BRPI0204489B1 - "derivado de rodamina, composição farmacêutica, intermediário, e, processo para a síntese de novos derivados rodamina". - Google Patents

Abstract

"derivados de rodamina, composto, intermediários, processos para a síntese de derivados de rodamina, uso de um composto, métodos para a terapia fotodinâmica de pacientes, para purga in vitro da medula óssea humana, para o tratamento de leucemias, de distúrbio imunológico e de infecções geradas por bactérias e para prevenção de doença, composição farmacêutica fotoativável composição e solução bactericida e medicamento". novos compostos de fórmula (i) em que: um de r1, r2, r3, r4 e (r10)n representa um átomo de halogêneo e cada um dos restantes r1, r2, r3, r4 e cada um do grupo r10 remanescente é independentemente selecionado do grupo constituído por hidrogênio, átomos de halogêneo, um grupo amino, acilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, azacicloalquila, alquilcicloalquilamino, aroilamino, diarilamino, arilalquilamino, aralquilamino, alquilaralquilamino, arilaralquilamino, hidróxi, alcóxi, arilóxi, aralquilóxi, mercapto, alquiltio, ariltio, aralquiltio, carboxila, alcoxicarbonila, ariloxicarbonila, aralcoxicarbonila, carbamoíla, alquilcarbamoíla, dialquilcarbamoíla, ciano, hidroxissulfonila, amidossulfonila, dialquilamidossulfonila, arilalquilamidossulfonila, formila, acila, aroíla, alquila, alquileno, alquenila, arila, aralquila, vinila, alquinila e pelos correspondentes grupos substituídos: m=0-1; n=1-4, a é nada, o ou nh; r9 representa um grupo alquileno; - z -e h, sal amino, dialquilamino ou trialquilamino; x- é um ânion; r5, r6, r7 e r8 são independentemente h ou c1-c6 alquila ou r1, em combinação com r5 ou r6, ou r2, em combinação com r7 ou r8, ou r4, em combinação com r7 ou r8, representa um alquileno, sozinho ou em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. estes compostos, que são úteis como intermediários e como bactericidas, como agente antiviral e no tratamento de distúrbios imunológicos

Description

“DERIVADO DE RODAMINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, INTERMEDIÁRIO, E, PROCESSO PARA A SÍNTESE DE NOVOS DERIVADOS RODAMINA” CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a novos derivados de rodamina, que são úteis por suas propriedades farmacêuticas e não farmacêuticas.

Os derivados de rodamina da presente invenção exibem poderosas atividades bactericida e antiviral.

Eles são úteis, sozinhos ou em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável, no tratamento e/ou na prevenção de distúrbios imunológicos.

Além disso, aqueles derivados são úteis como intermediários na síntese de outros novos derivados de rodamina e também na nova síntese dos já conhecidos derivados de rodamina.

Finalmente, a presente invenção também refere-se a novos processos para a preparação de derivados de rodamina.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A terapia fotodinâmica tem sido usada como um método para a erradicação de células neoplásticas de enxertos autólogos para tratamentos de câncer. Este método baseia-se no uso de corantes fotossensibilizadores, que, quando ativados com luz de um particular comprimento de onda, produz radicais O2' tóxicos, fmalmente resultando em morte da célula. Os tratamentos fotoquímicos têm também sido usados para inativação patogênica, tal como na “descontaminação” de sangue e produtos derivados de sangue. O perigo da transmissão patogênica, através de transfusão de sangue integral, concentrados de plaquetas, plasma e/ou glóbulos vermelhos, representa ainda as principais preocupações em medicina. Embora tenha havido impressionante progresso na prevenção e manutenção da segurança do sangue referente à presença de microorganismos, os componentes sangüíneos continuam a levar risco de transfusão de patógenos. Além disso, a presença de vírus nos componentes do sangue é também de grande preocupação, principalmente quanto a presença do vírus da Hepatite C e do vírus de imunodeficiência humana (HIV), mesmo embora o risco de contaminação seja reduzido para níveis desprezíveis. A presença de outros vírus é também requerida e inclui o vírus linfotrófico da célula T humana tipo 1 (HTLV-1), Hepatite B (HBV) e citomegalovírus. Os compostos fotodinâmicos, tais como pseuralenos, porfirinas, riboflavinas e dimetil de azul de metileno, têm sido usados no tratamento de patógenos em produto sangüíneo. Estes compostos necessitam radiação por uma lâmpada ultravioleta A (UVA) para serem ativados, assim conduzindo a possível efeito mutagênico nas restantes células presentes nas amostras tratadas (Corash, L., Inactivation of infectious pathogens in labile blood components: meeting the challenge, Transfiis Clin Biol, 2001, 8, 138-145Lin, L., Londe, H., Janda, M. J., Hanson, C.V. e Corash, L., Photochemical inactivation of pathogenic bactéria em human platelet concentrates, Bloos, 1994, 83, 9, 2698-2706; Lin, L, Londe, H., Hanson, C.V., Wiesehahn, G., Isaacs, S., Cimino, G. e Corash, L., Photochemical inactivation of cell-associated human immunodeficiency virus in platelet concentrates, Blood, 1993, 82, 1, 292 - 297; Lin, L., Eiesehahn, G. P., Morei, P.A. e Corash, L., Use of 8-metoxypsoralen e long-wavelength ultraviolet radiation for decontamination of platelet concentrates, Blood, 1989, 74, 1, 517-525; Lin, L., Cook, D.N., Wiesehahn, G. P., Alfonso, R., Behrman, B., Cimino, G. D., Corten, L., Damonte, P.B., Dikeman, R., Dupuis, K., Fang, Y.M. Hanson, C.V., Heasrt, J. E., Lin, C. Y., Londe, H., Metchette, K., Nerio, A.T., Pu, J.T., Reames, A.A., Rheinschmidt, M., Tessman. J., Isaacs, S.T., Wollowitz, S. e Corash, L., Photochemical inactivation of viruses and bactéria in platelet concentrates by uso of a novel psoralen and long-wavelength ultraviolet light, Transfusion, 1997, 37, 423-435). Por causa da exposição UVA aos componentes de sangue, estas técnicas não são inteiramente satisfatórias. Entretanto, houve necessidade de novos derivados sensíveis à luz, que não necessitem de exposição a UVA dos componentes de sangue e que possam também ser uma substituição mais segura e mais aceitável para os componentes de sangue tratados com UVA.

Os distúrbios imunológicos são proliferações celulares descontroladas, que resultam da produção de células imunes reconhecendo as células e tecidos normais como estranhos. Após um período de latência variável, durante o qual elas são clinicamente silenciosas, as células com imunorreatividade para as células normais induzem avarias nestas células e tecidos normais. Tais distúrbios imunológicos são usualmente divididos em condições aloimunes e condições autoimunes. Os distúrbios aloimunes ocorrem principalmente no contexto do transplante alogênico (medula óssea e outros órgãos; rins, coração, fígado, pulmões etc.). No cenário do transplante de medula óssea, as células imunes doadoras, presentes no enxerto de célula tronco hematopoiética, reagem em direção aos tecidos normais hospedeiros, provocando doença de enxerto-versus-hospedeiro (GVHD). A GVHD induz avaria principalmente ao fígado, pele, cólon, pulmão, olhos e boca. Os distúrbios autoimunes consistem de numerosas condições artríticas, tais como artrite reumatóide, esclerodema e lúpus eritematoso; as condições endócrinas, tais como diabetes melitus; condições neurológicas, tais como esclerose múltipla e miastenia grave; distúrbios hematológicos, tais como anemia hemolítica autoimune etc. A reação imune, em distúrbios tanto aloimunes como autoimunes, progride para gerar disfimção e avaria de órgão.

Apesar dos importantes avanços no tratamento, as complicações imunológicas permanecem a causa principal do fracasso dos transplantes alogênicos, quer em transplante de célula tronco hematopoiética (GVHD) ou em transplante de órgão sólido (rejeição de enxerto). Além disso, os distúrbios autoimunes representam a causa principal tanto da morbidez como da mortalidade. A prevenção e tratamento destes distúrbios imunes tem-se baseado principalmente no uso de agentes imunossupressores, terapias baseadas em anticorpo monoclonal, terapia de radiação e, mais recentemente, inibidores moleculares. Melhoria significativa no resultado tem ocorrido com o desenvolvimento continuado de modalidades combinadas, porém para um pequeno número de distúrbios e pacientes. Entretanto, para os tipos mais freqüentes de transplantes (medula óssea, rins, fígado, coração e pulmões) e para a maioria dos distúrbios imunes (artrite reumatóide, doenças do tecido conectivo, esclerose múltipla etc.) a resolução da disfunção imunológica e da cura não tem sido alcançada. Portanto, o desenvolvimento de novos caminhos para a prevenção e tratamento de pacientes com distúrbios imunológicos é criticamente necessário, particularmente para aqueles pacientes que estão em alto risco ou cuja doença tem progredido e são refratários à terapia imunossupressiva padrão. O transplante de célula tronco alogênico (AlloSCT) tem sido empregado para o tratamento de numerosas condições malignas e não-malignas. O transplante de célula tronco alogênico é baseado na administração de quimioterapia de alta dose, com ou sem irradiação corporal total, para eliminar as células malignas, e células hematopoiéticas hospedeiras. As células tronco doadoras hematopoiéticas normais são então infundidas dentro do paciente, a fim de substituir o sistema hematopoiético hospedeiro. O AlloSCT tem mostrado induzir taxas de resposta aumentadas, quando comparado com opções terapêuticas padrão. Um importante problema que necessita ser salientado quando empregando-se AloSCT refere-se ao risco de reinfundir células imunes, que subseqüentemente reconhecerão as células do paciente como estranhas e causarão GVHD. Uma variedade de técnicas foi desenvolvida que pode esgotar até 105 de células T da medula ou sangue periférico. Estas técnicas, incluindo purga imunológica e farmacológica, não são inteiramente satisfatórias. Uma consideração principal, quando purgando-se enxertos de célula tronco, é preservar as células T reativas não hospedeiras, a fim de que elas possam exercer atividade antiinfecciosa e anti-leucêmica quando do enxerto. O potencial da terapia fotodinâmica, em associação com moléculas fotossensibilizantes, capazes de destruir as células imunologicamente reativas, enquanto poupando as células imunes hospedeiras-não-reativas normais, para purgar os enxertos de células hematopoiéticas, na preparação para AlloSCT ou transplante de célula tronco autóloga (AutoSct) e após AlloSCT no contexto das infusões de linfócitos doadores para eliminar as células leucêmicas recorrentes, tem sido largamente não explorado. Para obter-se a erradicação das células T, diversos caminhos têm sido propostos, incluindo: 1) exposição in vitro do enxerto a anticorpos monoclonais e imunotoxinas contra antígenos presentes na superfície das células T (anti-CD3, anti-CD6, anti-CD8 etc.); 2) seleção in vitro por aglutinina da soja e rosetação dos glóbulos vermelhos do carneiro; 3) seleção positiva de células troncos CD34-I-; e 4) terapia in vivo com combinações de globulina anti-timócito ou anticorpos monoclonais. 5) exposição in vitro de células T doadoras reativas recipientes alvejando-se anticorpos monoclonais ou imunotoxinas no receptor da interleucina 2 ou antigene OX-40 (Cavazzana-Calvo M. e outros (1990) Transplantation, 50:1-7; Tittle T.V. e outros (1997) Blood 89:4652-58; Harris D.T. e outros (1999) Bone Marrow Transplantation 23:137-44).

Entretanto, a maioria destes métodos não é especificamente direcionado ao subconjunto de células T alorreativas e associada com numerosos problemas, incluindo recorrência de doença, rejeição de enxerto, malignidades secundárias e infecções severas. Além disso, a relevância clínica de diversos destes métodos permanece para ser estabelecida. Há muitos informes sobre o uso de terapia fotodinâmica no tratamento de malignidades (Daniell M. D., Hill J. S. (1991) Aust. N. Z. J. Surg., 61: 340-348). O método tem sido aplicado para cânceres de várias origens e, mais recentemente, para a erradicação dos vírus e patógenos (Raab O. (1990) Infusoria Z. Biol. 39: 524).

Os experimentos iniciais sobre o uso de terapia fotodinâmica para tratamento do câncer, empregando-se várias substâncias fotoativáveis, naturalmente ocorrentes ou sinteticamente produzidas, foram publicados cedo neste século (Jesionek A., Tappeiner V.H. (1903) Muench Med Wochneshr, 47: 2042; Hansman W. (1911) Biochem. Z., 30: 276). Nos anos 40 e 60, uma variedade de tipos de tumor foi submetida a terapia fotodinâmica, tanto in vitro como in vivo (Kessel, David (1990) Photodynamic Therapy of neoplastic disease, Vol. I, Π, CRC Press. David Kessel, Ed. ISBN 08-8493-5816-7 (v. 1), ISBN 0-8493-5817-5 (v. 2)). Dougherty e colegas e outros, nos anos 70 e 80, sistematicamente exploraram o potencial da aplicação oncológica da terapia fotodinâmica (Dougherty T. J. (1974) J. Natl. Câncer Inst., 51: 1333-1336; Dougherty T. J. e outros (1975) J. Natl Câncer Inst., 55: 115-121; Dougherty T. J. e outros (1978) Câncer Res., 38: 2628-2635; Dougherty T. J. (1984) Urol. Suppl., 23: 61; Dougherty T. J. (1987) Photochem. Photobiol., 45: 874 - 889).

Tratamento de células imunorreativas com terapia fotodinâmica Há atualmente uma falta de agentes que permitam a destruição seletiva de células imunorreativa, enquanto deixando intacta a população celular residual suprimida. A absorção preferencial do corante fotossensível e a citotoxicidade da terapia fotodinâmica contra a leucemia (Jamieson C. H. e outros (1990) Leuk Res., 14: 209-219) e células linfóides (Greinix H.T. e outros, Blood (1998) 92:3098-3104; são revistas em Zic J. A. e outros Therapeutic Apheresis (1999) 3:50-62) foram anteriormente demonstradas.

Seria altamente desejável ser-se providos fotossensibilizadores que possuam pelo menos uma das seguintes características: i) localização preferencial e absorção pelas células imunorreativas; ii) na aplicação de apropriadas intensidades de luz, matar aquelas células que tenham acumulado e retido os agentes fotossensíveis; iii) poupar o compartimento da célula tronco hemopoiética normal dos efeitos destrutivos dos fotossensibilizadores ativados; e iv) utilização potencial de fotossensibilizadores para purga de célula tronco hematopoiética de células imunorreativas em preparação para transplante de células tronco alogênicas ou autólogas. v) utilização potencial de fotossensibilizadores para eliminação ex vivo de células imunes reativas, em pacientes com distúrbios imunológicos.

Corantes de rodamina Rodamina 123 (2-(6-amino-3-imino-3H-xanteno-9-ila) cloridreto de éster metílico do ácido benzóico), um corante catiônico lipofílico da classe pirílio, que pode romper a homeostase celular e ser citostático ou citotóxico em exposição de alta concentração e/ou terapia fotodinâmica, embora com uma muito fraca produção quântica (Darzynkiewicz Z., Carter S. (1988) Câncer Res., 48: 1295 - 1299). Ela tem sido usada in vitro como uma mancha fluorescente específica para mitocôndrias vivos. Ela é absorvida e é preferivelmente retida por muitos tipos de célula tumorais, prejudicando sua proliferação e sobrevivência, pela alteração da membrana e função mitocondrial (Oseroff A. R. (1992) In Photodynamic therapy (Henderson B. W., Dougherty T. J., eds) New York: Marcei Dekker, págs. 79-91). In vivo, a quimioterapia com rodamina 123 pode prolonga a sobrevivência de camundongos cancerosos, porém, apesar das tentativas iniciais de utilizar rodamina 123 no tratamento de tomores, a toxicidade sistêmica da rodamina 123 pode limitar a utilidae (Bemal, S. D., e outros (1983) Science, 222: 169; Powers, S. K. e outros (1987) J. Neurosur., 67: 889). A Patente dos Estados Unidos No. 4.612.007, emitida em 16 de setembro de 1986 em nome de Richard L. Edelson, descreve um método para extemamente tratar sangue humano, com o objetivo de reduzir a população de linfócitos funcionando no sistema sangüíneo de um indivíduo humano. O sangue, retirado do indivíduo, é passado através de um campo de radiação ultravioleta, na presença de um agente fotoativo dissolvido, capaz de formar fotoadutos com DNA-linfocítico. Este método apresenta as seguintes desvantagens e deficiências. O procedimento descrito é baseado na utilização de agentes químicos fotoativos comercialmente disponíveis conhecidos, para extemamente tratar sangue de paciente, deixando a medula óssea e os clones leucêmicos residentes potenciais intactos no processo. De acordo com Richard L. Edelson, o método somente reduz, não erradica, a população de células alvo. Além disso, a faixa de comprimento de onda da radiação UV, usada no processo proposto por Richard L. Edelson, podería ser danosa para as células normais. O Pedido Internacional, publicado em 7 de janeiro de 1993, sob a publicação internacional número WO 93/00005, descreve um método para inativar patógenos em um fluido corporal, enquanto minimizando os efeitos adversos causados pelos agentes fotossensíveis. Este método consiste, essencialmente, de tratar as células na presença de um agente fotoativo, sob condições que realizem a destruição do patógeno, e de evitar que as células tratadas contatem a proteína extracelular adicional por um prolongado período de tempo. Este método refere-se à erradicação de agentes infecciosos do sangue coletado e seus componentes, antes da armazenagem ou transfusão.

Seria altamente desejável prover-se novos derivados de rodamina para o tratamento de células imunorreativas que superem estas desvantagens, enquanto não tendo toxicidade sistêmica para o paciente.

Os sais de rodamina halogenados são corantes que têm a propriedade de penetrar em células e geralmente localizando-se nos mitocôndrias. Eles têm sido usados em conjunto com fotoativação para matar certos tipos de células, isto é, células de câncer em Leucemia, e células-T ativadas em doenças autoimunes. O mecanismo geralmente aceito para o efeito de matar células é a produção do oxigênio singleto, que é o intermediário reativo no rompimento dos processos biológicos de sustentação da vida da célula. O papel do corante de rodamina, na produção do oxigênio singleto, é aquele de um fotossensibilizador, isto é, aquele de uma molécula que absorve a energia de luz incidente e transfere-a para o oxigênio de estado normal, desse modo elevando-o para seu estado excitado singleto, que é o intermediário reativo. É ainda sabido que a eficiência do processo de transferência de energia é grandemente aumentada pela presença de átomos pesados, tais como halogêneos, no cromóforo aromático do corante.

Um problema crítico que não foi tratado, entretanto, é a absorção diferencial do fotossensibilizador pelas células alvo relativas às outras células normais. Na realidade, sabe-se que a absorção é geralmente uma função da estrutura molecular do corante sendo absorvido e que esta propriedade varia com diferentes tipos de célula.

Entretanto, seria altamente desejável ser-se provido com uma série de novos corantes de rodamina halogenados, contendo uma variedade de substituintes em diferentes posições da molécula, desse modo tomando disponíveis novos corantes seletivos para células alvo específicas.

Um objetivo da presente invenção é produzir novos fotossensibilizadores dotados das seguintes características: i) localização preferencial e absorção pelas células imunorreativas; ii) na aplicação de apropriadas intensidades de luz, morte daquelas células que têm acumulado e retido agentes fotossensibilizantes; iii) poupar o compartimento de célula tronco hemopoiética normal dos efeitos destrutivos dos fotossensibilizadores ativados; iv) utilização potencial de fotossensibilizadores para purga de célula tronco hematopoiética de células imunorreativas, na preparação para transplante de célula tronco alogênica ou autóloga; e v) Utilização potencial de fotossensibilizadores para eliminação ex vivo de células imunes reativas em pacientes com distúrbios imunológicos.

Portanto, de acordo com a presente invenção, é provida uma série de novos derivados de rodamina, sozinhos ou em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável; por meio do que a fotoativação de ditos derivados induz a matança de células, enquanto os derivados inativados, de estrutura geral representada pela fórmula (I), e seus sais são substancialmente não-tóxicos para as células.

De acordo com a presente invenção, é também provido o uso de derivados de rodamina fotoativáveis de acordo com a invenção, para o tratamento fotodinâmico para a destruição seletiva e/ou inativação de células imunologicmente reativas, sem afetar as células normais e sem causar toxicidade sistêmica para o paciente, em que os níveis intracelulares de ditos derivados são obtidos e a irradiação de um comprimento de onda e intensidade adequados é aplicada.

De acordo com a presente invenção, é também provido um método de prevenção de doença de enxerto-versus-hospedeiro associada com o transplante de célula tronco alogênica em um paciente, que compreende as etapas de: a) ativar os linfócitos de um doador pela mistura de células doadoras com células hospedeiras, por um tempo suficiente, por um período de tempo suficiente para que ocorra uma reação imune; b) substancialmente eliminar os linfócitos ativados da etapa a) com terapia fotodinâmica, utilizando-se uma quantidade terapêutica de um derivado ou composição fotoativável da reivindicação 1, sob irradiação de um comprimento de onda adequado; e c) realizar transplante de célula tronco alogênica, utilizando-se a mistura tratada da etapa b).

De acordo com a presente invenção, é provido um método para o tratamento de distúrbio imunológico em um paciente, que compreende as etapas de: a) colheita de ditas células hematopoiéticas do paciente; b) tratamento ex vivo das células hematopoiéticas da etapa a) por terapia fotodinâmica, empregando-se uma quantidade terapêutica de um derivado ou composição fotoativável da reivindicação 1, sob irradiação de um comprimento de onda adequado; e c) realização de infusão de enxerto ou transplante de autoenxerto utilizando-se as células hematopoiéticas da etapa b) O distúrbio imunológico pode ser selecionado do grupo consistindo de condições em que as auto células ou células doadoras reajam contra os tecidos hospedeiros ou alvos estranhos, tais como doença de enxerto-versus-hospedeiro, rejeição de enxerto, distúrbios autoimunes e imunoalegrias mediadas por célula-T.

As células hematopoiéticas podem ser selecionadas do grupo consistindo de medula óssea, sangue periférico e células mononucleares de sangue de cordão.

Para fins da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo. A expressão “distúrbios imunorreativos” é destinada a significar qualquer reação e/ou distúrbios aloimunes ou autoimunes.

De acordo com outros aspectos da presente invenção, estes compostos de rodamina, que são preparados observando-se a estratégia geral de corantes de rodamina halogenantes, conhecidos e prontamente disponíveis, desse modo gerando uma primeira e variada série de intermediários, que podem eles próprios server como fotossensibilizadores potenciais ou o uso destas rodaminas halogenadas como intermediárias na síntese de uma segunda série de corantes de rodamina, por meio do que um ou mais halogêneo(s) sustituiu(íram) um dos grupos de estrutura (I). No caso em que todos os halogêneos são substituídos por novos grupos, uma subseqüente etapa de halogenação é adicionada à seqüência, para obter-se o desejado composto de estrutura I (vide Figuras 1 a 5). O teste destes compostos, em vários tipos de células, revelou surpreendentemente serem não-tóxicas, mais eficientes e mais seletivas algumas das moléculas candidatas do que os corantes de rodamina halogenados conhecidos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a derivados de rodamina de fórmula (I) 0) em que: - um de Ri, R2, R3, R4 e R[0 representa um átomo de halogêneo e cada um dos restantes Ri, R2, R3 e R4 e cada um do grupo Ri0 remanescente é independentemente selecionado no grupo constituído por átomos de hidrogêneo e halogêneo, grupos amino, acilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, azacicloalquila, alquilcicloalquilamino, aroilamino, diarilamino, arilalquilamino, aralquilamino, alquilaralquilamino, arilaralquilamino, hidróxi, alcóxi, arilóxi, aralquilóxi, mercapto, alquiltio, ariltio, aralquiltio, carboxila, alcoxicarbonila, ariloxicarbonila, aralcoxicarbonila, carbamoíla, alquilcarbamoíla, dialquilcarbamoíla, ciano, hidroxissulfonila, amidossulfonila, dialquilamidossulfonila, arilalquilamidossulfonila, formila, acila, aroíla, alquila, alquileno, alquenila, arila, aralquila, vinila, alquinila e pelos correspondentes grupos substituídos. - m = 0 - 1; -n = 1 - 4; - A é nada, O ou NH; - R9 representa um grupo alquileno; - Z é H, sal amino, dialquilamino ou trialquilamino; - X' é um ânion; e - R5, Re, R7 e R8 são independentemente H ou Ci-C6 alquila ou Ri, em combinação com R5 ou Re, ou R2 em combinação com R5 ou Re, ou R3, em combinação com R7 ou R8, ou R4, em combinação com R7 ou R8, representa um alquileno, sozinho ou em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. A invenção também refere-se a intermediários de fórmula (II) a (VII) e àqueles de fórmula (Γ) como definidos em 1 a 5, que são úteis, entre outras coisas, na síntese dos derivados de rodamina de fórmula (I). A invenção refere-se ainda aos novos processos para a síntese de novos derivados de rodaminas de fórmula (I), em que os vários grupos Ri a Rio, A, X, Y, Y’ e Z e m e n são como anteriormente definidos, sem exclusão dos compostos listados na condição no final da definição anterior. Estes processos sendo definidos pelos esquemas representados nas Figuras 1 a 5 e pelas correspondentes partes da descrição.

Os derivados de rodamina da invenção são úteis sozinhos ou em combinação com um veículo, para tratar infecções geradas por bactérias Gram+ e/ou Gra-. Bem como no tratamento de doenças geradas por vírus envelopados ou por vírus não-envelopados.

Aqueles compostos são também úteis no tratamento in-vivo e ex-vivo de distúrbios imunológicos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS ESQUEMAS A Fig. 1 é a síntese geral dos derivados de rodamina halogenados 4 e 2,7 substituídos. A Fig. 2 é a síntese geral de derivados de rodamina halogenados 2 e 4,5 substituídos. A Fig. 3 é a síntese geral de derivados de rodamina halogenados 4 e 2,7 substituídos. A Fig. 4 é a síntese geral de derivados de rodamina halogenados 2 e 4,5 substituídos. A Fig. 5 é a síntese geral de derivados de rodamina halogenados 2 e 4,5 substituídos. A Fig. 6 é a atividade bacteriostática dos derivados de rodamina em relação a Escherichia coli\ a cepa bacteriana Escherichia coli foi tratada com os derivados de rodamina a 50 uM sem tempo de extrusão. Os efeitos determinados são expressos em diminuição log do crescimento bacteriano: HA-X-40: 0,6 log; XA-X-44: erradicação; HA-X-164: 0,25 log; HA-X-171: 3,7 logs; HA-VIII-92: 6,2 LOGS; TH9402: 7 logs. LB é crescimento sem compostos. A Fig. 7 é atividade bacteriostática dos derivados de rodamina em relação a P. aeruginosa; a cepa bacteriana P. aeruginosa foi tratada com os derivados de rodamina a 50 uM, sem tempo de extrusão. Os efeitos determinados são expressos em diminuição log do crescimento bacteriano: TH9402: 2 logs. LB é crescimento sem compostos. A Fig. 8 é atividade bacteriostática dos derivados de rodamina em relação a S. typhimurium; a cepa bacteriana S. typhimurium foi tratada com os derivados de rodamina a 50 uM, sem tempo de extrusão. Os efeitos determinados são expressos em diminuição log do crescimento bacteriano: XA-X-44: 5 logs; HA-X-164: 0,3 log; TH9402: 6,7 logs. LB é crescimento sem compostos. A Fig. 9 é atividade bacteriostática dos derivados de rodamina em relação a E. coli; a cepa bacteriana E. coli foi tratada com os derivados de rodamina a 50 uM, sem tempo de extrusão. Os efeitos determinados são expressos em diminuição log do crescimento bacteriano: HA-X-40: 0,6 log; XA-X-44; erradicação; HA-X-164: 0,25 log; HA-X-171: 3,7 logs; HA-VIII-92: 6,2 logs; TH9402: 7 logs. LB é crescimento sem compostos. A Fig. 10 é atividade bacteriostática dos derivados de rodamina em relação a P. aeruginosa; a cepa bacteriana P. aeruginosa foi tratada com os derivados de rodamina a 50 uM, sem tempo de extrusão. Os efeitos determinados são expressos em diminuição log do crescimento bacteriano: TH9402: 2 logs. LB é crescimento sem compostos. A Fig. 11 é atividade bacteriostática dos derivados de rodamina em relação a S. typhimurium; a cepa bacteriana S. typhimurium foi tratada com os derivados de rodamina a 50 uM, sem tempo de extrusão. Os efeitos determinados são expressos em diminuição log do crescimento bacteriano: XA-X-44: 5 logs; HA-X-164: 0,3 log; TH9402: 6,7 logs. LB é crescimento sem compostos. A Fig. 12 é atividade bacteriostática dos derivados de rodamina em relação a E coli; a cepa bacteriana E. coli foi tratada com os derivados de rodamina a 50 uM, sem tempo de extrusão. Os efeitos determinados são expressos em diminuição log do crescimento bacteriano: HZ-X-40: 0,6 log; XA-X-44: erradicação; HA-X-164: 0,25 log; HA-X-171: 3,7 logs; HA-VIII-92: 6,2 logs; TH9402: 7 logs. LB é crescimento sem compostos. A Fig. 13 é atividade bacteriostática dos derivados de rodamina em relação a P. aeruginosa; a cepa bacteriana P. aeruginosa foi tratada com os derivados de rodamina a 50 uM, sem tempo de extrusão. Os efeitos determinados são expressos em diminuição log do crescimento bacteriano: TH9402: 2 logs. LB é crescimento sem compostos.

Fig. 14 é atividade bacteriostática dos derivados de rodamina em relação a S. typhimurium; a cepa bacteriana S. typhimurium foi tratada com os derivados de rodamina a 50 uM, sem tempo de extrusão. Os efeitos determinados são expressos em diminuição log do crescimento bacteriano: XA-X-44: 5 logs; HA-X-164: 0,3 log; TH9402: 6,7 logs. LB é crescimento sem compostos.

Fig. 15 é atividade antiviral de derivados de rodamina testados em citomegalovírus; diminuições log da infectividade e proliferação viral em células FS. Os compostos foram adicionados a 50 uM, sem tempo de extrusão. Diminuições log de infectividade e proliferação viral em células FS; os compostos foram adicionados a 50 mM sem tempo de extrusão e sem ativação por luz. A Figura 16 é staphilococcus epidermitis; TH9402 inibe o crescimento bacterianos de S. epidermitis a 50 uM sem tempo de extrusão. A Figura 17 é staphilococcus epidermitis; HA-X-40 exibe um efeito bacteriostático sobre o crescimento de S. epidermitis com uma diminuição 2 logs de crescimento bacteriano a 50 uM, sem tempo de extrusão. A Figura 18 é staphilococcus epidermitis; HA-X-40 erradica o crescimento bacteriano de S. epidermitis a 50 uM com 90 minutos de tempo de extrusão. A Figura 19 é staphilococcus epidermitis; HA-X-44 erradica o crescimento bacteriano de S. epidermitis a 50 uM, sem tempo de extrusão. A Figura 20 é staphilococcus epidermitis; HA-X-149 exibe um efeito bacteriostático sobre o crescimento de S. epidermitis com uma diminuição 4,5 logs do crescimento bacteriano a 50 uM, sem tempo de extrusão. A Figura 21 é staphilococcus epidermitis; HA-X-164 exibe um efeito bacteriostático sobre o crescimento de S. epidermitis com uma diminuição 3 logs de crescimento bacteriano a 50 uM, sem tempo de extrusão. A Figura 22 é staphilococcus epidermitis; HA-X-171 exibe um efeito bacteriostático sobre o crescimento de S. epidermitis com uma diminuição 6,5 logs do crescimento bacteriano a 10 uM, sem tempo de extrusão. A Figura 23 é staphilococcus epidermitis; HA-VIII-92 exibe um efeito bacteriostático sobre o crescimento de S. epidermitis com uma diminuição 4 logs do crescimento bacteriano a 10 uM, sem tempo de extrusão. A Figura 24 é atividade antiviral de derivados de rodamina testados em cytomegalovirus; diminuições log de infectividade e proliferação viral em células MRC-5. Os compostos foram adicionados a 50 uM sem tempo de extrusão.

As seguintes referências significam: HA-X-164 : sal de acetato de éster metílico de 2,7-dibromorrodamina B (4) HA-X-149 : sal de acetato de éster hexílico de 2,7-dibromorrodamina B (8) HA-X-171 : 4,49dibromorrodamina 6G (11) HA-X-40 : 2’-(6-dimetilamino-3-dimetilimino-3H-xanteno-9-il) 4’,5’- cloridreto de éster metílico do ácido dicloro-benzóico (10) HA-X-44 : éster etílico de 4,5-dibromorrodamina 110 2-(2-metóxi etóxi) (13) HA-VIII-92 : éster bromopropílico de rodamina B 3 (14) TH 9402 : éster metílico de 4,5-dibromorrodamina 123.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Um primeiro objetivo da presente invenção é constituído pelos novos derivados da rodamina de fórmula (I) (9 em que: - um de Ri, R2, R3, R4 e R10 representa um átomo de halogêneo e cada um dos restantes Ri, R2, R3 e R4 e cada um do grupo Ri0 remanescente é independentemente selecionado no grupo constituído por átomos de hidrogêneo e halogêneo, grupos amino, acilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, azacicloalquila, alquilcicloalquilamino, aroilamino, diarilamino, arilalquilamino, aralquilamino, alquilaralquilamino, arilaralquilamino, hidróxi, alcóxi, arilóxi, aralquilóxi, mercapto, alquiltio, ariltio, aralquiltio, carboxila, alcoxicarbonila, ariloxicarbonila, aralcoxicarbonila, carbamoíla, alquilcarbamoíla, dialquilcarbamoíla, ciano, hidroxissulfonila, amidossulfonila, dialquilamidossulfonila, arilalquilamidossulfonila, formila, acila, aroíla, alquila, alquileno, alquenila, arila, aralquila, vinila, alquimia e pelos correspondentes grupos substituídos. - m = 0 - 1; - η = 1 - 4; - A é nada, O ou NH; - R9 representa um grupo alquileno; - Z é H, sal amino, dialquilamino ou trialquilamino; - X' é um ânion; e - R5, R<5, R7 e Rs são independentemente H ou Ci-C6 alquila ou Ri, em combinação com R5 ou Ré, ou R2 em combinação com R5 ou Ré, ou R3, em combinação com R7 ou Rg, ou R4, em combinação com R7 ou R8, representa um alquileno, sozinho ou em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. com a condição de que os seguintes compostos específicos: - (cloridreto do éster metílico do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)benzóico) de 4,5-dibromorrodamina 123, também chamado TH9402; - (cloridreto do éster etílico do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanteno-9-il)benzóico) de 4,5-dibromorrodamina 123; - (cloridreto do éster octílico do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanteno-9-il)benzóico) de 4,5-dibromorrodamina 123; - (cloridreto do éster n-butílico do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanteno-9-il)benzóico) do éster n-butílico de 4,5-dibromorrodamina 110; e - (cloridreto do éster n-butílico do ácido (2-(6-etil amino-3-etil imino-3H-xanten-9-il)-benzóico) do éster n-butílico de rodamina B sejam excluídos.

De acordo com uma versão preferida deste objeto da invenção - “alquila” significa um grupo hidrocarbonado alifático reto ou ramificado e o grupo alquila correspondente substituído contendo um ou mais substituintes, que podem ser iguais ou diferentes e que são selecionados do grupo constituído por halo, arila, hidróxi, alcóxi, arilóxi, alquilóxi, alquiltio, ariltio, aralquilóxi, aralquiltio e cicloalquila e “ramificado” significa que um grupo alquila inferior, tal como metila, etila ou propila é ligado a uma cadeia de alquila linear, grupos alquila preferidas incluindo os grupos “alquila inferior”, que são aqueles grupos alquila tendo de cerca de 1 a cerca de 6 carbonos, grupos alquila exemplificativos sendo grupos metila, etila, isopropila, hexila, ciclo-hexilmetila, metila ou etila que são os mais preferidos; - “cicloalquila” significa um anel não-aromático, preferivelmente composto de 4 a 10 átomos de carbono e a alquila cíclica pode ser parcialmente insaturada, anéis alquila cíclicos preferidos incluem ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila, o grupo cicloalquila pode ser opcionalmente substituído com um substituinte do grupo arila, os grupos ciclopentila e ciclo-hexila são preferidos. - “alquenila” significa um grupo alquila contendo uma dupla ligação carbono-carbono e tendo preferivelmente de 2 a 5 átomos de carbono na cadeia linear, grupos exemplificativos incluem alil vinila; - “alquinila” significa um grupo alquila contendo uma tripla ligação carbono-carbono e tendo, preferivelmente, de 2 a 5 átomos de carbono na cadeia linear, grupos exemplificaktivos incluem etinila, propargila; - “arila” significa um radical carbocíclico aromátido ou um radical carbocíclico substituído, contendo preferivelmente de 6 a 10 átomos de carbono, tais como fenila ou naftila ou fenila ou naftila substituída por pelo menos um dos substituintes selecionados do grupo constituído por alquila, alquenila, alquinila, arila, aralquila, hidróxi, alcóxi, arilóxi, aralcóxi, carbóxi, aroíla, halo, nitro, tri-halometila, ciano, alcoxicarbonila, ariloxicarbonila, aralcoxicarbonila, acilamino, aroilamino, carbamoíla, alquilcarbamoíla, dialquilcarbamoíla, alquiltio, ariltio, alquileno ou NYY’, onde Y e Y’ são independentemente hidrogênio, alquila, arila ou aralquila; - “aralquila” significa um radical em que um grupo arila é substituído por um átomo H alquila, grupo aralquila exemplificaktivo é benzila; - “acila” significa um grupo alquil-CO-, em que o grupo alquila é como anteriormente descrito, acila preferida tem uma alquila contendo de 1 a 3 átomos de carbono no grupo alquila, grupos exemplificativos incluem acetila, propanoíla, 2-metilpropanoíla, butanoíla ou palmitoíla; - “aroíla” significa um grupo aril-CO-, em que um grupo arila é como anteriormente descrito e, preferivelmente, contém de 6 a 10 átomos de carbono no anel, grupos exemplificativos incluem benzoíla e 1 - e 2-naftoíla; - “alcóxi” significa um grupo alquila-O-, em que o grupo alquila é como anteriormente descrito, grupos alcóxi exemplificativos incluem metóxi, etóxi, n-propóxi, i-propóxi, n-butóxi e heptóxi; - “arilóxi” significa um grupo aril-O-, em que o grupo arila é como anteriormente descrito, grupos arilóxi exemplificaktivos incluem fenóxi e naftóxi; - “alquiltio” significa um grupo alquil-S, em que o grupo alquila é como anteriormente descrito, grupos alquiltio exemplificativos incluem metiltio, etiltio, i-propiltio e heptiltio; - “ariltio” significa um grupo-aril-S, em que o grupo arila é como anteriormente descrito, grupos ariltio exemplificaktivos incluem feniltio, naftiltio; - “aralquilóxi” significa um grupo-aralquil-O, em que o grupo aralquila é como anteriormente descrito, grupo aralquilóxi exemplificativo é benzilóxi; - “aralquiltio” significa um grupo-aralquil-S, em que o grupo aralquila é como anteriormente descrito, grupo aralquiltio exemplificativo é benziltio; - “dialquilamino” significa um grupo -NYY’, em que tanto Y como Y’ são grupos alquila como anteriormente descrito, alquilamino exemplificativo inclui etilamino, dimetilamino e dietilamino; - “alcoxicarbonila” significa um grupo alquil-O-CO-, em que o grupo alquila é como anteriormente descrito, grupos alcoxicarbonila exemplificativos incluem metóxi- e etóxi-carbonila; - “ariloxicarbonila” significa um grupo aril-O-CO, em que o grupo arila é como anteriormente descrito, grupos ariloxicarbonila exemplificativos incluem fenóxi- e naftóxi-carbonila; - “aralcoxicarbonila” significa um grupo aralquil-O-CO, em que a aralquila é como anteriormente definida, grupo aralcoxicarbonila é benziloxicarbonila; - “carbamoíla” é um grupo H2N-CO; - “alquilcarbamoíla” é um grupo Υ’ΥΝ-CO-, em que um de Y e Y’ é hidrogênio e o outro de Y e Y’ é alquila, como definido anteriormente; - “dialquilcarbamoíla” é um grupo Y’YN-CO-, em que tanto Y como Y’ são alquila, como definidos anteriormente; - “acilamino” é um grupo acil-NH, em que acila é como definida anteriormente; - “aroilamino” é um grupo aroil-NH, em que aroíla é como definida anteriormente; - “alquileno” significa um grupo de cadeia hidrocarbonada bivalente reta ou ramificada, tendo preferivelmente de 2 a 8 átomos de carbono e o grupo alquileno pode ser interrompido por um ou mais atómos de nitrogênio substituídos, em que o substituinte do átomo de nitrogênio é alquila ou átomos oxigênio ou enxofre, e é presentemente mais preferido do que o grupo alquileno, tem de 2 a 3 átomos de carbono, grupos alquileno exemplificativos incluem etileno (-CH2CH2-), propileno (-CH2CH2CH2-), -CH2NMe-CH2”, 0-CH2-0 ou -0-CH2CH2-0-; - “halo” preferivelmente significa fluoro, cloro, bromo ou iodo; - “azacicloalquila” preferivelmente significa um anel de carbono saturado de 4 a 9 membros, onde um dos grupos metileno é substituído por nitrogênio; - “cicloalquilamina” significa um grupo -NYY’, em que um de Y e Y’ é hidrogênio e o outro Y e Y’ é cicloalquila, como definido anteriormente; - “alquilcicloalquilamino” significa um grupo -NYY’, em que um de Y e Y’ é alquila como definida anteriormente e o outro Y e Y’ é cicloalquila como definido anteriormente; - “diarilamino” significa umgrupo -NYY’ em que tanto Y como Y’ são grupos arila como anteriormente descrito; - “aralquilamino” significa um grupo -NYY’, em que um do Y e Y’ é hidrogênio e o outro Y e Y’ é aralquila, como definido anteriormente; - “arilalquilamino” significa um grupo -NYY’, em que um do Y e Y’ é alquila como definido anteriormente e o outro Ye Y’ é arila como definido anteriormente; - “alquilaralquilamino” significa um grupo -NYY’, em que um do Y e Y’ é alquila como definido anteriormente e o outro Y e Y’ é aralquila como definido anteriormente; - “arilaralquilamino” significa um grupo -NYY’, em que um do Y e Y’ é arila como definido anteriormente e o outro YeY’é aralquila como definido anteriormente; - “mercapto” é um grupo -SH ou SR, em que R pode ser qualquer um dos grupos Rj a R]0 acima definidos, os grupos mercaptoarila e mercaptoalquila são preferidos; - “hidroxissulfonila” é um -S03H; - “amidossulfonila” é um -SO2NH2; - “dialquilamidossulfonila” significa um grupo -S02NYY’, em que tanto YeY’ são grupos alquila como anteriormente descrito; - “arilaralquilamidossulfonila” significa um grupo -SO2NYY, em que um de Y e Y’ é arila, como definido anteriormente, e 0 outro YeY’é aralquila, como definido anteriormente; - “ânion” significa a forma desprotonada de um ácido orgânico ou inorgânico e 0 ânion é preferivelmente selecionado de cloridretos, bromidretos, sulfatos, nitratos, boratos, fosfatos, oxalatos, tartaratos, maleatos, citratos, akcetatos, ascorbatos, succinatos, benzenossulfonatos, metanossulfonatos, ciclo-hexanossulfonatos, toluenossulfonatos, sulfamatos, lactatos, malonatos, etanossulfonatos, ciclo-hexilsulfamatos e quinatos. No caso em que o derivado de rodamina contém um ou mais substituintes ácidos, o composto coberto compreende 0 sal interno ou qualquer sal derivado da neutralização por qualquer uma das seguintes bases: hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, hidróxido de lítio, amônia, etileno diamina, lisina, dietanolamina, piperazina e similares.

Uma versão preferida da invenção é constituída por aqueles derivados de rodamina em que pelo menos 2 dos grupos Ri, R2, R3, R4 e Rio representam um átomo de halogêneo, que é preferivelmente um átomo de brometo.

Mais preferidas são aqueles derivados de rodamina, em que o(s) átomo(s) de halogêneo está(estão) na posição 2-7, 4-5 ou 4’-5’ do anel ou está(estão) no final da cadeia de éster.

Os seguintes derivados de rodamina específicos são particularmente interessantes: - cloridreto de éster de metila do ácido 4’,5’-diclorobenzóico de 2’-(6-dimetilamino-3-dimetilimino-3H-xanten-9-ila); - éster etílico de 4,5-dibromo rodamina 110 2-(2-metóxi etóxi); - sal de acetato do éster hexílico de 2,7-dibromorrodamina B; - sal de acetato do éster hexílico de 2,7-dibromorrodamina B; - 4,5-dibromorrodamina 6G; e - éster 3-bromopropílico de rodamina B.

Um segundo objetivo da presente invenção é constituído pelos intermediários representados pelas fórmulas (II) a (VII) e (Γ), as fórmulas sendo como definidas nas Figuras 1 a 5, em que os vários grupos são como anteriormente definidos, sem qualquer rejeição. Os intermediários sendo como definidos nas Figuras 1 a 5.

Um terceiro objetivo da presente invenção é constituído por novos processos para a síntese de novos derivados de rodaminas de fórmula (I), em que os vários grupos Rj a Ri0, A, X, Y, Y’ e Z e m e n são como anteriormente definidos, sem a exclusão dos compostos listados na condição no final da definição anterior. Estes processos sendo definidos pelos esquemas representados nas Figuras 1 a 5 e pelas correspondentes partes da descrição.

Um quarto objetivo da presente invenção é constituído pelo uso de pelo menos um derivado de rodamina, como definido no primeiro objetivo da invenção, sem a exclusão dos compostos listados na condição no final da definição do derivado de rodamina de fórmula (I), sozinho ou em combinação com um veículo, para tratar infecções geradas por bactérias Gram+ e/ou Gram-.

De acordo com uma versão preferida da presente invenção, os derivados de rodamina são usados para tratar infecções geradas por Staphylococcus epidermitis.

Particularmente interessantes são: - o uso do éster etílico de 4,5-dibromo rodamina 110 2-(2-metóxi etóxi) como agente bacteriostático Escherichia coli 0157:H7 e/ou contra Salmonella thyphimurium LT2; - o uso do sal de acetato de éster hexílico de 2,7-dibromorrodamina B como agente bacteriostático conta Salmonella thyphimurium LT2; - o uso de 4,5-dibromorrodamina 6G como agente bacteriostático contra Escherichia coli 0157:H7; - o uso do éster 3-bromopropílico de rodamina B como agente bacteriostático contra Escherichia coli 0157:H7; e - o uso do éster metílico de 4,5-dibromorrodamina como agente bacteriostático contra Escherichia coli 0157:H7, Salmonella thyphimurium LT2 e/ou Pseudomonas aeruginosa.

Preferivelmente, para este uso terapêutico o(s) derivado(s) de rodamina é(são) combinados com um veículo que é um veículo farmaceuticamente aceitável e é preferivelmente selecionado no grupo constituído por 5% manitol e/ou DMSO.

Qualquer veículo é possível, entretanto, o veículo aceitável é preferivelmente constituído por 5% de manitol em água ou em DMSO.

No caso do sal de acetato de éster hexílico de 2,7-dibromorrodamina B, do HA-X-149, do HA-X-164, o veículo é preferivelmente constituído por DMSO.

Um quinto objetivo da presente invenção é constituído por uma composição bactericida para o tratamento de um líquido contaminado com bactérias Gram+ e/ou Gram-, composição esta compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um derivado de rodamina como acima definido, sem a exclusão dos compostos listados na condição no final da reivindicação 1, sozinho ou em combinação com um veículo.

Um sexto objetivo da presente invenção é constituído por uma solução bactericida, para o tratamento de um local contaminado com bactérias Gram+ e/ou Gram-, solução esta compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um derivado de rodamina de fórmula (I), como anteriormente definido, sem qualquer rejeição, sozinho ou em combinação com um veículo, para tratar infecções geradas por bactérias Gram+ e/ou Gram-.

Um sétimo objetivo da presente invenção é constituído por um método para tratar infecções geradas por bactérias Gram+ e/ou Gram-, método este compreendendo administrar a um humano ou animal em necessidade uma quantidade eficaz de pelo menos um derivado de rodamina de fórmula (I) como anteriormente definido, sem qualquer rejeição, sozinho ou em combinação com um veículo.

De acordo com uma versão preferida deste método, a quantidade eficaz administrada compreende entre 0,5 e 200 mg por quilograma de peso corporal por dia.

Uma oitava versão da presente invenção é constituída por um medicamento contendo uma quantidade eficaz de pelo menos um derivado de rodamina de fórmula (I) como anteriormente definido, sem a exclusão dos compostos listados na condição no final da definição, sozinho ou em combinação com um veículo, para tratar infecções geradas por bactérias Gram+ e/ou Gram-, Um décimo objetivo da presente invenção é constituído pelo uso de uma quantidade eficaz de pelo menos um derivado de rodamina ou seu sal como acima definido, sem qualquer rejeição, sozinho ou em combinação com um veículo, no tratamento de doenças geradas por vírus envelopados ou por vírus não envelopados.

Preferivelmente, o vírus envelopado é um com ADN de duplo filamento, mais preferivelmente um da família Herpes viridae.

Um décimo-primeiro objetivo da presente invenção é constituído por medicamento contendo uma quantidade eficaz de pelo menos um derivado de rodamina ou seu sal, como acima, sem a exclusão dos compostos listados no final da definição dos derivados de rodamina de fórmula (I), sozinho ou em combinação com um veículo, para tratar infecções virais.

Versão mais preferida da presente invenção é o uso de: - cloridreto de éster metílico do ácido benzóico de 2’-(6-dimetilamino-3-dimetilimino-3H-xanten-9-il)-4’,5’-dicloro de 4,5-dibromo rodamina; - 4,5-dibromo rodamina 110 2-(2-metóxi etóxi) etila como um agente antiviral contra citomegalovírus; - éster metílico de 4,5-dibromorrodamina como um agente antiviral contra citomegalovírus; e - sal de acetato de éster hexílico de 2,7-dibromorrodamina B como um agente antiviral contra Citomegalovírus.

Outra versão preferida da invenção é constituída pelo sal de acetato de éster de hexila de 2,7-dibromorrodamina B como um agente antiviral contra Citomegalovírus.

Uso do sal de acetato de éster hexílico de 2,7-dibromorrodamina B como um agente antiviral contra Citomegalovírus.

Um décimo segundo objetivo da presente invenção é o uso dos derivados de rodamina de fórmula (I) como anteriormente definidos, sem qualquer rejeição, no tratamento de distúrbios imunológicos.

De acordo com uma versão preferida, o uso refere-se ao aumento da produção do elevado rendimento quântico e da geração do oxigênio singleto na irradiação, enquanto mantendo desejável retenção diferencial de rodamina entre as células normais e cancerosas, ditos derivados de rodamina de fórmula (I) sendo como anteriormente definidos, sem a rejeição.

De acordo com outra versão, o uso refere-se à terapia fotodinâmica de pacientes de câncer pela destruição das células cancerosas humanas, em que níveis intracelulares apropriados de ditos derivados são obtidos e a irradiação de um comprimento de onda e intensidade adequados é aplicada.

De acordo com mais uma versão preferida, o uso da invenção refere-se a um método para a trapia fotodinâmica de pacientes sofrendo de leucemias, múltiplos mielomas e linfomas disseminados, que compreende as etapas de: a) colher dita medula óssea humana do paciente; b) purgar a medula óssea da etapa a) por terapia fotodinâmica, empregando uma quantidade terapêutica de um derivado fotoativável de acordo com a fórmula (I), sem a exclusão dos compostos listados na condição no final da definição, sob irradiação de um comprimento de onda adequado; e c) realizar transplante de célula tronco autóloga, empregando a medula óssea purgada da etapa b).

Preferivelmente, a purga da etapa b) compreende ainda procedimentos de quimioterapia intensiva e irradiação corporal total (TBI).

Outra versão preferida refere-se a um método para purga in vitro da medula óssea humana contendo metástase de tumores sólidos, selecionada do grupo consistindo de metástase de mama, pulmão, prostática, pancreática e carcinomas colônicos, melanomas e sarcomas disseminados, em que a excisão ou desbaste cirúrgico pode ser conseguido, que compreende as etapas de: a) colher dita medula óssea de paciente; b) purgar a medula óssea da etapa a) por terapia fotodinâmica usando-se uma quantidade terapêutica de pelo menos um derivado fotoativável de fórmula (I), como acima definido, sem qualquer rejeição, sob irradiação de um comprimento de onda adequado; e c) realizar transplante de célula tronco autóloga, empregando a medula óssea da etapa b).

Preferivelmente, a purga da etapa b) compreende ainda procedimentos de quimioterapia e irradiação corporal total (TBI) totais.

Uma outra versão deste objetivo da invenção é um método para a terapia fotodinâmica de pacientes de câncer, que compreende administrar a ditos pacientes um nível intracelular terapeuticamente aceitável de pelo menos um derivado fotoativável de fórmula (I) como acima definido, sem rejeição, e submeter ditos pacientes a irradiação de um comprimento de onda terapeuticamente eficaz.

Preferivelmente, pelo menos um derivado fotoativável é administrado por instilação, injeção, difusão de corrente sangüínea nos locais de tumor diretamente acessíveis à emissão de luz ou sítios tumorais acessíveis a feixes de leiser, empregando-se endoscópios rígidos ou flexíveis.

Mais preferivelmente, o sítio de tumor acessível a leiser é selecionado do grupo consistindo de bexiga urinária, cavidade oral, esôfago, estômago, trato digestivo inferior, trato respiratório superior e inferior.

Outra versão preferida deste objetivo da invenção é constituída por um método para o tratamento de leucemias em pacientes, que compreende as etapas de: a) purgar os clones cancerosos da medula óssea de ditos pacientes; b) submeter ditos clones purgados da etapa a) a um tratamento fotodinâmico, empregando-se uma quantidade terapêutica de pelo menos um dos derivados fotoativáveis de fórmula (I) como anteriormente definido, sem a rejeição presente no final da definição, sob irradiação de um comprimento de onda adequado para a destruição seletiva de células leucêmicas, sem afetar as células normais dos pacientes; e c) administrar ditos clones tratados da etapa b) aos pacientes; desse modo não causando toxicidade sistêmica para os pacientes.

Um décimo quarto objetivo da presente invenção é constituído por uma composição farmacêutica fotoativável, para a destruição e/ou inativação seletivas de células imunologicamente reativas, sem afetar as células normais e sem provocar toxicidade sistêmica para o paciente, dita composição compreendendo pelo menos um derivado de rodamina fotoativável de fórmula (I) como anteriormente definido, sem a exclusão dos compostos listados na condição no final da definição, e seus derivados fotoativáveis; em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável; por meio do que a fotoativação de ditos derivados induz a matança de célula enquanto os derivados inativados são substancialmente não tóxicos para as células.

Um décimo quinto objetivo da presente invenção é constituído pelo uso dos derivados fotoativáveis da reivindicação 1, para o tratamento fotodinâmico para a destruição e/ou inativação seletivas de células imunologicamente reativas, sem afetar as células normais e sem causar toxicidade sistêmica para o paciente, em que níveis intracelulares apropriados de ditos derivados são conseguidos e irradiação de um comprimento de onda e intensidade adequados é aplicada.

Uma versão preferida é constituída por um método de prevenção de doença de enxerto-versus-hospedeiro, associada com transplante de célula tronco alogênica em um paciente, que compreende as etapas de: a) ativar os linfócitos de um doador pela mistura de células doadoras com células hospedeiras por um tempo suficiente e por um período de tempo suficiente para que ocorra uma reação imune; b) substancialmente eliminar os linfócitos ativados da etapa a) com terapia fotodinâmica, empregando-se uma quantidade terapêutica de uma composição fotoativável da reivindicação 24 sob irradiação de um comprimento de onda adequado; e c) realizar transplante de célula tronco alogênica, empregando-se a mistura tratada da etapa b).

Outra versão preferida é constituída por um método para o tratamento de distúrbio imunológico em um paciente, que compreende as etapas de: a) colher as células hematopoiéticas de ditos paciente; b) tratamento ex vivo das células hematopoiéticas da etapa a) por terapia fotodinâmica, empregando-se uma quantidade terapêutica de uma composição fotoativável da reivindicação 24 sob irradiação de um comprimento de onda adequado; e c) realizar infusão de enxerto ou transplante de autoenxerto usando-se as células hematopoiéticas tratadas da etapa b).

Preferivelmente, o distúrbio imunológico é selecionado do grupo consistindo de condições em que as auto células ou células doadoras reagem contra os tecidos hospedeiros ou alvos estranhos, tal como doença de enxerto-versus-hospedeiro, rejeição de enxerto, distúrbios autoimunes e imunoalergias mediadas por célula-T.

Mais preferivelmente, as células hematopoiéticas são selecionadas do grupo consistindo de medula óssea, sangue periférico e células mononucleares de sangue de cordão.

Os compostos de estrutura I exibem aumentadas propriedades como: corantes de rotulação para deoxinucleotídeos, dideoxinucleotídeos e polinucleotídeos; novos corantes adequados para gravar fluidos para o processo de jato de tinta; novos corantes para fibra de vidro e papel; novos corantes para a erradicação de contaminantes biológicos infecciosos em tecidos corporais; novos corantes aplicáveis em processos fotográficos; novos corantes aplicáveis em quimioterapia de câncer; novos corantes aplicáveis como inibidores da timidina cinase do vírus do herpes simples e no tratamento e/ou na profilaxia de infecções causadas pelo vírus do herpes simples; novos corantes para uso como amplificadores e leiseres óticos poliméricos; novos corantes aplicáveis em biologia celular; novos corantes aplicáveis na dopagem de materiais siliciosos para fornecer leiseres de corante sólido; novos pigmentos aplicáveis para tintas de pintar, tintas de escrever e plásticos; novos reagentes orgânicos em extração de solvente de íons metálicos; novos corantes aplicáveis na formação de novos produtos conjugados com outros corantes; novos corante para a manufatura de discos de memória ótica tipo CD-ROM; novos corantes aplicáveis na rotulação de fluoróforo de peptídeos; novos corantes aplicáveis na análise de citometria de fluxo; novos corantes aplicáveis como manchas para a detecção da Mycobacterium tuberculosis por microscopia de fluorescência; novos corantes aplicáveis no mapeamento fluorescente dos sítios de ligação para substratos, ligandos e inibidores, novos corantes para estudar o transporte através da barreira hematoencefálica; novos corantes para estudar a desinfecção de biofilme; novos corantes aplicáveis como sondas fluorescentes em biologia celular; novos corantes para uso como traçado de água; novos corantes para visualização de receptores de peptídeo por microscopia de fluorescência intensificada por imagem; novos corantes para a formação de quelatos metálicos em química analítica; novos corantes fluorescentes aplicáveis em terapia diagnostica. Síntese Química Estes compostos são preparados seguindo-se a estratégia geral de halogenação de corantes de rodamina conhecidos e prontamente disponíveis, desse modo gerando uma primeira e variada série de intrmediários, que podem eles próprios servir como fotossensibilizadores potenciais, ou uso destas rodaminas halogenadas como intermediárias na síntese de uma segunda série de corantes de rodamina, por meio do que um ou mais halogêneos substituiu um dos grupos de estrutura I. No caso em que todos os halogêneos sejam substituídos pelos novos grupos, uma subseqüente etapa de halogenação é adicionada à seqüência para obter-se o desejado composto de estrutura I (vide os esquemas ilustrativos 1 e 2).

Devido à retenção específica da classe de corantes rodamina 123 pelas células anormais malignas e à concomitante falta de seu acúmulo pelas células tronco hematopoiéticas normais, estes resultados provêem evidência para o uso potencial destes três novos corantes para terapia fotodinâmica in vivo ou in vitro.

De acordo com a presente invenção, é provido o uso de tais corantes supracitados, em conjunto com anticorpos específicos de tumor, ou substâncias venenosas, ou lipossomas ou lipoproteínas, ou adutos de fluorocromo.

Além disso, os fotossensibilizadores a serem descritos têm o potencial para atuar sinergicamente em conjunto com outras substâncias fotoativas.

Outrossim, o procedimento de seleção negativa provido pelo uso de tratamento fotodinâmico não impede o uso de outros meios para enriquecer as células tronco hematopoiéticas, tais como seleção positiva com anticorpos monoclonais anti-CD34.

Outras aplicações clínicas Além do uso de fotossensibilizadores no contexto da purga da medula óssea in vitro paras as leucemias e cânceres metastáticos, as moléculas podem também ser usadas in vivo para sítios de tumores diretamente acessíveis à exposição a uma fonte de luz e para apropriadas concentrações locais das drogas a serem descritas. As moléculas da invenção podem também ser utilizadas na terapia fotodinâmica de um paciente sofrendo de múltiplos mielomas ou linfomas disseminados. Os cânceres metastáticos, para os quais a terapia desta invenção é apropriada, incluem metástase de mama, pulmão, prostática, pancreática e carcinomas colônicos, melanomas e sarcomas disseminados. Os derivados fotoativáveis da presente invenção podem ser administrados por instilação, injeção, difusão de corrente sangüínea nos sítios de tumor diretamente acessíveis à emissão de luz de sítios tumorais acessíveis a feixes de luz, empregando-se endoscópios rígidos ou flexíveis.

DESCRIÇÃO DAS VERSÕES PREFERIDAS

Como uma questão de ilustração somente, 5 métodos de tratamento de distúrbios imunológicos, envolvendo os derivados de rodamina de acordo com a invenção, são em seguida ilustrados.

MÉTODO / DE TRATAMENTO DE LEUCEMIAS 1. Procedimentos diagnósticos O diagnóstico da leucemia mielógena crônica (CML) será estabelecida usando-se um ou mais dos seguintes procedimentos em células sangüíneas ou de medula óssea: a) estudos citogenéticos convencionais, com identificação de metáfases pH 1+ abrigando t(9:22); b) hibridização fluorescente in situ, para a detecção do rearranjo bcr/abl; e c) análise de mancha do Sul, para a detecção de um fragmento ber rearranjado ou PCR-RT para a detecção de RNA mensageiro abl/ber quimérico. 2. Colheita de medula óssea Após o diagnóstico, as células tronco hemopoiéticas derivadas de medula óssea (BM) ou sangue periférico (PB) serão colhidas usando-se procedimentos anteriormente descritos para o transplante de medula autóloga em terapia de câncer (revisto por Herzig GP (1981) Prog. Hematol., 12:1). As células tronco hemopoiéticas, coletadas para autoenxerto, serão imediatamente tratadas ex vivo como descrito abaixo. 3. Purga in vitro de leucemia O tratamento ex vivo consiste de incubação de curto termo ou células tronco BM ou PB com um ou diversos dos compostos fotoativos selecionados. A duração da incubação, concentração de células e molaridade de droga são para ser determinadas para cada paciente utilizando uma alíquota da população de células colhida. Excesso de corantes será removido pelas lavagens de célula com meio livre de corante estéril suplementado com 2% de soro autólogo. As células são em seguida expostas a energia radiante de suficiente intensidade, para realizar purga fotodinâmica das células leucêmicas. A eficácia do procedimento de purga fotodinâmica é verificado em uma alíquota da população de células tratada, antes da criopreservação e/ou reinfusão no paciente ser(em) realizados. Até a reinfusão no paciente, as células são criopreservadas em 10% de sulfóxido de dimetila (DMSO) - 90% de meio de soro autólogo, a -196 °C na fase vapor do nitrogênio líquido. 4. Tratamento sistêmico de pacientes Em seguida à colheita de células tronco, o paciente será tratado com regimes convencionais, até o autoenxerto ser clinicamente indicado, ou imediatamente submetido a quimioterapia dose-intensiva e irradiação corporal total, onde indicado. 5. Transplante de células tronco autólogas Seguindo-se tratamento apropriado do paciente por quimioterapia e irradiação de alta-dose e no apropriado momento clínico, a medula ou células tronco de sangue periférico criopreservadas serão rapidamente descongeladas e diluídas em meio contendo 25 UI DNase ml'1, -7 para minimizar formação de grumos. Um mínimo de 2 X 10 /kg de células nucleadas com 85% a 95% de viabilidade, como medido por exclusão de Trypan™ blue (azul tripano), será retomado para o paciente.

MÉTODO JJDO TRATAMENTO DE MALIGNIDADES 1. Procedimentos diagnósticos O diagnóstico das malignidades será estabelecido usando-se exame histopatológico convencional do tumor primário. A detecção de envolvimento de medula por células neoplásticas será conseguida por exame histológico direto e procedimentos auxiliares onde indicado (isto é, estudos de imuno-peroxidase, imunoistoquímica, marcadores tumorais e hibridização) 2. Colheita de medula óssea Após diagnóstico, as células tronco hemopoiéticas derivadas de medula óssea (BM) ou sangue periférico (PB) serão colhidas usando-se procedimentos anteriormente descritos para o transplante de medula autóloga em terapia de câncer (revisto por Herzig GP, (1981) Prog. Hematol., 12:1). As células tronco hemopoiética, coletadas para autoenxerto, serão tratadas imediatamente ex vivo como descrito abaixo. 3. Purga in vitro de leucemia O tratamento ex vivo consistirá de incubação de curto termo de células tronco BM ou PB com um ou diversos dos compostos fotoativos selecionados. A duração da incubação, concentração de células e molaridade de droga serão determinadas para cada paciente usando-se uma alíquota da população de células colhida. Excesso de corantes serão removidos por lavagens de célula em meio livre de corante estéril, suplementado com 2% de soro autólogo. As células serão em seguida expostas a energia radiante de suficiente intensidade, para realizar a purga fotodinâmica das células leucêmicas. Sempre que um marcador molecular sensível estiver disponível, uma alíquota da população de células tratada será testada para a detecção de células neoplásticas residuais, antes da criopreservação e/ou reinfusão no paciente serem tentadas. As células serão criopreservadas em 10% de sulfóxido de dimetila (DMSO) - 90% de meio de soro autólogo, a 196 °C, na fase vapor de nitrogênio líquido. 4. Tratamento sistêmico de pacientes Em seguida à colheita de célula tronco, o paciente será tratado com regimes convencionais, até o autoenxerto ser clinicamente indicado, ou imediatamente submetido a quimioterapia dose-intensiva e irradiação corporal total, onde indicado. 5. Transplante de célula tronco autóloga Em seguida à quimioterapia e irradiação de alta dose, as células tronco de medula ou de sangue periférico criopreservadas serão rapidamente descongeladas e diluídas em meio contendo 25 UI DNase ΜΓ1 para minimizar a formação de grumos. Um mínimo de 2 x 10 /kg de células nucleadas, com 85% a 95% de viabilidade, como medido por exclusão de Trypan™ blue, será retomado ao paciente.

MÉTODO III DE DOENÇA DE ENXERTO-VERSUS-HOSPEDEIRO NO CONTEXTO DE TRANSPLANTE DE CÉLULAS TRONCO

ALOGÊNICAS 1. Diagnóstico e identificação das diferenças imunológicas entre doador e receptor e doença de enxerto-versus-hospedeiro. O transplante de célula tronco alogênica é realizado para numerosas condições neoplásticas e não-neoplásticas. As malignidades hematológicas consistem de leucemia, linfoma, mieloma múltiplo, síndromes mielodisplástica etc.; e malignidades não-hematológicas: anemia aplásica, distúrbios congenitais, síndromes de imunodeficiência severa, artrite reumatóide, escleroderma, lúpus eritematoso, esclerose múltipla e outros distúrbios imunes. A doença de enxerto-versus-hospedeiro é uma complicação do transplante de célula tronco alogênica, onde as células doadoras reagem contra as células hospedeiras, danificando os tecidos alvo (usualmente a pele, fígado, intestinos, pulmões, glândulas lacrimais ou salivares etc.). O diagnóstico baseia-se em diversos parâmetros clínicos e laboratoriais, que são extensamente revisto em Graft-vs.-Host Disease, Ferrara JLM, Deeg HJ, Burakoff SJ eds, Marcei Dekker, New York, 1997. A GVHD desenvolve contra os antígenos presentes nas células receptoras mas não nas células doadoras. As diferenças imunológicas entre doador e receptor poderíam estar presentes no nível dos antígenos de maior histocompatibilidade, antígenos de menor histocompatibilidade ou antígenos associados a tumor. A disparidade será estabelecida usando-se um ou mais dos seguintes procedimentos nas células sangüíneas ou de medula óssea: a) Tipagem HLA: tipagem serológica convencional ou molecular, para identificar disparidades entre doador e receptor em antígenos do maior complexo de histocompatibilidade classe I e II; e b) Cultura mista de linfócitos, para identificar diferenças nos antígenos de classe II; e c) Antígenos de menor histocompatibilidade: embora algumas linhagens de célula T citotóxicas estejam disponíveis e possam ser usadas para identificar antígenos de menor histocompatibilidade, atualmente, estes testes são somente disponíveis para fins de pesquisa. 2. Colheita de células progenitoras Após diagnóstico, células tronco hemopoiéticas, derivadas de medula óssea (BM) ou sangue periférico (PB) ou sangue de cordão do doador, serão colhidas usando-se procedimentos anteriormente descritos para transplante de células progenitoras alogênicas (revisto em Bone Marrow Transplantation, Forman SJ, Blume KG, Thomas ED es, Blackwell Scientific Publications, Cambridge MA, USA, 1994). As células tronco hemopoiéticas doadoras, coletadas para aloenxerto, serão imediatamente incubadas com células mononucleares hospedeiras ou outras irradiadas (25Gy). As células hospedeiras, misturadas com as células doadoras, são incubadas em meio livre de corante estéril, suplementado com 20% de soro autólogo e interleucina-2 por 2 dias. Este procedimento elicia a alorreatividade da célula doadora em direção ao hospedeiro e o enxerto de célula subsequentemente sofre tratamento fotodinâmico ex vivo, como descrito abaixo. 3. Purga in vitro seletiva de células imunorreativas O tratamento ex vivo consistirá de incubação de curto termo de células tronco BM ou PB previamente ativadas com um ou diversos dos compostos fotoativos selecionados. A duração da incubação, concentração celular e molaridade da droga serão determinadas para cada paciente usando-se uma alíquota da população celular colhida. Excesso de corantes será removido por lavagens celulares com meio livre de corante estéril, suplementado com 2% de soro autólogo. As células serão em seguida expostas a energia radiante de suficientes intensidades, para realizar purga fotodinâmica de células de leucemia. A eficácia do procedimento de purga fotodinâmica será verificado em uma alíquota da população celular tratada, antes da criopreservação e/ou reinfusão no paciente serem realizadas. Até a reinfusão no paciente, as células serão criopreservadas em 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) - 90% de meio de soro autólogo, A -196 °C na fase vapor de nitrogênio líquido. 4. Tratamento sistêmico de pacientes Em seguida à colheita de célula tronco, o paciente será submetido a quimioterapia e/ou irradiação dose-intensiva, quando indicado. 5. Transplante de célula tronco alogênica Em seguida a apropriado tratamento do paciente por quimioterapia e/ou irradiação de alta dose e no apropriado momento clínico, as células tronco de medula ou sangue periférico ou sangue de cordão, criopreservadas, serão rapidamente descongeladas e retomadas para o paciente.

MÉTODO IVDE TRATAMENTO DE DOENÇA DE ENXERTO-VERSUS-HOSPEDEIRO E DOENÇAS AUTOIMUNES 1. Procedimentos diagnósticos O diagnóstico da doença de enxerto-versus-hospedeiro ou distúrbios imunorreativos será estabelecido usando-se exame clínico, bioquímico e/ou histopatológico convencional do sangue ou tecidos apropriados. Aspectos diagnósticos e preditivos da GVHD são revistos em Graft-vs.-Host Disease, Ferrara JLM, Deeg HJ, Burakoff SJ eds, Marcei Dekker, New York, 1997. 2. Colheita de células sangüíneas periféricas Após o diagnóstico de GVHD, distúrbio autoimune ou imunorreativo, as células mononucleares de sangue periférico (PB) serão colhidas usando-se procedimentos de leucoferese anteriormente descritos ou similares (revisto em Bone Marrow Transplantation, Forman SJ, Blume KG, Thomas ED eds, Blackwell Scientific Publications, Cambridge MA, USA, 1994). As células mononucleares de sangue periférico de paciente coletadas serão tratadas imediatamente ex vivo, como descrito abaixo.

3. Eliminação in vitro de células medianto GVHD O tratamento ex vivo consistirá de incubação de curto termo de células tronco PB com um ou diversos dos compostos fotoativos selecionados. A duração da incubação, a concentração celular e a molaridade da droga serão determinados para cada paciente usando-se uma alíquota da população celular colhida. Excesso de corantes será removido por lavagens de célula em meio livre de corante estéril, suplementado com 2% de soro autólogo. As células serão em seguida expostas a energia radiante de suficientes intensidades, para realizar purga fotodinâmica das células ativadas, que medeiam GVHD. 4. Administração de células fotodinamicamente tratadas em pacientes As células leucoferesadas, que são fotodinamicamente tratadas, serão reinfundidas no paciente. Este caminho possibilitará a eliminação de um grande número de linfócitos ativados circulantes e outras células envolvidas na GVHD. Além disso, as células poupadas pelo tratamento fotodinâmico são inativadas e sua reinfução no paciente pode ajudar a restaurar o equilíbrio imunológico normal.

MÉTODO KDE TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS IMUNOLÓGICOS 1. Procedimentos diagnósticos O diagnóstico dos distúrbios autoimunes será estabelecido usando-se exame clínico, bioquímico e/ou histopatológico convencionais do sange ou tecidos apropriados. As doenças autoimunes severas são receptivas a transplante autólogo (revisto em Sullivan KM e outros, Am. Soc. Hematol., Educ. Programa Book, 1998:198-214). 2. Colheita de células tronco hematopoiéticas Após o diagnóstico, as células mononucleares da medula óssea (BM), sangue periférico (PB) ou sangue do cordão (CB) serão colhidas usando-se os procedimentos anteriormente descritos para o transplante de medula autóloga em terapia de câncer (revisto em Bone Marrow Transplaníation, Forman SJ, Blume KG, Thomas ED eds., Blackwell Scientific Publications, Cambridge MA, USA, 1994). As células tronco hemopoiéticas de paciente, coletadas para autoenxerto, serão tratadas imediatamente ex vivo como descrito abaixo. 3. Eliminação in vitro de células mediando distúrbios autoimunes O tratamento ex vivo consistirá de incubação de curto termo de células tronco BM ou PB com um ou diversos dos compostos fotoativos selecionados. A duração da incubação, concentração celular e molaridade da droga serão determinadas para cada paciente usando-se uma alíquota da população celular colhida. Excesso de corantes será removido por lavagens de célula em meio livre de corante estéril, suplementado com 2% de soro autólogo. As células serão em seguida expostas à energia radiante de suficientes intensidades, para realizar a purga fotodinâmica das células imunorreativas que medeiam o distúrbio imunológico. 4. Administração de células fotodinamicamente tratadas em pacientes As células tronco hematopoiéticas, que são fotodinamicamente tratadas, serão armazenadas (congeladas ou mantidas em cultura). Este caminho possibilitará a eliminação de um grande número de linfócitos ativados e outras células envolvidas no distúrbio imunológico. Além disso, as células poupadas pelo tratamento fotodinâmico são inativadas e sua reinfusão pode ajudar a restaurar o equilíbrio imunológico normal. Em seguida à colheita de célula tronco, o paciente será tratado com regimes convencionais até o autoenxerto ser clinicamente indicado ou imediatamente submetido a quimioterapia intensiva de dose e irradiação corporal total, onde indicado. 5. Transplante de célula tronco autóloga Em seguida à quimioterapia de alta dose e irradiação criopreservada, as células tronco de medula ou de sangue periférico serão rapidamente descongeladas e infundidas no paciente. A preparação daqueles derivados de rodamina de fórmula (I), como acima definido, sem a condição, será mais prontamente entendida por referência aos seguintes exemplos, que são dados para fins ilustrativos. I Síntese de sal de acetato de éster metílico de 2.7-dibromorrodamina B (4) 1-1 Preparação de éter metílico de Rodamina B (1) Metanol ------>~ HClgaz 1 A uma mistura agitada de 1,63 g (3,40 mmol) de Rodamina B e 100 ml de metanol, foi borbulhado ácido clorídrico através da solução por 45 min e a mistura de reação foi refluxada durante a noite. O metanol foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo vermelho escuro foi então purificado por cromatografia cintilante, usando-se uma mistura de metanol e diclorometano (1:9) como eluente, para conceder o desejado produto como um resíduo viscoso vermelho carregado (1,54 g.).

Rf: 0,52 (MeOH:CH2Cl2 1,5:8,5) Produção: 92% Ms (FAB): Calculado para C29H3303N2: (M-C1)+: 457,2491 Encontrado (M-C1)+: 457,2494 UV (MeOH): 555 nm 1-2 Preparação de éster metílico de diidrorrodamina B (2) NaBH4 ----------► CH2C12:H20 1 1 Éster metílico de rodamina B 1,73 g (3,50 mmol) foi dissolvido em 250 ml de dicrometano e 100 ml de água. NaBH4 (sólido) em excesso foi adicionado em porção com vigorosa agitação, durante 30 min, até que a cor vermelho escuro inicial fosse descarregada. A faz orgânica laranja pálido foi separada e a fase aquosa extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram secadas em Na2S04, filtradas e evaporadas sob pressão reduzida e o resíduo purificado por cromatografia cintilante, empregando-se acetato de etila como o solvente eluente. Frações contendo o produto foram combinadas e o solvente evaporado para conceder o produto 2 como um óleo rosa (1,50 g). RF: 0,84 (AcOEt) Produção: 93,7% 1-3 Bromacão de éster metílico de diidrorrodamina B (2) Óxido de propileno ------------*- Br2, MeOH 2 3 Em um frasco de fundo redondo de 250 ml introduzimos éster metílico de diidrorrodamina B (2)_1,34 g (2,91 mmol) e 112 ml de metanol grau espectral. A mistura foi agitada em temperatura ambiente até todo o éster ter sido dissolvido. Óxido de propileno 2 eq. (409 pL, 5,85 mmol) foi adicionado, seguido por adição em gotas de bromo 2 eq. (300 pL, 5,85 mmol). A agitação foi continuada em temperatura ambiente por 1 h 30 min. O solvente volátil foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo oleoso vermelho foi submetido a purificação por cromatografia cintilante, empregando-se acetato de etila e hexanos (0,5 : 9,5) como eluente, para fornecer o desejado composto 3 como um sólido branco (570 mg) Rf: 0,41 (AcOEt:kHexanos 0,5:9,5) Produção: 31,6% Nmr: (CD3OD) δ 7,86 (dd, J = 1,44 e 7,8 Hz, 1H); 7,44 (m, 1H); 7,32 (m, 1H); 7,16 ((s, 2H); 7,10 (dd, J = 1,45 e 7,8 Hz, 1H); 6,93 (s, 2H); 6,17 (s, 1H); 3,94 (s, 3H); 3,09 (q, J = 7,09 Hz, 8H); 1,04 (t, J = 7,09 Hz, 12H).

Ms(FAB): (MH)+615,1 1-4 Oxidacão de éster metílico de 2,7-dibromodiidrorrodamina B e formação do sal de acetato de éster metílico de 2,7-dibromorrodamina B (4) 2) Cloranila, CH2CI 2) Purificação AcOH,CH2€I2 1 4 Em uma solução agitada de éster metílico de 2,7-dibromodiidrorrodamina B (3) 400 mg (0,64 mmol) em 10 ml de diclorometano foi adicionadl cloranila (1,2 eq., 0,77 mmol, 192 mg). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite, em seguida a reação foi parada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida, para fornecer o resíduo roxo. O composto oxidado, obtido na etapa precedente, foi dissolvido em 15 ml de diclorometano e foi agitado por 5 min, em temperatura ambiente, seguido pela evaporação do solvente volátil sob pressão reduzida, para fornecer um resíduo viscoso roxo. O resíduo foi purificado por cromatografia cintilante, empregando-se 10% de metanol em diclorometano como eluente, para fornecer o desejado composto 4 como um sólido roxo viscoso (200 mg).

Rf: 0,29 (MeOH: CH2C121:9) Produção: 45,7 % Nmr: (CD3OD) δ 8,48 (dd, J = 1,45 e 7,5 Hz, 1H); 7,95 (m, 2H); 7,52 (dd, J = 1,6 e 7,2 Hz, 1H); 7,45 (s, 2H); 7,38 (s, 2H); 3,79 (q, J = 8Hz, 8H); 3,71 (s, 3H); 1,99 (s, 3H); 1,37 (t, J = 7,02 Hz, 2H) Ms (FAB): Calculado para C29H3203N2Br2 (MH-Aco)+: 614,0779 Encontrado: 614.0765 UV (MeOH): ?,máx 577 nm EXEMPLO II II Síntese de sal de acetato de éster hexílíco de 2,7-dibromorrodamina B (8) II-l Preparação de éster hexílíco de Rhodamina B (5) 1-hexanol ------ HC1 gaz 5 Em uma mistura agitada de 2,39 g (4,98 mmol) de Rodamina Be 120 ml de 1-hexanol, ácido clorídrico foi borbulhado através da solução por 45 min e a mistura de reação foi refluxada durante a noite. O 1-hexanol foi então destilado sob pressão reduzida e o resíduo vermelho escuro foi purificado por cromatografia cintilante empregando-se uma mistura de metanol e diclorometano (1:9) como eluente. Após a evaporação dos solventes voláteis, obtivemos um resíduo verde vermelho viscoso (2,62 g).

Rf: 0,45 (MeOH: CH2C121,2 : 8,8) Produção: 93,5% Ms (FAB): Calculado 034Η4303Ν2 (M-C1)+: 527,3273 Encontrado: 527,3261 UV (MeOH): Xmáx 555 nm II-2 Preparação de éster hexílico de diidrorrodamina B (6) NaBH4 CHjCIj · HjO 5 6 Éster hexílico de rodamina B (5) 940 mg (1,66 mmol) foi dissolvido em 200 ml de dicrometano e 150 ml de água. NaBH4 (sólido) em excesso foi adicionado em porção com vigorosa agitação, durante 30 min, até que a cor vermelho escuro inicial fosse descarregada. A fase orgânica laranja pálido foi separada e a fase aquosa extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram secadas em Na2S04, filtradas e evaporadas sob pressão reduzida. O resíduo de óleo bruto foi purificado por cromatografia cintilante, empregando-se acetato de etila como eluente, fornecendo 794 mg de 6 como um óleo roseado.

Rf: 0,92 (AcOEt) Produção: 90% II-3 Bromacão de éster hexílico de diidrorrodamina B (6) 7 Óxido de propileno CH3 Br2, MeOH ^ 6 7 Em um frasco de fundo redondo de 100 ml introduzimos éster hexílico de diidrorrodamina (6) 784 mg (1,48 mmol) e 25 ml de metanol grau espectral. A mistura foi agitada em temperatura ambiente até que todo o éster se tivesse dissolvido. Óxido de propileno 2 eq. (208 pL, 2,96 mmol) foi adicionado, seguido por adição em gotas de 2 eq. de bromo (152 5L, 2,96 mmol). A agitação foi continuada em temperatura ambiente por 1 h 30 min. O solvente volátil foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo oleoso vermelho foi submetido a purificação por cromatografia cintilante usando-se acetato de etila e hexanos (0,25 : 9,75) como eluente para fornecer 207 mg do composto puro 7 como sólido espumoso branco e 123 mg de produto impuro.

Rf: 0,61 (AcOEt: Hexanos 0,5:9,5) Produção: 20,5% II-4 Oxidacão do éster de hexila de 2,7-dibromodiidrorrodamina B e formação do sal de acetato de éster hexílico de 2.7-dibromorrodamina B (81 1) Cloranila,CH2CI2 2) Purificação de 3 AcOH, CH2C12 2 8 A uma solução agitada de éster hexílico de 2,7-dibromo diidro rodamina B 207 mg (0,30 mmol) em 8 ml de diclorometano foi adicionada cloranila (1,2 eq., 0,36 mmol, 89 mg). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite, em seguida a reação foi parada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para dar um resíduo roxo. O composto oxidado, obtido na etapa precedente, foi dissolvido em 8 ml de diclorometano e ácido acético (0,8 ml) foi adicionado em gotas. A solução vermelho translúcido obtida foi agitada por 5 min em temperatura ambiente, seguido por evaporação do solvente volátil sob pressão reduzida para fornecer um resíduo viscoso roxo, que é purificado por cromatografia cintilante usando-se 10% metanol em diclorometano como eluente, para fornecer o desejado composto 8 como um sólido roxo viscoso (198 mg).

Rf: 0,47 (MeOH: CH2C121:9) Produção: 86,9% Nmr: (CD3OD) δ 8,29 (dd, J = 1,5 e 7,6 Hz, 1H); 7,82 (m, 2H): 7,40 (dd, J = 1,6 e 7,2 Hz, 1H); 7,37 (s, 2H); 7,28 (s, 2H); 3,96 (t, J = 7,2 Hz, 2H); 3,71 (q, J = 7,05 Hz, 8H); 1,91 (s, 3H); 1,29 (t, J = 7,095 Hz, 12H); 1,08 (m, 4H); 0,79 (t, j = 7,04 Hz, 3H).

Ms(FAB):Calculado para C34H4203N2Br2 (MH-AcO)+: 684,1561 Encontrado: 684,1587 UV (MeOH): Xmáx 582 nm EXEMPLO III III Síntese de cloridreto do éster metílico do ácido 4\5’-dicloro-benzóico de 2 ’-(6-dimetiIamino-3-dimetilimino-3H-xanten-9-ila) III-l Preparação de cloridreto do ácido 4,5’-dicloro-benzóico de 2’-(6-dimetilamino-3-dimetilimino-3H-xanten-9-íla) ^ 1) ZnCl2 165°C, 5 h 2) NaOH 2)HC1 9 Uma mistura de 3,00 g (21,8 mmol) de 3-(dimetilamino)fenol, 3,00 g (13,8 mmol) de anidrido 4,5-dicloroftálico e 1,72 g de cloreto de zinco é aquecida em um banho de óleo a 165 - 170 °C por 5 h 30 min com agitação. A fusão é esfriada e empoada para fornecer um sólido vermelho. O sólido é lavado com água quente, triturado com 10% de hidróxido de sódio e diluído com água. A goma que se separa é coletada, lavada com mais hidróxido de sódio e água. A base corante resultante é então triturada com ácido clorídrico concentrado. Água foi então adicionada e o precipitado vermelho obtido foi coletado e secado. O corante foi então dissolvido em metanol e precipitado com éter dietílico para fornecer 9 como um sólido vermelho (3,27 g).

Rf: 0,48 (MeOH: CH2C12 2:8) Produção: 48% Nmr: (CD3OD) δ 8,47 (s, 1H); 7,72 (s, 1H); 7,22 (d, J = 9,47 Hz, 2H); 7,11 (m, 2H); 7,01 (d, J = 2,4 Hz, 2H); 3,32 (s, 12H) Ms(FAB):Calculado para C24H2103N2C12 (M-CI)+: 455,0929 Encontrado: 455,0938 UV (MeOH): 511 nm III-2 Preparação de cloridreto de éster metílico do ácido 4’.,5’-dicIoro-beiizóico de 2’-(6-dimetilamino-3-dimetilimino-3H-xanten-9-ila) (10) DCC, DMAP MeOH 9 10 Em um frasco de fundo redondo de 250 ml, equipado com agitador magnético, foram adicionados 738 mg (1,50 mmol) do ácido 9 e 40 ml de diclorometano anidro e 10 ml de DMF anidro. A mistura foi agitada sob nitrogênio, até todo o ácido ter sido dissolvido. Uma quantidade de 309 mg (1,50 mmol) de 1,3-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) foi então adicionada, seguido por 200 pL de metanol e 18 mg de 4-N,N-dimetilamino piridina (DMAP). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. O solvente foi então destilado sob pressão reduzida para dar um resíduo vermelho, que foi purificado por cromatografia cintilante empregando-se MeOH: CH2C12 (1,2: 8,8) como eluente para fornecer 10 como um sólido marrom avermelhado (350 mg).

Rf: 0,52 (MeOH: CH2C12 2:8) Produção: 46% Nmr: (CD3OD) δ 8,50 (s, 1H); 7,80 (s, 1H); 7,18 (d, J = 9,2 Hz, 2H); 7,12 (m, 2H); 7,04 (d, J = 1,31 Hz, 2H); 3,80 (s, 3H); 3,35 (s, 12H) Ms (FAB): calculado para C25H2303N2C12 (M-C1)+: 469,1085 Encontrado: 469,1078 UV (MeOH): >umáx 555 nm EXEMPLO IV IV Preparação de 4,5-dibromorrodamina 6G (11) Br, MeOH 11 A uma quantidade de 600 mg (1,25 mmol) de rodamina 6G dissolvidos em 50 ml de metanol foi adicionada em gotas, em temperatura ambiente, uma solução de 128 pL (2 eq., 250 mmol) de bromo. Um precipitado foi formado 10 min após a adição do bromo. A mistura foi agitada por 3 horas e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para dar um sólido vermelho. O produto bruto foi recristalizado de metanol : éter dietílico (80 ml: 400 ml) para dar o produto ü como um sólido vermelho esverdeado (585 mg).

Rf: 0,26 (MeOH: CH2C121:9) Produção: 68,5% Nmr (CD3OD) δ 8,36 (dd, J = 1,13 e 7,44 Hz, 1H); 7,89 ((m, 2H); 7,47 (dd, J = 1,46 e 6,76 HZ, 1H); 6,98 (s, 2H); 4,07 (m, 6H); 2,29 (s, 6H); 1,28 (t, J = 7,04 Hz, 6H); 1,02 (t, J = 7,05 Hz, 3H) Ms(FAB): Calculado para C28H30O3N2Br2 (MH-Br)+: 600,0623 Encontrado: 600,0605 UV (MeOH): Xmàx 546 nm EXEMPLO V V Síntese do éster etílico de 2-(2-metóxi etóxi) de 4,5-dibromorrodamina 110 (13) V-l Preparação de éster etílico de 2-(2-metóxi etóxD de rodamina 110 (12) DÇC, HOBT DMF, CH2Cl2 ΗΟ^'^'ν^Ο'' 12 Em rodamina 110 1,00 g (2,72 mmol) foi adicionada uma mistura de DMF anidro e diclorometano (60 ml : 10 ml) e a mistura foi agitada até que todo o corante fosse dissolvido. 1,3-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) 562 mg (1 eq., 2,72 mmol) foram adicionados, seguido por HOBT 368 mg (1 eq., 2,72 mmol), 2-(2-metóxi etóxi) etanol 518 \\L (1,60 eq., 4,36 mmol) e 33 mg (0,27 mmol) de 4-dimetilamino piridina (DMAP). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite e DMF foi então destilado sob pressão reduzida para dar um resíduo vermelho carregado. Este resíduo foi submetido a purificação por cromatografia cintilante, empregando-se metanol : diclorometano (2 : 8) como eluente para dar (530 mg) de um sólido vermelho. A cromatografia de camada delgada (TLC) mostrou a presença de outro produto com o desejado. O sólido obtido foi então dissolvido em metanol (10 ml) e enlace descendente foi adicionado até que um precipitado fosse obtido. O produto foi coletado e secado para dar o composto desejado J_2 (220 mg) como um sólido vermelho.

Rf: 0,33 (MeOH: CH2C12 2:8) Produção: 18,4% Ms (FAB): Calculado para C25H25N205 (M-C1)+: 433, 1736 Encontrado: 433,1777 V-2 Preparação de éster etílico de 2-(2-metoxi etóxi) de 4,5-dibromo rodamina 110 Br2, MeOH 12 13 Em um frasco de fundo redondo de 100 ml, equipado com um agitador magnético, foram adicionados 235 mg (0,50 mmol) de éster etílico de 2-(2-metóxi etóxi) de rodamina 110 12 e 15mlde metanol grau espectral. A mistura foi agitada até que todo o corante de rodamina fosse dissolvido. Uma quantidade de 50 μΕ (2 eq., 1,00 mmol) de bromo foi então adicionada e a reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 h 30 min. No final da reação, 10 pL de ciclo-hexano foram adicionados e a mistura foi agitada por outros 10 min. O solvente volátil foi evaporado sob pressão reduzida para dar um sólido vermelho. Este sólido foi cromatografado sobre gel de sílica MeOH: CH2C12 (1,2 : 8,8) como solvente eluindo.

As frações puras foram combinadas e evaporadas para dar o composto J_3 (250 mg) como sólido vermelho.

Rf: 0,76 (MeOH: CH2C12 2:8) Produção: 74,3% Nmr (CD3OD) δ 8,38 (dd, J = 1,5 e 6,87 Hz, 1H); 7,88 (m, 2H); 7,47 (dd, J = 1,48 e 7,02 Hz, 1H); 7,15 (d, J = 9,22 Hz, 2H); 7,04 (d, J = 9,21 Hz, 2H); 4,15 ((m, 2H); 3,39 - 3,25 (m, 9H) Ms (FAB): Calculado para C25H2305N2Br2 (M-Br)+: 588,9973 Encontrado: 588,9962 UV (MeOH): 502 nm EXEMPLO VI VI Preparação de 3-bromopropil éster de Rodamina B (14) DCC, DMAP CH2C12 14 Em Rodamina B 300 mg (0,62 mmol) foram adicionados 5 ml de diclorometano e a mistura foi agitada até que todo o corante fosse dissolvido. Uma quantidade de 1,3-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) 142 mg (1 eq, 0,62 mmol) foi adicionada seguido por 139 mg (10,0 mmol) de 3-bromopropanol e 8 mg (0,06 mmol) de 4-dimetil aminopiridina (DMAP). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A N,N-diciclo-hexil uréia foi filtrada e o solvente evaporado in vacuo para dar um resíduo vermelho carregado, que foi submetido a purificação por cromatografia cintilante usando-se metanol: diclorometano (1 : 9) como eluente. As frações contendo o desejado composto foram combinadas e o solvente evaporado sob pressão reduzida para dar 14 como um sólido viscoso vermelho carregado (300 mg) Rf: 0,71 MeOH : CH2C12 1,5 : 8,5) Produção: 79,8% Nmr (CD3OD) δ 8,29 (m, 1H); 7,85 (m, 2H); 7,43 M^R2 (R3)m; 7,05 (m, 6H); 4,08 (m, 2H); 3,68 (q, J = 7,06 Hz, 8H); 3,21 (m, 2H); 1,81 (m, 1H); 2,29 (t, J = 7,08 Hz, 12H) Ms (FAB): Calculado para C3iH3603N2Br! (M-C1)+: 563,1909 Encontrado: 563,1921 UV (MeOH): ?.máx 545 nm EXEMPLO VII VII Síntese de sal de metil éster acetato de 2/7-dibromo-4’-carboxitetrametilrosamina VII-1 Preparação de 4’-carboxidiidrotetrametilrosamina metila NaBH4 CH2C12:H2o’ éster (17) 15 16 Éster F5 910 mg (2,08 mmol) foi dissolvido em 250 ml de diclorometano e 150 ml de água. NaBH4 em excesso (sólido) foi adicionado em porção com agitação vigorosa, durante 30 min, até quase toda a cor fosse descarregada. A faz orgânica laranja pálido foi separada e a fase aquosa extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram secadas em Na2S04, filtradas e evaporadas sob pressão reduzida. O resíduo de óleo bruto foi purificado por cromatografia cintilante usando-se acetato de etila como eluente, fornecendo 530 mg de sólido branco espumoso.

Rf: 0,83 (AcOEt) Produção: 63% VII-2 Bromacão de diidro-4’-carboxitetrametiIrosamina metil éster Br2,MeOH Óxido de propileno 16 17 Em um frasco de fundo redondo de 100 mecanismo de levantamento introduzimos diidro rodamina B hexil éster 530 mg (1,31 mmol) e 50 ml de metanol grau espectral. A mistura foi agitada em temperatura ambiente até que todo o éster estivesse dissolvido. Óxido de propileno 2 eq. (185 μΐ, 2,63 mmol) foi adicionado, seguido por adição em gotas de bromo 2 eq. (135 qL, 2,63 mmol). A agitação foi continuada em temperatura ambiente por 1 h 30 min. O solvente volátil foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo oleoso vermelho foi submetido a purificação em cromatografia cintilante usando-se acetato de etila e hexanos (1:9) como eluente, para fornecer um sólido espumoso branco (391 mg) Rf: 0,36 (AcOEt: Hexanos 1:9) Produção: 53,5% Nmr (CD3OD) δ 7,96 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,28 (d, J = 8,31 Hz, 2H); 7,22 (s, 2H); 6,94 (s, 2H); 3,87 (s, 3H); 2,77 (s, 12H) VII-3_______Oxidação________do_______2,7-dibromodiidro-4’- carboxmexitetrametil rosamino metil éster (17) e formação do sal de acetato de 2,7 dibrom-4’-carboxitetrametilrosamino metil éter (18) Cloranila, CH2C 2) AcOH

13B A uma solução agitada de 2,7-dibromodiidrotetrametilrodamino metil éster 390 mg (0,69 mmol) em 15 ml de diclorometano foi adicionada cloranila (1,2 eq., 0,83 mmol, 205 mg). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite, em seguida a reação foi parada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para dar um resíduo roxo. O composto oxidado obtido foi dissolvido em 15 ml de diclorometano e ácido acético (0,8 ml) foi adicionado em gotas. A solução roxa translúcida obtida foi agitada por 5 min em temperatura ambiente, seguido pela evaporação do volátil sob pressão reduzida para dar um resíduo viscoso roxo, que é purificado por cromatografia cintilante usando-se 10% metanol em diclorometano como eluente, para dar o desejado composto 18A que está em equilíbrio com o composto 18B. 18A Rf: 0,34 (MeOH: CH2C121:9) 18Β Rf: 0,93 (MeOH: CH2C12 1:9) Produção: 30% Nmr (CD3OD) δ 7,97 (d, J = 8,28 Hz, 2H); 7,45 (d, J = 8,33 Hz, 2H); 7,19 (s, 2H); 6,99 (s, 2H); 3,89 (s, 3H); 2,93 (s, 2,64H); 2,83 (s, 12H); 2,01 (s, 0,356H) MS (FAB): Calculado para C25H2403N2Br2 (MH-AcO)+: 558,0153 Encontrado: 558,0169 EXEMPLO VIII

Preparação de 4,5-dibromo Rodamina B lactona (191 AcOH:H£> -------->~ Br2 12 Rodamina B 500 mg (1,04 mmol) foi dissolvida em 25 ml de ácido acético e 25 ml de água. Bromo 107 pL (2 eq., 2,08 mmol) foi então adicionado em gotas e a mistura de reação foi então evaporada sob pressão reduzida e 0 resíduo obtido foi redissolvido em diclorometano e 10% de solução aquosa de bicarbonato de sódio. A camada orgânica foi separada e lavada duas vezes com água, secada em Na2S04, filtrada e evaporada para dar um óleo rosa. O resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica usando-se metanol : diclorometano (0,2 : 9,8) como eluente, para dar 544 mg de sólido espumoso branco Rf: 0,88 (MeOH: CH2C121:9) Produção: 86,8% Nmr (CD3OD) δ 7,89 (dd, J = 1,45 e 7,8 Hz, 1H); 7,62 (m, 2H); 7,14 (dd, J = 1,6 e 7,2 Hz, 1H); 6,81 (d, J = 9,2 Hz, 2H); 6,58 (d, J = 9,2 Hz, 2H); 3,02 (q, J = 7,05 Hz, 8H); 0,93 (t, J = 7,04 Hz, 12H) Ms(FAB):Calculado para C28H2903N2Br2 (MH)+: 599,0545 Encontrado: 599,0527 EXEMPLO IX

Preparação de 2,7-dibromo Rodamina B lactona (20) j 1) Cloranila, CH->C12 ----------1_ 2) HC1 (IN), dioxano 3 20 A uma solução agitada de 2,7-dibromodiidrorrodamina B metil éster (3) 46 mg (0,10 mmol) em 4 ml de diclorometano foi adicionada cloranila (1,2 eq. 0,12 mmol, 30 mg). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite, em seguida a reação foi parada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para dar um resíduo roxo. O composto oxidado obtido na etapa precedente foi dissolvido em 4 ml de dioxano e HC1 (1M) (5 ml) foi adicionado em gotas e a solução resultante foi aquecida em banho de água para dar uma solução vermelho translúcido. Após a evaporação à secura sob pressão reduzida obtivemos um resíduo viscoso roxo. O resíduo foi purificado por cromatografia cintilante usando-se acetato de etila : hexanos (1,5 : 8,5) como eluente, para fornecer o desejado composto 4 como um sólido espumoso branco (35 mg).

Rf: 0,34 (AcOEt:hexanos 1,5:8,5) Produção: 80% Nmr: (CD3OD) δ 7,92 (dd, J = 1,45 e 7,5 Hz, 1H), 7,63 (m, 4H); 7,18 (dd, J = 1,6 e 7,2 Hz, 1H); 7,02 ((m, 2H).

Ms(FAB):Calculado para C28H2903N2Br2 (MH)+: 599,0545 Encontrado: 599.0570 EXEMPLOS DE USOS DOS DERIVADOS DE RODAMINA DE ACORDO COM A INVENÇÃO COMO INTERMEDIÁRIOS

EXEMPLO X X Síntese de cloreto de éster metílico de 4-bromo-5-fenil Rodamina B (22) X-l Preparação de 4-bromo-5-fenil Rodamina B lactona £21} PhB(OH)i Et3N;Pd(OAc)2;P(Ar)3 19 21 Uma mistura de 10 mmol de dibromolactona 19± 10 mmol de ácido fenilborônico, 4,2 mL (30 mmol) de Et3N, 0,067 g (0,3 mmol) de Pd(OAc)2 e 0,19 g (0,62 mmol) de catalisador de tri-o-tolilfosfina ou 0,16 g (0,62 mmol) de catalisador PPh3, em 40 ml de DMF é aquecida sob uma atmosfera de nitrogênio a 100 °C por 2-3 horas. O solvente é então destilado sob pressão reduzida e o resíduo dividido entre CH2C12 e 10% NH3 aquoso. Os extratos orgânicos são então secados (MgS04) e concentrados sob pressão reduzida. Purificação por cromatografia cintilante sobre gel de sílica fornece a monobromolactona pura 21. (Vide W.J. Thompson e J. Gaudino, J. Org. Chem. 1984, 49, 5237-5243: N. Miyaura, T. Yanagi e A. Suzuki, Synthetic Communications, 1981, 11(7), 513-519).

X-2 Preparação de cloreto de éster metílico de 4-bromo-5-fenil Rodamina B

MeOH/HQ

Rcfluxo 21 22 Metanólise e concomitante oxidação de monobromolactona 21 são realizados agitando-se primeiro uma mistura de 3-4 mmóis do composto em 100 ml de metanol, enquanto borbulhando-se em uma fina corrente de gás HC1 anidro por um período de 5 min e em seguida aquecendo-se a mistura ao refluxo durante a noite. O metanol é então evaporado sob pressão reduzida e o resíduo vermelho escuro purificado por cromatografia cintilante para fornecer o desejado produto vermelho escuro 22.

EXEMPLO XI XI Síntese de brometo de éster metílico de 2,7-dibromo-4,5-dimetiI Rodamina B (241 XI-1 Preparação de 4.5-dimetil Rodamina B lactona (23) PhCH2Pd(PPl%)2Br Me„Sn; HMPA 19 23 A uma solução de 7,0 mmol da dibromolactona 19 em hexametilfosforamida (HMPA) são adicionados 0,05 mmol do catalisador benzilbromobis(trifenilfosfino)-paládio(II) e 16,0 mmol de tetrametilestanho. A solução é então aquecida a 65 °C com agitação sob ar em um tubo selado, até ocorrer enegrecimento. A solução é então esfriada à temperatura ambiente e 5 ml de água são adicionados. A mistura é extraída com diclorometano e a solução orgânica secada sobre MgS04. A evaporação do solvente produz o produto bruto, que é purificado por cromatografia cintilante em gel de sílica para dar a lactona pura 23. (Vide D. Milstein e J. K. Stille, J. Am. Chem. Soc. 1979, 101 (17), 4992-4998). XI- 2 Preparação de brometo de éster metílico de 2,7-dibromo-4.5-dimetil Rodamina B (24) Br2/MeOH ......... ■ .......-»» 22 2á Uma solução de 1,25 mmol de 4,5-dimetil Rodamina B lactona 23 em 50 ml de metanol foi tratada, em temperatura ambiente, por 2,5 mmol de bromo. Um precipitado foi formado após a adição de bromo e a mistura foi agitada por 3 horas. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para dar um sólido vermelho, que foi recristalizado de metanol: éter dietílico para dar o desejado éster de dibromometila 24.

EXEMPLO XII XII Síntese de brometo de éster metílico de 2-bromo-7-etinil Rodamina B (261. XII- I Preparação de 2-bromo-7-etinil Rodamina B lactona (25) HC=CSi{CH3)3 (ΡΡ%Ρ<3(ΟΑ<02,Εί3Ν 20 25 Uma mistura de 53 mmol de dibromolactona 20 e 53 mmol de etiniltrimetilsilano, 300 mg de trifenil fosfina e 150 mg de acetato de paládio(II) é preparada em 100 ml de trietilamina anidra desareada a 30 - 40 °C. A mistura é então aquecida sob argônio a 90 - 100 °C por 22 h. A mistura é esfriada e filtrada para dar o desejado derivado de trimetilsilila impuro de 25. O tratamento com carbonato de potássio a 25 °C por 16 h, seguido por neutralização, fornece lactona 25 após purificação por cromatografia cintilante. (Vide W. B. Austin, N. Bilow, W. J. Kelleghan, e K. S. Y. Lau, J. Org. Chem. 1981, 46, 2280 - 2286; S. Takahashi, Y. Kuroyama, K. Sonogashira, N. Hagihara, Synthesis, 1980, 627 - 630) XII- 2 Preparação de cloreto de éter metílico de 2-bromo-7-etinil Rodamina B (26) MeOH/HCl Re fluxo 25 26 Uma solução agitada de 3,5 mmol de 2-bromo-7-etinil Rodamina B lactona 25 em 100 ml de metanol é tratada com uma fina corrente de gás HC1 borbulhada por 45 min. A mistura de reação é então aquecida ao refluxo durante a noite e o metanol evaporado sob pressão reduzida. O resíduo vermelho escuro é purificado por cromatografia cintilante usando-se uma mistura de metanol e diclorometano, para fornecer o desejado éster 26.

EXEMPLO XIII XIII Síntese de brometo de éster metílico de 4,5-dibromo-2,7-di-n-butil Rodamina B (28). XIII- 1 Preparação de 2.7-di-n-butil Rodamina B lactona Í27L

PhCH2Pd(PP^)3Br («-Bu^Sn; HMPA 20 27 Uma solução de 7,0 mmol da dibromolactona 20 em 4 ml de hexametilfosforamida (HMPA) é tratada com 0,05 mmol de benzilbromobis(trifenilfosfmo)paládio (II) e 16,0 mmol do composto tetra-n-butilestanho. A solução é então aquecida a 65 °C com agitação sob ar em um tubo selado até ocorrer enegrecimento. A solução é então esfriada à temperatura ambiente e 5 ml de água são adicionados. A mistura é extraída com diclorometano e o último é evaporado in vacuo para dar o produto bruto, que é purificado por cromatografia cintilante para produzir a lactona pura 27 (vide D. Milstein e J. K. Stile, J. Amer. Chem. Soc. 1979, 101 (17), 49924998).

XIII-2 Preparação de brometo de éster metüico de 4,5-dibromo-2.7-di-n-butil Rodamina B

Br2 / MeOH Refluxo 27 28 Uma solução de 1,25 mmol de Rodamina B lactona 27 em 50 ml de metanol é tratada em temperatura ambiente com 2,5 mmol de bromo. Um precipitado é formado brevemente após a adição do bromo e a mistura é agitada por 3 horas. O solvente é então evaporado sob pressão reduzida para dar um sólido vermelho, que é recristalizado de metanol : éter dietílico para dar o desejado brometo de éster de dibromometila 28.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE BACTERIOSÍDICA E/OU

BACTERIOSTÁTICA DOS DERIVADOS DE RODAMINA

Projeto Experimental Os seguintes procedimentos experimentais foram usados para a determinação da atividade antibacteriana.

Bacterioestase: Escherichia coli: (0157)a O protocolo usado para a inativação bacteriosídica foi realizado como descrito em Brasseur e colegas, com algumas modificações para a avaliação do potencial bacteriosídico (Brasseur e outros, 2000). Os compostos TH9402, HA-X-44, HA-X-164, HA-X-171 e HA-VIII-92 mostraram atividade antibacteriana contra E coli empregando-se o seguinte procedimento experimental.

As bactérias foram cultivadas durante a noite em meio de Calda Lubria (LB), 100 μΐ (« 1 x 10 bactérias) de cada suspensão bacterial foram adicionadas a 4 ml de meio LB, uma pequena alíquota da suspensão bacteriana foi retirada para titulação bacteriana antes do tratamento expresso λ como CFU/mL (unidades formadoras de colônia por mL). A suspensão bacteriana foram adicionados derivados de rodamina, cada derivado sendo testado em duplicata em uma concentração de 50 μΜ. Cada mistura de derivado de rodamina de bactérias foi incubado a 37 °C por 40 minutos. As suspensões de bactérias-rodamina foram então tratadas e expostas a uma luz de comprimento de onda de 514 nm por 180 minutos, durante uma energia de saída total de 30 Joules/cm. Em seguida ao tempo de tratamento, as suspensões de bactérias-rodamina foram centrifugadas a 3000g, ressuspensas em 4 ml e diluições seriais foram realizadas para cada duplicata. 10 pL das suspensões bacterianas diluídas foram revestidas em placas, as placas incubadas durante a noite a 37 °C. O efeito bacteriostático é expresso pelo número de CFU/ml.

Pseudomonas aeruginosa: O protocolo usado para a inativação bacteriosídica foi realizado como descrito em Brasseur e coll. com algumas modificações para a avaliação do potencial bacteriosídico (Brasseur e outros, 2000). O composto TH9402 mostrou atividade antibacteriana contra P. aeruginosa empregando-se o seguinte procedimento experimental.

As bactérias foram cultivadas durante a noite em meio de Calda Lubria (LB), 100 μΐ (« 1 x 107 bactérias) de cada suspensão bacteriana foram adicionados a 4 ml de meio LB, uma pequena alíquota da suspensão bacteriana foi retirada para titulação bacteriana antes do tratamento expresso como CFU/mL. À suspensão bacteriana foram adicionados derivados de rodamina, cada derivado sendo testado em duplicata em uma concentração de 50 μΜ. Cada mistura de derivado de rodamina bactérias foi incubada a 37 °C por 40 minutos. As suspensões de bactérias-rodamina foram então tratadas e expostas a uma luz de comprimento de onda de 514 nm por 180 minutos, para uma energia total de saída de 30 Joules/cm2. Em seguida ao tempo de tratamento, as suspensões de bactérias-rodamina foram centrifugadas a 3000g, ressuspensas em 4 ml e diluições seriais foram realizadas para cada duplicata. 10 pL das suspensões bacterianas diluídas foram revestidas em placas, as placas incubadas durante a noite a 37 °C. O efeito bacteriostático é expresso pelo número de CFU/mL.

Salmonella typhimurium O protocolo usado para a inativação bacteriosídica foi realizado como descrito em Brasseur e colegas, com poucas modificações para a avaliação do potencial bacteriosídico (Brasseur e outros, 2000). Os compostos TH9402, HA-X-44 e HA-X-164 mostrou atividade antibacteriana conta Salmonella thyphimurium usando-se o seguinte procedimento experimental.

As bactérias foram cultivadas durante a noite em meio de Calda Lubria (LB), 100 μΐ (« 1 x 107 bactérias) de cada suspensão bacteriana foram adicionados a 4 ml de meio LB, uma pequena alíquota da suspensão bacteriana foi retirada para titulação bacteriana antes do tratamento expresso como CFU/mL. À suspensão bacteriana foram adicionados derivados de rodamina, cada derivado sendo testado em duplicata em uma concentração de 50 μΜ. Cada mistura de derivado de rodamina bactérias foi incubada a 37 °C por 40 minutos. As suspensões de bactérias-rodamina foram então tratadas e expostas a uma luz de comprimento de onda de 514 nm por 180 minutos, para 'S uma energia total de saída de 30 Joules/cm . Em seguida ao tempo de tratamento, as suspensões de bactérias-rodamina foram centrifugadas a 3000g, ressuspensas em 4 ml e diluições seriais foram realizadas para cada duplicata. 10 pL das suspensões bacterianas diluídas foram revestidas em placas, as placas incubadas durante a noite a 37 °C. O efeito bacteriostático é expresso pelo número de CFU/mL.

Staphilococcus epidermitis O protocolo usado para a inativação bacteriosídica foi realizado como descrito em Brasseur e colegas, com poucas modificações para a avaliação do potencial bacteriosídico (Brasseur e outros, 2000). Os compostos TH9402, HAX-40, HA-X-44, HA-X-149 e HA-X-164 mostraram atividade antibacteriana contra S. epidermitis, usando-se o seguinte procedimento experimental.

As bactérias foram cultivadas durante a noite em meio de Calda Lubria (LB), 100 μΐ (« 1 x 107 bactérias) de cada suspensão bacteriana foram adicionados a 4 ml de meio LB, uma pequena alíquota da suspensão bacteriana foi retirada para titulação bacteriana antes do tratamento expresso como CFU/mL. À suspensão bacteriana foram adicionados derivados de rodamina, cada derivado sendo testado em duplicata em uma concentração de 50 μΜ. Cada mistura de derivado de rodamina-bactérias foi incubada a 37 °C por 40 minutos. As suspensões de bactérias-rodamina foram então tratadas e expostas a uma luz de comprimento de onda de 514 nm por 180 minutos, para uma energia total de saída de 30 Joules/cm . Em seguida ao tempo de tratamento, as suspensões de bactérias-rodamina foram centrifugadas a 3000g, ressuspensas em 4 ml e diluições seriais foram realizadas para cada duplicata. 10 pL das suspensões bacterianas diluídas foram revestidas em placas, as placas incubadas durante a noite a 37 °C. O efeito bacteriostático é expresso pelo número de CFU/mL.

Staphilococcus epidermitis O protocolo usado para a inativação bacteriosídica foi realizado como descrito em Brasseur e colegas, com poucas modificações para a avaliação do potencial bacteriosídico (Brasseur e outros, 2000). Os compostos HA-X-171 e HA-VIII-92 mostraram atividade antibacteriana contra S. epidermitis, usando-se o seguinte procedimento experimental, exceto que uma concentração de 10 μΜ foi usada no procedimento experimental.

As bactérias foram cultivadas durante a noite em meio de n Calda Lubria (LB), 100 μΐ (« 1 x 10 bactérias) de cada suspensão bacteriana foram adicionados a 4 ml de meio LB, uma pequena alíquota da suspensão bacteriana foi retirada para titulação bacteriana antes do tratamento expresso \ como CFU/mL. A suspensão bacteriana foram adicionados derivados de rodamina, cada derivado sendo testado em duplicata em uma concentração de 10 μΜ. Cada mistura de derivado de rodamina-bactérias foi incubada a 37 °C por 40 minutos. As suspensões de bactérias-rodamina foram então tratadas e expostas a uma luz de comprimento de onda de 514 nmpor 180 minutos, para uma energia total de saída de 30 Joules/cm2. Em seguida ao tempo de tratamento, as suspensões de bactérias-rodamina foram centrifugadas a 3000g, ressuspensas em 4 ml e diluições seriais foram realizadas para cada duplicata. 10 pL das suspensões bacterianas diluídas foram revestidas em placas, as placas incubadas durante a noite a 37 °C. O efeito bacteriostático é expresso pelo número de CFU/mL.

Staphilococcus epidermitis O protocolo usado para a inativação bacteriosídica foi realizado como descrito em Brasseur e colegas, com poucas modificações para a avaliação do potencial bacteriosídico (Brasseur e outros, 2000). O composto HAX-40 mostrou atividade antibacteriana contra S. epidermitis, usando-se o seguinte procedimento experimental, exceto que um tempo de extração de 90 minutos foi realizado antes do tratamento de radiação. S. epidermitis foi cultivado durante a noite em meio de Calda n Lubria (LB), 100 μΐ (« 1 x 10 bactérias) de cada suspensão bacteriana foram adicionados a 4 ml de meio LB. Uma pequena alíquota da suspensão bacteriana foi retirada para titulação bacteriana antes do tratamento. A suspensão bacteriana foram adicionados os derivados de rodamina, o derivado sendo testado em duplicata em uma concentração de 50 μΜ. Cada mistura de derivado de rodamina-bactérias foi incubada a 37 °C por 40 minutos. As suspensões de bactérias-rodamina foram então centrifugadas a 3000 g por 10 minutos, ressuspensas em 4 mL de meios LB e incubadas por 90 minutos a 37 °C para permitir a extração dos derivados. As suspensões de bactérias-rodamina foram então tratadas e expostas a uma luz de comprimento de onda de 514 nm por 180 minutos, para uma energia de saída total de 30 Joules/cm . Em seguida ao tempo de tratamento, diluições seriais foram realizadas para cada duplicata e 10 pL da suspensão bacteriana diluída foram revestidos em placa, as placas incubadas durante a noite a 37 °C. O efeito bacteriostático é expresso pelo número de unidades formadoras de colônia/mL. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DOS DERIVADOS DE RODAMINA DE FÓRMULA (I) Ensaio antiviral Referências Lin L., Inactivation of cytomegalovírus em platelet concentrates using Helinx™ technology, Seminar em Hematology, 2001, 38, 4, Supp. # 11, 27-33;

Brasseur, N., Ménard, I., Forget, A., El Jastimi, R., Hamel, R., Molflno. N.A. e E van Lier, J., Eradication of Multiple Myeloma and Breast Câncer Cells by Th9402-mediated Photodynamic Therapy: Implication of Clinicai Ex vivo Purging of Autologous Stem Cell Transplant, Photochemistry and Photobiology, 2000, 72, 6, 780-878;

Lin.B., Londe, H., Janda, J.M., Hanson, C.V. e Corash, L., Photochemical Inactivation of Pathogenic, Bactéria in Human Platelet Concentrates, Blood, 1994, 83, 9, 2698-2706;

Lin, B.L., Londe, H., Hanson, C.V., Wioesehahn, G., Isaacs, S., Cimino, G. e Corash, L., Photochemical Inactivation of Cell-Associated Human Immunodeficiency Virus em Platelets Concentrates, Blood, 1993, 82, 1,292-297;

Li, B.L., Viesehahn, G.,P., Morei, P.A. e Corash L., Use of 8-Metoxypsoralen and Long-Wavelength Ultraviolet Radiation for Decontamination of Platelet Concentrates, Blood, 1989, 74, 1, 517-525.

Objetivo: O ensaio antiviral foi realizado como descrito em Lin, L (2001). Células de fibroblasto diplóide e de prepúcio (FS) humanos foram usadas neste ensaio. A atividade antiviral dos derivados de rodamina foi testada e os resultados mostraram que todos os compostos, HA-X-40, HA-X-149, HA-X-164, HA-X-171 e HA-VIII-92, seguidos por tratamento PDT, possuíam atividade antiviral contra Cytomegalovírus. Método: Células FS foram cultivadas até a confluência em frascos de cartucho. Na ocasião da infecção, 2,5 - 3,5 x 105 células estavam sendo cultivadas em cada sobrelâmina. A solução de estoque CMV (ADI69), contendo 1 mL de vírus, foi rapidamente descongelada, semeada e diluída em seguida a diluições de 100 vezes em MEM (sal de Earle) suplementado com L-glutamina e 2% FBS, volume total de 30 ml. A titulação do víms foi determinada a em 10‘2 (104 TCID50) unidades formadoras de placa (pfu) em 0,2 ml. Portanto, 1 ml usado nos experimento PDT representa 1,4 x 105 pfu. Um Μ O.I. de 0,4 - 0,5 de CMV foi usado por todo este experimento.

As placas não contendo derivados de rodamina foram tratadas com luz em paralelo às placas não tratadas com luz. A concentração usada por todo o ensaio para os derivados de rodamina foi mantida a 50 μΜ. Seguindo-se à adição dos derivados à solução de estoque viral, as placas foram colocadas dentro do dispositivo Theraluz L6.30 e iluminadas por 180 minutos com agitação de 210 rpm. A saída de energia foi medida como sendo de 30 Joules/cm2. A placa não-PDT foi colocada dentro de um incubador de 37 °C pela mesma quantidade de tempo. Em seguida a este tempo de tratamento, forem feitas diluições e inoculadas com as células FS sob centrifugação (2000 g, 60 minutos). Em seguida à centrifugação, as células são incubadas 60 minutos a 37 °C, 5% C02, em seguida são lavadas com os meios de cultura e incubadas por 18-24ha37°Ca 5% C02. O volume de inoculação de cada diluição foi de 0,2 ml, as diluições feitas eram IO"3 a 10'5 em duplicata.

As células foram fixadas, removidas dos frascos e manchadas com FITC rotulado (isotiocianato fluoresceína) Mab com antígeno precoce imediatamente CMV. As partículas virais CMV foram contadas. Uma partícula de vírus fluorescente (com formato de rins) representa uma unidade formadora de placa.

Aqui, é o protocolo para os dois outros compostos TH9402 e XA-X-44 que inibe a infectividade por citomegalovírus sem tratamento PDT, bem como uma nova versão da tabela a ser acrescentada na patente.

Objetivo: O ensaio antiviral foi realizado como descrito em Lin, L (2001). Células de prepúcio (FS), de fibroblasto diplóide humano, foram usadas neste ensaio. A atividade antiviral dos derivados de rodamina foram testados e os resultados mostraram que os compostos, TH9402 e HA-X-44 não precisam de tratamento PDT para possuir atividade antiviral contra Citomegalovírus. Método: Células FS foram cultivadas à confluência em frascos de cartucho. Na ocasião da infecção, 2,5-3,5 x 105 células estavam sendo cultivadas em cada sobrelâmina. A solução de estoque CMV (ADI69), contendo 1 ml de vírus, foram rapidamente descongeladas, semeadas e diluídas em seguida a diluições de 100 vezes em MEM (sal de Earle) suplementado com L-glutamina e 2% FBS, volume total 30 ml. A titulação do vírus foi determinada em ΙΟ"2 (104 TCID50) unidades formadoras de placa (pfu) em 0,2 ml. Portanto, 1 ml usado nos experimento PDT representa 1,4 x 105 pfu. Um M.O.I. de 0,4 - 0,5 de CMV foi usado por todo este experimento.

As placas não contendo derivados de rodamina foram tratadas com luz em paralelo com as placas não tratadas com luz. A concentração usada por todo o ensaio para os derivados de rodamina foi mantida a 50 μΜ. Em seguida à adição dos derivados à solução de estoque viral, as diluições foram feitas e inoculadas com as células FS sob centrifugação (2000 g, 60 minutos). Em seguida à centrifugação, as células são incubadas 60 minutos a 37 °C, 5% C02, em seguida lavadas com os meios de cultura e incubadas por 18 - 24 h a 37 °C a 5% C02. O volume de inoculação de cada diluição foi de 0,2 ml, as diluições feitas foram de 10'3 a 10'5 em duplicata.

As células foram fixadas, removidas dos frascos e manchadas com FITC (isotiocianato de fluoresceína) rotulado Mab com antígeno precoce imediatamente CMV.

As partículas virais CMV foram contadas. Uma partícula de vírus fluorescente (com formato de rins) representa uma unidade formadora de placa.

Embora a invenção tenha sido descrita com relação a suas versões específicas, deverá ser entendido que ela é capaz de mais modificações e este pedido destina-se a cobrir quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção, seguindo-se, em geral, os princípios da invenção e incluindo-se tais desvios da presente descrição que se situem dentro da prática conhecida ou costumeira da arte a que a invenção pertence e como possa ser aplicada aos aspectos essenciais aqui antes expostos e como segue no escopo das reivindicações anexas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (6)

1. Derivado de rodamina, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo de: cloridreto de éster metílico do ácido 2’-(6-dimetilamino-3-dimetilimino-3H-xanten-9-il) 4’,5’- dicloro-benzóico; bromidreto de éster etílico de 4,5-dibromorrodamina 110 2-(2- metóxi etóxi); sal de acetato de éster hexílico de 2,7-dibromorrodamina B; sal de acetato de éster metílico de 2,7-dibromorrodamina B; bromidreto de 4,5-dibromorrodamina 6G; 3-bromopropílico de rodamina B; sal de metil éster acetato de 2,7-dibromo-4’-carboxitetrametilrosamina; cloreto de éster metílico de 4-bromo-5-fenil Rodamina B; brometo de éster metílico de 2,7-dibromo-4,5-dimetil Rodamina B; brometo de éster metílico de 2-bromo-7-etinil Rodamina B; e brometo de éster metílico de 4,5-dibromo-2,7-di-n-butil Rodamina B.

2. Derivado de rodamina, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de infecções geradas por bactérias Gram positiva e/ou Gram negativa, em que o dito derivado de rodamina é selecionado do grupo consistindo de: cloridreto de éster metílico do ácido 2,-(6-dimetilamino-3-dimetilimino-3H-xanten-9-il) 4’,5’- dicloro-benzóico; bromidreto de éster etílico de 4,5-dibromorrodamina 110 2-(2- metóxi etóxi); sal de acetato de éster hexílico de 2,7-dibromorrodamina B; sal de acetato de éster metílico de 2,7-dibromorrodamina B; bromidreto de 4,5-dibromorrodamina 6G; 3-bromopropílico de rodamina B; sal de metil éster acetato de 2,7-dibromo-4’-carboxitetrametilrosamina; cloreto de éster metílico de 4-bromo-5-fenil Rodamina B; brometo de éster metílico de 2,7-dibromo-4,5-dimetil Rodamina B; brometo de éster metílico de 2-bromo-7-etinil Rodamina B; e brometo de éster metílico de 4,5-dibromo-2,7-di-n-butil Rodamina B.

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um derivado de rodamina, como definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

4. Composição farmacêutica para uso no tratamento de infecções geradas por bactérias Gram positiva e/ou Gram negativa, dita composição caracterizada pelo fato de compreender um derivado de rodamina selecionado do grupo consistindo de: cloridreto de éster metílico do ácido 2’-(6-dimetilamino-3-dimetilimino-3H-xanten-9-il) 4’,5’- dicloro-benzóico; bromidreto de éster etílico de 4,5-dibromorrodamina 110 2-(2- metóxi etóxi); sal de acetato de éster hexílico de 2,7-dibromorrodamina B; sal de acetato de éster metílico de 2,7-dibromorrodamina B; bromidreto de 4,5-dibromorrodamina 6G; 3-bromopropílico de rodamina B; sal de metil éster acetato de 2,7-dibromo-4’-carboxitetrametilrosamina; cloreto de éster metílico de 4-bromo-5-fenil Rodamina B; brometo de éster metílico de 2,7-dibromo-4,5-dimetil RodaminaB; brometo de éster metílico de 2-bromo-7-etinil Rodamina B; e brometo de éster metílico de 4,5-dibromo-2,7-di-n-butil RodaminaB.

5. Intermediário, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo de 4,5-dibromo Rodamina B lactona e 2,7-dibromo Rodamina B lactona.

6. Processo para a síntese de novos derivados rodamina como definidos na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma etapa reacional de quaisquer dos seguintes esquemas reacionais: onde R, Ar e Y são tais para permitir a preparação dos derivados supracitados.