BRPI0207477B1 - Processo para prepapar ácido d- pantotênico e/ou sais do mesmo - Google Patents

Description

"PROCESSO PARA PREPARAR ÁCIDO D- PANTOTÊNICO E/OU SAIS DO MESMO" [0001] A presente invenção refere-se a um processo aperfeiçoado para preparar ácido D- pantotênico e/ou sais do mesmo e ao uso, como aditivo, de alimentos para animais. [0002] D- pantotenato é difundido no reino animal e das plantas como um produto de partida para a biossíntese de coenzima A. Em contraste com humanos, que consomem ácido pantotênico em quantidades suficientes via a dieta, sintomas de deficiência de D- pantotenato são, no entanto, com freqüência descritos não somente para plantas mas também para animais. A disponibilidade de D- pantotenato é, assim, de grande interesse econômico, particularmente na indústria de rações para animais. [0003] Convencionalmente, D- pantotenato é preparado por síntese química a partir de D- pantolactona e β- alaninato de cálcio (Ullmamfs Encyclopedia of Industrial Chemical, 6a, ed. 1999, versão eletrônica, cap. "Vitamins"). Para preparar D- pantolactona, uma separação de racemato clássica, complexa, via sais diastereoméricos, é requerida. O produto comercial resultante da síntese química é geralmente o sal de cálcio de ácido D- pantotênico, D- pantotenato de cálcio. [0004] Comparado com síntese química, a vantagem dos processos de preparação biotecnológica usando microorganismos é na provisão seletiva (enanciomericamente puro) de forma D de ácido pantotênico que pode ser usado por organismos superiores. Uma separação de racemato complexa, como é requerido em síntese química é, assim, desnecessária. [0005] Os processos de fermentação para preparar ácido D-pantotênico por microorganismos foram descritos em grande número, incluindo EP 0 590 857, WO 96/33283, US 6 013 492, WO 97/10340, DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 e EP 1 006 193. [0006] Assim, EP 1 006 189 e EP 1 001 027 descrevem processos para preparar pantotenato em que a solução de fermentação alcança um teor de, no máximo, 1 g/1 de ácido D- pantotênico. No entanto, estes teores baixos de ácido pantotênico na solução de fermentação, isto é, menos que 10 % em peso com base no teor em sólidos, são inapropriados para produção econômica de suplementos de alimento para animal contendo ácido D- pantotênico. Uma outra desvantagem dos processos descritos até agora é que o isolamento do produto do meio de fermentação requer numerosas etapas de trabalho complexas. Um processo de produção econômico para a escala industrial não foi descrito. [0007] No pedido alemão acessível ao público DE 100 16 321, um processo de fermentação é descrito para produzir um suplemento de alimento para animal contendo ácido D- pantotênico. No entanto, uma desvantagem significante deste processo, como também com os processos de fermentação citados acima para produção de ácido D- pantotênico, é que o precursor de ácido pantotênico, β- alanina, precisa ser suprida ao microorganismo via o meio de fermentação a fim de obter rendimentos econômicos do produto desejado. [0008] Além disso, US 6.013.492 e WO 96/332839 descrevem o trabalho de ácido D- pantotênico a partir da solução de fermentação por filtragem dos componentes insolúveis (por exemplo material de célula) do meio de cultura, adsorvendo o filtrado para carbono ativado, subseqüentemente eluindo o ácido D- pantotênico com o solvente orgânico, preferivelmente metanol, neutralizando o eluente com hidróxido de cálcio, e finalmente cristalizando D- pantotenato de cálcio. Desvantagens significantes são as perdas de produto de valor que ocorrem durante a cristalização e o uso de um solvente orgânico que pode ser removido do produto somente com dificuldade e requer recuperação de solvente complexa. [0009] EP 0 590 857 descreve um processo de fermentação para produzir ácido D- pantotênico em que o cultivo de um microorganismo obrigatoriamente requer suprimento de β- alanina. A solução de fermentação é filtrada para separar a biomassa, então passada através de um trocador catiônico e então através de um trocador aniônico, é então neutralizada com hidróxido de cálcio, concentrada por evaporação, misturada com carbono ativado, filtrada uma vez mais e cristalizada com adição de metanol e cloreto de cálcio. O produto contendo pantotenato de cálcio resultante, além de ácido D-pantotênico na forma de sal de cálcio, também contém cloreto de cálcio em uma relação molar de 1:1. Para reduzir o teor de cloreto de cálcio, eletrodiálise com subseqüente secagem por pulverização é necessária. Este processo tem a desvantagem, devido à multiplicidade de etapas de processo complexas, e o uso de solventes orgânicos, de não ser nem econômico nem ecológico. [00010] É um objeto da presente invenção prover um suplemento de alimento para animal contendo ácido D- pantotênico e/ou sais do mesmo e também a produção do mesmo por um processo melhorado para preparar ácido D- pantotênico e/ou sais do mesmo que não tem as desvantagens mencionadas acima. Neste caso, por razoes econômicas, um processo é desejável em que o suprimento de β- alanina é drasticamente reduzido ou não é requerido de todo. Além disso, é desejável preparar ácido D- pantotênico na forma de seus sais divalentes, neste caso especialmente os sais de metal alcalino terroso, porque os sais divalentes tem propriedades higroscópicas menores do que sais monovalentes de ácido pantotênico e para uso posterior, por exemplo como suplemento de alimento para animal, assim tem uma tendência menos pronunciada à agregação. [00011] Os requerentes verificaram que este objeto é obtido em um modo vantajoso pela presente invenção. [00012] A presente invenção refere-se a um processo para preparar ácido D- pantotênico e/ou sais do mesmo, que compreende: a) usar pelo menos um organismo produtor de ácido D-pantotênico, o ácido D- pantotênico (pan) e/ou isoleucina/ valina (ilv) cuja biossíntese é desregulada e que forma pelo menos 2 g/1 de sais de ácido D-pantotênico por fermentação em um meio de cultura, com 0 - 20 g/1 de β-alanina livre e/ou sal de β- alanina sendo alimentado para o meio de cultura, b) sais contendo cátions polivalentes sendo alimentados para o D- pantotenato formado, sais polivalentes de ácido D- pantotênico sendo formados, c) a solução contendo sais polivalentes de ácido D- pantotênico sendo trabalhada por nanofiltração, os sais polivalentes de ácido D- pantotênico sendo enriquecidos e d) o retido da nanofiltração contendo sais polivalentes de ácido D- pantotênico sendo submetido a secagem e/ou formulação. [00013] Em uma variante do processo inventivo, o retido da etapa c) é uma suspensão contendo sais polivalentes de ácido D- pantotênico. [00014] Além disso, a fermentação pode ser realizada por procedimentos conhecidos por si no modo em batelada, batelada alimentada ou batelada alimentada repetida ou sob procedimentos de processo contínuos. Para neutralizar o ácido pantotênico resultante, sistemas de tampão comuns são usados neste caso, por exemplo tampão fosfato contendo NaOH, KOH ou amônia. [00015] Em outras variantes do processo inventivo, na etapa a), pelo menos 10 g/1, preferivelmente pelo menos 20 g/1, particularmente preferivelmente pelo menos 40 g/1, muito particularmente preferivelmente pelo menos 60 g/1, e particularmente pelo menos 70 g/1 de sais de ácido D-pantotênico são formados no meio de cultura por fermentação. [00016] Para os fins da presente invenção, a formulação "produzir" significa que o organismo pode sintetizar maiores quantidades de ácido D-pantotênico e/ou sais do mesmo do que são requeridos para suas próprias necessidades metabólicas. Em uma variante vantajosa de modo inventivo, a quantidade de ácido D- pantotênico e/ou sais do mesmo que é sintetizada não está presente no interior da célula, mas, idealmente, é completamente liberada no meio de cultura do organismo. Esta secreção pode ocorrer ativamente ou passivamente por mecanismos que são conhecidos por si. [00017] De acordo com a invenção, os organismos produzindo ácido D-pantotênico usados são microorganismos. Estes incluem, de acordo com a invenção, fungos, leveduras e/ou bactérias. De acordo com a invenção, dá-se preferência a fungos, por exemplo mucor, ou leveduras, por exemplo Saccharomyces ou Debaromyces e, neste caso, dá-se preferência a uso de Saccharomyces cerevisiae. Com vantagem, de acordo com a invenção, bactérias corineformes ou Bacillaceas são usadas. As que são cobertas de acordo com a invenção são, preferivelmente, por exemplo, bactérias do gênero Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Acinetobacter, ou Rhizobium. Dá-se preferência particular aqui, por exemplo, a Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium breve ou Baccillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus, B. pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus, e outras espécies Bacillus de grupo 1, que são caracterizadas por seu lósRNA, ou Actinum mycetalis. Esta listagem serve para ilustração e não é limitativa para a presente invenção. [00018] Além disso, a presente invenção também compreende o uso de organismos geneticamente modificados para a preparação inventiva de um suplemento de alimento para animal contendo ácido D- pantotênico livre e/ou sais do mesmo. Este organismo geneticamente modificado pode ser isolado, por exemplo, por mutagênese química e subseqüente seleção por um "método de seleção" apropriado. A invenção também compreende o que são chamadas "cepas de produção", que são apropriadas para produzir o produto dentro do significado da presente invenção e tem modificações genética com relação ao fluxo metabólico na direção de ácido D- pantotênico, outras modificações com relação à secreção de ácido D- pantotênico e sais do mesmo através da membrana da célula também sendo incluídas. Isto pode ser obtido, por exemplo, por modificações em posições chaves em vias de biossíntese metabólica do organismo usado. [00019] Também é concebível usar organismos transgênicos que resultam da transferência de seqüências de nucleotídeos homólogas e/ou heterólogas que são requeridas ou podem ser benéficas para a síntese de produto desejado. Neste caso, a super- expressão e/ou desregulação de um ou mais genes individualmente e/ou em combinação, localizados no genoma e/ou em um vetor, é concebível. [00020] Estes organismos transgênicos podem conter, com vantagem, cópias adicionais de e/ou genes geneticamente modificados selecionados dentre o grupo consistindo de panB, panC, panD, panE, e/ou combinações dos mesmos e/ou mesmo unidades organizacionais, como operon panBCD. Além disso, outras vias metabólicas, por exemplo a via biossintética isoleucina-valina pode ser manipulada com vantagem nos organismos, por exemplo como descrito em EP 1 006 189, EP 1 006 192, EP 1 006 193 ou EP 1 001 027. Por este meio, substâncias precursoras de cadeia ramificada, de biossíntese de ácido pantotênico são providas em maior quantidade. Com vantagem, se apropriado, os genes para esta via biossintética, isto é, ilvB, ilvN, ilvC, e/ou ilvD, são super- expressadas. [00021] Além disso, modificações genéticas de aspartato- a-decarboxilase (panD), por exemplo por super- expressão e/ou des- regulação, são compostas, de acordo com a invenção, no organismo produtor de ácido D-pantotênico usado. [00022] Para os fins da presente invenção, a formulação "desregulação" significa o seguinte: mudança ou modificação de pelo menos um gene que codifica para uma enzima em uma via biossintética metabólica, de modo que a atividade da enzima no microorganismo é mudada ou modificada.

Preferivelmente, pelo menos um gene que codifica para uma enzima da via biossintética metabólica é alterado de tal modo que o produto de gene é formado em uma extensão aumentada ou tem uma aumentada atividade. O termo "via metabólica desregulada" também inclui uma via biossintética metabólica em que mais de um gene que codifica para mais de uma enzima é mudado ou modificado em tal modo que as atividades de mais de uma enzima são mudadas ou modificadas. [00023] As mudanças ou modificações podem compreender, mas não são limitadas a : remoção do promotor endógeno ou elementos regulatórios, introdução de promotores fortes, promotores indutíveis ou uma pluralidade de promotores simultaneamente, remoção de seqüências regulatórias, de modo que a expressão do produto de gene é mudada; mudança da posição cromossômica do gene; mudança da seqüência de DNA na proximidade do gene ou dentro do gene, por exemplo o sítio de ligação ribossômico (RBS); aumento do número de cópias do gene no genoma ou por introdução de plasmídeos de diferente número de cópias; modificação de proteínas (por exemplo proteínas regulatórias, supressores, melhoradores, ativadores transcripcionais, e outros) que desempenham um papel na transcrição do gene e/ou na tradução para dar o produto de gene. Este também incluem todas as outras possibilidades para desregulação da expressão dos genes que são arte anterior, por exemplo o uso de oligonucleotídeos anti-sentido, ou o bloqueio de proteínas repressoras. [00024] A desregulação também pode compreender mudanças na região de codificação de genes que leva, por exemplo, à remoção de regulação de retro- alimentação no produto de gene ou para uma atividade específica maior ou menor do produto de gene. [00025] Além disso, de acordo com a invenção, as mudanças de engenharia genética para enzimas são vantajosas que afetam o efluxo de precursores de ácido pantotênico e/ou o fluxo de ácido pantotênico para coenzima A. exemplos destes genes codificando enzima são: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX, etc. Esta listagem serve para ilustração e de nenhum modo limita a presente invenção. [00026] Além disso, mudanças de engenharia genética são vantajosas que fixam a provisão celular de co- fatores (por exemplo de tetraidrofolato de metileno, equivalentes redox, etc), em uma quantidade ótima para produção de ácido pantotênico. [00027] Com vantagem, β- alanina assim já está presente nas células em concentrações aumentadas comparadas com organismos correspondentemente não geneticamente modificados, e assim não precisam ser adicionados como um precursor para o meio de cultura, como é requerido, por exemplo, em EP-A - 0 590 857. Os microorganismos são vantajosos em que biossíntese de ácido pantotênico (pan) e/ou isoleucina / valina (ilv) e/ou asparato a- descarboxilase (panD) é desregulada. Além disso, uma super- expressão adicional de cetopantoato reductase (panE) nos microorganismos é vantajosa. [00028] É ainda vantajoso de acordo com a invenção se o gene coaA, que é requerido para a síntese de coenzima A, se apropriado, seja reduzido em atividade ou (por exemplo na espécie Bacillus) seja completamente comutado. Isto é porque Bacillus, além de coaA, contém um outro gene para esta função enzimática (= coaX). A atividade deste gene coaX ou de enzima correspondente também pode ser alterada, preferivelmente reduzida, ou mesmo deletada, desde que o próprio coaA ainda tenha uma suficiente atividade de enzima, mesmo se diminuída, isto é, a atividade de enzima de coaA não foi completamente perdida. Além da super- expressão de vários genes, a manipulação genética das regiões promotoras destes genes é vantajosa em tal modo que esta manipulação leva a uma super- expressão dos produtos de genes. [00029] Em uma forma de realização variante da presente invenção, as cepas bacterianas descritas de acordo com o anexo (PCT/pedido US 0025993), por exemplo Bacillus subtilis PA824 e/ou derivados do mesmo são usadas. Em uma outra forma de realização variante, de acordo com a invenção, o microorganismo Bacillus subtil is PA668, como descrito de acordo com o anexo (no* de série US 60/ 262 995) é usado no processo inventivo. Estas cepas Bacillus subtilis PA824 e PA668 são produzidas como a seguir: 100030] Partindo da cepa Bacillus subtilis 168 (cepa Marburg ATCC 6051), que tem o genótipo trpC2 (Trp' ), a cepa PY79 foi produzida via iransdução do marcador Trp+ (de Bacillus subtilis tipo selvagem W23). As mutações ApanB e ApanEI foram introduzidas na cepa PY79 por métodos de engenharia genética clássicos (como descrito, por exemplo, em Harwood, C.R. e Cutting, S.M (editores), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd, Chíchester, Inglaterra). [00031] A cepa resultante foi transformada usando DNA genômico de cepa Bacillus subtilis PA221 (genótipo PjtpanBCD, trpC2 (Trp' )) e DNA genômico de Bacillus subtilis cepa PA303 (genótipo PιφαηΕΙ). A cepa resultante PA327 tem o genótipo P^panBCD, PχψαηΕΙ e é um auxótrofo de tipotofano (Trp ). Usando Bacillus subtilis cepa PA327, em culturas de 10 ml usando meio SVY (25 g/l de caldo de infusão Veal Difco, 5 g/l de extrato de levedura Difco, 5 g/l de glutamato de Na, 2,7 g /1 de sulfato de amônio, completando até 740 ml com água, autoclavagem, então adição de 200 ml de 1M fosfato de potássio, pH 7,0 e 60 ml de solução de glucose estéril a 50%), que foi suplementada com 5 g/l de β- alanina e 5 g/l de ct- cetoisovalerato, títulos de ácido pantotênico de até 3,0 g/I (24 h) foram obtidos. [00032] A preparação de Bacillus subtilis cepa PA221 (genótipo PitpanBCDy trpC2 (Trp')) é descrita na seguinte seção: 100033] Por métodos de engenharia genética clássicos, com a ajuda da informação de sequência de operon panBCD de E. coli (ver Merkel et al, FEMS Microbiol. Lett. 143 1996: 247- 252), partindo de uma biblioteca de plasmídeo de Bacillus subtilis GP275, o operon panBCD de Bacillus foi clonado. Para a clonagem, a cepa de E. coli BM4062 (birts) foi usada, como foi a informação que o operon Bacillus está na proximidade de gene birA. O operon panBCD foi introduzido em um plasmídeo que pode replicar em E. coli. Para melhorar a expressão do operon panBCD, promotores constitutivos fortes de Bacillus subtilis fagos SP01 (P26) foram usados e o sítio de ligação de ribossomas (=RBS) em frente do gene panB foi substituído por um RBS artificial. Um fragmento de DNA que está imediatamente a montante do gene panB nativo em Bacillus, foi ligado em frente do cassete P26panBCD no plasmídeo. Este plasmídeo foi transformado no Bacillus subtilis cepa RL- 1 (derivado de Bacillus subtilis obtido por mutagênese clássica (cepa Marburg ATCC 6051), genótipo trpC2 (Trp') e, por recombinação homóloga, o operon panBCD nativo foi substituído pelo operon P26panBCD. A cepa resultante é chamada PA221 e tem o genótipo P26panBCD, trpC2 (Trp'). [000341 Usando Bacillus subtilis cepa PA221, em culturas de 10 ml com meio SVY, que foi suplementado com 5 g/1 de β- alanina e 5 g/1 de a-cetoisovalerato, títulos de ácido pantotênico de até 0,92 g/1 (24 h) foram obtidos. [00035] A produção de Bacillus subtilis cepa PA303 (genótipo P26panEl) é descrita nas seguintes seções: [00036] Com a ajuda da seqüência de gene panE de E. coli, a seqüência panE de Bacillus foi similarmente clonada. Verificou-se que dois homólogos do gene panE de E. coli existem em Bacillus subtilis que são chamados panEl e panE2. Por análise de deleção, verificou-se que o gene panEl é responsável por 90% da produção de ácido pantotênico, enquanto deletando o gene panE2 não tem efeito significante sobre a produção de ácido pantotênico. Aqui, também, em um modo similar à clonagem do operon panBCD, o promotor foi substituído pelo promotor constitutivo forte P26 e o sítio de ligação de ribossomas antes do gene panEl foi substituído pelo sítio de ligação artificial. O fragmento P2(panEl foi clonado em um vetor que foi projetado de modo que o fragmento P2φαηΕΙ pode integrar no local panEl original no genoma de Bacillus subtilis. A cepa resultante após transformação e recombinação homóloga é chamada PA303 e tem o genótipo P26panEl. [00037] Usando Bacillus subtilis cepa PA303, em culturas de 10 ml usando meio SVY que foi suplementado com 5 g/1 de β- alanina e 5 g/1 de a-cetoisovalerato, títulos de ácido pantotênico de até 1,66 g/1 (24 h) foram obtidos. [00038] Outra construção de cepa prosseguiu via transformação de PA327 usando um plasmídeo que contém o operon ViélvBNC e o gene de marcação para espectinomicina. O operon fyeilvBNC integrado no local amyE, que foi demonstrado por PCR. Um transformante foi chamado PA340 (genótipo V2(>pcinBCD, fyeilvBNC, specR, trpC2 (Trp' )). Usando Bacillus subtilis cepa PA340, em culturas de 10 ml usando meio SYV que tinha sido somente suplementado com 5 g/1 de β- alanina, títulos de ácido pantotênico de até 3,6 g/1 (24 h) foram obtidos, e em culturas de 10 ml usando meio SVY, que foi suplementado com 5 g/1 de β- alanina e 5 g/1 de a- cetoisovalerato, títulos de ácido pantotênico de até 4,1 g/1 (24 h) foram obtidos. [00039] Além disso, um cassete de ilvD desregulado foi introduzido em cepa PA340. Para isto, um plasmídeo contendo o gene ilvD sob o controle do promotor P26 tendo o RBS2 artificial foi transformado em PA340. Neste caso, o gene fyeilvD foi integrado no local ilvD original por recombinação homóloga. A cepa resultante PA374 foi o genótipo P26panBCD, fyepanEl, P26ilvBNC, V26ÍlvD, specR, e trpC2 (Trp'). [00040] Usando Bacillus subtilis cepa PA374, em culturas de 10 ml, usando meio SVY, que foi suplementado somente com 5 g/1 de β- alanina, títulos de ácido pantotênico de até 2,99 g/1 (24 h) foram obtidos. [00041] Para produzir ácido pantotênico usando cepa PA374 sem suprir β- alanina, cópias adicionais do gene panD codificando para aspartato a-decarboxilase foram introduzidos na cepa PA374. Para isto, DNA cromossômico de cepa PA401 foi transformado em PA374. A cepa PA377 foi obtida por seleção em tetraciclina. [00042] A cepa PA377 resultante foi o genótipo P2epanBCD, V^anEl, P26ilvBNC, P26ilvD, specR, tetR e trpC2 (Trp'). [00043] Usando Bacillus subtilis cepa PA377, em culturas de 10 ml usando meio SVY, títulos de ácido pantotênico isento de suprimento de precursor de até 1,3 g/1 (24 h) foram obtidos. [00044] A preparação de Bacillus subtilis cepa PA401 (genótipo P26panD) é descrito na seguinte seção. [00045] O gene panD de Bacillus subtilis foi clonado a partir do operon panBCD em um vetor contendo o gene marcador de tetraciclina. O promotor P26 e um RBS artificial acima descrito foram clonados em frente do gene panD. Por digestão de restrição, um fragmento contendo o gene marcador de tetraciclina e o gene P26panD foi produzido. Este fragmento foi religado e transformado na cepa acima descrita PA221. O fragmento integrado no genoma de cepa PA211. A cepa resultante PA401 tem o genótipo fyepanBCD, ViepanD, tetR e trpC2 (Trp'). [00046] Usando Bacillus subtilis cepa PA401, em culturas de 10 ml em meio SVY que foi suplementado com 5 g/ 1 de a- cetoisovalerado, títulos de ácido pantotênico de até 0,3 g/1 (24 h) foram obtidos. Em culturas de 10 ml usando meio SVY que foi suplementado com 5 g/1 de ácido D- pantoína e 10 g/1 de L- aspartato, títulos de ácido pantotênico de até 2,2 g/1 (24 h) foram obtidos. [00047] Partindo de cepa PA377, por transformação com DNA cromossômico de cepa PY79, uma cepa de triptofano prototrófo foi gerada. Esta cepa PA824 tem o genótipo fyepanBCD, ΫιβραηΕΙ, P26ilvBNC, P26ilvD, specR, tetR e Trp+.

[00048] Usando Bacillus subtilis cepa PA824, em culturas de 10 ml em meio SVY, títulos de ácido pantotênico isentos de suprimento de precursor de até 4,9 g/1 (48 h) foram obtidos (controle PA 377: até 3,6 g/1 em 48 h). A construção exata das cepas é como dada de acordo com o anexo de pedido PCT/US 0025993. [00049] A preparação de PA668 é descrita na seguinte seção: [00050] O gene panB de Bacillus foi clonado do operon panBCD de tipo selvagem e inserido em um vetor que, além de gene de resistência a cloranfenicol, também contém seqüências de Bacillus subtilis do local vpr. [00051] O promotor constitutivo forte P26 foi introduzido na frente da extremidade 5' do gene panB. Um fragmento que contém o gene V^panB, o gene marcador para resistência a cloranfenicol e seqüências de Bacillus subtilis vpr foi obtido por digestão de restrição. O fragmento isolado foi religado e a cepa PA824 foi transformado com o mesmo. A cepa resultante foi chamada PA668. O genótipo de PA668 é P2epanBCD, P26panEl, P26ilvBNC, P26ilvD, P26UvD, ΫιφαηΒ, specR, tetR, CmR e Trp+. [00052] Duas colônias de PA668 foram isoladas e chamadas PA668- 2A e a outra PA668- 24. [00053] Usando Bacillus subtilis cepa PA668- 2A, em culturas de 10 ml em meio SVY sem suprimento de precursores, títulos de ácido pantotênico de 1,5 g/1 são obtidos em 48 h. Em culturas de 10 ml que são suplementadas com 10 g/1 de aspartato, títulos de até 5 g/1 são obtidos. [00054] Usando Bacillus subtilis cepa PA668- 24, em culturas de 10 ml em meio SVY, sem suprimento de precursores, títulos de ácido pantotênico de 1,8 g/1 foram obtidos em 48 h. Em culturas de 10 ml suplementadas com 10 g/1 de L- aspartato, títulos de até 4,9 g/1 são obtidos. [00055] A construção exata das cepas é dada de acordo com os anexos de PCT/pedido US 0025993 e número de série US 60/262.995. [00056] Usando a cepa PA377, acima descrito, em fermentação limitada por glucose em meio SVY (25 g/1 de caldo de infusão Veal Difco, 5 g/1 de extrato de levedura Difco, 5 g/1 de triptofano, 5 g/1 de glutamato de Na, 2 g/1 de (NH4)2S04, 10 g/1 de KH2PO4, 20 g/1 de K2HPO4, 0,1 g/1 de citrato de sódio, 0,01 g/1 de FeSQ*. 7 H2O e 1 ml/1 de solução de sal de traço da seguinte composição: 0,15 g de Na2MoC>4. 2 H2O, 2,5 g de H3BO3, 0,7 g de C0CI2. 6 H20, 0,25 g de CuS04. 5 H20, 1,6 g de MnCl2. 4 H20, 0,3 g de ZnS04. 7 H20, feitos até 1 1 com água), em uma escala de 10 1 com suprimento contínuo de uma solução de glucose, concentrações de ácido pantotênico de 18- 19 g/1 (22 -25 g/1) no caldo de fermentação são obtidos em 36 h (48 h). [00057] Em uma fermentação limitada em glucose de PA824, o derivado de triptofano- prototrofo de PA377, em meio de extrato de levedura (10 g/1 de extrato de levedura Difco, 5 g/1 de glutamato de Na, 8 g/1 de (NH4)2S04, 10 g/1 de KH2PO4, 20 g/1 de K2HPO4, 0,1 g/1 de CaCl2, 1 g/1 de MgSC>4, 1 g/1 de citrato de sódio, 0,01 g/1 de FeSC>4. 7 H2O e 1 ml/1 de solução de sal traço acima descrita) em uma escala de 10 1 com suprimento contínuo de uma solução de glucose, as seguintes concentrações de ácido pantotênico são obtidas em caldos de fermentação em 36 h, 48 h e 72 h, 20 g/1, 28 g/1 e 36 g/1. [00058] Por outra otimização do meio, usando cepa PA824 em fermentação limitada em glucose, em um meio consistindo de 10 g/1 de extrato de levedura Difco, 10 g/1 de NZ amina A (Quest International GmbH, Erftstadt), 10 g/1 de glutamato de Na, 4 g/1 de (NFL^SC^, 10 g/1 de KH2PO4, 20 g/1 de K2HPO4, 0,1 g/1 de CaCI2, 1 g/1 de MgSC>4, 1 g/1 de citrato de sódio, 0,01 g/1 de FeSQ*. 7 H2O e 1 ml/1 de solução de sal traço acima descrita) em uma escala de 10 1 com suprimento contínuo de uma solução de glucose, as concentrações de ácido pantotênico de 37 g/1 (48 g/1) são obtidas em caldos de fermentação em 36 h, (48 h). Outros aumentos em concentração de ácido pantotênico em caldo de fermentação são concebíveis por outra otimização do meio, por aumento do tempo de fermentação, por melhora do processo e cepas e por combinações de etapas individuais. Assim, as concentrações de ácido pantotênico acima descritas também podem ser obtidas por fermentação de cepas que são derivados de PA824 acima descrito. Os derivados podem ser produzidos por desenvolvimento de cepas clássicas e por outras manipulações de engenharia genética. Por desenvolvimento de meios, os processos de fermentação e cepas, os títulos de ácido pantotênico nos caldos de fermentação podem ser aumentados a mais do que 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 e > 90 g/1. [00059] Uma vantagem importante do processo inventivo é que a fermentação é realizada em um meio de cultura, que além de pelo menos uma fonte de carbono e nitrogênio, como compostos de partida, não contém outros precursores. Isto é, a biossíntese de ácido D- pantotênico é independente do suprimento de outros precursores. Para os fins da presente invenção, estes precursores são, por exemplo, β- alanina e/ou L- aspartato e/ou L- valina e/ou a- cetoisovalerato e/ou combinações dos mesmos. [00060] Em uma variante preferida do processo inventivo, a fermentação do organismo produtor de ácido D- pantotênico é realizada em um meio de cultura que contém uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio, em que, no entanto, nem β- alanina livre nem sais de β- alanina são adicionados ou é reabzada no curso da fermentação. Isto é, para produzir ácido D- pantotênico nas faixas de pelo menos 10 g/1 de meio de cultura, preferivelmente pelo menos 20 g/1, particularmente preferivelmente pelo menos 40 g/1, muito particularmente preferivelmente pelo menos 60 g/1, e particularmente pelo menos 70 g/1, de acordo com a invenção, não é necessário suprimento de β- alanina e/ou sais de β- alanina. [00061] A independência do suprimento de precursores é, particularmente, uma vantagem econômica importante do processo inventivo comparado com processos conhecidos, porque uma multiplicidade de precursores é muito cara. [00062] No entanto, a adição de β- alanina e/ou sais de β- alanina não é excluída de acordo com a invenção, de modo que, assim, o rendimento de ácido D- pantotênico pode ser ainda melhorado por adição de β- alanina e/ou sais de β- alanina. Considerando, por exemplo, que todos os precursores requeridos de ácido pantotênico estão presentes em uma quantidade suficiente, somente a atividade do gene panD limita um outro aumento na produção de ácido pantotênico, então, o rendimento de ácido pantotênico pode ser aumentado, por exemplo, por acima de 50% por adição de β- alanina livre e/ou sais de β- alanina. [00063] Em uma variante vantajosa da presente invenção, até 20 g/1 de β- alanina livre e/ou sais de β- alanina podem ser adicionados ao meio de cultura para aumento adicional em rendimento de ácido pantotênico em mais de 50%. Preferência é dada à adição de cerca de 15 g/1 de β- alanina livre e/ou sais de β- alanina ao meio de cultura. [00064] Exemplos de fontes de carbono apropriadas de acordo com a invenção para uso em um meio de cultura para fermentação dos organismos acima mencionados são açúcares, como hidrolisados de amido (mono-, di- e oligossacarídeos), preferivelmente glucose ou sacarose, e também melaços de açúcar de cana ou beterraba, proteínas, hidrolisados de proteína, farinha dc soja, licor de milho, gorduras, ácidos graxos livres, células recirculadas de fermentações realizadas previamente ou hidrolisados dos mesmos e também extrato de levedura. Estas listagens não são límitativas para a presente invenção. [00065] Além disso, a presente invenção é distinta, com vantagem, em que o teor de açúcar total é reduzido a um mínimo para o final da fermentação, porque, de outra forma, isto torna difícil a posterior secagem e/ou formulação da solução de fermentação devido ao agarramento. Isto pode ser obtido de acordo com a invenção por realização na fermentação durante algum tempo após a fonte de carbono ser exaurida (no caso de cultura em baldada), ou após a alimentação de carbono (no caso de condições dc batelada alimentada ou processo de batelada alimentada repetida) ser interrompida e/ou regulada em tal modo que a concentração da fonte de carbono é virtual mente zero (no caso de condições de batelada alimentada ou processo contínuo ou de batelada alimentada repetida). [00066] Isto é realizado, de acordo com a invenção, por realização da fermentação, após interrupção na adição da fonte de carbono (por exemplo solução de açúcar), até a concentração de oxigênio dissolvido (pC^) alcançar pelo menos 80%, preferivelmente 90% e particularmente preferivelmente 95%, do valor de saturação na solução de fermentação. [00067] Exemplos de fontes de nitrogênio apropriadas de acordo com a invenção são amônia, sulfato de amônio, uréia, proteínas, hidrolisados de proteína, ou extrato de levedura. Esta listagem não é limitativa para a presente invenção. [00068] Além disso, o meio de fermentação contém sais minerais e/ou elementos de traço, como aminoácidos e vitaminas. As composições exatas de meio de fermentação apropriados são conhecidas em grandes números e acessíveis para os versados na técnica. [00069] Após inocular o meio de fermentação com um organismo produto de ácido D- pantotênico apropriado (em densidades de células bem conhecidas dos versados na técnica), se apropriado, com adição de um antiespumante, o organismo é cultivado. Qualquer regulação necessário do pH do meio pode ser realizada usando várias soluções de hidróxido de metal alcalino inorgânico ou orgânico ou ácidos, por exemplo NaOH, KOH, amônia, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido fórmico, ácido succínico, ácido cítrico ou semelhantes. [00070] Devido aos sistemas tampão usados durante a fermentação, que podem ser como previamente descritos, por exemplo NaOH, KOH, amônia, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido fórmico, ácido succínico, ácido cítrico ou semelhantes, o ácido D- pantotênico formado na solução de fermentação, dependendo do sistema tampão usado, está presente na forma do (s) sal(ais) respectivo(s). Porque neste caso, particularmente, os sais de ácido D- pantotênico na forma de seus cátions monovalentes são desvantajosos, a solução de fermentação é trabalhada de acordo com a invenção por nanofiltração. [00071] Para isto, os sais contendo cátions polivalentes são primeiro alimentados de acordo com a invenção para o D- pantotenato formado, que forma sais polivalentes de ácido D- pantotênico. De acordo com a invenção, sais contendo cátions polivalentes podem ser adicionados em forma sólida ou em solução aquosa durante, preferivelmente no final de, ou após, a fermentação na etapa a). Uma solução aquosa contendo cátions polivalentes pode ser alimentada, por exemplo, continuamente. [00072] Além disso, em uma etapa a montante da nanofiltração, isto é, antes da nanofiltração na etapa c) do processo inventivo, a massa de células ou componentes precipitados na solução podem ser separados. Neste caso, a separação pode ser realizada por decantação ou filtração em membrana, preferivelmente ultrafiltração. Em uma variante do processo inventivo, a filtração em membrana é realizada como diafiltração. Aqui, também, de acordo com a invenção, sais contendo cátions polivalentes podem ser adicionados em forma sólida ou solução aquosa durante, ou após, uma filtração em membrana de uma solução contendo D- pantotenato. Por exemplo, uma solução aquosa contendo cátions polivalentes é alimentada aqui continuamente. [00073] Na separação de massa de células e/ou componentes precipitados na solução, por exemplo sais fosfato ou sais sulfato levemente solúveis ou insolúveis, enzimas, hormônios, proteínas, antibióticos, pirogenes, vírus, polissacarídeos, colóides, tensoativos, pesticidas ou outras substâncias inorgânicas, a separação é baseada na utilização de gravidade, força centrífuga, pressão ou vácuo. Os processos exemplares são, inter alia: decantação, elutriação, peneiramento, classificação pelo vento, classificação, filtração, diálise, sedimentação, microfiltração, ultrafiltração, flotação, ffacionamento por espuma, separação imersão- nado, clarificação, centrifugação ou separação. Os processos de separação em membrana, como microfiltração ou ultrafiltração, operados por uma diferença de pressão entre lado de alimentação e lado de permeado, são somados como filtração em membrana. Os processos diferem, por exemplo, por seus limites de separação. Assim, no caso de ultrafiltração, o limite de corte não é baseado no tamanho de partícula, por exemplo como no caso de microfiltração, mas na massa molar que está na faixa de cerca de 103 a 2 x 106 Da. Em ultrafiltração, além do filtrado (permeado), o que é conhecido como o concentrado (retido) também é produzido. [00074] Para separar as substâncias sólidas, ou enriquecer ou depletar substâncias de peso molecular médio e peso molecular alto, dissolvidas, com vantagem são usadas membranas porosas assimetricamente estruturadas. [00075] As membranas usadas de acordo com a invenção podem, em uma variante vantajosa, ser feitas de uma camada de separação, que afeta a separação real, e uma camada ou camada de suporte em múltiplas camadas que contém a camada de separação e tem poros mais grosseiros do que a camada de separação. As camadas de separação e a camada de suporte podem consistir de polímeros orgânicos ou inorgânicos, cerâmica, metal ou carbono e devem ser estáveis no meio de reação e na temperatura do processo. Exemplos destes são listados na tabela 1, mas não são limitativos para a presente invenção. [00076] As membranas podem ser usadas na forma de tubulação flexível, tubos, capilares, fibras ocas, ou membranas planas em elemento plano, tubular, de múltiplos canais, módulos capilares ou em bobinas, que são conhecidos por si. As pressões de transmembranas ótimas entre o retido e o permeado são essencialmente de 1 e 40 bar, dependendo do diâmetro dos poros da membrana ou o limite de corte (expresso em unidades de peso molecular), a estabilidade mecânica da membrana e o tipo de membrana. Pressões de transmembranas maiores geralmente levam a fluxos de permeados maiores. No caso em que a alimentação (solução a ser tratada) é alimentada em uma pressão excessiva, a pressão transmembrana pode ser adaptada por aumento da pressão do permeado. [00077] A temperatura de operação é dependente da estabilidade do produto e estabilidade da membrana. Ela é de cerca de 20 a 90 °C, preferivelmente de cerca de 40 a 70 °C. Maiores temperaturas levam a maiores fluxos de permeado. As membranas de acordo com a tabela 2 podem ser usadas, por exemplo, mas não são limitativas para a presente invenção. [00078] A separação de células, de acordo com a invenção, pode ser com vantagem também realizada por um tipo especial da filtragem de membrana, isto é, diafiltração. A diafiltração pode ocorrer em batelada por passagem da solução contendo sais polivalentes de ácido D- pantotênico via um circuito compreendendo um vaso, uma bomba e um ou mais módulos de membrana e ajustando as pressões nos módulos de membrana em tal modo que o permeado é produzido. Continuamente, ou em algumas vezes, água ou uma solução aquosa é adicionada que não contém o produto a ser removido, ou contém o mesmo em uma menor concentração do que no ponto de tempo de adição ao circuito de separação. De acordo com invenção, a solução aquosa pode conter sais de cátions polivalentes, por exemplo halogenetos de cálcio ou magnésio, ou combinações dos mesmos, preferivelmente cloreto de cálcio e/ou cloreto de magnésio. [00079] A remoção de células por meio de diafiltração pode de acordo com a invenção ser também realizada continuamente, com preferivelmente uma pluralidade de módulos de membrana sendo conectados em série, ou em cada caso um ou mais circuitos de bomba contendo módulo- membrana sendo conectado em série. A montante de, enfie ou a jusante de módulos de membrana ou circuitos de bomba, água ou uma solução aquosa que não contém o produto a ser removido ou somente contém o mesmo em menor concentração do que no sítio de alimentação podem ser adicionados, em cujo caso, como na variante de batelada, a solução aquosa pode conter sais de cátions polivalentes, por exemplo halogenetos de cálcio ou magnésio ou combinações dos mesmos, preferivelmente cloreto de cálcio e/ou cloreto de magnésio. [00080] De acordo com a invenção, a ultrafiltração ou diafiltração podem ser realizadas diretamente usando a produção de fermentação ou após um tratamento da produção de fermentação, por exemplo por centrifugação, decantação ou procedimento similar. [00081] Se, de acordo com a invenção, a massa celular ou componentes precipitados na solução são removidos, a adição de sais contendo cátions polivalentes de acordo com a etapa b) do processo inventivo pode ocorrer durante, ou após, a ultrafiltração ou diafiltração. Nas variantes do processo inventivo, cátions polivalentes adicionados são, por exemplo, cloreto de cálcio e/ou magnésio, nitrato, hidróxido, formiato, acetato, propionato, glicinato e/ou lactato. Neste caso, o cátion polivalente por exemplo Ca2+ pode ser alimentado a uma concentração de 0,05- 50 mol de Ca2+/ mol de D- pantotenato, preferivelmente 0,2- 2 mol de Ca2+/mol de D- pantotenato. [00082] Na etapa c) do processo inventivo, a solução contendo sais polivalentes de ácido D- pantotênico é então trabalhada por nanofiltração, os sais polivalentes de ácido D- pantotênico sendo enriquecidos e simultaneamente íons monovalentes indesejados, preferivelmente cátions monovalentes, por exemplo íons amônio, sódio ou potássio, são depletados. No processo inventivo, o teor de cátions monovalentes, preferivelmente íons amônio, potássio e/ou sódio, é reduzido a uma concentração de < 5 g /kg de solução. [00083] A presente invenção compreende todos os sistemas de nanofiltração comercialmente disponíveis. A separação é realizada com vantagem em membranas porosas assimetricamente estruturadas. Em uma variante preferida do presente processo, membranas são usadas para isto que são feitas de uma camada de separação que realiza a separação real, e uma camada de suporte de camada única ou múltipla, que contém a camada de separação e tem poros mais grosseiros do que a camada de separação. As camadas de separação e a camada de suporte podem consistir de polímeros orgânicos, cerâmica, metal ou carbono, e devem ser estáveis no meio de reação e na temperatura do processo. Os materiais preferidos para a camada de separação são poliamidas, poliimidas, ou polipiperazinas. As camadas de separação também podem ter uma carga de superfície positiva ou negativa. Um exemplo de uma membrana de nanofiltração anionicamente funcionalizada é a membrana DESAL 5 DK, mas a presente invenção não é limitada ao uso exclusivo desta membrana. [00084] As membranas podem ser usadas na forma de tubulações flexíveis, capilares, fibras ocas, ou membranas planas, e em módulos planos, tubulares, de elementos de múltiplos canais, capilares ou bobinas, que são conhecidos por si. [00085] Em variantes vantajosas do processo inventivo, na nanofiltração na etapa c), um diferença de pressão sobre a membrana na faixa de 5-100 bar, preferivelmente 20- 80 bar, e particularmente preferivelmente 40- 70 bar, é acumulada. [00086] A temperatura do processo é com vantagem de 20 a 80 °C, preferivelmente 30 a 60 °C. Além disso, a nanofiltração pode ser realizada em um modo bem conhecido dos versados na técnica continuamente ou em batelada em uma ou mais etapas. [00087] Em uma variante preferida, em cada caso antes de uma ou mais etapa(s) de nanofiltração, um sal contendo cátions polivalentes é adicionado em forma sólida ou em solução aquosa. [00088] De acordo com a invenção, os cátions polivalentes são adicionados como cloreto de cálcio e/ou magnésio, nitrato, hidróxido, formiato, acetato, propionato, glicinato, e/ou lactato. Neste caso, como cátion polivalente, Ca2+ pode ser alimentado a uma concentração de 0,05- 50 mol de Ca2+/ mol de D- pantotenato, preferivelmente 0,2- 2 mol de Ca2+/ mol de D- pantotenato (com base no estado após misturação). [00089] No processo inventivo, sais contendo cátions polivalentes são adicionados em forma sólida ou solução aquosa durante, preferivelmente no final, ou após, a fermentação na etapa a) ou durante ou após a separação de células. [00090] De acordo com invenção, além disso, a adição de sais contendo cátions polivalentes durante a etapa de nanofiltração pode ser vantajosa. Além disso, uma solução aquosa contendo cátions polivalentes pode ser suprida continuamente. [00091] Em uma outra variante do presente processo, é concebível que, em uma ou mais etapas de processo a montante da nanofiltração, soluções de diferentes concentrações de produto podem surgir. Referidas soluções podem ser ainda processadas por nanofiltração em tal modo que referidas soluções são supridas em etapas de nanofiltração seqüenciais na ordem de concentrações de produto ascendentes. [00092] De acordo com a invenção, como um resultado do processo inventivo acima mencionado, primariamente os sais polivalentes de ácido pantotênico são enriquecidos no retido da nanofiltração. Na solução de permeado, principalmente os íons monovalentes são enriquecidos, quando uma membrana de nanofiltração anionicamente fimcionalizada é usada, os cátions monovalentes são enriquecidos. O teor de cátions monovalentes, preferivelmente íons amônio, potássio, e/ou sódio, no retido, pode ser reduzido neste caso a uma concentração de < 5 g/kg de solução. De acordo com a invenção, o permeado da nanofiltração ou parte da mesma pode ser recirculado para a fermentação na etapa a), do processo inventivo. Esta recirculação do permeado ou partes do mesmo pode ser realizada continuamente. As etapas de processo acima descritas realizadas além da nanofiltração servem para a pré-concentração ou outra concentração de D- pantotenato na forma de sais polivalentes. [00093] Uma outra vantagem da nanofiltração usada de modo inventivo é que a redução dos cátions monovalentes (na solução de retido) pode ser obtida simultaneamente com uma redução de volume do retido. O trabalho da solução de fermentação contendo D- pantotenato via nanofiltração pode, assim, ser usado de acordo com a invenção como um processo de troca de íons e concentração para produzir D- pantotenato. Isto leva, com vantagem, a uma simplificação, e simultaneamente aumentada eficiência, das etapas de processo subseqüentes. Por exemplo, o consumo de energia na secagem pode ser significativamente reduzido devido à concentração. [00094] Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a solução de fermentação é isentada da massa celular por centrifugação e/ou decantação e/ou ultrafiltração. Após adição de 0,05 a 50 mol íons (Ca2+) /mol de íon pantotenato, preferivelmente 0,2 - 2 mol íons (Ca2+) /mol de íon pantotenato, que são preferivelmente carregados na forma de uma solução diluída tendo 0,01- 10 mol de Ca2+/1, a solução resultante é introduzida em um módulo de nanofiltração. A diferença de pressão através da membrana está na faixa de cerca de 5- 100 bar, preferivelmente cerca de 20- 80 bar, particularmente preferivelmente cerca de 40- 70 bar. Antes ou durante a nanofiltração neste caso, a solução aquosa contendo íon Ca2+ pode ser adicionada à solução fluindo através da membrana no lado de alimentação. O retido tem um volume de 30- 200% de solução de partida. Além disso, cerca de 5- 99% preferivelmente 30- 80% de cátions monovalentes presentes são removidos. [00095] O retido preferivelmente contendo D- pantotenato de cálcio, D-pantotenato de magnésio, ou uma mistura dos mesmos é então submetido a uma secagem e/ou formulação. A secagem e/ou formulação da solução contendo D- pantotenato de cálcio e/ou magnésio é realizada por meios conhecidos por si, por exemplo secagem por pulverização, granulação com pulverização, secagem em leito fluidizado, granulação em leito fluidizado, secagem em tambor, ou secagem instantânea (Ullmann's Encyclopedia Of industrial Chemistry, 6a. ed, 1999, versão eletrônica, cap. "Drying of Solid Materials"). A temperatura de entrada de gás na secagem por convecção está na faixa de 100- 280 °C, preferivelmente 120- 210°C. A temperatura de saída de gás é de 50- 180°C, preferivelmente 60- 150°C. Para estabelecer uma distribuição de tamanho de partícula desejada, e as propriedades de produto associadas, partículas finas podem ser separadas e recirculadas. Além disso, material grosseiro pode ser triturado em um moinho e do mesmo modo então recirculado. [00096] O processo inventivo tem as vantagens de que cátions indesejados são eficientemente e virtualmente completamente removidos e, ao mesmo tempo, uma redução no volume ocorre que toma as etapas de processo subseqüentes, particularmente secagem e/ou formulação, simplificadas ou mais eficientes. Além disso, não ocorre decomposição do produto, ou somente uma decomposição do produto extremamente baixa, com simultaneamente um elevado rendimento de produto. Por alimentação de soluções de sal de cátions polivalentes durante, ou no final da fermentação, ou duração, ou no final da ultra- filtração ou diafiltração, ou durante a etapa de nanofiltração e/ou por recirculação do permeado para a solução de fermentação, os rendimentos de D-pantotenato na forma de íons polivalentes, preferivelmente divalentes, como cálcio ou magnésio, são ainda aumentados. [00097] No processo acima descrito, além disso, de acordo com a invenção, a redução de etapas de trabalho complexas é vantajosa, particularmente omitindo o uso de solventes orgânicos, com provisão simultânea de um produto desejado de bom valor biológico. Além disso, de acordo com a invenção, a quantidade de água de refugo produzida é substancialmente reduzida. Isto, assim, resulta em outras economias nas plantas complexas de tratamento e descarte. Assim, o processo inventivo é vantajosamente distinto em que é mais simples, menos susceptível a faltas, menos consumidor de tempo, significativamente menos caro e, assim, mais econômico do que os processos convencionais. [00098] No entanto, isto não exclui o processo inventivo de ser capaz de ser variado. O processo inventivo previamente descrito pode ser suplementado por um ou mais das seguintes etapas de processo, cada um sendo familiar para os versados na técnica. Neste caso, todas as combinações concebíveis das seguintes etapas de processo com as etapas de processo conhecidas até agora são incluídas de acordo com a invenção. [00099] Assim, as soluções resultantes do processo inventivo podem ser desinfectadas, por exemplo por aquecimento (esterilização) ou outros métodos, por exemplo pasteurização ou filtração estéril. [000100] Em outras variantes do processo inventivo, antes da secagem e/ou formulação do retido, pelo menos um, ou combinações, das seguintes etapas pode ser realizada, compreendendo lise e/ou esterilização da biomassa e/ou separação da biomassa da solução de fermentação e/ou adição de outros aditivos e/ou concentração da solução de fermentação, preferivelmente por remoção de água. [000101] A presente invenção assim também refere-se a um processo em que a lise e/ou esterilização da biomassa é realizada enquanto ainda na solução de fermentação, ou não até após a biomassa ser separada da solução de fermentação. Isto pode ser realizado, por exemplo, por um tratamento em temperatura, preferivelmente a 80 - 200°C e/ou tratamento com ácido, preferivelmente com ácido sulfurico ou ácido clorídrico e/ou enzimaticamente, preferivelmente com lisozima. [000102] Também é concebível para a massa de células presente para ser removida diretamente via a nanofiltração, isto é, simultaneamente com a troca de cátions monovalentes contra cátions polivalentes. [000103] A solução resultante do trabalho via nanofiltração pode ser concentrada antes da secagem e/ou formulação via um evaporador apropriado, por exemplo evaporador de filme cadente, evaporador de película fina, ou evaporador giratório. Estes evaporadores são fabricados, por exemplo, pela GIG (4800 Affhang Puchheim, Áustria), GEA Canzler (52302 Duren, Alemanha), Diessel (31103 Hildesheim, Alemanha), e Pitton (35274 Kirchhain, Alemanha). [000104] Para melhorar as propriedades de cor do produto final, uma etapa de filtração adicional pode ser realizada, em que um pequeno carbono ativado é adicionado às soluções obtidas durante o processo e esta suspensão é então filtrada. Ora, as soluções obtidas durante a fermentação podem ser passadas através de um leito de carbono ativado pequeno. As quantidades de carbono ativado usadas requeridas para isto estão na faixa de alguns por cento em peso da solução e dentro do conhecimento e julgamento do versado na técnica. [000105] Estas filtrações podem ser simplificadas por adição de um floculante comercialmente convencional (por exemplo Sedipur CF 902 ou Sedipur CL 930 de BASF AG Ludwigshafen), para a solução respectiva antes da filtração. [000106] Em uma forma de realização vantajosa da presente invenção, a saída de fermentação (caldo de fermentação) é esterilizada por aquecimento e então isentada da massa de células por centrifugação, filtração, ultrafiltração, ou decantação. Após adição de 50- 1 000 mg/kg, preferivelmente de 100- 200 mg/kg, de um floculante comercialmente convencional, com base na saída de fermentação, a suspensão é filtrada através de um leito curto de carbono ativado e areia para obter uma solução isenta de biomassa tendo um teor em ácido D- pantotênico elevado. Esta solução tratada é então tratada por nanofiltração. [000107] A subseqüente secagem desta solução pode ser realizada, por exemplo, por secagem por pulverização. Isto pode ser realizado em co-corrente, contra- corrente ou fluxo de corrente mista. Para atomização, todos os atomizadores conhecidos podem ser usados, particularmente atomizadores centrífugos (disco atomizador), bocal de fluido único ou bocal de dois fluídos. As condições de temperatura de secagem preferidas são 150- 250°C de temperatura de entrada da torre, e 70- 130°C temperatura de saída da torre. No entanto, a secagem também pode ser realizada em um nível de temperatura maior ou menor. Para obter umidade residual muito baixa, uma outra etapa de secagem no leito fluidizado pode ser provida a jusante. [000108] A secagem por pulverização também pode ser realizada em um secador FSD ou SBD (FSD secador de pulverização fluidizada, SBD - secador de leito de pulverização) como são construídos pela empresa Niro (Copenhagen, Dinamarca), e APV- Anhydro (Copenhagen, Dinamarca), que são uma combinação de secador de pulverização e leito fluidizado. [000109] Na secagem por pulverização, um auxiliar de fluxo pode ser adicionado. Como um resultado, os depósitos da parede do secador podem ser reduzidos e o comportamento de fluxo particularmente no caso de pós de grão fino, podem ser melhorados. Os auxiliares de fluxo que podem ser usados são, particularmente, silicatos, estearatos, fosfatos e amido de milho. [000110] Em princípio, secagem também pode ocorrer em um leito fluidizado com pulverização, neste caso este pode ser operado não somente continuamente mas também em batelada. A solução pode ser pulverizada em não apenas do topo (pulverização do topo) do fundo (pulverização do fundo) mas também do lado (pulverização lateral). [000111] A presente invenção ainda refere-se a uma composição para o uso como um aditivo de alimento para animal e/ou suplemento de alimento para animal, em que ela pode ser preparada por: a) usar pelo menos um organismo produtor de ácido D-pantotênico, o ácido D- pantotênico (pan) e/ou isoleucina/ valina (ilv) cuja biossíntese é desregulada e que forma pelo menos 2 g/1 de sais de ácido D-pantotênico por fermentação em um meio de cultura, com 0-20 g/1, preferivelmente 0 g/1, de β- alanina livre e/ou sal de β- alanina sendo alimentado para o meio de cultura, b) alimentar sais contendo cátions polivalentes para o D-pantotenato formado, sais polivalentes de ácido D- pantotênico sendo produzidos, c) tratar a solução de fermentação contendo D- pantotenato por nanofiltração, os sais polivalentes de ácido D- pantotênico sendo enriquecidos e d) submeter o retido da nanofiltração contendo sais polivalentes de ácido D- pantotênico à secagem e/ou formulação. [000112] Em uma variante da presente invenção, uma composição é composta, que pode ser preparada por, antes da nanofiltração na etapa c), realizar uma remoção de massa celular ou componentes precipitados na solução, preferivelmente por filtragem em membrana, particularmente preferivelmente por ultrafiltração, e muito particularmente preferivelmente por diafiltração. A presente invenção ainda refere-se a uma composição que pode ser preparada por alimentação de sais (em forma sólida ou como solução aquosa) contendo cátions polivalentes durante, ou após, a remoção de massa celular ou componentes precipitados na solução. De acordo com a invenção, estes sais, em uma outra variante, também podem ser supridos durante a nanofiltração. [000113] De acordo com a invenção, a composição é ainda distinta em que ela contém sais de ácido D- pantotênico, em uma concentração de pelo menos 1-100 % em peso, preferivelmente 20- 100 % em peso e particularmente preferivelmente pelo menos 50 % em peso. A presente invenção refere-se a uma composição que contém sais de ácido D- pantotênico na forma de cátions divalentes, preferivelmente D- pantotenato de cálcio, e/ou D- pantotenato de magnésio. De acordo com a invenção, preferência é dada a uma composição que é distinta em que o teor de sais de ácido D- pantotênico na forma de cátions monovalentes é de < 5 g/kg. [000114] De acordo com a invenção, devido ao processo acima mencionado, um D- pantotenato de cálcio ou D- pantotenato de magnésio é obtido que atende às exigências de um aditivo para alimento. Estas exigências [000118] A solução de sal traço tinha a seguinte composição: 0,15 g de NaMo04.2 H20, 2,5 g de H3B03,0,7 g de CoCl2 - 6 H20,0,25 g de CuS04.5 H20, 1,6 g de MnCl2.4 H20,0,3 g de ZnSC>4.7 H20 foram completados até 1 1 com água. A solução de sal traço foi adicionada através de filtração estéril. O volume liquido inicial foi de 5 1. Os teores listados acima são baseados neste valor. [000119] A esta solução foram adicionados 100 ml de cultura de inoculação (OD = 10) de Bacillus Subtilis PA668 e a cultura inoculada são, por exemplo, um teor relativamente elevado de D- pantotenato, e uma alta compatibilidade para o organismo de marcação, e também um valor biológico no sentido de "atividade de vitamina" do produto inventivo. [000115] A presente invenção é descrita em detalhes por exemplos abaixo, que não limitam a invenção, no entanto.

Exemplo 1 [000116] Em um fermentador de laboratório equipado com agitador e dispositivo de introdução de gás de capacidade de 14 1, meio de fermentação aquoso da seguinte composição é carregado: [000117] Após esterilização, os seguintes componentes de meio estéril foram adicionados em adição: fermentada a 43 °C com agitação vigorosa em uma taxa de fluxo de gas de 12 1/niin. Esta cepa é descrita de acordo com o pedido US no. de série 60/ 262. 995. [000120] No curso de 47 h, 2,1 1 de solução aquosa estéril foram adicionados. A composição foi [000121] Durante a fermentação, o pH foi mantido a 7,2 por adição solução amônia a 25% ou ácido fosfórico a 20%. Amônia simultaneamente atua como fonte de nitrogênio para a fermentação, A velocidade da rotação do elemento agitador foi controlada para manter o teor de oxigênio dissolvido a 30% do valor de saturação. Após terminar a adição da fonte de carbono, a fermentação foi continuada até o teor de oxigênio dissolvido (pCb) ter alcançado um valor de 95% do valor de saturação. À concentração de D-pantotenato no término após 48 h foi 22,8 g/1. [000122] Similarmente, os caldos de fermentação também podem ser produzidos que dão títulos de ácido pantotênico isentos de suprimento de β-alanina maiores que 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 e > 90 g/f Exemplo 2 [000123] 7.000 ml de produção de fermentação produzidos de acordo com o exemplo I foram submetidos a ultra- centrifugação, um módulo tubular de monocanais cerâmico (de Atech, Gladbeck, Alemanha) sendo usado. Neste caso, primeiro uma membrana lendo uma largura de poro de 20 kD (10 nm) e segundo uma membrana tendo uma largura de poro de 50 nm foram usados. [000124] A temperatura da experiência foi de 40 °C, a velocidade de super- fluxo de 4 m/s e a pressão da transmembrana (TMP = [ p(alimentação) + p (retido)J /2 - ρ (permeado), salvo indicado em contrário, foi de 1 bar. [000125] Na figura 1, os fluxos de t rans membrana (fluxos de permeado) foram traçados como uma função do fator de concentração MK (MK(t) = Ittaljmcniação^ OI relido (t)). [000126] Nota-se que a membrana tendo a menor largura de poro (20 kD) demonstra fluxos marcadamente maiores do que a membrana tendo a maior largura de poro (50 nm).

Exemplo 3 [000127] 7.000 ml de produção de fermentação produzidos de acordo com o exemplo 1 foram submetidos a ultra- filtração similar ao exemplo 2, a membrana usada tendo uma largura de poro de 20 kD. [000128] A figura 2 mostra a concentração usando produção de fermentação que já tinha sido centrifugada sendo marcadamente maior que no exemplo 2, Exemplo 4 [000129] 1.000 ml de uma solução aquosa contendo pantotenato de cálcio (de acordo com a tabela 3, alimentação de retido da coluna) foram colocados em uma célula de pressão de agitador tendo uma capacidade de operação máxima de aproximadamente 1,5 1. A pressão da "alimentação'' é gerada nesta célula por super- pressão de nitrogênio e o super- fluxo da membrana foi assegurado por agitação usando um agitador de âncora acionado por um acoplamento magnético. [000130] A membrana de nanofiltração DES AL 5 DK, obtida de Osmonics Deutschland GmbH em Moers, foi usada. [000131J Antes, durante e após as experiências com a solução acima mencionada, para testar a integridade da membrana, testes de rejeição com solução de MgSCb (2.000 ppm em peso) foram realizados. [000132] A taxa de rejeição Ri é lísada nas duas colunas à direita da tabela 3. Aqui, a taxa de rejeição é definida como : Rj = 1 - Q, permtW C, m\ikü onde Rj = taxa de rejeição para componente i, Cl permeado = concentração de componente i no permeado, Cj relbj0 = concentração de componente í no retido. [0001331 As concentrações significam as concentrações instantaneamente estabelecidas na experiência em estado não uniforme em um ponto de tempo definido, mas não a concentração nas frações resultantes após o final da experiência. A taxa de rejeição Ri, no caso ideal, é independente da concentração, que foi usada em uma base no cálculo dos valores registrados das concentrações nas frações. [000134] A partir da tabela 3, segue-se que Ca2+ e pantotenato tem taxas de rejeição de 84% e 99%, respectivamente, isto é, estão presentes no retido. Exemplo 5 [000135] No trabalho da solução aquosa de pantotenato de Na (0,2 mol/1) sob condições similares para exemplo 4, uma concentração por nanofiltração foi realizada, A tabela 4 mostra que a taxa de rejeição de pantotenato é de 80%.

Exemplo 6 [000136] Concentração de uma solução equimolar de NaCl/ CaCb sob condições similares para exemplo 4 é resumida na tabela 5. Aqui, pode-se notar que a taxa de rejeição de membrana para Ca2+ de 41% ou 42% é relação baixa comparada com a taxa de rejeição elevada de cálcio em combinação com pantotenato (exemplo 5).

Legenda para figuras e tabelas [000137] Figura 1: Apresentação gráfica de fluxos de t rans membrana (fluxos de permeado) de produção de fermentação durante ultra- filtração como uma função de fator de concentração MK usando membranas tendo largura de poro de 50 nm e 20 kD. [000138] Figura 2: Apresentação gráfica de fluxos de transmembrana (fluxos de permeado) de produção de fermentação centrifugada durante ultra-filtração como uma função de fator de concentração MK usando membrana tendo largura de poro de 20 kD. [000139] Tabela 1: Esboço de membranas assimetricamente estruturadas para separação de massa celular ou componentes precipitados em solução. [000140] Tabela 2 Esboço de membranas e suas propriedades para separação de massa celular ou componentes precipitados em solução.

[000141] Tabela 3 : Esboço de valores analíticos de nanofiltração, espeeialmente com relação à taxa de rejeição de íons cálcio e pantotenato, cm uma solução aquosa contendo 0,1 mol/kg de pantotenato de Ca e 0,2 mol/kg de NaCL [000142] Tabela 4 : Esboço de valores analíticos de nanofiltração, especial mente com relação à taxa de rejeição de íons cálcio e pantotenato, em uma solução aquosa contendo 0,2 mol/kg de pantotenato de Na e 0,1 mol/1 de CaCb, [000143] Tabela 5 - Esboço de valores analíticos de nanofiltração, especial mente com relação à taxa de rejeição de íons cálcio, em uma solução aquosa contendo quantidades equimolares de NaCI e CaCli.

Claims (19)

1. Processo para preparar ácido D- pantotênico e/ou sais do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) preparar um caldo de cultura contendo pelo menos um microorganismo cuja biossíntese de ácido D- pantotênico (pan) e/ou isoleucina/ valina (ilv) é desregulada para produzir pelo menos 2 g/l de saís de ácido D-pamotênico por fermentação em um meio de cultura contendo 0 - 20 g/l de β-alanina livre e/ou sal de β- alanina sendo alimentados para o meio de cultura, e b) adicionar ao caldo de cultura um sistema de tampão e sais comendo cátions poli vai entes, c) submeter o caldo obtido na etapa (b) à nanofiltração, e d) submeter o conteúdo retido na etapa (c) à secagem e/ou formulação*

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que β- alanina livre e/ou sal de β- alanina nào serem adicionados ao meio de cultura.

3. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o organismo produtor de ácido D- pantotênico usado é uma bactéria, levedura ou um fungo.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 3, caracterizado pelo fato de que o microorganismo usado é uma bactéria de família Bacillaceae.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações I- 4, caracterizado pelo fato de que uma bactéria do gênero Bacillus é usada, e preferivelmente da espécie B. subtilis, B. licheniformis ou B. amy I ol iquefac iens.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 5, caracterizado pelo fato de que, na etapa a), um teor de ácido D- pantotênico e/ou sais do mesmo de, pelo menos, 10 g/l de meio de cultura. preferivelmente pelo menos 20 g/1, particularmente preferivelmente pelo menos 40 g/1, e muito preferivelmente pelo menos 60 g/1, de meio de cultura, são formados.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações Ιό, caracterizado pelo fato de que a massa de células ou componentes precipitados na solução é/ são separado(s) antes da nanofiltração na etapa c).

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a separação é realizada por decantação ou filtração em membrana, preferivelmente ultrafiltração.

9. Processo de acordo com uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a filtração em membrana é realizada como diafiltração.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que os sais contendo cátions polivalentes são adicionados em forma sólida ou solução aquosa durante, preferivelmente no final, ou após, a fermentação na etapa a), durante, ou após, uma filtração em membrana de uma solução contendo D- pantotenato.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de que os sais contendo cátions polivalentes são adicionados em forma sólida ou solução aquosa durante uma nanofiltração.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado pelo fato de que uma solução aquosa contendo cátions polivalentes é alimentada continuamente.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 12, caracterizado pelo fato de que os cátions polivalentes são adicionados como cloreto de cálcio e/ou magnésio, nitrato, hidróxido, formiato, acetato, propionato, glicinato e/ou lactato.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 13, caracterizado pelo fato de que o cátion polivalente alimentado é Ca2+ em uma concentração de 0,05- 50 mol de Ca2+/mol de D- pantotenato, preferivelmente 0,2- 2 mol de Ca2+/mol de D- pantotenato.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 14, caracterizado pelo fato de que, na nanofiltração na etapa c), uma diferença de pressão através da membrana na faixa de 5- 100 bar, preferivelmente 20- 80 bar, e particularmente preferivelmente 40- 70 bar, é acumulada.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizado pelo fato de que a nanofiltração na etapa c) reduz o teor de cátions monovalentes, preferivelmente íons amônio, potássio e/ou sódio, para uma concentração de < 5 g/kg de solução.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizado pelo fato de que o permeado da etapa c) ou uma parte do mesmo é recirculado para a fermentação na etapa a).

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 17, caracterizado pelo fato de que o permeado ou partes do mesmo é recirculado continuamente.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado pelo fato de que o retido da etapa c) é uma suspensão contendo sais polivalentes de ácido D- pantotênico.