BRPI0200585B1 - processo para a identificação e contagem de células biológicas em uma amostra de sangue. - Google Patents

Abstract

"reagente e processo para a identificação e contagem de células biológicas em uma amostra". a presente invenção refere-se a um reagente e a um processo para a identificação e a contagem de células biológicas em uma amostra. esse reagente compreende um agente de lise celular escolhido entre pelo menos um detergente em uma concentração eficaz para lisar especificamente um determinado tipo de célula da amostra, e um colorante próprio para marcar os ácidos nucleicos intracelulares das células restantes não lisadas. aplicação, em particular, para a identificação e a contagem de células a partir de um autômato de análise baseado na citometria de fluxo.

Description

"PROCESSO PARA A IDENTIFICAÇÃO E CONTAGEM DE CÉLULAS BIOLÓGICAS EM UMA AMOSTRA DE SANGUE" Campo da Invenção A presente invenção refere-se as análises biológicas e, particularmente, as análises de sangue.

Esta se refere mais particularmente a um reagente e de um processo para a identificação e a contagem de células biológicas em uma amostra, em particular em uma amostra de sangue.

Antecedentes da Invenção A amostra biológica pode ser de sangue humano ou animal, ou ainda, qualquer outro liquido biológico ou preparação biológica.

No campo das análises biológicas, a importância do diagnóstico da determinação e da contagem precisa de diferentes populações celulares é conhecida há muito tempo. De fato, o aparecimento de relações anormais de equilíbrio entre populações celulares normais do sangue pode ser correlacionada com o aparecimento de certas doenças, por exemplo, reações imunológicas, inflamatórias, etc. Da mesma forma, o aparecimento de populações celulares anormais pode também ser correlacionada com o aparecimento de outras moléstias como leucemias, etc.

Os métodos tradicionais de análise citológica podem ser variados e compreendem a observação microscópica após coloração, e eventualmente sedimentação ou agregação. A determinação automática das células sangüíneas começou no início da década de 1960 pela separação das principais populações leucocitárias normais. Vide a seguinte referência bibliográfica: (1) Hailerman L., Thom R., Gerhartz H,: Eiektronische Differeníialzàhlzun von Granulocyten and Lymphocyten rtach intervaler Fluochromierung mit Acrídinorange” Verh Deutsch Ges Inn Med 70: 217, 1964. A separação dos leucócitos foi realizada em citometria de fluxo pela utilização de múltiplos princípios que envolvem as propriedades ópticas e químicas das células. Vários autômatos de hematologia foram fabricados, utilizando técnicas variadas, como o princípio de Coulter para a determinação dos volumes, a medição de luz difratada para a estimativa dos tamanhos, a medição de luz difundida a 90° para a determinação das estruturas internas das células, e as medições de fluorescência ou de absorção para a determinação das afinidades celulares com diversos colorantes. Veja as referências bibliográficas 2 a 5 indicadas a seguir: (2) Ada ms L. R., Kamensky L. A. : Fiuorometric Characterízation of Six Classes of Human Leukoeytes Acta Cytol. 18: 389, 1974; (3) Shapiro HL M. et al. Combined Blood Celi Counting and Classlfication wlth Fluorochrome Stains and Flow Instrumentatlon J, Histochem Cytochem 24: 396-411, 1976; (4) Terstappen L. W. et al. Multidimensional Flow Cytometríe Blood Cefl Differentiation withoui Erythrocyte Lysis. Blood Cells 17: 585-602, 1991; (5) Terstappen L. W., Levin J. Bone marrow Cell differential counts obtained by muitidimensional flow cytometry. Blood Cells 18 (2); 311-30, 1992. A caracterização de células em estágios precoces do ciclo celular vem interessando há muito tempo os cientistas e, a quantificação do conteúdo de cada célula de RNÀ é conhecida de longa data como sendo um parâmetro representativo desse ciclo. Veja as referências bibliográficas 2 a 5 acima e as referências bibliográficas 6 e 7 indicadas a seguir: <6) Traganos F., Darzynkiewicz Z., Sharpless T., Mclamed M. R. Simultaneous Staining of Ribonucleic and Deoxyribonucleic Acids in Unfíxed Cells Using Acridine Orange in a Flow Cytofluorometríc System. J. Histochem 25: 46, 1977; (7) Pollack A. et al., Flow Cytomeínc Anafysis of RNA Content in Diffenentia! Cefl PopuJatíon Using Pyronin Y and Methyl Green. Cytometry, vol. 3, n° 1, páginas 28-35, 1982.

Na patente FR 9701090, de 31 de janeiro de 1997, a Depositante descreveu uma composição, e mais particularmente um reagente de coloração, que permite esse tipo de análise.

Para automatizar essas técnicas, ê preciso resolver primeiramente problemas múltiplos como, em particular, a redução dos tempos e do custo de tratamento das amostras. Essa redução pode ser abordada de diferentes maneiras, sendo que a mais evidente è a redução do número de canais para possibilitar apenas uma única preparação celular por vez. Esse tipo de técnica foi previamente descrito por Léon W. Terstappen {referência 4 acima), mas requer um tempo de tratamento e de análise elevado, particularmente para a contagem precisa das células nucleadas cuja quantidade é geralmente mil vezes menor que as células eritrocitárias.

Geralmente, para corrigir isso, a amostra biológica é freqüentemente separada em pelo menos duas alíquotas, sendo que uma delas é preparada a uma certa concentração que permite o estudo das células eritrocitárias e das plaquetas, e a outra é preparada em uma concentração mais elevada para a análise das células nucleadas.

Essas técnicas conhecidas apresentam diversos inconvenientes.

Previamente à análise, o tratamento dessa alíquota compreende freqüentemente a destruição específica das células eritrocitárias para facilitar a medição das células restantes. Esse método permite obter mais rapidamente os resultados das observações, mas é todavia dificultado pelos tempos de reação, de transferência e de coloração para obter a preparação desejada. O tempo de incubação de uma suspensão celular em uma solução reativa está partícula rmente ligado ao tempo necessário para que os princípios ativos penetrem no interior das células. Na patente FR 9701090 já citada, a Depositante descreveu meios para acelerar essa penetração graças à utilização de um aditivo, em particular de um aditivo do tipo ionóforo, para auxiliar a penetração celular. O tempo de tratamento é também função do número de etapas sucessivas que a alíquota deverá sofrer. A lise e a coloração das células são geralmente realizadas em duas etapas sucessivas, em uma ordem ou outra (vide patente US 6004816).

Essas duas etapas de diluição implicam um custo não desprezível de material, associado a um tempo de tratamento mínimo elevado. É consequentemente uma finalidade da presente invenção propor um reagente para a identificação e a contagem das células biológicas que supere os inconvenientes acima citados. É, em particular, um objetivo da presente invenção proporcionar tal reagente que permita efetuar simultaneamente a líse de certas células, em particular, de células eritrocitárias, a fixação das células nucleadas e a coloração do material intracelular. É também um objetivo da presente invenção proporcionar tal reagente que permita realizar essas operações em um tempo restrito para reduzir de forma significativa os custos e os tempos de análise, e o número de reagentes.

Descrição da Invenção A presente invenção propõe para esse fim um reagente para a identificação e a contagem de células biológicas em uma amostra, o qual compreende: - um agente de lise celular escolhido entre pelo menos um detergente em uma concentração eficaz para lísar especifica mente um determinado tipo de células da amostra, e - um colorante próprio para marcar os ácidos nucleicos intracelulares das células restantes náo lisadas. A presente invenção proporciona também um reagente de lise e de coloração simultânea de uma amostra biológica que permite obter em uma etapa única uma solução de células que pode ser analisada, por exemplo, por um sistema de citometria de fluxo, Essa análise permite obter uma classificação e uma contagem das células assim tratadas.

Assim, o reagente da presente invenção combina uma solução reativa do tipo descrita na patente FR 9701090 com um agente de lise celular que permite lisar especificamente um determinado tipo células da amostra, em particular, as células eritrocitárias. A solução reativa colorante em si mesma, descrita na patente FR9701090, permite acelerar a permeação através da membrana para a coloração das células biológicas da amostra, Essa solução colorante pode ser utilizada tanto antes quanto depois da lise das hemácias segundo os tipos celulares a serem estudados. Assim, o princípio reativo dessa solução colorante foi conservado e transposto em uma solução lítica que permite uma destruição das hemácias e uma coloração das células restantes prevíamente à medição, O agente de lise celular compreende vantajosa mente pelo menos um detergente tônico e/ou não tônico em uma concentração própria para lisar os eritrócitos. O detergente da presente invenção é vantajosamente escolhido entrei - as aminas primárias, os acetatos e clorídratos de aminas, os sais de amônia quaternária e o brometo de trimetilcetil amônio; - as amidas de diaminas substituídas, a dietanolamino- propilamina ou a d iet ΪΙ am ino-p ro pi Ia m ida, as amidas de dietilenotríaminas cíclicas, - os alquilaril sulfonatos, sulfonatos de petróleo, glicerídeos sulfonados; - as colamidas, as sulfobetaínas; - os alquil glicosídeos, as saponinas; - os polioxietileno éteres e sorbitanos, e os poliglicol éteres.

Em um exemplo de realização, esse detergente compreende uma mistura de Triton X1G0 em uma concentração de 0,05 % (p/v) e de Tween 20 em uma concentração de 0,0001 % (v/v).

Em toda a descrição, a expressão "p/vw significa Mpeso/volume” e a expressão “v/v'! significa “volume/volume". O colorante utilizado é vantajosa mente do tipo fluorescente.

Vantajosamente, escolhemos um colorante que seja próprio para se associar especificamente com o ácido ribonucleíco intracelular e para aumentar sua fluorescência, depois que tiver sido associada a ele. O colorante da presente invenção pode ser escolhido em particular entre os seguintes colorantes: - o tiazoi laranja ou o 1-metil-4-[(3-metil-2-(3H)-benzotiazolilideno) metiljquinolínio p-tosilato, - o tiazoi azul, - o quinolínio, 4-[(3-metil-2-(3H)-benzotiazolilideno)metíl]-1[3-(trimetilamônio)propil], diodeto, - o S.S^dimetiloxacarbocianina íodeto ou 3-metil-2-[3-(3-metil-2{3H)-benzoxazolilideno)- 1 -propeniljbenzoxazólio íodeto, - a tioflavina T, - os colorantes SYTO®1 e TOTO® (TM Molecular Probes), - o brometo de etídio, - o iodeto de propídio, - a acridina laranja, - a corifosfina O, - a auramina O, - os colorantes HOECHST 33258 e HOECHST 33342, - o 4\6-diamino-2-fenilindol, diidrocloreto (DAPI), - o 4\6-(diimidazolin-2-il)-2-fenilindol diidrocloreto (DIPI), - a 7 aminoactinomicina-D, - a actinomicina-D, e - o LDS751, Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o reagente compreende ainda pelo menos um agente de penetração através da membrana próprio para favorecer a penetração do colorante nas células a serem marcadas. O agente que favorece a penetração através da membrana é vantajosa mente um composto ionóforo de tipo protonóforo e/ou antibiótico.

Esse agente está geralmente presente em uma concentração inferior a 0,005 % (p/v), Um exemplo de antibiótico utilizável é a valinomicina. É vantajoso que o reagente compreenda, ainda, pelo menos um agente de fixação através da membrana presente em uma concentração de 0,1% a 10% (p/v). Esse agente de fixação compreende, de preferência, pelo menos um álcool e/ou um aldeído. A esse título, preferímos utilizar, por exemplo, o paraformaldeído ou o glutaraldeído.

Também esta no âmbito da presente invenção prever outros aditivos ou componentes no reagente.

Assim, esse reagente pode compreender, ainda, pelo menos um composto escolhido entre um agente complexante, um sal inorgânico e um sistema tampão.

Sob outro aspecto, a presente invenção trata de um processo para a identificação e a contagem de células biológicas em uma amostra, em particular, em uma amostra de sangue, o qual compreende as seguintes operações: - misturar e incubar a amostra com um reagente tal como definido acima para realizar, em uma única etapa, a lise de células de um determinado tipo, em particular de células eritrocitárias, a coloração dos ácidos nucleicos intracelulares e a fixação das células nucleadas; - medir a solução resultante em citometria de fluxo com pelo menos dois parâmetros de medida escolhidos entre o volume de resistência, a difração luminosa no eixo, a transmissão luminosa no eixo, a difusão luminosa ortogonal e a fluorescência; e - classificar e contar as células nucleadas em populações, através dos parâmetros mensurados.

Na medição em citometria de fluxo, o parâmetro de difração luminosa no eixo é pelo menos um parâmetro escolhido entre a difração nos pequenos ângulos e a difração nos grandes ângulos.

Essa medição pode ser realizada por meio de um citômetro de fluxo que possui os parâmetros convencionais tais como a difração no eixo ou “ESC” (Forward Scatter), a difusão ortogonal ou "SSC" (Side Scatter), a fluorescência (FL1) seja ortogonal, seja no eixo, seja em epi-fluorescência, tudo isso sendo polarizado ou despolarizado, mas também parâmetros de medida adicionas tais como a medida de luz transmitida ou a volumetria de resistência, tais como descritas na patente FR 8914120 de 27 de outubro de 1989. A resistividade pode ser medida por meio de uma corrente contínua (DC) a fim de expressar o volume dos elementos e/ou por meio de uma corrente pulsada ou alternada (RF) a fim de expressar as diferenças densimétricas internas que se aproximam da determinação da estrutura, Desses parâmetros podem ser extraídos conjuntos de informações multiparamétrícas para cada uma das células analisadas que permitem sua classificação, A classificação será tanto mais precisa quanto mais apropriados e numerosos forem os parâmetros que definem as células. Esse tipo de estudo multiparamétrico já foi descrito anteriormente (veja as referências bibliográficas 4 e 5 acima).

De acordo com a presente invenção, as células nucleadas classificadas são indiferentemente células maturas ou imaturas, normais ou anormais. A classificação das células nucleadas é efetuada por processos conhecidos. Ela pode ser realizada por um software de análise multidimensional com ou sem recurso de uma técnica neuronal informatizada ou não.

De acordo com a presente invenção, a amostra biológica pode ser uma amostra de sangue humano ou animal, ou ainda uma amostra de liquido biológico ou uma suspensão de células, de origem humana ou animal, Essa amostra é misturada com uma solução reativa em condições de temperatura definidas. A cinética da reação faz com que as células eritrocítárias sejam primeiramente destruídas, sendo que a penetração do colorante é auxiliada paralelamente à fixação das células que se faz mais lentamente. A presente invenção será descrita agora em relação ao exemplo a seguir: Exemplo De acordo com este exemplo, utilizamos um reagente com a seguinte composição: Agente complexante EDTA 0,02% (p/v) Sal inorgânico NaCI 0,85% (p/v) Sistema tampão Fosfatos 0,5% (p/v) Detergentes TritonXlOO 0,05% (p/v) Tween 20 0,0001% (v/v) lonóforo Valinomicina 0,003% (p/v) Colorante Tiazol laranja 0,005% (p/v) Aldeído Paraformaldeído 1% (p/v) Uma amostra de sangue total ê misturada à solução reativa acima. Após uma incubação de alguns segundos (tipicamente da ordem de 15 a 30 segundos), a solução é analisada por meio de um conjunto de citometria de fluxo que compreende os seguintes parâmetros: difração no eixo (FSC) que dá uma interpretação do tamanho, difusão ortogonal (SSC) que expressa a estrutura dos elementos observados e fluorescência ortogonal (FL1) que permite medir a expressão do ácido ribonucleico intracelular.

Os resultados assim obtidos são observados em modo multidimensional, a fim de determinar as inter-relações das diferentes populações entre cada parâmetro.

Vamos nos referir agora às Figuras 1 a 4 que representam os resultados obtidos com uma amostra de sangue humano normal. A Figura 1 representa a matriz obtida por meio de dois parâmetros de difração no eixo (FSC) e de difusão ortogonal (SSC). Quatro populações destacam-se nitidamente: L que representa os linfócítos, M que representa os monócitos, N que representa os neutfófilos polinucleares e E que representa os eusinófilos polinucleares. As populações IG para imaturos granulosos, BL para blastos, B para basófilos polinucleares e ErB para erítroblastos estão indicadas mas não dissociáveis em apenas duas dimensões. A Figura 2 representa a matriz formada pelos parâmetros de difração no eixo (FSC) e de fluorescência (FL1). As mesmas quatro populações representadas na Figura 1 reaparecem, mas estão organizadas de forma diferente. As céiulas mononucleadas L e M formam o grupo superior de fluorescência média e as células polimorfonucleadas N, EeB formam o grupo inferior de fluorescência fraca. A população ErB dos erítroblastos está nitidamente separada na ponta dos dois grupos assim formados. As localizações normais das populações BL e IG estão indicadas. A Figura 3 representa a matriz formada pelos parâmetros de difusão ortogonal (SSC) e de fluorescência (FL1). As mesmas populações encontram-se organizadas de uma maneira diferente, mas permitem isolar as populações IG e BL (em pequenas quantidades em uma amostra normal). A Figura 4 representa visão tridimensional das populações obtidas.

As Figuras 5 a 8 representarão os mesmos tipos de resultados que as Figuras 1 a 4 respectiva mente, mas obtidos com uma amostra que apresenta células blástícas (B1) e tratada segundo a presente invenção.

As Figuras 9 a 12 representam os mesmos tipos de resultados que as Figuras 1 a 4 respectivamenfe, mas obtidos com uma amostra que apresenta células granulocitárias imaturas (IG) e tratada segundo a presente invenção, O reagente e o processo da presente invenção permitem assim, em uma única etapa, realizar uma lise específica e uma coloração simultânea de células biológicas em uma amostra, em particular em uma amostra de sangue humano ou animal, Podemos assim obter rapidamente uma identificação e uma contagem de células a partir de um autômato de análise baseado na citometria de fluxo.

Claims (6)

1. PROCESSO PARA A IDENTIFICAÇÃO E CONTAGEM DE CÉLULAS BIOLÓGICAS EM UMA AMOSTRA DE SANGUE, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes operações: misturar e incubar a amostra com um reagente compreendendo um agente de líse celular escolhido entre pelo menos um detergente iônico e/ou não iônico em urna concentração eficaz para lisar especificamente eritrócitos, escolhidos a partir de aminas primárias, acetatos e cioridratos de aminas, sais de amônia quaternária e brometo de trimetilcetil amônio; amidas de diaminas substituídas, dietanolamino-propilamina ou d ieti Ia m ino-prop ilam ida, amidas de dietilenotriaminas cíclicas; alquilanl sulfonatos, sulfonatos de petróleo, glicerideos sulfonados; colamidas, sulfobetaínas, alquil glicosídeos, saponinas; polioxietileno éteres e sorbitanos, e poliglícol éteres; um colorante próprio para marcar os ácidos nucleicos intracelulares das células restantes não lísadas; e um agente de penetração através da membrana capaz de promover a penetração do colorante nas células a serem marcadas, selecionado a partir de um composto ionóforo de tipo protonóforo, um composto ionóforo de tipo antibiótico ou uma mistura de íonóforos; para realizar, em uma única etapa, a líse de eritrócitos, a coloração dos ácidos nucleicos intracelulares e a fixação das células nucleadas; medir a solução resultante em citometria de fluxo com pelo menos dois parâmetros de medida escolhidos entre o volume de resistência, a difração luminosa no eixo, a transmissão luminosa no eixo, a difusão luminosa ortogonal e a fluorescência; e, classificar e contar as células nucleadas em populações, por melo dos parâmetros mensurados.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a medida da resistividade é efetuada por meio de pelo menos uma corrente escolhida entre uma corrente contínua (DC) e uma corrente pulsada ou alternada (RF).

3. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o parâmetro de difração luminosa no eixo é pelo menos um parâmetro escolhido entre a difração nos pequenos ângulos e a difração nos grandes ângulos.

4. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as células nucleadas classificadas são índiferentemente células maturas ou imaturas, normais ou anormais.

5. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a classificação das células nucleadas é realizada por um software de análise multidimensional com ou sem recurso de uma técnica neuronal informatizada ou não.

6. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de sangue humano ou animal.