BRPI0205800B1 - composição bioinoculante sinergística compreendendo cepas bacterianas de nº de acesso nrrl-30486, nrrl b-30487 e nrrl b-30488 e método para produzir a composição das mesmas - Google Patents
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Abstract
"composição bioinoculante sinergística compreendendo cepas bacterianas de n<0> de acesso nrrl-30486, nrrl b-30487 e nrrl b-30488 e método para produzir a composição das mesmas". a presente invenção refere-se a uma composição sinergística útil como bioinoculante, a referida composição compreendendo cepas bacterianas de acessão n<0>s. nrrl b30486, nrrl b-30487 e nrrl-b 30488, individualmente ou em todas as combinações possíveis, e opcionalmente veículo, com cada uma das cepas mostrando atividade promotora de planta, atividade de controle de fungos fitopatogênicos, capacidade de tolerar condições de tensão abiótica, capacidade de solubilização de fosfato sob condições de tensão abiótica; adicionalmente, um método de produzir a referida composição do mesmo e além disso um método de isolar as referidas cepas bacterianas da vaca <39>sahiwal<39>.
Description
"COMPOSIÇÃO BIOINOCULANTE e MÉTODO PARA PROMOVER O CRESCIMENTO DE UMA PLANTA" Campo técnico A presente invenção refere-se a uma composição sinergistica útil como bioinoculante, a referida composição compreendendo cepas bacterianas de N°s. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487 e NRRL-B 30488, individualmente ou em todas as combinações possiveis, e opcionalmente veiculo, com cada uma das cepas mostrando atividade promotora de planta, atividade para controle de fungos fitopatogênicos, capacidade de tolerar condições de tensão abiótica, capacidade de solubilização de fosfato sob condições de tensão abiótica; adicionalmente, um método de produzir a referida composição das mesmas, e além disso, um método de isolar as referidas cepas bacterianas da vaca 'Sahiwal'. Técnica Antecedente O mundo microbiano é um microcosmo cujas atividades são de importância central para a biosfera. Produtos microbianos contribuem para a saúde do meio ambiente, de planta, pública e do solo. Há uma surpreendente diversidade de microorganismos em sua especialização fisiológica e ecológica. Eles se desenvolveram para lidar com e florescem em quase todo lugar, não importa quão inóspito. Os microorganismos também formam uma gama de associações com outros micróbios e com outras plantas e animais. Podem ser patógenos, parasitas, simbiontes, comensais e saprófitos, e desse modo sua influência ecológica infiltra em todos os níveis tróficos de vida e gama de possíveis ecossistemas. Os micróbios provaram ser uma fonte excepcionalmente rica de produtos novos, e há toda indicação de que continuarão a ser dessa forma no futuro. Portanto, a exploração de biodiversidade por novos micróbios que sejam de importância ecológica ou sejam de valor econômico é importante. Isto tem induzidos os microbiólogos a continuarem a busca por novos micróbios úteis de fontes que permanecem não caracterizadas.
De acordo com a mitologia Hindu bem como às práticas médicas tradicionais indianas (os dois sistemas clássicos como Ayurveda e Siddha e as práticas orais dos habitantes de vilarejos rurais) o leite de vaca possui propriedades promotoras de saúde e que protegem a saúde rejuvenescente e consequentemente tem sido considerado como o melhor entre vitalizadores [Caraka-Samhita, tradutor-Editor P. Sharma, Chaukhambha Orientalia, Varanasi, índia, volume 1, pág. 213 (1981); P. Pushpangadan, Ethnobiology in índia: A status report, Ministry of Environment and Forests, Governo da índia, Nova Déli (1994); P. Pushpangadan, All índia Coordinated research project on ethnobiology: Final technical report 1982-1998, Ministry of Environment and Forests, Governo da índia, Nova Déli (1998)].
Leite pode ser definido como a secreção normal da glândula mamária dos mamíferos. Leite como é secretado pela glândula dos mamíferos é isento de microorganismos. Contudo, os microorganismos associados a teta se deslocam pelo canal da teta e para o interior do úbere [J.C. Olsen e G. Mocquot. Milk and milk products. In: International coinmission on microbiological specif ications for foods. Microbial ecology of foods. Food commodities. Vol. 2 Nova York: Academic press (1980) pág. 470-486]. Isto faz com que mesmo leite assepticamente tirado contenha microorganismos, na maior parte bactérias. Bactérias em leite assepticamente tirado são normalmente limitadas em número e incluem na maior parte micrococos, lactococos, estafilococos, estreptococos, e bacilus [F.L. Bryan, Journal of Food Protection, volume 46, pág. 637-649 (1983); R.A. Ledford, Raw milk and fluid milk products. In; Applied dairy microbiology. Eds. E.H. Marth e J.L. Steele, Nova York: Marcei Dekker, Inc. (1998) pág. 55-64]. É conhecido há mais de quatro décadas que muitas das bactérias que ocorrem comumente em leite acham-no um meio relativamente desfavorável e parecería desse modo que o leite tem propriedades seletivas acentuadas [T. Gibson e Y.A. Abd-El-Malek, Canadian Journal of Microbiology, volume 3, pág. 203-213, (1957)]. Desse modo a flora bacteriana que invadiu a teta e/ou úbere deve ter a capacidade de persistência para sobrevivência e multiplicação, sob essas condições sub-ideais. Portanto, o trabalho sobre leite descrito neste pedido se refere à flora bacteriana que persiste na teta e/ou úbere, que entrou no leite assepticamente tirado, em nossa tentativa pela busca de novos micróbios, de um lugar ecológico que permanece não caracterizado. A melhora da fertilidade do solo é uma das táticas mais comuns para aumentar a produção agrícola e florestal. Isolamos bactérias benéficas das plantas do leite da vaca. Inoculação de sementes ou solo com microorganismos benéficos para melhora de cultura tem sido praticada há alguns anos. Uma variedade de mecanismos foi identificada como sendo responsável por tal atividade de promoção do crescimento de plantas. Por exemplo, certos microorganismos promovem indiretamente o crescimento da planta pela inibição do crescimento de microorganismos prejudiciais; ou aumentam diretamente o crescimento da planta pela produção de hormônios de crescimento; e/ou pelo auxilio na absorção de nutrientes pelas culturas, por exemplo fósforo (P) [C.S. Nautiyal e outros, FEMS Microbiology Letters, volume 182, pág. 291-296 (2000)].
Contudo, um fator principal na comercialização mau sucedida de bioinoculantes tem sido a inconsistência de resultados de teste em campo visto que seu estabelecimento e desempenho são severamente afetados por fatores ambientais especialmente sob condições de tensão encontradas em solo, por exemplo, sal, pH e temperatura [C.S. Nautiyal e outros, FEMS Microbiology Letters, volume 182, pág. 291-296 (2000)]. Portanto, seria desejável fornecer cepas bacterianas tolerantes à tensão como bioinoculantes [C.S. Nautiyal, Biocontrol of plant diseases for agricultural sustainability. In: Biocontrol potential and its exploitation in sustainable agriculture. Volume 1, Eds. R.K. Upahyay, K.G. Mukerji, e B.P. Chamola, Kluwer Academic/Plenum Publishers, Nova York (2000) pág. 9-23] . Microorganismos promotores de crescimento de planta incluem porém não são limitados a Rhizobium, Pseudomonas, Azospirillum e Bacillus etc. [A.K. Saxena e outros, Bacterial biocontrol agents and their role in plant disease management. In: Biocontrol potential and its exploitation in sustainable agriculture. Volume 1, Eds. R.K. Upadhyay, K.G. Mukerji, e B.P. Chamola, Kluwer Academic/Plenum Publishers, Nova York (2000) pág. 25-37]. A utilidade de B. subtilis como fonte de antagonista para o fungo patogênico de planta Sclerotium rolfsii é bem conhecida [P. Broadbent e outros, Australian Journal of biological Sciences, volume 24, pág. 975 (1971)]. Baker e outros [Phytopathology, volume 73, 1148-1152 (1983) ] também relatam o uso de B. subtilis como agente de biocontrole de patógenos fúngicos de planta. Pusey e outros [Plant Disease, volume 72, pág. 622-626 (1988)] e P.L. Pusey [patente norte-americana número 5.047.239] revelaram o controle de deterioração de fruta pós-colheita utilizando B. subtilis. S.D. Heins e outros [patente norte-americana número 6103.228] revelaram métodos para proteger ou tratar plantas contra infecções fúngicas e bacterianas e infestações de larva de raiz de milho utilizando B. subtilis. B. lentimorbus é o agente causativo de doença leitosa em besouro japonês e larvas de escaravelho relacionadas [K.E. Rippere e outros International Journal of Systematic Bacteriology, volume 48, pág. 395-402 (1998)], e portanto utilizado para o biocontrole de larvas de certos insetos [R.E. Gordon e outros. 0 gênero Bacillus, Agriculture handbook no. 427, Departamento de Agricultura dos Estados Unidos da América, Gráfica do Governo norte-americano, Washington, D.C. (1973)]. B. lentimorbus também foi utilizado para aumentar a produção de peixe [W.T. Logan e outros, patente norte-americana número 5.746.155] e para tratar ninhada de aves domésticas [W.T. Logan e outros, patente norte-americana número 6.017.525].
Para propagar bactérias veículos comumente utilizados para inoculantes comerciais são vermiculita, carvão, carboximetil celulose, turfa, perlite, polivinil pirrolidona, e talco. Lama de prensa, um produto de "refugo" obtido durante a fabricação do açúcar também foi utilizado como veículo para Azotobacter chroooccum e Rhizobium japonicum [K.S. Jauhri, Indian Journal Agriculture Research, volume 24, pág. 189-197 (1990)]. Lama de prensa como qualquer outro adubo orgânico afeta as propriedades física, química e biológica dos solos. Ajuda também a aumentar os agregados estáveis em água, nos solos. Pode ser composto com líquido de lavagem usado de destilaria e utilizada como melhor adubo orgânico do que lama de prensa individualmente [D.P. Yadav. Recycling of sugar factory press mud in agriculture. In: Recycling of crop, animal, human and industrial wastes in agriculture. Ed. H.L.S. Tandon, Fertilizer development and consultation organization, Nova Déli (1995) pág. 91-108]. A indústria agrícola e ambiental se beneficiaria portanto claramente de um método simples e mais barato de inoculantes microbianos para plantas, sementes e solo.
Embora o trabalho em microbiologia do leite até o presente tenha sido em bactérias psicotróficas devido à sua importância em leite e produtos de laticínio [M.A. Cousin, Journal of food protection, volume 45, pág. 172-207 (1982); R.A. Ledford, Raw milk and fluid milk products. In: Applied dairy microbiology, Eds. E.H. Martha e J.L. Steele, Nova York: Marcei Dekker, Inc. (1998) pág. 55-64] não se encontrou previamente nenhuma cepa bacteriana do leite de vaca que tivesse a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos, promover crescimento de planta, tolerância para tensões abióticas e solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica. A índia é um dos poucos países no mundo que contribuiu ricamente para o grupo de genes de animais domésticos Internacional e aperfeiçoamento da população animal no mundo. Gado e búfalo contribuem com quase 15% da renda bruta nacional. 0 país possui 23% da população bovina do mundo. Gado, termo comiam para os mamíferos herbívoros domesticados que contribuem para o gênero Bos, da família Bovidae. Gado moderno é dividido em duas espécies: B. taurus, que se originou na Europa e inclui raças mais modernas de gado leiteiro e de corte, e B. indicus, que se originou na índia e é caracterizado por uma corcova e por cernelhas. 0 mencionado por último é agora difundido na África e na Ásia, com números menores importados para a América do Norte (principalmente na parte sul dos EUA) , América Central e América do Norte e Central.
Gado leiteiro são aquelas raças que foram desenvolvidas principalmente para produzir leite. Na América do norte as principais raças de gado leiteiro são Holstein-Friesian, Ayrashire, Brown Swiss e Jersey. Entre as principais raças leiteiras de B. indicus encontradas principalmente na índia estão a Gir, Hariana, Red Sindhi, Tharparker e Sahiwal. De longe Sahiwal é a melhor raça do subcontinente. É comparativamente uma raça pesada com corpo simétrico e pele solta, em comparação com Red Sindhi com a qual se parece muito. Os animais são normalmente longos e carnudos e com compleição mais pesada. A cor é parda avermelhada ou vermelho pálido, às vezes carne com manchas brancas. Diversos rebanhos dessa raça são mantidos na índia. 0 rendimento de leite varia de 1400 a 2500 kg. A hereditariedade desse traço é 0,2 a 0,3. A idade na primeira cria varia de 37 a 48 meses e o intervalo de cria é de 430 a 580 dias. Sahiwal é uma das raças mais populares do subcontinente. Foi exportada para Srilanka, Quênia e muitos países na América Latina e West Indies onde uma nova raça chamada Jamaica Hope foi desenvolvida dos cruzamentos de Sahiwal e Jersey [P.N. Bhat, Handbook of Animal Husbandry, Directorate of Publication and Information on Agriculture, Krishi Anusandhan Bhawan, Pusa, Nova Déli (1997)].
Por conseguinte, não houve indicação clara até o presente de que qualquer bactéria isolada da vaca poderia agir como um agente de biocontrole, e certamente não mostrando estimulação direta mediada por bactérias, do crescimento de planta por si. Não obstante, uma cepa bacteriana capaz de promover crescimento da planta, tolerância para tensões abióticas, e solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica, se fosse isolada, poderia encontrar aplicação imediata, por exemplo em solos afetados por fitopatógenos, disponibilidade insuficiente de nutrientes como fósforo, e tensões ao meio ambiente, etc., não resultou em uma melhora desejável no desenvolvimento de culturas, adicionalmente nenhum procedimento para a seleção de tal cepa bacteriana foi reportado. Verificamos por comparação direta em uma variedade de tipos de plantas que a combinação exclusiva de cepas bacterianas selecionadas é eficaz no aumento de saúde e crescimento de planta. A presente invenção se refere a novas cepas de bactérias isoladas de vaca que têm a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos, promover crescimento de plantas, tolerância para tensões abióticas, solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica e um método para a seleção dessas cepas.
Objetivos da presente invenção 0 principal objetivo da presente invenção é isolar cepas bacterianas da vaca, úteis como bioinoculante.
Outro objetivo principal da presente invenção é isolar cepas bacterianas de vaca Sahiwal, tendo atividade promotora de planta.
Ainda outra objetivo da presente invenção é isolar cepas bacterianas da vaca Sahiwal, tendo atividade promotora de planta de pelo menos 5% do peso seco.
Ainda outro objetivo da presente invenção é isolar cepas bacterianas de vaca Sahiwal que mostram atividade promotora de planta em termos de menor mortalidade de sementes, melhor germinação de mudas, altura de planta, número de vagens e peso seco de semente.
Ainda outro objetivo da presente invenção é isolar cepas bacterianas de vaca Sahiwal com atividade para controle de fungos fitopatogênicos.
Ainda outro objetivo da presente invenção é isolar cepas bacterianas de vaca Sahiwal com propriedade de solubilização de fosfato.
Ainda outro objetivo da presente invenção é isolar cepas bacterianas de vaca Sahiwal com atividade para tolerar condição de tensão abiótica.
Ainda outro objetivo da presente invenção é isolar a cepa bacteriana de vaca Sahiwal tendo 4-8% de capacidade de tolerância a sal.
Ainda outro objetivo da presente invenção é isolar cepas bacterianas da vaca Sahiwal tendo capacidade de tolerância a pH 4-10.
Ainda outro objetivo da presente invenção é isolar cepas bacterianas de vaca Sahiwal tendo capacidade de tolerância à temperatura 50-60°C.
Ainda outro objetivo da presente invenção é desenvolver uma formulação sinergística que compreende três cepas isoladas de vaca Sahiwal com a referida composição tendo propriedades, que compreendem controlar fungos fitopatogênicos, promover crescimento de planta, ter tolerância para tensões abióticas, solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica, produzindo metabólitos anti-fúngicos.
Ainda outro objetivo da presente invenção é desenvolver uma formulação que compreende três cepas isoladas da vaca Sahiwal, úteis como bioinoculante, mostrando máxima viabilidade sob condições variadas de armazenagem ou estufa ou campo.
Ainda outro objetivo da presente invenção é desenvolver uma formulação que compreende as três cepas isoladas da vaca Sahiwal com N°s de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487 e NRRL-B 30488, onde a referida formulação pode estar em forma líquida ou seca para sementes, plantas e solo.
Sumário da presente invenção A presente invenção refere-se a uma composição sinergística útil como bioinoculante, a referida composição compreendendo cepas bacterianas de N°s. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487, e NRRL-B 30488, individualmente ou em todas as combinações possíveis e opcionalmente veículo, com cada uma das cepas mostrando atividade promotora de planta, atividade para controlar fungos fitopatogênicos, capacidade de tolerar condições de tensão abiótica, capacidade de solubilização de fosfato sob condições de tensão abiótica; além disso, um método de produzir a referida composição do mesmo, e além disso, um método de isolar as referidas cepas bacterianas da vaca 'Sahiwal'.
Descrição detalhada da presente invenção Por conseguinte, a presente invenção refere-se a uma composição sinergística útil como bioinoculante, a referida composição compreendendo cepas bacterianas de Nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487 e NRRL-B 30488, individualmente ou em todas as combinações possíveis, e opcionalmente veículo com cada uma das cepas mostrando atividade promotora de planta, atividade para controlar fungos fitopatogênicos, capacidade de tolerar condições de tensão abiótica, capacidade de solubilização de fosfato sob condições de tensão abiótica; além disso, um método de produzir a referida composição das mesmas, e além disso, um método de isolar as referidas cepas bacterianas da vaca ' Sahiwal' .
Em uma modalidade da presente invenção, uma composição sinergística útil como bioinoculante, a referida composição compreendendo cepas bacterianas de N°s de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487 e NRRL-B 30488, individualmente ou em todas as combinações possíveis, e opcionalmente veículo.
Em outra modalidade da presente invenção, onde as cepas NRRL B-30486, e NRRL B-30488 pertence ao grupo Bacillus lentimorbus.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a cepa NRRL B-30487 pertence ao grupo Bacillus subtilis.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a cepa NRRL B-30486 mostra características como mostrado abaixo: Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a cepa NRRL B-30487 mostra características como mostrado abaixo: Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a cepa NRRL B-30488 mostra características como mostrado abaixo: Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde o veiculo é selecionado de um grupo que consiste em vermiculita, carvão, uma mistura de lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentada e liquido de lavagem usado de destilaria, e lama de prensa de carbonatação de usina de açúcar.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a razão de três cepas é aproximadamente 1:1:1.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a concentração total de cepas é 4-10 cfu/g de veiculo e preferivelmente 6-8 cfu/g de veiculo.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a concentração de cada cepa é 4-10 cfu/g de veiculo e preferivelmente 7-8 cfu/g de veiculo.
Ainda em outra modalidade da presente invenção onde o tempo de geração das cepas é 55-65 minutos a 30°C.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde as referidas cepas colonizam raizes de plantas.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde as referidas cepas sobrevivem a todas as estações da planta.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde as referidas cepas sobrevivem por pelo menos 2/3 anos na composição.
Em outra modalidade da presente invenção, um método in vitro de isolar cepas bacterianas de nos. de acessão NRRL B-0486, NRRL B-30487 e NRRL-B 30488, do lei de vaca 'Sahiwal", as referidas cepas tendo propriedades que compreendem controlar fungos fitopatogênicos, promover crescimento de plantas, ter tolerância para tensões abióticas, solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica, produzir metabólitos antifúngicos, coletando leite da vaca 'Sahiwal'.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, revestir leite em um meio de cultura.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, incubar a cultura em temp. de 25-35°C por aproximadamente 1-3 dias.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, selecionar todas as bactérias morfologicamente distintas da cultura.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, examinar as referidas cepas selecionadas na etapa anterior que suprimirão fungos fitopatogênicos mostrando uma zona de inibição de pelo menos 2 mm, pela incubação a 30-35°C, de preferência 28°C,por 20-35 dias, preferivelmente 27 dias.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, examinar as referidas cepas selecionadas na etapa anterior para bactérias promotoras de crescimento de planta mostrando pelo menos 5% de aumento em peso de planta, pelo crescimento de plantas na presença de bactérias selecionadas em uma concentração de bactérias que varia entre aproximadamente Log 6 a 10 CFU/ semente ou aproximadamente Log 6 a 8 CFU/grama de solo.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, examinar as referidas cepas selecionadas na etapa anterior de tolerância de tensão de sal a 4-8% para seleção adicional.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, o exame das referidas cepas selecionadas na etapa anterior de tolerância de tensão em pH 4-10 para seleção adicional.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, o exame das referidas cepas selecionadas na etapa anterior em tolerância de tensão de temperatura a 50-60°C para seleção adicional.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, examinar as referidas cepas selecionadas na etapa anterior em relação à capacidade de solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica de sal, pH e temperatura elevados para seleção adicional.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, isolar as três cepas bacterianas desejadas.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a planta para atividade promotora de crescimento é selecionada de um grupo que compreende Zea mays, Abelmoschus esculentus, Luffa cylindrica, Lycopersicon esculentum, Abelmoschus esculentus e Cucumis sativus.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde o meio de cultura é Nutriente Agar, o referido meio compreendendo extrato de carne (2-10 g) , peptona (5-15 g) , cloreto de sódio (2-10 g), agar (10-20 g) , água destilada (aproximadamente 1,0 L) com pH variando entre 7.0 - 7,4.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a tolerância de pH é testada a 30°C.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a umidade do solo varia entre 15-30%, preferivelmente 20%.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde o sal é preferivelmente NaCl.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde as cepas são cultivadas em meio de Caldo Nutriente (NB) que consiste em extrato de carne (0,5%), peptona (1%), NaCl (0,5%) e água destilada, com pH do meio sendo 7,2.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde os fungos patogênicos são selecionados de um grupo que compreende F. moni li forme, C. falcatum, F. oxysporum f.sp. ciceri, R. solani, Pythium sp., Phoma sorghii, Sclerotium rolfsii, alternaria solani, curvularia lunata, sclerotinia sclerotiorum e aspergillus niger.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a concentração das cepas varia entre 4-10 CFU/ml.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a solubilização de fosfato aumenta em aproximadamente 428% mediante um aumento combinado de temperatura, sal e pH.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a solubilização de fosfato aumenta em aproximadamente 160% com o aumento em concentração de sal.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a solubilização de fosfato aumenta em aproximadamente 130% com aumento em pH.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde as cepas são selecionadas em relação à tolerância de tensão de pH elevado preferivelmente pH 9.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde cepas são selecionadas em relação à tolerância de tensão de temperatura a 55°C.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a seleção de bactérias que demonstram melhores resultados em termos de menor mortalidade de mudas e melhor germinação de mudas, altura de planta, número de vagens e peso seco de semente.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a atividade promotora de planta sobe de 3-400%.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a concentração de fungos varia entre 4-7 esporos/ml de meio de cultura.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde as condições de tensão abiótica para solubilização de fosfato são selecionadas de um grupo de condições que compreende pH elevado variando entre 7-9, temp. elevada variando entre 30-45 e concentração de sal que varia entre 0,1-4%.
Em outra modalidade da presente invenção, um método de preparar formulação promotora de crescimento de planta compreendendo cepas bacterianas de nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487 e NRRL-B 30488, individualmente ou em todas as combinações possíveis, e veículo.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, cultivar bactérias em uma cultura, individualmente a uma concentração de aproximadamente Log 8 a 11 cfu/ml, preferivelmente log 9 a 10 cfu/ml, opcionalmente seguido por mistura das culturas em razão igual no caso de preparar uma combinação.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, diluir a referida cultura com água na razão de 1:50 a 1:150, de preferência 1:100, contendo aproximadamente Log 8-9 cfu/ml de bactérias.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, pulverizar aproximadamente 1-3 litros da cultura/ton. de veículo recentemente homogeneizado de preferência 2 litros da cultura/ton. de veículo recentemente homogeneizado e misturar.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, agitar os amontoados diariamente pelo menos duas vezes por dia por aproximadamente 2 dias, para aumentar a temperatura dos amontoados até 70-75°C.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, pulverizar liquido de lavagem usado ou água no amontoado agitado por aproximadamente 40 dias para manter o nivel de umidade de aproximadamente 55-65%.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, agitar os amontoados adicionalmente por mais 3-5 dias, agora para reduzir a umidade e temperatura do produto fermentado em aproximadamente 30% e 40-45°C.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, embalar o bioinoculante promotor de crescimento de planta pronto para sua aplicação.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde o veiculo é selecionado de um grupo que compreende lama de prensa sulfinada e lama de prensa de carbonatação, novas.
Ainda em oura modalidade da presente invenção, onde o meio de cultura é meio NB.
Ainda outra modalidade da invenção, onde homogeneiza a mistura manualmente e usa um meio de lavrar aéreo.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a referida formulação demonstra viabilidade máxima sob condição de campo ou estufa ou armazenagem variada.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde e a razão das referidas cepas é aproximadamente 1:1:1.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde usa a referida formulação em plantas, sementes e solo.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, um método de usar formulação promotora de crescimento de planta que compreende cepas bacterianas de Nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487 e NRRL-B 30488, individualmente ou em todas as combinações possíveis, e veículo, o referido método compreendendo as etapas de aplicar o referido bioinoculante em uma forma líquida ou seca em sementes, plantas e solo.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde o referido bioinoculante também contém as gomas ou açúcares a fim de melhorar adesão.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde as cepas estão na razão de 1:1:1.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a referida formulação demonstra viabilidade máxima, sob condição de campo ou estufa ou armazenagem variada.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde o veículo é selecionado de um grupo que compreende lama de prensa sulfinada e lama de prensa de carbonatação, novas.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde as plantas da variedade a ser testada em relação à promoção de crescimento de planta no campo na presença de bactérias em uma concentração de aproximadamente Log 7-9 cfu/semente ou aproximadamente Log 6-8 cfu/grama de solo.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde o usa formulação individualmente ou em combinação com outros produtos químicos a qual é inofensiva ao crescimento e sobrevivência de bactérias.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde os produtos químicos são selecionados de um grupo que compreende pesticidas, fertilizantes, nematicidas e herbicidas com ou sem, por exemplo formação de pelotas de cal para limitar a gravidade dos efeitos desses materiais.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, o método de preparar uma composição útil como bioinoculante, a referida composição compreende uma ou mais de cepas bacterianas novas, de Nos. de acessão NRRL B-30486, NRRL B-30487 e NRRL-B 30488 e um veículo.
Ainda outra modalidade da presente invenção, o cultivo das referidas cepas bacterianas em um meio de crescimento para fase log.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, diluir a referida cultura com água na razão que varia entre 1:10 e 1:100000, com a razão preferível de 1:100.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, misturar a referida cultura diluída com um veículo em pó inerte, com o nível de umidade da mistura variando entre 20-40%, de preferência aproximadamente 30% em uma base úmida.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, incubar a referida mistura por pelo menos aproximadamente dois dias, mantendo o nível de umidade constante na referida mistura.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, aumentar a contagem de bactérias na referida mistura para uma faixa de aproximadamente log 4-10 CFU/g de veículo.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, monitorar a taxa de sobrevivência das bactérias durante o período de pelo menos um ano na referida composição, onde as cepas bacterianas estão presentes de preferência em uma faixa de aproximadamente Log 7 a 9 CFU/g de veículo, mostrando taxa de sobrevivência longa de micróbios como inoculado.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde o veículo é selecionado de um grupo que compreende vermiculita, carvão, uma mistura de lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado e líquido de lavagem usado de destilaria, e lama de prensa de carbonatação de usina de açúcar, casca de arroz, carboximetil celulose, turfa, perlite, talco, e polivinil pirrolidona.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde veículos preferidos são selecionados de um grupo que compreende vermiculita, carvão e lama de prensa fermentada.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a contagem bacteriana é mais preferivelmente aproximadamente Log 8 CFU/g de veículo.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde as plantas para promoção de crescimento são selecionadas de um grupo que compreende grão-de-bico, A. esculentus e C. sativus e Z. mays e Triticum aestivum e Glycine max e Pisum sativum e Impatiens balsamina.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a razão de cepas é aproximadamente 1:1:1, no caso de uma combinação.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde e o meio de crescimento é meio NB.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde cultiva bactérias individualmente em uma concentração de aproximadamente Log 9 a 10 CFU/ml seguido por mistura das culturas na razão de aproximadamente 1:1:1.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde dilui a cultura com água de preferência na razão de 1:10, contendo aproximadamente Log 8-9 cfu/ml.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, onde a umidade do produto é regulada com amontoados.
Ainda em outra modalidade da presente invenção, os requerentes descobriram um método novo para examinar bactérias para selecionar aquelas cepas bacterianas que têm a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos, promover crescimento de planas, tolerância a tensões abióticas e solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica. Quanto utilizados como bioinoculantes, as bactérias novas obtidas por nosso método têm a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos e promover crescimento de plantas sob condições de campo.
Os requerentes descobriram também três novas cepas de Bacillus, quando utilizadas individualmente ou como uma mistura nova de combinação que provê um sinergismo exclusivo, as quais têm a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos sob condições de campo, promover crescimento de planta sob condições de campo, tolerância a tensões abióticas, e solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica. 0 método de seleção compreende: 1. isolar cepas de bactérias do leite e selecionar as bactérias com potencial para suprimir crescimento de fungos fitopatogênicos Colletotrichum falcatum, Sclerotium rolfsii, Alternaria solani, Penicillium sp., Pythium aphanidermatum, Phytophthora palmivora, Curvularia lunata, Sclerotinia sclerotioum, e Aspergillus niger, sob condições in vitro em placas de nutriente agar (NA) riscando uma a quatro colônias bacterianas individuais em torno da borda de uma placa petri com 90 mm de diâmetro e incubando a mesma a 28°C por dois dias; transferir um inóculo de tampão agar dos fungos (quadrado de 5 mm) para o centro da placa individualmente de uma placa de fonte de fungos a serem testados em NA por 2 a 7 dias; e selecionar as cepas bacterianas que têm a atividade de biocontrole que inibiu crescimento fúngico. 2. Examine de bactérias selecionadas na etapa 1 na estufa que têm potencial para suprimir crescimento de fungos patogênicos sob condições in vitro, para bactérias promotoras de crescimento de plantas como a seguir: cultivar plantas de milho na presença de bactérias selecionadas na etapa 1 na estufa em uma concentração de aproximadamente Log 8 unidades de formação de colônia (cfu)/semente em solo não estéril; cultivar plantas de milho de controle como acima porém sem a adição das bactérias; e selecionar como bactérias promotoras de crescimento de plantas aquelas cepas que fazem com que as plantas tratadas apresentem maior peso seco. 3. Exame de bactérias selecionadas na etapa 2 como promotores de crescimento de planta para tolerância de tensão abiótica (sal, pH e temperatura) sob condições in vitro como a seguir: selecionar como bactérias tolerantes à tensão aquelas cepas selecionadas na etapa 2 que apresentam tolerância a 6% de sal (NaCl), pH 5-9, e temperatura de 55°C. 4. Caracterização de bactérias selecionadas na etapa 3 tolerantes à tensão abiótica em relação à capacidade de solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica (sal, pH e temperatura) como a seguir: estimativa quantitativa de solubilização de fosfato em caldo utilizando meio de crescimento de fosfato do National Botanical Research Institute (NBRPI); elucidar o efeito de sal (NaCl), pH e temperatura sobre a solubilização de fosfato pelo cultivo de cepas em NBRIP contendo quantidades variadas de NaCl (peso/v), pH e temperatura como indicado; inocular meio NBRIP com a cepa bacteriana com aproximadamente Log 9 cfu/ml; meio não inoculado posto em autoclave serviu como controle. 5. Exame de bactérias selecionadas na etapa 3 tolerantes à sobrevivência em veículos, em relação ao seu uso comercial como bioinoculante, como a seguir: cultivar as bactérias em um meio de crescimento; adicionar células de fase-log a vários veículos, particularmente vermiculita, carvão e lama de prensa fermentada; posteriormente aplicar o inóculo a sementes (por exemplo, pela preparação de uma pasta gue contém a mistura de bactérias/veículo e gomas ou açúcares para melhorar a adesão) ou aplicando diretamente ao solo ou por gotejar suspensões de bactérias/veículo em sulcos de plantio ou pela mistura com outro material de plantio; utilizar a formulação demonstrando viabilidade máxima (sob condições variadas de armazenagem ou estufa ou campo) para plantas, sementes e solo. 6. Experimento em campo de bactérias selecionadas na etapa 3 tolerantes à tensão abiótica em relação à capacidade de controlar patógenos de plantas, particularmente fungos, como Fusarium oxysporum f.sp. ciceri isto é, reduzir a incidência ou gravidade da doença em grão-de-bico cultivado em campo e em relação à capacidade de controlar patógenos de plantas, particularmente fungos, como Fusarium moniliforme e Colletotrichum falcatum em cana-de-açúcar cultivada em campo, utilizando vários veículos como vermiculita. 7. Experimento em campo de bactérias selecionadas na etapa 3 tolerantes à tensão abiótica em relação à capacidade de promover crescimento de planta de plantas cultivadas em campo como cana-de-açúcar, utilizando vários veículos como vermiculita e lama de prensa fermentada.
As cepas bacterianas selecionadas pelo processo acima têm a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos, promover crescimento de plantas, tolerância a tensões abióticas e solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica.
De acordo com esta descoberta, é um objetivo da invenção fornecer um método para selecionar aquelas cepas que têm a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos, promover crescimento de planta, tolerância a tensões abióticas, e solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica, utilizando as cepas bacterianas assim selecionadas.
Também é um objetivo da invenção fornecer um meio para examinar bactérias a fim de selecionar aquelas cepas que têm a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos e promover crescimento de plantas sob condições de campo.
Um objetivo adicional da invenção é a provisão de cepas novas de B. lentimorbus e B. subtilis que têm a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos, promover crescimento de planta, tolerância a tensões abióticas e solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica.
Outro objetivo da invenção é a provisão de veículos adequados para cepas bacterianas, em particular novas cepas de B. lentimorbus e B. subtilis selecionadas na etapa 3 para sobrevivência em vários veículos, para produção comercial como bioinoculante para plantas, sementes e solo.
Ainda outro objetivo da invenção é a provisão de novas cepas de B. lentimorbus e B. subtilis que têm a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos sob condições de campo.
Ainda outro objetivo da invenção é a provisão de novas cepas de B. lentimorbus e B. subtilis que têm a capacidade de promover crescimento de planta sob condições de campo.
Outros objetivos e vantagens da invenção tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição. Deve ser entendido, contudo, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferidas da invenção, são fornecidos apenas como ilustração, uma vez que várias alterações e modificações compreendidas no espírito e âmbito da invenção tornar-se-ão evidentes para aqueles versados no estado da técnica a partir desta descrição detalhada.
Nesta descrição, o termo "bactérias do leite" é utilizado para indicar bactérias, que entraram no leite assepticamente tirado, pela invasão da teta e/ou úbere e têm a capacidade de persistência para sobrevivência e multiplicação, sob essas condições sub-ideais. Portanto, as bactérias descritas neste pedido se referem à flora bacteriana que persiste na teta e/ou úbere representam um lugar ecológico que permanece não caracterizado.
Foi descoberto que a percentagem de cepas bacterianas que mostram atividade de biocontrole contra fungos fitopatogênicos era máxima no leite de vaca Sahiwal, seguida pelo ser humano, vaca Holestien e búfalo. A partir desse parâmetro o leite da vaca Sahiwal foi superior ao do ser humano, da vaca Holestien e ao de búfalo. Seleções extensas de um grande número de cepas bacterianas coletadas do leite de ser humano, vaca Sahiwal, vaca Holestien e búfalo mostraram que algumas dessas cepas, como descrito abaixo, têm a capacidade de estimular o crescimento de plantas.
Portanto um aspecto da presente invenção se refere a métodos para selecionar bactérias úteis a partir do leite do ser humano, de vaca Sahiwal, vaca Holestien e de búfalo e a aplicação das mesmas para promoção de crescimento de plantas.
Primeiramente as bactérias são isoladas por procedimentos padrão como descrito em Eklund e Lankford, Laboratory manual for general microbiology [Prentice-Hall, Inc., USA (1967), pág. 21-27]. Por exemplo, diluições em série das amostras de leite são preparadas e podem ser revestidas por dispersão em vários meios gerais. Os exemplos de meios gerais, que propagam um número grande de bactérias, incluem NA e similares. A seguir as placas NA são incubadas por 1 a 3 dias em uma temperatura adequada para crescimento bacteriano, genericamente aproximadamente 25 a 35°C. A temperatura preferida para incubação de placas é 30°C. A seguir, cepas individuais das bactérias são submetidas a um primeiro exame para seleção de bactérias que têm potencial para suprimir fungos fitopatogênicos sob condições in vitro como descrito anteriormente [C.S. Nautiyal, Current Microbiology, volume 35, pág. 525-8 (1997)]. Colônias bacterianas em placas NA foram riscadas em torno da borda de uma placa petri com 90mm de diâmetro e as placas foram incubadas a 25-35°C por 1 a 2 dias. Um inóculo de tampão de agar dos fungos a serem testados (quadrado de 5 mm) foi então transferido para o centro da placa individualmente de uma placa de fonte dos fungos. Após incubação por 5 a 7 dias zonas de inibição foram prontamente observadas no caso de cepas bacterianas que têm a atividade de biocontrole. A escolha de tempo para incubação das colônias bacterianas nas placas antes de desafio com os fungos patogênicos a serem testados e o tempo de incubação das placas posteriormente para observar a zona de inibição depende da taxa de crescimento dos fungos patogênicos a serem testados. Por exemplo se o fungo for de crescimento rápido, por exemplo Rhizoctonia, então prefere-se que as colônias bacterianas em placas NA sejam riscadas em torno da borda de uma placa petri com 90 mm de diâmetro pelo menos 2 dias antes que um inóculo de tampão agar do fungo a ser testado, seja transferido para o centro da placa. Ao contrário, se o fungo for de crescimento lento, por exemplo, Fusarium, então prefere-se que um inóculo de tampão agar do fungo a ser testado seja transferido para o centro da placa e as placas sejam incubadas por 2 a 3 dias para permitir tempo suficiente para que os fungos cresçam, antes das colônias bacterianas nas placas NA serem riscadas em torno da borda da placa petri.
Cepas bacterianas isoladas na etapa anterior são examinadas para selecionar aquelas, que em uma concentração especifica promovem o crescimento de planta sob condições de estufa como descrito anteriormente [C.S. Nautiyal, Current Microbiology, volume 34, pág. 12-17 (1997)]. Neste teste sementes esterilizadas de milho são cultivadas em solo não esterilizado e inoculadas com as cepas bacterianas, individualmente, em uma concentração de Log 6-10 cfu/semente. A concentração preferida de inóculo é Log 8 cfu/semente. Verificou-se que as bandejas (35x35 cm) com 16 (4x4) lugares por bandeja (cada espaço tinha 7 cm de largura, 10 cm de profundidade e 1 cm de separação entre si) são de um tamanho conveniente para cultivo de milho e de outras plantas para o teste em estufa. Cada lugar foi enchido até 8 cm com solo não esterilizado. Embora o solo estéril ou qualquer outro material de suporte de crescimento de planta por exemplo como vermiculita também possa ser utilizado em vez de solo não estéril, prefere-se que solo não estéril do campo onde essas bactérias pretendem ser liberadas, seja utilizado no teste em estufa. Água de torneira foi adicionada em cada furo antes do plantio de sementes para ajustar o solo a 15 até 30% de umidade. A umidade preferida de solo é 20%. Quatro sementes tratadas com bactérias foram adicionadas por furo. O experimento em estufa foi realizado em quatro conjuntos diferentes de 16 mudas de milho cada, para sementes não bacterizadas (controle) e bacterizadas (tratadas). Em cada conjunto os dados de mudas com 21 dias de idade foram registrados em relação a um peso seco médio de 16 plantas. A fim de que a cepa bacteriana seja considerada como promotor de crescimento de plantas, as mudas tratadas com as bactérias devem ter em média peso seco pelo menos 10% mais elevado do que plantas não bacterizadas comparáveis.
As cepas bacterianas desse modo selecionadas foram adicionalmente submetidas à tolerância à tensão abiótica primeiramente por exame em relação a sua capacidade de crescimento em caldo nutriente (NB) que contém 6% de sal (NaCl; pH 7 e 30°C de temperatura), durante a noite (14-16 horas) em um agitador incubador refrigerado, a 180 rpm, da New Brunswick Scientific, USA, Innova Modelo 4230. As cepas tolerantes a 6% de sal foram cultivadas em pH 9 (6% NaCl e temperatura de 30°C) , e finalmente as cepas tolerantes a 6% de sal e pH 9 foram cultivadas em temperatura de 55°C. Células viáveis foram contadas pela remoção de amostras em vários momentos na presença ou ausência de tensão, como indicado. Diluições em série de cada amostra foram marcadas (25 μΐ) sobre placas NA, e incubadas a 30°C em triplicata como descrito anteriormente [C.S. Nautiyal e outros, FEMS Microbiology Letters, volume 182, pág. 291-296 (2000)]. Células viáveis foram contadas após 2-3 dias.
As 3 cepas bacterianas tolerantes a tensões abióticas (sal, pH e temperatura) selecionadas como acima foram adicionalmente examinadas em relação a sua capacidade de solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica. Estimativa quantitativa de solubilização de fosfato em caldo foi realizada utilizando o meio de crescimento de fosfato do National Botanical Research Institute (NBRIP) como descrito anteriormente [C.S. Nautiyal, FEMS Microbiology Letters, volume 170, pág. 262-270 (1999)]. O efeito de sal (NaCl), pH e temperatura sobre a solubilização de fosfato foi testado pelo cultivo dos mesmos em NBRIP na presença de NaCl, pH e temperatura como correspondido utilizando o método Fiske e Subbarow [C.H. Fiske e Y. Subbarow, Journal of Biological Chemistry, volume 66, pág. 375-400 (1925)].
As presentes cepas Bacillus lentimorbus NBRI0725, Bacillus subtilis NBRI1205, e Bacillus lentimorbus NBRI3009 têm as características taxonômicas listadas na tabela 1, em comparação com aquelas de cepas do estado da técnica de B. lentimorbus e B. subtilis. A comparação de características bioquímicas e físicas de B. lentimorbus NBRI0725 (invenção), B. lentimorbus NBRI3009 (invenção), B. lentimorbus( descritivo), B. subtilis NBRI1205 (invenção) e B. subtilis (descritivo). * = como descrito em R.E. Gordon e outros, The genus Bacillus, Agriculture handbook no. 427, Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, Gráfica do Governo norte- americano, Washington D.C. (1973; ND = nenhum dado disponível.
As 3 cepas B. lentimorbus NBRI0725, B. subtilis NBRI1205 e B. lentimorbus NBRI3009 isoladas da vaca Sahiwal selecionadas pelo método de exame como descrito acima têm a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos, promover crescimento de plantas, tolerância a tensões abióticas e solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica. B. lentimorbus NBRI0725, B. subtilis NBRI1205 e B. lentimorbus NBRI3009 foram depositados sob o tratado de Budapeste de 5 de julho de 2001 na ARS Patent culture collection, Departamento de Agricultura dos Estados Unidos da América, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, E.U.A. As cepas bacterianas B. lentimorbus NBRI0725, B. subtilis NBRI1205 e B. lentimorbus NBRI3009 receberam os seguintes números NRRL B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 e B. lentimorbus NRRL B-30488, respectivamente.
Além das outras propriedades mencionadas acima, os atributos inesperados e surpreendentes dessas cepas específicas B. lentimorbus e B. subtilis incluem as seguintes características. Todas as três cepas foram isoladas do leite da vaca Sahiwal. As cepas têm um tempo de geração rápido em cultura (55-60 minutos a 30°C). Em cultura pura as cepas inibem o crescimento de muitos fungos patogênicos de plantas. As cepas são capazes de colonizar raízes de plantas. Essas bactérias reduzem a doença da planta no solo tanto em condições de estufa como em campo.
As cepas da presente invenção são capazes de promover crescimento de planta das plantas no solo tanto em condições de estufa como em capo. Além disso, as cepas continuam a sobreviver no solo durante toda a estação de crescimento da planta.
As presentes cepas Bacillus tem também tolerância a tensões abióticas como 6% de sal (NaCl), pH 5-9 e temperatura de 55°C.
As presentes cepas Bacillus têm a capacidade de solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica por exemplo 0-4% de sal (NaCl), pH 7-9, e temperatura de 30-45°C. A atividade de solubilização de fosfato das cepas é induzida na presença de sal elevado, pH elevado e temperatura elevada.
Está compreendido no âmbito da invenção isolar qualquer tipo de bactérias que tenham a capacidade de controlar fungos fitopatogênicos, promover crescimento de planta, tolerância a tensões abióticas e solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica, Bacillus são as bactérias escolhidas porque (1) elas podem ser facilmente isoladas, cultivadas e identificadas; (2) sendo uma cepa ou isolado de ocorrência natural não exige que a engenharia genética seja efetiva; (3) sendo nutricionalmente versáteis são capazes de utilizar um grande número de substratos orgânicos, incluindo exsudados de raiz; (4) são supressivas a um ou mais fungos patogênicos; (5) têm um estágio em seu ciclo de vida que é resistente a condições ambientais duras; (5) são tolerantes a tensões abióticas (sal elevado, pH elevado e temperatura elevada); (7) são capazes de solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica (sal elevado, pH elevado e temperatura elevada); (8) colonizam a rhizosphere do sistema de raizes da(s) planta(s) hospedeira(s) por toda a estação de crescimento no campo; (9) aumentam o rendimento da(s) planta(s) hospedeira(s) sob condições de campo; e (10) são relativamente fáceis de se desenvolver para fins comerciais.
Outro aspecto da invenção é dirigido a um método de controlar doenças de planta e promover crescimento de planta das plantas em solo tanto em condições de estufa como em campo. As 3 cepas bacterianas designadas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 são especialmente preferidos nesse processo. Um inoculante da presente cepa é utilizado de tal modo que a colonização está na faixa de aproximadamente Log4-10 unidades de formação de colônia/grama (cfu/g) de raiz ocorre e preferivelmente Log 6-8 cfu/g. Uma mistura das 3 cepas (combinação) designadas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 na razão de 1:1:1, consistindo em aproximadamente Log 6-10 cfu/ml cada e preferivelmente Log 7-8 cfu/ml cada é especialmente preferido neste processo. O inóculo pode ser aplicado diretamente nas sementes ou planas, pode estar presente no solo antes do plantio ou pode ser distribuído, por exemplo por dispersão, formação de pó ou similar, sobre a cultura ou parte superior do solo ou em sulco de solo onde a cultura foi plantada.
As sementes podem ser tratadas por revestimento com uma composição que contém as bactérias em questão mergulhando em um liquido que contém essas bactérias, pulverizando com o liquido ou outro método conhecido no estado da técnica para aplicar bactérias a sementes.
De acordo ainda com outro aspecto da invenção culturas de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 podem ser cultivadas individualmente em melado diluído com água na razão de 1:1 a 1:10. Contudo, a diluição de 1:5 é especialmente preferida neste processo. As cepas bacterianas podem ser utilizadas individualmente ou como uma combinação na razão de 1:1:1, consistindo em aproximadamente Log 6-11 cfu/ml cada e preferivelmente Log 8-9 cfu/ml cada é especialmente preferido neste processo. A combinação desse modo obtida pode ser adicionalmente diluída com água na razão de 1:10 a 1:10000. Contudo, a diluição de 1:10 é especialmente preferida neste processo. O crescimento das bactérias em melado torna o processo economicamente muito viável. As bactérias cultivadas de tal modo podem ser adicionalmente utilizadas para tratar sementes por revestimento com uma composição que contém as bactérias em questão pela imersão em um líquido que contém essas bactérias, pulverização com o líquido, ou outro método conhecido no estado da técnica para aplicar bactérias às sementes.
De acordo com um aspecto adicional da invenção, o processo da invenção pode ser utilizado com qualquer tipo de bactérias ou outros microorganismos capazes de sobreviver sob condições de tensão abiótica, por exemplo, tolerância a sal, pH e temperatura. De particular interesse são as bactérias que têm propriedades biocidas, por exemplo, biofungicidas, pesticidas e outras propriedades; promovem crescimento de plantas, e solubilizam fosfato sob condições de tensão abiótica, por exemplo elevado sal, pH elevado e temperatura elevada que são capazes de viver no solo na presença das plantas.
Os veículos que podem ser utilizados para dispersar as cepas em questão incluiríam todos aqueles comumente utilizados para inocular culturas e incluiríam veículos como casca de arroz, carboximetil celulose, turfa, perlite, polivinil pirrolidona e talco. As bactérias em tais composições estão em um nível de aproximadamente Log 4-10 cfu/g de veículo. Veículos como vermiculita ou carvão ou lama de prensa fermentada são especialmente preferidos neste processo. As bactérias são cultivadas em caldo até a quantidade necessária, e a seguir misturadas com o veículo no inóculo desejado, seguido por cura da mistura por métodos bem conhecidos.
De acordo com esta modalidade da invenção o veículo ideal pode variar dependendo das bactérias utilizadas. Qualquer uma das composições acima, líquidos, pós, turfa, solo, vermiculita, carvão, lama de prensa fermentada e similares pode ter nutrientes incluídos no mesmo ou meio de veículo apropriado como água, óleos ou bases sólidas como pós, turfa, solo, vermiculita, carvão lama de prensa fermentada e quaisquer outros agentes portadores. Contudo, como demonstrado pelos exemplos abaixo, vermiculita, carvão, lama de prensa fermentada são preferidos. O aspecto adicional da presente invenção se refere a um processo pelo que a composição sinergística desse modo produzida da presente invenção pode ser utilizada em qualquer modo conhecido na técnica por exemplo, incluindo pré-tratamento de solo ou sementes ou raízes de plantas pré-germinadas individualmente ou em combinação com outros produtos químicos que é inofensiva ao crescimento e sobrevivência de bactérias por exemplo compostos promotores de crescimento de plantas, pesticidas, fertilizantes, nematicidas, herbicidas com ou sem por exemplo formação de pelotas de cal para limitar a gravidade do efeito desses materiais. Contudo, como demonstrado pelo exemplo abaixo, preferem-se pesticidas compatíveis.
Os exemplos dados abaixo em um modo não limitador tornarão possível entender melhor a invenção. EXEMPLO 1 Isolamento de cepas bacterianas do leite Cinqüenta representantes bacterianos das colônias morfologicamente distintas predominantes presentes nas placas foram selecionados de três amostras de leite individuais, cada, de ser humano saudável, vaca nativa (Sahiwal), vaca exótica (Holestien Frisian) e de búfalo. Portanto, um total de 600 cepas bacterianas foram coletadas para exame adicional. O leite humano foi coletado de três mães com bebês alimentados no peito na faixa de 6 a 12 semanas de idade. Leite das vacas Sahiwal nativas de raça pura no. 12, no. 217 e no. 249 foi coletado da fazenda Gajaria, Department of Animal Husbandry, Governo de uttar Pradesh, Lucknow. 0 leite das vacas Holestien Frisian de raça exótica (15/16) no. 154, no. 412 e no. 667 foi coletado da Indian Military Farm, Central Command Headquarters, Indian Army, Lucknow. As amostras de leite de búfalo foram coletadas de fazendas de laticínios comerciais locais. 0 leite foi coletado em recipientes estéreis após tomar-se o devido cuidado para higienizar a teta e manipulador humano. As amostras de leite foram coletadas de manhã, a meio caminho do fluxo de leite que sai da teta diretamente em recipiente estéril, sem ter nenhum contato e armazenado em uma caixa de gelo, durante seu transporte. A diluição em série das amostras de leite foi então revestida no prazo de duas horas de sua coleta em placas de Nutriente Agar (NA) (extrato de carne 5,0 g, peptona 10,0 g, cloreto de sódio 5,0 g, agar 15 g, água destilada 1000 ml, pH 7,2).
Isolados puros das cepas individuais foram obtidos de representantes de bactérias das colônias morfologicamente distintas predominantes presentes nas placas, foram selecionados aleatoriamente e purificados por subcultura de uma cepa individual em placas NA para se obter uma cultura pura. Cada isolado foi armazenado em uma solução aquosa de 30% de glicerol a -25°C.
As contagens bacterianas totais de três amostras de leite individuais coletadas de ser humano saudável, vaca Sahiwal, vaca Holestien foram Log 3 cfu/ml, em comparação com uma unidade log mais elevada de Log 4 cfu/ml de búfalo (Tabela 2). EXEMPLO 2 Exame de cepas bacterianas sob condições in vitro em relação à capacidade de suprimir fungos patogênicos e bactérias As 600 cepas bacterianas, obtidas pelo procedimento delineado no Exemplo 1 foram examinadas em relação à sua capacidade para inibir crescimento de Collectotrichum falcatum, Sclerotium rolfssi, Alternaria solani, Penicillium sp, Pythium aphanidermatum, Phytophthora palmivora, Curvularia lunata, Sclerotinia sclerotiorum e Aspergillus niger sob condições in vitro como a seguir: quatro colônias bacterianas individuais em placas NA foram riscadas em torno da borda de uma placa petri com 90 mm de diâmetro e as placas foram incubadas a 28°C por dois dias. Um inóculo de tampão agar dos fungos a serem testados (quadrado de 5 mm) foi então transferido para o centro da placa individualmente de uma placa de fonte dos fungos. Após incubação por 5 a 7 dias zonas de inibição foram prontamente observadas no caso de cepas bacterianas tendo a atividade de biocontrole à medida que o crescimento fúngico em torno da risca foi inibido. Embora no caso de cepas bacterianas não tenha atividade de biocontrole, o crescimento fúngico em torno da risca não foi inibido e os fungos cresceram em direção à borda da placa (Tabela 3) . Cepas, que mostram uma zona de inibição de pelo menos 2 mm, foram selecionadas como positivas e utilizadas para trabalho adicional.
Descobriu-se que a % de cepas bacterianas que mostram atividade de biocontrole contra fungos fitopatogênicos era máxima em vaca Sahiwal, seguida pelo ser humano, vaca Holestien e búfalo. A partir desse parâmetro o leite da vaca Sahiwal era superior ao humano, ao da vaca Holestien e búfalo (Tabela 2) . Cepas, que mostram uma zona de inibição de pelo menos 2 mm, foram selecionadas como positivas e utilizadas para trabalho adicional.
Das 600 cepas testadas in vitro, apenas 150 foram determinadas como tendo a atividade de biocontrole, de acordo com os critérios acima. EXEMPLO 3 Exame de cepas bacterianas em relação à capacidade para promover crescimento de plantas em estufa As 150 cepas bacterianas que foram supressivas a fungos patogênicos in vitro foram examinadas em estufa pelo cultivo de sementes de milho tratadas com bactérias em solo não estéril e comparando o milho tratado com as plantas de milho de controle sem tratamento bacteriano. O processo de exame de cepas bacterianas em relação à capacidade para promover crescimento de planta em estufa da presente invenção é revelado com referência especifica à plana milho. Contudo, não deve ser deduzido que o processo de exame de cepas bacterianas em relação à capacidade para promover crescimento de planta em estufa é restrito a esta planta, visto que qualquer outra planta adequada pode ser empregada.
Solo de campo não estéril da fazenda do National Botanical Research Institute, Lucknow foi utilizado para avaliar o potencial de promoção do crescimento de planta das 150 cepas em estufa.
Inóculo bacteriano para sementes de milho foi preparado raspando cultura crescida por 48 h. de placas com 10 ml de água salina a 0,85%. Sementes de milho foram esterilizadas superficialmente agitando suavemente (80 RPM em um agitador reciproco a 28°C) com etanol a 70% (5 min.), 20% de alvejante Chlorox (10 min.) seguido por três enxágües em água estéril. Após esterilização superficial as sementes foram mergulhadas na suspensão bacteriana por 4 h a 28°C em um agitador reciproco a 100 RPM. Sementes de controle (não bacterizadas) foram mergulhadas em água salina a 0,85% lavadas das placas não inoculadas. Níveis de bacterização de sementes foram determinados agitando-se 4 sementes de cada tratamento e revestidas após diluição em série na placa NA. cfu/semente médio foi determinado tirando a média dos valores de cfu/g de três populações em três réplicas por tratamento após 48 h de incubação das placas a 28°C. Sementes para tratamentos nos quais misturas de três isolados foram utilizadas, foram inoculadas pelo uso do mesmo número total de bactérias para o inóculo como foi utilizado para os tratamentos de isolado único. Desse modo, um terço da quantidade normal de cada isolado na mistura foi utilizado.
Bandejas (35x35 cm) com 16 (4x4) lugares por bandeja (cada espaço tinha 7 cm de largura, 10 cm de profundidade e 1 cm de separação um do outro) foram utilizados, para cultivar milho. Cada lugar foi enchido até 8 cm com solo não esterilizado. Água de torneira (25 ml) foi adicionada em cada furo antes do plantio de sementes para ajustar o solo até 205 de umidade. Quatro sementes tratadas com bactérias foram adicionados por furo. Os experimentos em estufa foram realizados em quatro conjuntos diferentes de 16 mudas de milha cada, para sementes não bacterizadas (controle) e bacterizadas (tratadas). Em cada conjunto os dados de mudas com 21 dias de idade foram anotados em relação ao peso seco das plantas. A fim de que a cepa bacteriana seja promotora de crescimento da planta, as mudas tratadas com as bactérias devem ter em média peso seco pelo menos 10% mais elevado do que as plantas não bacterizadas comparáveis.
Das 150 cepas bacterianas testadas no teste em estufa, 50 foram determinadas como sendo para promoção de crescimento de planta de acordo com os critérios acima. EXEMPLO 4 Exame de cepas bacterianas em relação à tolerância à tensão abiótica As cepas bacterianas que foram supressivas a fungos patogênicos in vitro e aumentaram crescimento de planta de milho quando examinadas em estufa pelo cultivo de sementes de milho tratadas com bactérias em solo não estéril, comparadas com as plantas de milho de controle cultivadas sem tratamento bacteriano foram adicionalmente examinadas em relação à tolerância à tensão abiótica como a seguir: a tolerância à tensão das cepas em relação a sal (NaCl), pH e temperatura foi testada pelo cultivo delas em caldo de nutriente (NB; extrato de carne 5,0 g, peptona 10,0 g, cloreto de sódio 5,0 g, água destilada 1000 ml, pH 7,2) sob diversas condições de tensão, por exemplo como sal a 6% (NaCl), pH 5-9, e temperatura de 55°C. Células viáveis foram contadas pela retirada de amostras em diversos momentos na presença ou ausência de tensão, como indicado. Primeiramente, as 50 cepas foram submetidas a tensão de sal a 6%. Quinze cepas de 50 puderam crescer na presença de tensão de sal a 6% durante a noite (14-16 horas) a 30°C em um agitador incubador refrigerado, a 180 rpm, Innova Modelo 4230 da New Brunswick Scientific, EUA. As 15 cepas tolerantes à tensão de sal a 6% também puderam crescer em tensão de pH 9,0 durante a noite. Contudo, apenas 3 cepas de 15 puderam crescer em tensão de 55°C durante a noite. Diluições em série de cada amostra foram marcadas 25 μΐ) sobre placas NA, e incubadas a 30°C em triplo como descrito anteriormente [C.S. Nautiyal e outros, FEMS Microbiology Letters, volume 182, pág. 292-296 (2000)]. Células viáveis foram contadas após 2-3 dias.
Das 50 cepas bacterianas testadas no teste de tolerância de tensão, as 3 cepas de número NRRL B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foram desse modo determinadas como sendo tolerantes a tensão de acordo com os critérios acima. EXEMPLO 5 Capacidade de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 de solubilizar fosfato sob condições de tensão abiôtica As 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 que eram supressivas por fungos patogênicos in vitro, aumentaram o crescimento de planta de milho quando examinadas em estufa pelo cultivo de sementes de milho tratadas com bactérias em solo não estéril, comparadas com as plantas de milho de controle cultivadas sem tratamento bacteriano, e foram tolerantes a tensões abióticas (sal, pH e temperatura) foram adicionalmente examinadas em relação a sua capacidade de solubilizar fosfato sob condições de tensão abiótica como a seguir: estimativa quantitativa de solubilização de fosfato em caldo foi realizada utilizando frascos Erlenmeyer (150 ml) contendo 10 ml de meio inoculado em triplicata com a cepa bacteriana 100 μΐ de inóculo com aproximadamente Log 9 cfu/ml). O valor se refere à quantidade de P solubilizado ^g/ml) por cepas quando individualmente cultivadas por 3 dias no meio de crescimento de fosfato do National Botanical Research Institute (NBRIP; glicose, 10 g; Ca3(P04)2 fosfato de tricálcio, 5 g; MgCl2; 6H20, 5 g; MgS04. TH20, 0,25 g; KC1, 0,2 g e (NH4)2S04, 0,1 g [C.S. Nautiyal, FEMS Microbiology Letters, volume 170, pág. 265-270 (1999)], a 30°C na presença de 0% sal (NaCl) em pH 7. O efeito de sal (NaCl) , pH e temperatura sobre solubilização de fosfato foi testado pelo cultivo deles em NBRIP na presença de NaCl (0, 1, 2 e 4%), pH (7 e 9), e temperatura (30 e 45°C) como indicado (Tabela 4). Culturas de batelada não inoculadas, postas em autoclave serviram como controles negativos. Os frascos foram incubados por 3 dias a 30°C em um agitador incubador refrigerado, a 180 rpm, Innova Modelo 4230 da New Brunswick Scientific, USA. As cepas foram colhidas por centrifugação a 10000 rpm por 10 min, utilizando uma centrifuga Sorvall RC 5C, Dupont, EUA. A concentração de fosfato em sobrenadante de cultura foi estimada utilizando o método Fiske e Subbarow [C.H. Fiske e Y. Subbarow, Journal of Biological Chemistry, volume 66, pág. 375-400 (1925)].
Todas as 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 demonstraram capacidade variável de indução de solubilização de fosfato, sob condições in vitro na presença de tensão de sal elevado, pH elevado e temperatura elevada.
Exemplo 6 Capacidade de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 sob condições in vitro de suprimir fungos patogênicos na presença ou ausência de tensão de pH e sal elevados As 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foram examinadas em relação à sua atividade de biocontrole contra vários fungos patogênicos de plantas, sob condições in vitro na presença ou ausência de tensão de pH e sal elevados (Tabela 5). NG* = sem crescimento de fungos; NZ** = sem zona de inibição.
Todas as 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 demonstraram atividade de biocontrole variável contra vários fungos fitopatogênicos, sob condições in vitro na presença de tensão de sal e/ou pH elevado. As cepas também demonstraram atividade de biocontrole variável contra vários fungos fitopatogênicos, sob condições in vitro na presença ou ausência de tensão de sal e pH elevados. Portanto, a possibilidade de utilizar a combinação de todas as três bactérias foi explorada. EXEMPLO 7 Interação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e sua combinação sob condições in vitro com fungos fitopatogênicos de grão-de-bico A interação de F. oxysporum f. sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Pythium sp., e S. sclerotiorum com B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação em meio liquido foi elucidada em um teste de cultura duplo pelo cultivo de bactéria/combinação em caldo de nutriente na presença e ausência dos fungos. Um disco agar (5mm de diâmetro) de F. oxysporum f.sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Pythium sp., e S. sclerotiorum foi individualmente inoculado em frascos Erlenmeyer de 150 ml contendo 50 ml de caldo de nutriente.
Uma suspensão de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e sua combinação, contendo Log 8.0 cfu/ml foi inoculada e os frascos foram incubados a 30°C por 7 dias em um agitador incubador sob condição estática, e as culturas de controle foram cultivadas sem bactérias. A combinação das 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foi preparada misturando as 3 culturas de aproximadamente Log 8,0 cfu/ml, na razão de 1:1:1. Peso seco micelial do fungo cultivado na presença e ausência de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e sua combinação foi determinado por filtração do meio usado utilizando um filtro de papel Whatman no. 1, e secagem da massa de fungos no papel filtro a 60°C por 3 dias. Os resultados dos testes da interação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação, sob condições in vitro com F. oxysporum f.sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Pythium sp., e S. sclerotiorum são apresentados na Tabela 6.
Como pode ser visto dos resultados que são apresentados na Tabela 6, todas as três cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e sua combinação inibiram de forma eficaz o crescimento de F. oxysporum f.sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Pythium sp., e S. sclerotiorum sob condições in vitro. Contudo, a combinação das cepas bacterianas foi mais eficaz para inibir o crescimento dos fungos em teste. EXEMPLO 8 Sobrevivência de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação, em vermiculita como veiculo A determinação da sobrevivência de 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação, em vermiculita como veículo, durante o período de doze meses, a 10°C foi realizada de acordo com o seguinte método. As 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foram cultivadas individualmente em meio de crescimento líquido NB. As culturas foram cultivadas em frascos de 2 litros contendo 1,5 litro de meio NB e incubadas por 2 dias a 30°C em um agitador incubador refrigerado, a 180 rpm, Innova Modelo 4230 da New Brunswick Scientific, EUA. Após 2 dias de crescimento 300 ml da cultura foram adicionados a 1 kg de vermiculita estéril contendo saco plástico autoclavável, que forneceu aproximadamente 30% de umidade do produto. A combinação das 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foi preparada misturando as 3 culturas de aproximadamente Log 8,5 cfu/ml na razão de 1:1:1. A incubação dos sacos vedados por 2 dias a 30°C fez a cura da preparação bioinoculante. Após cura, os sacos vedados foram armazenados a 10°C e alíquotas foram periodicamente removidas para medições de viabilidade (Tabela 7). A viabilidade do produto foi determinada por método de diluição em série padrão em placas NA.
Como mostrado na Tabela 7, todas as três cepas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação demonstraram boas taxas de sobrevivência, durante armazenagem a longo prazo em vermiculita a 10°C. Após doze meses de armazenagem, aproximadamente Log 8 cfu/g de vermiculita estava presente. Esses dados indicam que a vermiculita funciona como um excelente material portador para as cepas a serem posteriormente inoculadas sobre sementes, plantas ou solo, visto que não se observou nenhuma perda apreciável de viabilidade de células. EXEMPLO 9 Atividade de biocontrole de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação, em estufa contra fungos fitopatogênicos de grão-de-bico As 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foram examinadas individualmente e em uma combinação, em estufa contra fungos fitopatogênicos de grão-de-bico. 0 cultivo de fungos para ensaio de planta foi realizado utilizando um frasco Erlenmeyer de 1000 ml com 100 g de milho e 400 g de areia grossa foram postos em autoclave e após autoclave a umidade foi ajustada para 15% com água destilada estéril. 0 frasco foi incubado a 30°C individualmente com um tampão agar de 10 mm de diâmetro de uma cultura de agar nutriente de F. oxysporum f.sp. ciceri, R. solani e Pythium sp. no escuro por 4 semanas. Após quatro semanas a mistura foi seca a ar e moida e peneirada para obter partículas com 0,5 mm de tamanho. Cada um do inóculo foi intimamente misturado com solo estéril a 0,15% de inóculo por peso total de solo, para fornecer uma mistura final de 0,45% de inóculo de F. oxysporum f.sp. ciceri, R. solani e Pythium sp. por peso total de solo como descrito anteriormente [C.S. Nautiyal, Current Microbiology, volume 35, pág. 52-58 (1997)]. O experimento para examinar a atividade de biocontrole de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação foi realizado em quatro conjuntos diferentes de 30 mudas de grão-de-bico cada, para sementes tratadas e não tratadas (controle). Sementes de grão-de-bico foram preparadas para inóculo de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação como descrito no Exemplo 3, exceto que vermiculita foi utilizada como veiculo como descrito no Exemplo 8, em vez de inóculo direto da placa petri. Em cada conjunto os dados foram anotados durante cinco meses de crescimento de planta em relação à germinação da muda, mortalidade da muda (mudas mortas, retardamento de altura de broto, pendência de folhas, descoloração da raiz), altura da planta, número de vagens e peso seco de semente. Os resultados são tabulados na seguinte Tabela 8.
Como pode ser visto dos resultados que são apresentados na Tabela 8, plantas inoculadas demonstraram menor mortalidade de mudas e melhor germinação de mudas, altura de planta, número de vagens e peso seco de semente, em comparação com controle não inoculado. Entre as plantas inoculadas, a comparação mostrou melhores resultados em termos de menor mortalidade de mudas e melhor germinação de muda, altura de planta, número de vagens e peso seco de semente . EXEMPLO 10 Atividade de promoção de crescimento de planta de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação, em estufa utilizando grão-de-bico O experimento para examinar a atividade de promoção de crescimento de planta de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação foi realizado em quatro conjuntos diferentes de 30 mudas de grão-de-bico cada, para sementes tratadas e não tratadas (controle). Sementes de grão-de-bico foram preparadas para inóculo de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação utilizando vermiculita como veiculo como descrito no Exemplo 9. Em cada conjunto dados foram anotados durante cinco meses de crescimento de planta em relação à germinação de mudas, altura de planta, número de vagens e peso seco de semente. Os resultados são tabulados na seguinte Tabela 9.
Como pode ser visto dos resultados que são apresentados na Tabela 9, plantas inoculadas demonstraram melhor germinação de mudas, altura de planta, número de vagens e peso seco de semente, em comparação com controle não inoculado. Entre as plantas inoculadas, a combinação mostrou melhores resultados em termos de melhor germinação de muda, altura de planta, número de vagens e peso seco de semente. EXEMPLO 11 Atividade de promoção de crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 em estufa sobre várias plantas Sementes foram preparadas e inoculadas para testar a atividade de promoção do crescimento da planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 em estufa sobre várias plantas, como descrito acima no exemplo 8. O experimento em estufa foi realizado em quatro conjuntos diferentes de 16 mudas cada, para sementes não bacterizadas (controle) e bacterizadas (tratadas) de Zea mays, Abelmoschus esculentus, Luffa cylindrica, Lycopersicon esculentum e Cucumis sativus. Em cada conjunto, dados de mudas com 21 dias de idade foram anotados em relação ao peso seco de plantas. Os resultados da atividade de promoção do crescimento da planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 em estufa sobre várias plantas são fornecidos na Tabela 10.
Como os dados da Tabela 10 demonstram a resposta variável de promoção de crescimento de planta sobre o peso seco de Zea mays, Abelmoschus esculentus, Luffa cylindrica, Lycopersicon esculentum e Cucumis sativus pela combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 em estufa. Como pode ser visto a partir dos resultados, o peso seco das mudas bacterizadas foi mais elevado na faixa de 18-340% em comparação com mudas não bacterizadas. EXEMPLO 12 Experimento em campo de atividade de biocontrole da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 contra fungos fitopatogênicos de grão-de-bico A atividade de biocontrole da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 contra fungos fitopatogênicos de grão-de-bico foi testada em campo nas fazendas de Banaras Hindu University, Varanasi; Chandra Shekhar Azad University of Agriculture & Technology, Kanpur, e Indian Agricultural Research Institute, Nova Déli em canteiros com histórico consistente de intensa infecção de variedade de grão-de-bico Radhey, por F. oxysporum f. sp. ciceri. As cepas bacterianas foram propagadas como descrito no Exemplo 8. Todos os experimentos foram semeados em outubro de 2000 e colhidos após cinco meses de crescimento em março de 2001. A umidade do solo do campo no momento de semeadura estava na faixa de 25-30% e a plantação foi totalmente alimentada por chuva. Práticos de cultivo mecânico não foram utilizadas após semeadura. Cada experimento foi em um desenho de bloco randomizado. Seis réplicas por tratamento nos blocos consistiam em canteiros de três fileiras de 4 m (espaçamento de 30 cm) . Após 10 dias de germinação, as mudas foram desbastadas para 50 mudas por fileira. Todos os resultados foram coletados das fileiras do meio, excluindo duas fileiras adjacentes como fileiras de proteção tanto para sementes de grão-de-bico não bacterizadas (controle) como bacterizadas (tratadas) com a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 (Log 8 cfu/ml). Os valores são a média de seis réplicas de 10 plantas cada, ao passo que os valores para os pesos secos (g) são a média de 100 sementes escolhidas aleatoriamente de seis réplicas de 10 plantas cada.
Como pode ser visto dos dados na Tabela 11, em todos os três locais comparados com controle, as sementes de grão-de-bico tratadas com a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 melhoraram o desempenho da planta, em termos de % aumenta de sobrevivência de muda, altura de planta, número de vagens/planta, peso de 100 sementes, e rendimento/canteiro. EXEMPLO 13 Sobrevivência de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação, em carvão como veiculo A determinação da sobrevivência de 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em lima combinação, em carvão como veiculo, durante o período de seis meses, a 10°C foi realizada de acordo com o seguinte método. As 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foram cultivadas individualmente em meio de crescimento líquido NB. As culturas foram cultivadas em frascos de 2 litros contendo 1,5 litro de meio NB e incubadas por 2 dias a 30°C em um agitador incubador refrigerado, a 180 rpm, Innova Modelo 4230 da New Brunswick Scientific, EUA. Após 2 dias de crescimento 600 ml da cultura foram adicionados a 1 kg de carvão estéril contendo saco plástico autoclavável, que forneceu aproximadamente 30% de umidade do produto. A combinação das 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foi preparada misturando as 3 culturas de aproximadamente Log 8,5 cfu/ml na razão de 1:1:1. A incubação dos sacos vedados por 2 dias a 30°C fez a cura da preparação bioinoculante. Após cura, os sacos vedados foram armazenados a 10°C e alíquotas foram periodicamente removidas para medições de viabilidade. A viabilidade do produto foi determinada por método de diluição em série padrão em placas NA. A Tabela 12 mostra a sobrevivência de 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação, em carvão como veículo, durante o período de seis meses a 10°C, após a colheita.
Como mostrado na Tabela 12, todas as três cepas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 individualmente e em uma combinação demonstraram boas taxas de sobrevivência, durante armazenagem a longo prazo em carvão a 10°C. Após seis meses de armazenagem, aproximadamente Log 7 cfu/g estava presente. Esses dados indicam que o carvão funciona como um excelente material portador, embora não tão eficaz em comparação com vermiculita, para as cepas a serem posteriormente inoculadas sobre sementes, plantas ou solo. Contudo, como material portador o custo de carvão é 8 vezes menor, em comparação com vermiculita. Portanto, o custo inferior do carvão torna muito atraente a sua escolha como veiculo devido ao seu uso comercial em grande escala. EXEMPLO 14 Uso de lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar e líquido de lavagem usado de destilaria como veículo para a preparação em combinação em escala comercial de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 Os seguintes procedimentos foram realizados para utilizar lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar e líquido de lavagem usado de destilaria como veículo para preparar em escala comercial, após sua fermentação utilizando combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 Culturas de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foram cultivadas individualmente em melado diluído com água na razão de 1:5. As culturas foram cultivadas em frascos de 2 litros contendo 1,5 litros de melado diluído com água na razão de 1:5 e incubadas por 3 dias a 30°C em um agitador incubador refrigerado, a 180 rpm, Innova Modelo 4230, da New Brunswick Scientific, EUA. Após 3 dias de crescimento a combinação das 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B- 30488 foi preparada misturando as 3 culturas de aproximadamente Log 9 cfu/ml na razão de 1:1:1. A combinação das 3 cepas bacterianas desse modo obtida foi adicionalmente diluída com água na razão de 1:10, contendo aproximadamente Log 8-9 cfu/ml. O cultivo das bactérias em melado torna o processo economicamente muito viável.
Aproximadamente 300 toneladas de lama de prensa sulfinada nova, obtida durante clareamento do caldo de cana-de-açúcar com cal e dióxido de enxofre, foram dispostos em piso cimentado com largura de 2,5 metros, 1,5 metros de altura e comprimento de 150 metros amontoados. A lama de prensa foi agitada e homogeneizada, manualmente ou com o auxílio de um meio de lavrar aéreo antes da adição de aproximadamente 600 litros da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B—30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 preparada como descrito acima, isto é, 2 litros da combinação/tonelada de lama de prensa e misturando novamente. Em 2-3 dias, a temperatura dos amontoados sobre para 70-75°C. Posteriormente, os amontoados são agitados duas vezes por dia e líquido de lavagem usado é pulverizado numa base diária para manter a umidade a 55-65%, por até 40 dias. Após aproximadamente 40 pulverizações a pulverização de líquido de lavagem usado é parada e amontoados regulamente girados por 3-5 dias para reduzir a umidade do produto fermentado a aproximadamente 30%. Normalmente após 45 dias, a temperatura dos amontoados cai para 40-45°C. O produto neste estágio é totalmente fermentado e está pronto para sua aplicação e embalagem.
Para monitorar a presença de cepas de Bacillus durante o processo de fermentação dos amontoados, derivado de cepa resistente a rifampicina (Rif) espontâneo de B. lentimorbus NRRL B-30488R foi isolado em placas NA, contendo 100 μg de rifampicina. A cepa de B. lentimorbus NRRL B-30488R espontâneo que mostra crescimento comparável com o tipo selvagem B. lentimorbus NRRL B-30488 com base no tamanho da colônia, em placas de agar contendo 100 μg de rifampicina, foi selecionado para estudos adicionais. Placas de agar contendo 100 μg de rifampicina/ml, uma quantidade suficiente para inibir o crescimento de outras bactérias em lama de prensa não esterilizada e liquido de lavagem usado foram utilizados para recuperar B. lentimorbus NRRL B-30488R dos amontoados durante o processo de fermentação. A presença de B. lentimorbus NRRL B-30488R Log 8 cfu/g no produto fermentado por 45 dias é indicativo da sobrevivência, multiplicação e presença continua do B. lentimorbus NRRL B-30488R, durante o processo de fermentação. EXEMPLO 15 Uso de lama de prensa de carbonatação de usina de açúcar como veiculo para preparar em escala comercial a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 Os procedimentos para fermentar lama de prensa de carbonatação de usina de açúcar como veiculo para preparar em escala comercial, utilizando combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foram iguais aos descritos acima no exemplo 14, exceto que água foi utilizada em vez de liquido de lavagem usado, para manter a umidade durante fermentação. EXEMPLO 16 Análise comparativa de atividade de promoção do crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 em estufa utilizando vermiculita, carvão, lama de prensa de sulfitaçâo de usina de açúcar fermentado e líquido de lavagem usado de destilaria e lama de prensa de carbonatação de usina de açúcar como veículo, em plantas Sementes foram preparadas e inoculadas com a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 em estufa utilizando vermiculita, carvão, lama de prensa de sulfitaçâo de fábrica de açúcar fermentado e líquido de lavagem usado de destilaria, e lama de prensa de carbonatação de usina de açúcar como veículos para testar a atividade de promoção do crescimento da planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 em estufa em várias plantas, como descrito acima nos Exemplos 8, 13, 14 e 15 respectivamente. O experimento em estufa foi realizado em quatro conjuntos diferentes de 16 mudas cada, para sementes não bacterizadas (controle) e bacterizadas (tratadas) de A. esculentus, C. sativus, Z. mays, Triticum aestivum, Glycine max, Pisum sativum, e Impatiens balsamina. Em cada conjunto, dados de mudas com 21 dias de idade foram anotados em relação ao peso seco das plantas. Os resultados da atividade de promoção de crescimento da planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 em estufa sobre várias plantas, enquanto utiliza vermiculita, carvão, lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado e liquido de lavagem usado de destilaria, e lama de prensa de carbonatação de usina de açúcar como veículos, são dados na Tabela 13.
Como os dados da Tabela 13 demonstram a resposta variável de promoção de crescimento da planta sobre o peso seco de diferentes plantas pela combinação de B. lentimorbus NRRL B—30486, B. subtilis NRRL B—30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 em estufa. Como pode ser visto a partir dos resultados, o peso seco das mudas bacterizadas de A. esculentus, C. sativus, Z. mays, Triticum aestivum, Glycine max, Pisum sativum e Impatiens balsamina foi mais elevado na faixa de 21-1505 em comparação com mudas não bacterizadas utilizando vermiculita, carvão, lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado e liquido de lavagem usado de destilaria, e lama de prensa de carbonatação de usina de açúcar como veículos. EXEMPLO 17 Experimento em campo de atividade de biocontrole da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 contra fungos fitopatogênicos de cana-de-açúcar, utilizando vermiculita como veículo O tamanho do canteiro de experimento em campo para todos os experimentos em campo foi de 9,0 x 3,5 metros de tamanho de canteiro, consistindo em quatro fileiras para cada tratamento, em triplicata.
Experimentos em campo utilizando cana-de-açúcar de variedade Cos 95255 foram realizados colocando mudas de cana-de-açúcar no momento de semeadura diretamente em vermiculita, contendo a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 até saturação de 20%.
Inóculo dos dois patógenos Fusarium moniliforme e Colletotrichum falcatum multiplicado em meio líquido foi preparado para um teste de cultura duplo pelo cultivo do fungo individualmente em NB. Um disco de agar (5 mm de diâmetro) do F. moniliforme e C. falcatum foram individualmente inoculados em frascos de Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml de NB. Os frascos foram incubados a 30°C por 10 dias sob condição estática. O inóculo foi diluído com água Milli Q salina a 0,85% (MQW) para concentração de esporos de Log 5 e 6 esporos/ml. Os conjuntos foram mergulhados no inóculo desse modo preparado de F. moniliforme ou C. falactum como indicado, por 30 minutos antes do plantio. O inóculo também foi utilizado para encharcar as fileiras antes de plantar a cana-de-açúcar. Além disso o experimento foi conduzido em canteiro galho murcho onde no ano anterior a incidência de murchar foi tão elevada quanto 95%. O primeiro experimento de cana-de-açúcar foi realizado utilizando vasos (com 22,85 cm de diâmetro) em agosto de 2000 em Dhampur Sugar Mills ltd., Rozagaon, Faizabad utilizando a comparação. Após três meses de crescimento as plantas dos vasos foram passadas para o campo. O número de plantas infectadas, altura de planta, número de brotos e circunferência de cana foram anotados em agosto de 2001. Os resultados do teste são dados na Tabela 14. * n.a. = não aplicável Os resultados apresentados na Tabela 14 demonstram claramente o biocontrole efetivo de murchar de cana-de-açúcar e fungos de deterioração, aumentos no número de brotos, altura de planta, e circunferência de cana-de-açúcar inoculado com a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando vermiculita como veiculo, em comparação com controle não inoculado. EXEMPLO 18 Experimentos em campo de atividade de promoção do crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL Β-30486, Β. subtilis NRRL B-30487, e Β. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando vermiculita como veículo, em cana-de-açúcar em Rozagaon Experimentos de campo utilizando cana-de-açúcar foram conduzidos colocando mudas de cana-de-açúcar no momento de semeadura diretamente em vermiculita, contendo a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, preparado como descrito no Exemplo 8. O experimento de cana de açúcar foi feito em outubro de 2000 em Dhampur Sugar Mills Ltd., Rozagaon. Após nove meses de crescimento de planta, número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moivel, e rendimento de cana da cana-de-açúcar foram anotados em dezembro de 2001. Para os experimentos de campo a variedade de cana-de-açúcar Cos 95255 foi utilizada em Dhampur Sugar Mills ltd., Rozagaon. Os resultados de teste dos experimentos em campo de atividade de promoção de crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando vermiculita como veiculo, sobre cana-de-açúcar são dados na Tabela 15.
Os resultados apresentados na Tabela 15 mostram claramente aumentos no número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moivel e rendimento de cana da cana inoculada com a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando vermiculita como veiculo, em comparação com controle não inoculado. EXEMPLO 19 Experimentos em campo de atividade de promoção do crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando vermiculita como veículo, em cana-de-açúcar em Dhampur Experimentos de campo utilizando cana-de-açúcar foram conduzidos colocando mudas de cana-de-açúcar no momento de semeadura diretamente em vermiculita, contendo a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e Β. lentimorbus NRRL B-30488, preparado como descrito no Exemplo 8. 0 experimento de cana de açúcar foi feito em novembro de 2000 em Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur, Bijnour. Após treze meses de crescimento de planta, número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moivel, e rendimento de cana da cana-de-açúcar foram anotados em dezembro de 2001. Para os experimentos de campo a variedade de cana-de-açúcar Cos 95255 foi utilizada. Os resultados de teste dos experimentos em campo de atividade de promoção de crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando vermiculita como veiculo, sobre cana-de-açúcar são dados na Tabela 16.
Os resultados apresentados na Tabela 16 mostram aumentos no número de brotos, altura de planta, circunferência de cana, cana moível e rendimento de cana da cana inoculada com a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando vermiculita como veiculo, em comparação com controle não inoculado. EXEMPLO 20 Experimentos em campo de atividade de promoção do crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando carvão como veículo, em cana-de-açúcar Experimentos de campo utilizando cana-de-açúcar foram conduzidos colocando mudas de cana-de-açúcar no momento de semeadura diretamente em vermiculita, contendo a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, preparado como descrito no Exemplo 13. O experimento de cana de açúcar foi feito em abril de 2001 em Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur. Após dez meses de crescimento de planta, número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moível, e rendimento de cana da cana-de-açúcar foram anotados em dezembro de 2001. Para os experimentos de campo a variedade de cana-de-açúcar Cos 89003 foi utilizada em Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur. Os resultados de teste dos experimentos em campo de atividade de promoção de crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando carvão como veículo, sobre cana-de-açúcar são dados na Tabela 17.
Os resultados apresentados na Tabela 17 mostram aumentos no número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moível e rendimento de cana da cana inoculada com a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando carvão como veiculo, em comparação com controle não inoculado. EXEMPLO 21 Experimentos em campo de atividade de promoção do crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado e liquido de lavagem usado de destilaria como veiculo, em cana-de-açúcar em Dhampur Experimentos de campo utilizando cana-de-açúcar foram conduzidos colocando mudas de cana-de-açúcar no momento de semeadura diretamente em lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado e liquido de lavagem usado de destilaria como veiculo, contendo a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, preparado como descrito no Exemplo 14. 0 experimento de cana de açúcar foi feito em maio de 2001 em Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur. Após dez meses de crescimento de planta, número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moivel, e rendimento de cana da cana-de-açúcar foram anotados em dezembro de 2001. Para os experimentos de campo a variedade de cana-de-açúcar Cos 89003 foi utilizada em Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur. Os resultados de teste dos experimentos em campo de atividade de promoção de crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado e liquido de lavagem usado de destilaria como veiculo, sobre cana-de-açúcar são dados na Tabela 18.
Os resultados apresentados na Tabela 18 mostram aumentos no número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moivel e rendimento de cana da cana inoculada com a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado e liquido de lavagem usado de destilaria como veiculo, em comparação com controle não inoculado. EXEMPLO 22 Experimentos em campo de atividade de promoção do crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado como veiculo, em cana-de-açúcar em Dhampur Experimentos de campo utilizando cana-de-açúcar foram conduzidos colocando mudas de cana-de-açúcar no momento de semeadura diretamente em lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado e liquido de lavagem usado de destilaria como veiculo, contendo a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, preparado como descrito no Exemplo 14. 0 experimento de cana de açúcar foi feito em maio de 2001 em Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur. Após dez meses de crescimento de planta, número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moivel, e rendimento de cana da cana-de-açúcar foram anotados em dezembro de 2001. Para os experimentos de campo a variedade de cana-de-açúcar Cos 89003 foi utilizada em Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur. Os resultados de teste dos experimentos em campo de atividade de promoção de crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado como veiculo, sobre cana-de-açúcar são dados na Tabela 19.
Os resultados apresentados na Tabela 19 mostram aumentos no número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moivel e rendimento de cana da cana inoculada com a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado como veiculo, em comparação com controle não inoculado. EXEMPLO 23 Experimentos em campo de atividade de promoção do crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado como veiculo, em cana-de-açúcar em Rozagaon Experimentos de campo utilizando cana-de-açúcar foram conduzidos colocando mudas de cana-de-açúcar no momento de semeadura diretamente em lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado como veiculo, contendo a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488, preparado como descrito no Exemplo 15. O experimento de cana de açúcar foi feito em maio de 2001 em Dhampur Sugar Mills Ltd., Rozagaon. Após oito meses de crescimento de planta, número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moivel, e rendimento de cana da cana-de-açúcar foram anotados em dezembro de 2001. Para os experimentos de campo a variedade de cana-de-açúcar Cos 96258 foi utilizada em Dhampur Sugar Mills Ltd., Rozagaon. Os resultados de teste dos experimentos em campo de atividade de promoção de crescimento de planta da combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado como veículo, sobre cana-de-açúcar são dados na Tabela 20.
Os resultados apresentados na Tabela 20 mostram aumentos no número de brotos, altura de planta, circunferência, cana moível e rendimento de cana da cana inoculada com a combinação de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 utilizando lama de prensa de sulfitação de usina de açúcar fermentado como veículo, em comparação com controle não inoculado. EXEMPLO 24 Análise comparativa do efeito de pesticidas sobre o crescimento de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 As 3 cepas bacterianas B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488 foram examinadas para avaliar o efeito de pesticidas sobre seu crescimento como a seguir: avaliação do efeito de pesticidas sobre o crescimento das cepas bacterianas em caldo foi realizado utilizando frascos Erlenmeyer (150 ml) contendo 40 ml de meio inoculado em triplicata com a cepa bacteriana (100 μΐ de inóculo com aproximadamente Log 6 cfu/ml) . O valor se refere ao número de células (Log cfu/ml) de cepas quando individualmente cultivadas por 1 dia em NB, a 30°C na presença de pesticida, conforme dose recomendada de sua aplicação. O efeito de pesticida sobre seu crescimento foi apresentado na Tabela 20. Culturas de batelada inoculadas, sem nenhum pesticida, serviram como controle. Os frascos foram incubados por 1 dia a 30°C em um agitador incubador refrigerado, a 180 rpm, Innova Modelo 4230 da New Brunswick Scientific, EUA. *WP = pó umectável; ** NG = sem crescimento; *** EC = concentrado emulsificante; *** SL = liquido solúvel Os resultados apresentados na Tabela 21 demonstram resposta variável de pesticidas sobre o crescimento de B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488. Entre vários pesticida testados carbendazim 50% W.P., metalaxil 8% + mancozeb 64% W.P. e deltametrin 2,8% E.C. foram mais compatíveis para aplicação com B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487, e B. lentimorbus NRRL B-30488.
Entende-se que a descrição detalhada supra é dada simplesmente como ilustração e que modificação e variações podem ser feitas na mesma sem se afastar do espírito e âmbito da invenção.
REIVINDICAÇÕES
Claims (15)
1. Composição bioinoculante CARACTERIZADA por compreender células de culturas purificadas de espécies de Bacillus selecionadas do grupo consistindo em: i) Bacillus lentímorbus depositado como NRRL B- 30486 exibindo as seguintes características: formato de bastão com 1,5 a 2,0 micra de largura e de 3,0 a 6,0 de comprimento; Gram positiva; negativa para reação de catalase; positiva para crescimento anaeróbico; negativa para reação Voges-Proskauer; pH em caldo V-P de 5,5; dentre D-glicose, L-arabinose, D-xilose e D-manitol produz ácido somente a partir de D-glicose; produz gás a partir de glicose; negativa para hidrólise de caseina, gelatina e amido; negativa para uso de citrato; negativa para conversão de nitrato em nitrito; negativa para formação de indol; crescimento em caldo de nutrientes em pH 5,7 e pH 6,8; crescimei to em meios contendo Nacl até 10%; crescimento em temperati ra até 55°C; ii) Bacillus subtilis depositado como NRRL B-30487 exibindo as seguintes características: formato oval com 2,5 micra de largura; Gram positiva; positiva para reação de catalase; negativa para crescimento anaeróbico; positiva para reação Voges-Proskauer; pH em caldo V-P de 5,8; produz ácido a partir de D-glicose, L-arabinose, D-xilose e D-manitol; negativa para produção de gás a partir de glicose; positiva para hidrólise de caseina, gelatina e amido; positiva para uso de citrato; positiva para conversão de nitrato em nitrito; negativa para formação de indol; crescimento em caldo de nutrientes em pH 5,7 e pH 6,8; crescimento em meios contendo Nacl até 5%; crescimento em temperatura até 55°C; e iii) Bacillus lentimorbus depositado como NRRL B-30488 exibindo as seguintes características: formato de bastão com 1,5 a 2,0 micra de largura e de 5,0 a 10,0 de comprimento; Gram positiva; negativa para reação de catalase; positiva para crescimento anaeróbico; negativa para reação Voges-Proskauer; pH em caldo V-P de 5,2; dentre D-glicose, L-arabinose, D-xilose e D-manitol produz ácido somente a partir de D-glicose; produz gás a partir de glicose; negativa para hidrólise de caseína, gelatina e amido; negativa para uso de citrato; negativa para conversão de nitrato em nitrito; negativa para formação de indol; crescimento em caldo de nutrientes em pH 5,7 e pH 6,8; crescimento em meios contendo Nacl até 10%; crescimento em temperatura até 55°C; e um veículo sendo água salina a 0,85%.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA por compreender pelo menos duas das cepas i), ii) e iii) .
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA por compreender todas as três cepas i), ii) e iii) .
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelas três cepas estarem presentes combinadas numa razão aproximada de 1:1:1.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela concentração de células de cada cepas ser de 104 a IO10 cfu/g de veículo.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela concentração de células de cada cepas ser de 107 a 108 cfu/g de veículo.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela concentração total de células ser de 104 a IO10 cfu/g de veículo.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela concentração total de células ser de 107 a 108 cfu/g de veículo.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo tempo de geração das cepas ser de 55 a 65 minutos quando cultivadas a 30°C.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelas células colonizarem as raízes de plantas que entram em contato com a somposição.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo veículo compreender uma goma ou um açúcar.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo veículo compreender vermiculita, carvão, lama de prensa de carbonatação de usina de açúcar refinado, ou uma mistura de lama de prensa de sulfitação de açúcar refinado e líquido de lavagem usado de destilaria.
13. Método para promover o crescimento de uma planta CARACTERIZADO por compreender aplicar a composição bioinoculante definida na reivindicação 1 na semente da planta, ao solo em que a planta está crescendo ou diretamente na planta.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pela composição ser aplicada ao solo para proporcionar de 106 a 108 cfu/g de solo.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13,vou te CARACTERIZADO pela composição ser aplicada à semente para proporcionar de 107 a 109 cfu/semente.
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