (DNA condutor) , em que a extensão média de cadeia é de cerca de 200-300 pares de base. (4c) O DNA condutor é quimicamente biotinilado. (4d) O dito DNA condutor biotinilado [sua quantidade mista (d) ] e o DNA alvo [sua quantidade mista (t)], são misturados de modo a fazer com que a proporção (d/t) seja maior que 1, mas não superior a

1000 ou, preferencialmente, cerca de 10, pelo que o DNA na dita solução mista é tornado de filamento único e a hibridização é realizada numa fase líquida. (4e) Avidina (Dynabeads) é adicionado à solução mista, pelo que o DNA de filamento duplo formado pela hibridização do DNA condutor e

DNA alvo é removido. Assim, a biotima que é aderida ao DNA condutor forma um complexo com a avidina. Portanto, o DNA alvo hibridizado ao DNA condutor é capturado pelo produto Dynabeads. Uma vez que o produto Dynabeads pode ser facilmente removido mediante separação por centrifugação, o

DNA de filamento duplo, formado pela hibridização do DNA condutor e DNA alvo, pode ser facilmente removido, junto também com o produto Dynabeads. Nesse momento, o DNA de filamento duplo formado pelos DNAs condutores e DNA condutor de filamento único é também removido. (4f) As

operações de (4d) e (4e) são realizadas uma ou mais vezes, usando o líquido sobrenadante obtido em (4e), ao invés do DNA alvo.

Quando é utilizado o método para concentração de gene mencionado acima de acordo com a presente invenção, é preparada uma amostra de DNA que é caracterizada em que a proporção existente de gene raro antes do tratamento, em relação ao gene abundante, aumenta após o tratamento. 0 gene raro pode ser preparado a partir de tal amostra de DNA. Na preparação, pode ser usado um método que seja conhecido per si, tal como o método descrito na publicação Molecular Cloning 2^a. Edição, Cold Springer Harbor Laboratory (1989). Um kit comercialmente disponível pode também ser usado. Quando a seqüência do adicionado adaptador de ligação é usada nesse momento, é possível facilmente clonar através de um método que seja conhecido per si. Com relação ao gene raro preparado, sua seqüência básica pode ser decodificada na forma em que a mesma se encontra ou após integração em um vetor apropriado e submissão à subclonagem, podendo ser realizada a ^^ecodíficação da seqüência básica. A decodificação da seqüência básica pode ser realizada por meio de um método que seja conhecido per si, como aquele baseado no princípio do método de Maxam-Gibert, ou método de Sangar ou, alternativamente, podendo ser usado um sequenciador de DNA comercialmente disponível.

A presente invenção fornece ainda um kit para concentração do gene raro na amostra de DNA acima. Para ser mais específico, é preferido um kit compreendendo meios

38/62 para divagem do DNA, uma substância ou veículo de rotulação, um reagente para rotulação do DNA ou um reagente para fixação do DNA ao veículo, um reagente para hibridização e meios para remoção de um DNA de filamento duplo formado pelo DNA condutor e DNA alvo. Na presente invenção, a substância ou veículo rotulado, é usado para rotulação do DNA condutor ou para fixação do DNA condutor, de modo que o DNA de filamento duplo, formado pela hibridização do DNA condutor e DNA alvo, é facilmente removido. A expressão reagente para rotulação do DNA significa um reagente que é usado para rotulação do DNA condutor e a expressão reagente para fixação do DNA ao veículo significa um reagente que é usado para fixação do DNA condutor. Para ser mais específico, os reagentes que foram mencionados no método acima para concentração do gene raro podem ser apropriadamente usados. Com relação à constituição, forma, etc., do kit, uma técnica que seja conhecida per si pode ser usada.

A presente invenção proporciona ainda um aparelho para concentração de gene raro numa amostra de DNA. Para ser mais específico, é fornecido um aparelho para concentração de gene raro que é caracterizado por compreender (a) meios para que um DNA numa solução mista de DNA alvo e DNA condutor rotulado, seja tornado de filamento único; meios para que seja realizada uma hibridização; (c) meios para que o DNA de filamento duplo, formado pelo DNA condutor e DNA alvo, seja removido por meio de rotulação do DNA condutor; e (d) meios para que a solução de DNA obtida em (c), de onde o DNA de filamento duplo é removido, seja usada no lugar do DNA alvo e as operações de (b) e (c) sejam repetidas. Cada um desses meios são idênticos aos da descrição concernente ao método acima mencionado para concentração do gene raro. A combinação de tais meios pode ser feita de acordo com um método que seja conhecido per si. É também possível que: (a) meios para que o DNA seja clivado em cada fração do DNA condutor e fração do DNA alvo, de modo que o peso molecular do DNA condutor seja tornado inferior ao do DNA alvo; (b) meios para que o DNA condutor seja rotulado; ou (c) meios para que um adaptador de ligação seja fixado ao DNA alvo, podem ser ainda aqui combinados.

Outra modalidade do aparelho para concentração do gene raro numa amostra de DNA de acordo com a presente invenção, é um aparelho para concentração de gene raro que é caracterizado por compreender (a) meios para que o DNA condutor, tornado de filamento único seja fixado ao veículo; (b) meios para que o veículo ao qual o DNA condutor de filamento único é fixado, seja contactado ou misturado com uma solução do DNA alvo tornado de filamento único, para realização de hibridização; (c) meios para que o veículo e a solução sejam separados, de modo a remover o DNA alvo que forma um filamento duplo com o DNA condutor; e (d) meios para que as operações de (b) e (c) sejam repetidas usando a solução de DNA alvo obtida em (c) , ao invés da solução de DNA alvo. Cada um desses meios são idênticos aos da descrição concernente ao método acima mencionado para concentração do gene raro. A combinação de tais meios pode ser feita de acordo com um método que seja

40/62 conhecido per si. É também possível que: (a) meios para que o DNA seja clivado em cada fração do DNA condutor e fração do DNA alvo, de modo que o peso molecular do DNA condutor seja tornado inferior ao do DNA alvo; (b) meios para que um adaptador de ligação seja aderido ao DNA alvo, ou (c) meios para que o DNA seja tornado de filamento único em cada uma das frações de DNA condutor e DNA alvo.

Exemplos

A presente invenção será agora especificamente ilustrada por meio dos seguintes Exemplos, sem que seja, entretanto, limitada pelos mesmos.

Exemplo 1

O DNA da linhagem B de Escherichia coli foi adquirido da Sigma Co. (USA) e o DNA de genoma humano da 15 Clontech Laboratories Inc. (USA). O DNA do Bacillus pumilus foi preparado a partir do micróbio usando Gen Turukun (nome comercial, fabricado pela empresa Takara Shuzo).

Nos presentes Exemplos, as seguintes enzimas de restrição, tampões, reagentes, etc., foram usados. 0 uso de cada enzima de restrição, reagente, etc., foi realizado de acordo com as Diretrizes de Uso do Produto.

(a) MspI (fabricado pela empresa Takara Shuzo): 10 unidades/μΐ [solventes: KPO4 10 mM; NaCl 200 mM, EDTA 1 mM; ditiotreitol (DTT) 1 mM; albumina de soro bovino a 0,02% (daqui em diante referida como BSA) e glicerol 50% (pH 7,5) ] ;

(b) Sse8387I (fabricado pela empresa Takara Shuzo):

' Tris-HCl 10 mM (pH 7,5); MgCl₂ 10 mM; DTT lmM; NaCl 50 mM e

BSA 100 μg/ml;

41/62 * a · ·· (c) TE: Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 (d) 10 x M: Tris-HCl 100 mM (pH 7,5); MgCl₂ 100 mM; DTT 10 mM e NaCl 500 mM;

(e) 10 x Tampão A de rotulação Mirus (Mirus): MOPS 200 5 mM, pH 7,5;

(f) 20 x SSC: NaCl 3M e Na₃-Citrato 0,3 M;

(g) formamida: após adição de AG501-x8, malha 20-50, totalmente regenerada (BioRad Lab., USA), a mistura foi homogeneizada mediante rotação durante uma noite e o líquido sobrenadante resultante foi usado;

(h) W x B: Tris-HCl 5 mM; EDTA 0,5 mM e NaCl 1M;

(i) Dynabeads (Dynabeads M-280 Streptavidin, Japan Dynal K.K.): Uma suspensão (1 ml) de Dybabeads foi separada em Dynabeads e fase líquida, o produto de Dynabeads foi novamente suspenso em W x B contendo tRNA (20 μς/πιΐ) e as pérolas na fase líquida foram separadas pelo procedimento Dynal MPC. Isso foi repetido uma vez mais e, finalmente, Dynabeads foi suspenso em W x B contendo tRNA (20 gg/ml) e a suspensão numa quantidade necessária foi colocada em cada tubo de teste.

Operação 1 - Preparação de uma Solução Mista de DNA

DNA de Escherichia coli (80 pg) e 8 ng de

Bacillus pumilus foram dissolvidos em 440 μΐ de TE, de modo a proporcionar um líquido A.

DNA humano (80 pg) , 80 ng de DNA de Escherichia coli e 0,8 ng de DNA de Bacillus pumilus foram dissolvidos em 700 μΐ de Te, de modo a proporcionar um líquido B. Operação 2 - Preparação do DNA condutor (Fragmentação e

Biotinação do DNA)

42/62

Ao líquido A contendo 75 gg de DNA de Escherlchia coli e 7,5 ng de DNA de Baciilus pumilusr foram adicionados 120 μΐ de 10 x B, 600 unidades de MspI e água, para proporcionar 1,2 ml e a mistura foi mantida a 37°C durante 2 horas para clivar o DNA e, depois, tratada a 60°C durante 15 minutos, para inativação do MspI. A solução reacional foi dividida em três e os fragmentos de DNA foram precipitados com etanol e recuperados mediante tratamento com um separador centrífugo (daqui em diante, referidos como fragmentos de DNA misto E/B) .

Ao líquido B contendo 75 μg de DNA humano, 75 ng de DNA de Escherlchia coli e 75 ng de DNA de Baciilus pumilus, foram adicionados 120 μΐ de 10 x B, 600 unidades de MspI e água, de modo a proporcionar 1,2 ml, e a mistura foi mantida a 37°C durante 2 horas para clivar o DNA e, depois, tratada a 60°C durante 15 minutos, para inativação do MspI. A solução reacional foi dividida em três e os fragmentos de DNA foram precipitados com etanol e recuperados mediante tratamento com um separador centrífugo (daqui em diante, referidos como fragmentos de DNA misto de H/E/B).

O precipitado em cada tubo de teste (cada um contendo 1/3 equivalente aos fragmentos mistos de DNA) foi dissolvido em 200 μΐ de água e 25 μΐ de Tampão A de rotulação 10 x Mirus, depois foi adicionado 25 μΐ de reagente IT de Rótulo Mirus e a reação foi realizada a 37°C durante 2 horas, após o que o DNA foi rotulado com biotina. A esta mistura foram adicionados 25 μΐ de NaCl 5M e 550 μΐ de etanol, a mistura sendo preservada a -20°C (daqui em

43/62

diante, os fragmentos de DNA mistos de E/B biotinados serão referidos como fragmentos de DNA condutor E/B e os fragmentos de DNA mistos de H/E/B biotinados serão referidos como fragmentos de DNA condutor H/E/B).

Operação 3 - Preparação de DNA alvo (fragmentação de DNA)

Ao líquido A contendo 2,5 μg de DNA de Escherichia coli e 0,25 ng de DNA de Bacillus pumilus, foram adicionados 10 μΐ de 10 x M, 10 μΐ de BSA 0,1%, 20,4 unidades de Sse8387I e água, de modo a proporcionar 100 μΐ, e a mistura foi mantida a 37°C durante 2 horas para clivar o DNA e tratada a 60°C por 15 minutos para inativação do Sse8387I. A esta mistura foram adicionados 20 μg de tRNA, 10 μΐ de acetato de sódio 3M e 220 μΐ de etanol e a mistura foi conservada a -20°C {daqui em diante, esse DNA fragmentado é referido como DNA alvo E/B).

Ao líquido B contendo 2,5 μg de DNA humano, 2,5 ng de Escherichia coli e 0, 025 ng de DNA de Bacillus pumilus, foram adicionados 10 μΐ de 10 x M, 10 μΐ de BSA 0,1%, 20,4 unidades de Sse8387l e água, de modo a proporcionar 100 μΐ, e a mistura foi mantida a 37°C durante 2 horas para clivar o DNA e tratada a 60°C por 15 minutos para inativação do Sse8387I. A esta mistura foram adicionados 20 μg de tRNA, 10 μΐ de acetato de sódio 3M e 220 μΐ de etanol e a mistura foi conservada a -20°C (daqui em diante, esse DNA fragmentado é referido como DNA alvo

H/E/B).

Operação 4 - Hibridização

Um tubo de teste contendo um DNA alvo E/B precipitado em etanol, foi centrifugado a 15.000 rpm

44/62 ·:

durante 20 minutos e o liquido sobrenadante foi descartado. Ao mesmo tubo de teste, foram adicionados 400 μΐ de uma suspensão de DNA condutor E/B precipitado em etanol e a mistura foi centrifugada a 15.000 rpm durante 20 minutos. O líquido sobrenadante foi descartado e foram adicionados 425 μΐ de uma suspensão de DNA condutor E/B precipitado em etanol, depois, a mistura foi centrifugada e o líquido sobrenadante descartado. O precipitado final foi dissolvido em 9,28 μΐ de água e 0,96 μΐ de NaOH 3N à temperatura ambiente, a mistura foi rapidamente resfriada em gelo, e foram adicionados 0, 96 μΐ de HC1 3N e Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) e, depois, 8 μΐ de 20 x SSC e 20,8 μΐ de formamída, seguido de uma adequada mistura. Foi gotejado uma gota de óleo mineral e a mistura foi adequadamente fechada com uma tampa e mantida a 37°C, para realização de reação de hibridização.

Tanto o DNA alvo H/E/B como o DNA condutor H/E/B foram similarmente tratados de modo a realizar uma reação de hibridização.

N° mostra uma solução de DNA em que foi realizada uma operação híbrida e não-híbrida durante N vezes.

Após 24 horas, 20 μΐ da solução de ração de hibridização foram tomados e adicionados a um tubo de teste, no qual 1 ml equivalente da suspensão do produto Dynabeads foi colocado. Os produtos que restaram (1° e 2° ) continuaram a ser aquecidos. O dito tubo de teste foi normalmente misturado durante 50 minutos mediante 'aquecimento em um banho sob temperatura constante de 43°C. Em seguida, foi submetido a um procedimento Dynal MPC e

45/62 < * · · >»♦ I·· · ««

deixado permanecer por diversos minutos, a fase líquida foi dividida em duas partes iguais e cada uma delas foi adicionada aos dois tubos de teste, onde foi colocado 1 ml de etanol resfriado a -20°C, deixado permanecer em um refrigerador (freezer) à temperatura de -80°C durante 35 minutos e centrifugado a 15.000 rpm por 20 minutos, para obtenção de um precipitado. O precipitado em dos tubos de teste (A) foi dissolvido em 80 μΐ + 10 μΐ de NaOH 3H e a quantidade total foi transferida para outro tubo de teste (B), de modo a dissolver o precipitado. Por outro lado, o equivalente a 1/3 do DNA condutor foi centrifugado sob as mesmas condições, de modo a separar o precipitado, o precipitado foi dissolvido em 80 μΐ + 10 μΐ de NaOH 3H e a quantidade total foi despejada em (B). Em (B) foram adicionados 15 μΐ de HC1 3N e 50 Tris mM (pH 7,2), depois foram adicionados 300 μΐ de etanol a -20°C seguido de mistura, em que tal mistura foi deixada permanecer em um refrigerador, a uma temperatura de “80°C durante 30 minutos ou mais. Ao precipitado obtido por separação centrífuga, foram adicionados 4,64 μΐ de água + 0,48 μΐ de NaOH 3N, de modo a suficientemente dissolver sob temperatura ambiente, depois a solução foi rapidamente resfriada em gelo e foram adicionados 0,48 μΐ de HCl 3N + Tris-HCl 50 mM (pH 7,2), μΐ de 20 x SCC e 10,4 μΐ de formamida, de forma sucessiva, sendo que uma gota de óleo mineral foi ainda adicionada, com a mistura sendo mantida a 37°C.

Após 20 horas, foram adicionados 40 μΐ de W x B contendo tRNA (20 μg/ml) e misturados, em que o óleo mineral foi removido o máximo possível, sendo adicionado

46/62 ··· ·· clorofórmio saturado com TE, e a extração com clorofórmio sendo realizada de acordo com um método convencional. A fase aquosa se concretizou ao se adicionar 1 ml de W x B contendo tRNA (20 μς/ιηΐ) a um tubo de teste-, -no— qual foi

colocado	o	equivalente a 1 ml	de	Dynabeads	lavado.	Essa
mistura	foi	mantida a 43°C por	50	minutos e,	durante	esse
período	foi	misturada a cada 1	ou	2 minutos.	Em seguida,

foi submetida a um procedimento de Dynal MFC e deixada permanecer por diversos minutos, a fase líquida foi dividida em duas partes iguais e cada uma delas foi adicionada a um tubo de teste, onde foi colocado 1 ml de etanol resfriado a -20°C, deixado permanecer em um refrigerador (freezer) à temperatura de -80°C durante 35 minutos ou mais e centrifugado a 15.000 rpm por 20 minutos, para preparação de um precipitado. O precipitado foi dissolvido em cada 50 μΐ de água e 5 μΐ de NaOH 3N à temperatura ambiente e adicionado ao precipitado de DNA condutor correspondente a um tubo, em seguida, foram adicionados 10 μΐ de HCl 3N e Tris 50 mM (pH 7,2) e, depois, 220 μΐ de etanol a -20°C, e a mistura deixada permanecer em um refrigerador à temperatura de -80°C durante 50 minutos ou mais. Ao precipitado centrifugado foram adicionados 4,64 μΐ de água + 0,48 μΐ de NaOH 3N, de modo a suficientemente dissolver sob temperatura ambiente, depois a solução foi rapidamente resfriada em gelo e foram adicionados 0,48 μΐ de HCl 3N + Tris-HCl 50 mM (pH 7,2), μΐ de 20 x SCO e 10,4 μΐ de formamida, de forma sucessiva, sendo que uma gota de óleo mineral foi ainda adicionada, com a mistura sendo mantida a 37°C.

47/62

Após 213 horas e 50 minutos, 10 μΐ foram tomados, sendo adicionado 40 μΐ de W x B contendo tRNA (50 μς/ιηΐ) , o óleo mineral foi removido conforme mencionado acima e a quantidade restante foi transferida para um tubo de teste onde foi colocado o equivalente a 500 μΐ de Dybabeads lavado, com agitação por rotação e mistura durante a noite à temperatura ambiente, após permanência em uma máquina rotativa. Em seguida, foi submetida a um procedimento de Dynal MPC para separação da fase líquida, tratada com o equivalente a 0,05 ml de Dynabeads lavado e a fase líquida resultante final foi submetida à precipitação com etanol para recuperação do DNA (3°) .

Por outro lado, 10 μΐ foram tomados dos (1° e 2°) após 119 horas e 5 minutos. O material restante continuou a ser aquecido. Os 10 μΐ tomados foram tratados com o equivalente a 0,5 ml de Dynabeads lavado e, do mesmo modo que acima, foram recuperados com etanol como um precipitado, junto com o equivalente a 1/6 do DNA condutor. Ao precipitado foram adicionados 9,28 μΐ de água + 0,96 μΐ de NaOH 3N, de modo a suficientemente dissolver sob 0 temperatura ambiente, depois a solução foi rapidamente resfriada em gelo e foram adicionados 0,96 Ao precipitado centrifugado foram adicionados 4,64 μΐ de água + 0,48 μΐ de NaOH 3N, de modo a suficientemente dissolver sob temperatura ambiente, depois a solução foi rapidamente resfriada em gelo e foram adicionados 0,48 μΐ de HCl 3N + Tris-HCl 50 mM (pH 7,2), 4 μΐ de 20 x SCC e 10,4 μΐ de '' formamida, de forma sucessiva, sendo que uma gota de óleo mineral foi ainda adicionada, com a mistura sendo mantida a

48/62

37°C. de HCl 3N + Tris-HCl 50 mM (pH 7,2), 8 μΐ de 20 x SCC e 20,8 μΐ de formamida, de forma sucessiva, sendo que uma gota de óleo mineral foi ainda adicionada, com a mistura sendo mantida a 37°C, durante 87 horas e 10 minutos. Após remoção do óleo mineral, a fase líquida obtida pelo tratamento com o equivalente a 1 ml de Dynabeads lavado, foi ainda tratada com o equivalente a 0,1 ml de Dynabeads lavado e a fase líquida final resultante foi precipitada com etanol para recuperar o ácido nucléico (2°) .

O material restante foi mantido em aquecimento a 37°C durante 289 horas e 20 minutos, similarmente tratado com 0,5 ml e, depois, com 0, 05 ml de Dynabeads lavado e a fase líquida final resultante foi precipitada com etanol para recuperar o ácido nucléico (1°) .

Finalmente, a todos os precipitados de ácido nucléico recuperados, foram adicionados 0,5 Ao precipitado centrifugado foram adicionados 4,64 μΐ de água + 0,48 μΐ de NaOH 3N, de modo a suficientemente dissolver sob temperatura ambiente, depois a solução foi rapidamente resfriada em gelo e foram adicionados 0,48 μΐ de HCI 3N + jTris-HCl 50 mM (pH 7,2), 4 μΐ de 20 x SCC e 10,4 μΐ de formamida, de forma sucessiva, sendo que uma gota de óleo mineral foi ainda adicionada, com a mistura sendo mantida a 37 °C. de ETHACHINMATE e 20 Ao precipitado centrifugado foram adicionados 4,64 μΐ de água + 0,48 μΐ de NaOH 3N, de modo a suficientemente dissolver sob temperatura ambiente, depois a solução foi rapidamente resfriada em gelo e foram adicionados 0,48 μΐ de HCI 3N + Tris-HCl 50 mM (pH 7,2), μΐ de 20 x SCC e 10,4 μΐ de formamida, de forma

49/62

sucessiva, sendo que uma gota de óleo mineral foi ainda adicionada, com a mistura sendo mantida a 37°C. de NaOH 3N, tratado a 37°C durante 1,5 horas para decomposição e remoção de excesso de tRNA, depois foram adicionados 20 μΐ de HC1 0,3N + Tris-HCl 5 mM (pH 7,2) e o DNA foi recuperado mediante precipitação com etanol, com seguinte dissolução em TE.

O fluxo do experimento acima mencionado é mostrado em um fluxograma (figura 3) . O tempo de aquecimento para cada fração e o Cot calculado a partir disso são resumidos na tabela seguinte.

Tabela 1

	1°	2°	3°
Tempo de Hibridização	289h 20m	119h 5m + 88h lOm	24h + 20h + 213h 50m
Cot	E/B
E. coli	2,285	940+316	190+192+1535
B. pumilus	0.228	0.09+0.03	0.02+0.02+0.15
H/E/B
Ser Humano	2,285	940+316	190+192+1535
E. coli	0.228	0.09+0.03	0.02+0.02+0.15
B. pumilus	0.023	0.009+0.003	0.002+0.002+0.015

Exemplo de Teste 1 - Verificação de Gene em cada Fração de

Ácido Nucléico

O precipitado foi dissolvido em TE, uma fração da solução foi adicionada para preparar 25 μΐ de uma solução reacional de PCR (compreendendo 2,5 μΐ de 10 x Tampão de PCR, 2 μΐ de dNTP, 0,25 μΐ de rTaq, 1 μΐ de um conjunto de

50/62

I · · > · *· primers e DNA em molde e adição de água de modo a preparar 25 μΐ) , uma gota de óleo mineral adicionada seguido de adequado fechamento, e realização de PCR durante 94°C/1 minuto, 60°C/l minuto e 72°C/2 minutos-,—em—35—c-i-cl-os-,-- a mistura sendo deixada permanecer a 72°C por 8 minutos e resfriada a 23°C. Com relação ao conjunto de primers, foi usado uma mistura de 0,5 μΐ de Ef e Er (para o gene de Escherichia coli} , Bf e Br (para o gene de Bacillus pumilus) ou Hf e Hr (para o gene humano) .

Cada um dos seguintes nucleotídios foi dissolvido em TE e 100 μΜ da solução resultante foi usada como o primer acima mencionado.

(a) Escherichia coli; As seguintes partes de ompA ecompa.gb_bal, 1-2271 CDS 172-669, foram usadas como primers.

Ef 1102-1119: 5'TCCGAAAGATAACACCTG 3'(SEQ ID No. 1) ;

Er 1892-1908: 5'GGGATACCTTTGGAGAT 3' (SEQ ID No. 2);

O produto ampliado por PCR apresentou 807 pares de base.

(b) Bacillus pumilus; As seguintes partes de xynA bpxyna.gb_bal, 1-1070 CDS 61-747, foram usadas como primers.

Bf 243-260: 5'ATTTAGTGCAGGCTGGAA 3'(SEQ ID No. 3);

Br 650-672: 5' CGTTTCATACATTTTCCCCATTG 3^r (SEQ ID No.

4) ;

produto ampliado por PCR apresentou 439 pares de base.

fc) Ser humano; As seguintes partes de IL5hj03478.gb_pr2, 1-3220 foram usadas como primers.

51/62

Hf 1600-1629: 5'ACTTTTTGAAAATTTTATCTTAATATGTGG 3' (SEQ

ID No. 5);

Hr 1981-2007: 5'T GGC CGTCAATGTATT TC TTTATTAAG 3' (seq id nO. 6) ; ___

O produto ampliado por PCR apresentou 408 pares de base.

Com relação a outras soluções, os seguintes produtos foram usados.

(i) 10 x Tampão de PCR: Tris-HCl 100 mM, pH 8,3 + KC1 500 mM + MgCl₂ 15 mM;

(ii) mistura de dNTP: cada 2,5 mM de dATP + dGTP + dCTP + dTTP;

(iii) Taq: 5 unidades/μΐ (solvente: Tris-HCl 20 mM +

KC1 100 mM + EDTA 0,1 mM + DTT 1 mM + Tween 20 0,5% +

Nonidet P-40 0,5% + glicerol 50%);

(iv) molde de DNA

Resultado 1

	Conforme	mostrado na figura	4A,	as	bandas	de
produtos	de PCR de	gene de Escherichia	coli	e	de gene	de
Bacillus	pumilus de	uma solução mista de	DNA,	refletiram	de
forma satisfatória	a quantidade de cada DNA.	Quando	as

mesmas foram submetidas uma hibridização (I^a.), o gene de Escherichia coli e o gene de Bacillus pumilus se tornaram praticamente da mesma quantidade. Quando foram ainda submetidas à duas (2^a.) e três (3^a.) hibridizações, o resultado foi que a quantidade do gene de Escherichia coli foi muito inferior a do gene de Bacillus pumilus (figura 5A) . Portanto, o gene de Escherichia coli que ocupou a maior parte da mistura foi predominantemente removido. Isso

52/62 demonstrou que o grau relativo de concentração foi maior que de 10.000 vezes.

Como pode ser observado da figura 4B, as bandas de produtos PCR_de—gene—humano-,—gene—de—Es-chârrLcbi_a_coli e gene de Bacillus pumillus em uma mistura de DNA H/E/N, refletiram de forma satisfatória a quantidade de cada DNA. Uma vez que o gene de Bacillus pumilus existe apenas em uma quantidade bastante pequena numa mistura de DNA, ocorrem muitas bandas não-específicas ao se comparar com o caso em que apenas o DNA de Bacillus pumilus esteve presente em uma quantidade bastante 'pequena e uma banda para a banda específica de 430 pares de base foi ligeiramente observada. Quando isso foi submetido à hibridização por três vezes (3^a.), foi observado que o gene de Escherichia coli foi significativamente concentrado, quando comparado com o gene humano (figura 5B). Uma vez que o gene humano foi concentrado em cerca de diversas dezenas de vezes e o gene de Escherichia coli foi de 5 a 10 vezes, quando comparado com o caso de PCR de controle (figura 4B) , o grau de concentração foi calculado como sendo de diversas centenas de vezes.

No caso do gene de Bacillus pumilus, as bandas não-específicas desapareceram e as bandas específicas foram possíveis de ser também claramente identificadas e, quando comparado com o DNA contaminado, foi observado que foi obtida uma significativa concentração. Nesse momento, a concentração não foi tão significativa quando comparada com Escherichia coli e que pode ser interpretada para suportar o fato de que o DNA humano, que foi excessivamente presente

53/62

selecionado termofílica e no início, foi especificamente removido.

Exemplo 2

Como micróbio minúsculo, foi Sulfolobus shibatae, que foi uma bactéria acidofílica, DNA de S. shibatae e DNA de Escherichia coli, foram misturados e o mesmo experimento do Exemplo 1 foi realizado, após o que foi confirmado que como resultado de uma remoção seletiva do DNA de Escherichia coli, o DNA de S. shibatae que esteve presente apenas mil vezes em relação ao DNA de Escherichia coli, foi relativamente concentrado. 0 DNA de S. shibatae foi preparado a partir do micróbio usando Gen Torukun (nome comercial fabricado pela empresa Takara Shuzo).

No Exemplo 2, foram usados a mesma enzima de restrição, tampão, reagente, etc., como no Exemplo 1, com relação aos aspectos que foram mencionados no Exemplo 1, os seguintes produtos foram usados.

(a) 10 x Tampão A de Rotulação Mirus (Mirus): MOPS 200 mM;

(b) Glicogênío: 20 mg/ml;

(c) MAGNOTEX-SA (Takara Shuzo) : 0 DNA híbridizado foi removido usando um kit MAGNOTEX-SA, por meio de um método mencionado no manual do kit. Assim, foi colocado MAGNOTEXSA (50 μΐ; 1 mg) em um tubo de 1,5 ml, o tubo foi deixado permanecer por 1 minuto sobre uma plataforma magnética e o líquido sobrenadante foi removido. Um tampão de Aglutinação 2 x, fixado ao kit que foi da mesma quantidade que a solução de DNA rotulada de biotina. Foi misturado, adicionado ao tubo, novamente misturado e deixado

54/62 permanecer à temperatura ambiente por 10 minutos. O tubo foi deixado permanecer por 1 minuto sobre a plataforma magnética e o líquido sobrenadante foi recuperado. Foi acrescentado um adicional de 200 μΐ do tampão de aglutinação 2 x à MAGNOTEX-AS e lavado e a lavagem foi repetida uma vez mais. Após a mistura, o tubo foi deixado permanecer por 1 minuto na plataforma magnética e, depois, o sobrenadante líquido foi recuperado.

Operação 1 - Preparação de uma Solução Mista de DNA

DNA de Escherichiâ coli (80 pg) e 80 ng de DNA de S. shibâtae foram dissolvidos em 44 0 μΐ de TE, de modo a proporcionar um líquido A.

Operação 2 - Preparação do DNA condutor (Fragmentação e

Biotinação do DNA)

Ao líquido A contendo 75 μg de DNA de Escherichiâ coli e 75 ng de DNA de S. shibatae, foram adicionados 120 μΐ de 10 x B, 600 unidades de MspI e água, para proporcionar 1,2 ml e a mistura foi mantida a 37°C durante 2 horas para clivar o DNA e, depois, tratada a 60°C durante 15 minutos, para inativaçâo do MspI. A solução reacional foi dividida em três e os fragmentos de DNA foram precipitados com etanol e recuperados mediante um separador centrífugo (referidos como fragmentos de DNA misto E/S).

precipitado em cada tubo de teste (contendo o equivalente a 1/3 do fragmento de DNA misto E/S) foi dissolvido em 200 μΐ de um tampão A de rótulo 10 x Mirus, depois 25 μΐ de reagente IT de rótulo Mirus foram adicionados e a reação foi realizada a 37°C durante 2 horas para rotular o DNA com biotina. A esta mistura foram

55/62

# · ·#· ♦*» · **< ·· *·* adicionados 25 μΐ de NaCl 5M e 550 μΐ de etanol e a mistura foi armazenada a -20°C.

Operação 3 - Preparação de DNA alvo (hidrólise parcial de de DNA)

Ao líquido A contendo 2,5 gg de DNA de 5.

shíbatae foram adicionados 10 μΐ de 10 x M, 10 μΐ de BSA Q,1%, 20,4 unidades de Sse8387l e água, de modo a proporcionar 100 μΐ, e a mistura foi mantida a 37°C durante horas para clivar o DNA e tratada a 60°C por 15 minutos para inativaçâo do Sse8387l. A esta mistura foram adicionados 10 pg de NaOAc, 220 μΐ de etanol e 1 μΐ de glicogênio, seguido de agitação a -20°C (daqui em diante, será referido como fragmento de DNA alvo E/S).

Operação 4 - Hibridização

Um tubo de teste contendo o DNA alvo E/S precipitado em etanol, foi submetido à centrifugaçâo de 15,000 rpm durante 20 minutos e o líquido sobrenadante foi descartado. Ao mesmo tubo de teste, foram adicionados 4 00 μΐ de uma suspensão de DNA condutor E/S precipitado em etanol e a mistura foi submetida à centrifugaçâo de 15.000 ^^rpm durante 20 minutos, 0 líquido sobrenadante foi descartado e foram adicionados 425 μΐ de uma suspensão de DNA condutor E/S precipitado em etanol, depois, a mistura foi centrifugada e o líquido sobrenadante descartado. O precipitado final foi dissolvido em 9,28 μΐ de água e 0,96 μΐ de NaOH 3N à temperatura ambiente, a mistura foi rapidamente resfriada em gelo, e foram adicionados 0,96 μΐ dg HCI 3N e Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) e, depois, 8 μΐ de 20 x S.SC e 20,8 μΐ de formamida, seguido de adequada mistura e a

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mistura foi chamada de 0° . Foi gotejado uma gota de óleo mineral e a mistura foi adequadamente fechada com uma tampa e aquecida a 37 °C para realização de reação de hibridização. Após 24 horas, foram tomados 10 μΐ da solução reacional de hibridização e o DNA rotulado com biotina foi removido usando 1 mg de MAGNOTEX-SA. Ao líquido sobrenadante recuperado, foram adicionados 20 μΐ de NaOAc, 500 μΐ de etanol a -20°C e 1 μΐ de glicogênio, sendo obtido um precipitado mediante centrifugação de 15.000 rpm durante 15 minutos, sendo chamado de 1°.

A remoção do DNA rotulado com biotina usando 1 mg de MAGNOTEX-SA foi também realizada para cada um de 10 μΐ (2°) e 20 μΐ (3°) da solução reacional de hibridização restante. Ao líquido sobrenadante recuperado foram adicionados 20 μΐ de NaOAc, 500 μΐ de etanol a -20°C e 1 μΐ de glicogênio, sendo submetido a uma centrifugação de 15.000 rpm durante 15 minutos, de modo a proporcionar um precipitado (2° precipitado: A/ 3° precipitado: B) . Por outro lado, o equivalente a 1/3 (2°) e um tubo (3°) do DNA condutor foram centrifugados sob a mesma condição, o precipitado foi separado e dissolvido em 80 μΐ de água + 10 μΐ de NaOH 3N e cada um de A e B foram dissolvidos em todas as quantidades dos mesmos. Após adição de 15 μΐ de HCl 3N + Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) ao mesmo, foram adicionados 300 μΐ de etanol a -20°C e a mistura foi deixada permanecer em um refrigerador a -80°C por 30 minutos ou mais. 0 precipitado preparado pela centrifugação foi também dissolvido em 4,64 μΐ de água + 0,48 μΐ de NaOH 3N à temperatura ambiente e rapidamente resfriado em gelo, sendo adicionados de forma

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sucessiva 0,48 μΐ de HCI 3N + Tris-HCl 50 mM (pH 7,2), 4 μΐ de 20 x SSC e 10,4 μΐ de formamida e, depois, uma gota de óleo mineral foi depositada e a mistura foi mantida a 37°C. Após 24 horas, foram tomados 10 μΐ de uma soluçãoreacional de hibridização do tubo de teste A e o DNA alvo foi recuperado pelo mesmo procedimento acima, que foi chamado de 2°.

Com relação a Β, o precipitado foi obtido (3° precipitado: C) por meio da remoção do DNA rotulado com biotina, recuperação do fluido sobrenadante e centrifugação a 15.000 rpm durante 15 minutos, da mesma maneira que acima. O DNA condutor (1/3 equivalente) foi centrifugado e o precipitado foi separado e dissolvido em 50 μΐ de água + 10 μΐ de NaOH 3N e C foi dissolvido em todas as quantidades acima. Após adição de 10 μΐ de HCI 3N + Tris 50 mM (pH 7,2), foram adicionados e misturados 300 μΐ de etanol a uma temperatura de -20°C e a mistura foi deixada permanecer em um refrigerador a -80°C durante 50 minutos ou mais. O precipitado preparado pela centrifugação foi também dissolvido em 4, 64 μΐ de água + 0, 48 μΐ de NaOH 3N à temperatura ambiente e rapidamente resfriado em gelo, sendo adicionados de forma sucessiva 0,48 μΐ de HCI 3N + Tris-HCl 50 mM (pH 7,2), 4 μΐ de 20 x SSC e 10,4 μΐ de formamida e, depois, uma gota de óleo mineral foi depositada e a mistura foi mantida a 37°C. Após 24 horas, foram tomados 10 μΐ da solução reacional de hibridização do tubo de teste C e o DNA alvo foi recuperado pelo mesmo procedimento, para proporcionar 3°. Finalmente, todo o precipitado de DNA recuperado foi dissolvido em 50 μΐ de 1 x TE.

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Exemplo de Teste 1 - Verificação do Gene em Frações de DNA

Foi preparada uma solução de PCR (25 μΐ) (compreendendo 2,5 μΐ de 10 x Tampão de PCR, 2 μΐ de dNTP,

0, 25 μΐ de rT/aq,—1 μ-l- de—um -conj-unto—de—primers,_3 μΐ de

DNA em molde e adição de água de modo a preparar 25 μΐ), e realização de PCR durante 94°C/1 minuto, 60°C/l minuto e 72°C/2 minutos, em 35 ciclos, usando um Thermal Cycler Ciclador Térmico (Takara Shuzo), seguido de deixar a mistura permanecer a 72°C por 8 minutos e resfriamento a

4°C. Com relação ao conjunto de primers, foi usado uma mistura de 0,5 μΐ de Ef e Er (para o gene de Escherichia coli) e Sf e Sr (para o gene de S. shibatae).

Cada um dos seguintes nucleotídios foi dissolvido em TE, para preparar 100 μΜ de solução, que foi usada como o primer acima mencionado.

(a) Escherichia coli: As seguintes partes do gene de ompA (ecompa.gb_bal) foram usadas como primers.

Ef2: 5'-TCCGAAAGATAACACCTG-3'(SEQ ID No. 7);

Er2: 5'-GGGATACCTTTGGAGAT-3'(SEQ IDNo. 8);

O produto ampliado por PCR apresentou 807 pares de base.

(b) S. shibatae: As seguintes partes do gene esterase (EstI) foram usadas como primers.

Sf: 5'-ATGCCCCTAGATCCTCGAATC-3'(SEQ ID No. 9); sr: 5'-TCAACTTTTATCATAAAATGTACG-3'(SEQ ID No. 10);

O produto ampliado por PCR apresentou 918 pares de base.

Com relação a outras soluçoes, os seguintes produtos foram usados.

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mM (pH 8,3) + KCl de dATP + dGTP +

Tris-HCl 20 mM +

(i) 10 x Tampão de PCR: Tris-HCl 100 500 mM + MgCl₂ 15 mM;

(ii) mistura de dNTP: cada 2,5 mM dCTP + dTTP;

(üi) Taq: 5 unidades/μΐ (solvente:

KCl 100 mM + EDTA 0, 1 mM + DTT 1 mM + Tween 20 0, 5% +

Nonidet P-40 0,5% + glicerol 50%);

(iv) molde de DNA

Exemplo de Teste 2 - Determinação Quantitativa por meio de

PCR de Tempo Real

A fim de analisar a proporção existente de diversos genes em uma mistura de DNA, o modo de ampliação da amostra foi analisado para cada ciclo por meio de um método de PCR de tempo real. Uma vez que não é possível analisar a proporção existente para cada gene pelo método de PCR mencionado acima, um sistema rápido Líght Cycler 330 (fabricado pela Roche Diagnostics) foi usado para análise da proporção existente de gene de E. coli e gene de S. shlbatae.

2(u A composição da solução reacional para o PCR foi composta de 5 μΐ de molde de DNA, 2 μΐ de DNA master SYBR Green I/Light Cycler, 1 μΐ de um conjunto de primers e 1,6 μΐ de MgCl₂ 25 mM (concentração final: 3 mM) , em que foi adicionado água para proporcionar 20 μΐ.

Cada um dos seguintes nucleotídios foi dissolvido em TE e a 10 μΐ da solução resultante foi usada como os primers acima mencionado, (a) Escherichia coli: As seguintes partes do gene de ompA (ecompa.gb_bal) foram usadas como primers.

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Ρ

Ef2: 5'-TCCGAAAGATAACACCTG-3' (SEQ ID No. 7);

Er2: 5'-GGGATACCTTTGGAGAT-3'(SEQ ID No. 8);

O produto ampliado por PCR apresentou 807 pares de base. .............

(b) S. shibatae: As seguintes partes do gene esterase (EstI) foram usadas como primers.

Sf: 5'-ATGCCCCTAGATCCTCGAATC-3'(SEQ ID No. 9); sr: 5'-TCAACTTTTATCATAAAATGTACG-3'(SEQ ID No. 10);

O produto ampliado por PCR apresentou 918 pares

A de base.

Resultado 2

Conforme mostrado na figura 7, foi observado que a banda de Escherlchia coli gradualmente diminuiu na medida em que foi concentrada e, no 3°, foi obtida uma completa remoção. Por outro lado, foi confirmado que o gene S. shibatae foi quase da mesma quantidade no decorrer de uma série de etapas (consequentemente, a banda de lado de baixo peso molecular foi acreditada como um primer que se tornou um dímero) . A razão pelo que bandas não-específicas foram muitas como um todo, foi acreditado como devido a que o DNA alvo ter sido parcialmente digerido por Sau3Al.

Numa curva de ampliação para o DNA de E. coli, foi observada uma fase de crescimento exponencial em 18,2 ciclos, 20,74 ciclos, 23,31 ciclos e 23,80 ciclos no caso do DNA alvo, 1° DNA, 2° DNA e 3° DNA, respectivamente, e foi observado do exposto acima que os números de cópias foram maiores para o DNA alvo diminuindo da ordem de 1°, 2° e’3°, pelo que o DNA de E. coli que ocupa a maior parte foi removido predominantemente.

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Por outro 1 ado, numa curva de ampliação para o DNA de S. shibatae, foram 19,22 ciclos para o DNA alvo e 1° DNA, 20,58 ciclos para o 2° DNA e de 20,65 ciclos para o 3° DNA e, embora ten-ha s-i-do- obse-rvado—uma—d-i-minui-ção do.. 1 ° para o 2°, a proporção existente raramente se modificou, mesmo após uma série de etapas de concentração, quando comparado com a taxa de redução do E. coli. Além disso, como resultado de duas hibridizações, os DNAs de E. coli e S. shibatae se tornaram quase da mesma quantidade e, como resultado de três hibridizações, o resultado foi DNA de E. coli « (muito inferior) ao DNA de 5. shibatae. Dos resultados acima, foi quantitativamente confirmado que quando a proporção existente de cada gene em uma solução mista de DNA foi analisada usando um método de PCR de tempo real, o DNA de E. coli mostrado no resultado da figura 7 mediante eletroforese, foi seletivamente removido.

Aplicabilidade Industrial

É agora possível se concentrar o gene raro em uma amostra de DNA em uma tal proporção, que o mesmo se torna 20 numa maior quantidade que o gene abundante, quando é usado um método para concentração de gene raro, um kit para concentração de gene raro e um aparelho para concentração de gene raro, de acordo com a presente invenção. Além disso, não é necessário que o gene abundante que deve ser removido da amostra de DNA seja um gene conhecido. Consequentemente, existe a vantagem em que, por exemplo, um DNA ou elemento similar extraído de amostras do ambiente natural, tal como o solo, água de lagos ou água de rios, possa ser usado como amostra.

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Como tal, quando o gene raro é concentrado, é possível diminuir acentuadamente o número total de clones de um acervo de genes a ser selecionado para clonagem do dito gene. Como resultado, é~ possível -uma.- s-i-gn-if icativa redução em termos de mão-de-obra humana, custo e tempo. Consequentemente, um gene útil, tal como o gene de enzimas que são importantes tendo em vista a indústria química ou um grupo de genes sintéticos de antibióticos e compostos líderes para produtos químicos farmacêuticos e da agricultura, podem ser obtidos mais fácil e rapidamente do que pelos métodos convencionais. Além do exposto acima, é também possível que o gene do antígeno da superfície da célula seja obtido usando um método para concentração de gene raro de acordo com a presente invenção, em que é preparado um anticorpo usando o dito gene ou informação do gene, após o que a célula ou micróbio tendo um antígeno do mesmo é identificada ou a dita célula ou micróbio é isolada usando um classificador de célula, tal como FACS. É ainda possível que um novo gene seja obtido mediante análise da seqüência básica do genoma total de tal célula ou micróbio isolado. Além disso, é possível que o gene de micróbio de parasita ou de infecção de animais ou plantas, incluindo o ser humano, é concentrado pelo método ou aparelho de acordo com a presente invenção, após o que o micróbio do parasita ou de infecção é identifiçado, sendo ainda possível que uma função do dito gene sej a esclarecida e devidamente utilizada. Desse modo, são possíveis diversas aplicações.

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Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade caracterizado pelo fato de que uma amostra de DNA contendo gene que está presente em pequena quantidade e gene que está presente em grande quantidade é submetida às seguintes operações, de modo que o gene que está presente em pequena quantidade é separado do gene que está presente em grande quantidade:

   (a) a amostra de DNA é dividida em duas partes iguais: uma amostra de DNA é chamada de fração de DNA condutor, enquanto a outra amostra de DNA é chamada de fração de DNA alvo;

   (b) a fração de DNA é clivada em cada uma das frações de DNA condutor e DNA alvo; nesse momento , o peso molecular do DNA condutor é tornado menor que o peso molecular do DNA alvo, de modo que a extensão média de cadeia do DNA condutor é de 200-300 pares de base e a extensão média de cadeia do DNA alvo é de 1000 ou mais

   pares de base;

   (c) o DNA condutor é rotulado; opcionalmente, um adaptador de ligação é aderido ao DNA alvo;

   (d) o DNA alvo é misturado com uma quantidade em excesso do DNA condutor rotulado, depois, o DNA na solução de mistura é tornado de filamento único, sendo realizada uma hibridização;

   (e) por meio de uma rotulação do DNA condutor, um DNA de filamento duplo formado pelo DNA condutor e DNA alvo é removido da solução de mistura acima mencionada; nesse momento, um DNA de filamento duplo formado por DNAs condutores e um DNA condutor de filamento único são também removidos; e (f) a operação de (d) e (e) é realizada uma ou mais vezes, em que, ao invés do DNA alvo, é usada uma

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2. 2/4 solução de DNA obtida em (e), de onde o DNA de filamento duplo é removido.

   2. Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proporção (d/t) da quantidade misturada (d) do DNA condutor para a

   quantidade misturada (t) do DNA alvo é maior que 1 e até 1.000. 3. Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o DNA

   condutor é rotulado com biotina, digoxina, fluoresceína ou rodamina.

   4. Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a clivagem do DNA é realizada por meio de uma enzima de restrição de reconhecimento de quatro bases para a fração do DNA condutor, enquanto ela é realizada por meio de uma enzima de restrição de reconhecimento de 5-8 bases para a fração de DNA alvo.

   5. Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a clivagem do DNA é realizada por meio de MspI para a fração de DNA condutor, enquanto ela é realizada por meio de Sse8387I para a fração de DNA alvo.

   6. Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a clivagem do DNA é realizada por meio de onda ultrassônica ou por força de cisalhamento mecânica.

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   7. Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade caracterizado pelo fato de que uma amostra de DNA contendo gene que está presente em pequena quantidade e gene que está presente em grande quantidade é submetida às seguintes operações, de modo que o gene que está presente em pequena quantidade é separado do gene que está presente em grande quantidade:

   (a) a amostra de DNA é dividida em duas partes iguais: uma amostra de DNA é chamada de fração de DNA condutor, enquanto a outra amostra de DNA é chamada de fração de DNA alvo;

   (b) o DNA é clivado em cada uma das frações de DNA condutor e DNA alvo; nesse momento, o peso molecular do DNA condutor é tornado menor que o peso molecular do DNA alvo; opcionalmente, um adaptador de ligação é aderido ao DNA alvo, de modo que a extensão média de cadeia do DNA condutor é de 200-300 pares de base e a extensão média de cadeia do DNA alvo é de 1000 ou mais pares de base;

   (c) o DNA é tornado de filamento único em cada uma das frações de DNA condutor e DNA alvo;

   (d) o DNA condutor do item anterior é fixado sobre um veículo;

   (e) o veículo onde o DNA condutor de filamento único é fixado é contatado ou misturado com uma solução do DNA alvo tornado de filamento único do item (c) para realização de uma hibridização;

   (f) o veículo e a solução do DNA alvo do item (e) são separados e o DNA alvo formador de um duplo filamento com o DNA condutor é removido; e (g) as operações (e) e (f) são realizadas uma ou mais vezes usando a solução de DNA alvo obtida em (f) ao invés da solução de DNA alvo.

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5. 8. Método para concentração de gene que está presente em pequena quantidade, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a amostra de DNA é preparada a partir de um espécime em que pelo menos dois tipos de micróbios, tecidos de organismo ou células são misturados ou é um ácido nucleico extraído a partir de organismos individuais, tecidos ou células de organismos e/ou uma amostra de DNA preparados a partir do dito ácido nucleico.
6. 9. Método para análise de gene raro caracterizado por compreender uma etapa em que o gene que existe em pequena quantidade, daqui em diante referido como “gene raro”, é concentrado pelo método conforme definido nas reivindicações 1 a 8, uma etapa em que o gene raro é obtido a partir da amostra de DNA resultante em que o gene raro é concentrado e uma etapa em que a sequência base do gene raro é analisada.

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