BRPI0208896B1 - vacina contra o vírus da febre do nilo - Google Patents

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Abstract

"vacina contra o vírus da febre do nilo". a invenção refere-se aos vetores de expressão in vivo e in vitro compreendendo um polinucleotídeo codificando para a proteína estrutural b do vírus da febre do nilo ou vírus wn, eventualmente associado a um polinucleotídeo codificando para a proteína de pré-membrana prm e/ou para a proteína de membrana m, notadamente sob a forma codificando para prm-m-e. vacinas vivas incorporam esses vetores de expressão in vivo. os vetores de expressão in vitro são utilizados para produzir as proteínas in vitro que poderão em seguida ser utilizadas em vacinas de subunidades. a invenção refere-se também as vacinas multivalentes compreendendo um componente de vacina contra o vírus wn e um componente de vacina contra um outro agente patógeno. a invenção visa, em particular, os eqüinos, os caninos, os felinos, os bovinos, os suínos e os pássaros.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINA CONTRA O VÍRUS DA FEBRE DO NILO". A presente invenção refere-se a vetores de expressão in vivo e in vitro compreendendo e expressando pelo menos um polinucleotídeo do vírus da febre do Nilo, assim como composições ímunógenas e vacinas contra a febre do Nilo. A mesma tem ainda por objeto métodos de imunização e de vacinação contra esse vírus. O vírus da febre do Nilo (West Nile Virus ou WNV) foi identificado pela primeira vez em 1937, no homem em Uganda na província de West Nile (Zeller H.G., Med. Trop., 1999, 59, 490-494).
Amplamente difundido na África, e também encontrado na índia, no Paquistão e na bacia do Mediterrâneo, foi identificado nos USA pela primeira vez na cidade de Nova Iorque em 1999 (Anderson J.F. et al. Science, 1999, 286, 2331-2333). O vírus da febre do Nilo atinge tanto os pássaros, quanto os mamíferos e o homem. A doença se caracteriza nos pássaros por um ataque do sistema nervoso central e pela morte. As lesões incluem encefalites, hemorragias no miocárdio e hemorragias e necroses no trato intestinal.
Nos frangos, infecções experimentais por inoculações subcutâ-neas de vírus da febre do Nilo, isolados em gralhas, acarretaram necroses do miocárdio, nefrites e pneumonias de 5 a 10 dias, após inoculação, encefalites moderadas a rigorosas, 21 dias após inoculação (Senne D.A. et al. Avian Disease, 2000, 44, 642-649). O vírus da febre do Nilo atingiu também os cavalos, notada-mente na África do Norte e na Europa (Cantile C. et al., Equine Vet. J., 2000, 32(1), 31-35). Esses cavalos mostraram sinais de ataxia, de fraqueza dos membros posteriores, de paresia, evoluindo para uma tetraplegia e a morte. Os cavalos e os camelos são os principais animais que manifestaram sinais clínicos sob a forma de encefalites.
Anticorpos anti-WNV foram detectados em certos roedores, no gado, notadamente nos bovinos e ovinos, nos animais domésticos, notada- mente no cão (Zeller H.G., Med, Trop,, 1999, 59, 490-494; Lundstrom J.O., Journal of Vector Ecology, 1999, 24(1), 1-39). A espécie humana não foi poupada pelo vírus da febre do Nilo, com numerosos sintomas (Sampson B.A., Human Pathology, 2000, 31(5), 527-531; Marra C.M., Seminars in Neurology, 2000, 20(3), 323-327). O vírus da febre do Nilo é transmitido aos pássaros e aos mamíferos por picadas de certos mosquitos (por exemplo Culex, Aedes, Ano-pheles) e carrapatos.
Os pássaros selvagens e domésticos são um reservatório para o vírus da febre do Nilo e um vetor de propagação por suas migrações.
Os vírions do vírus da febre do Nilo são partículas esféricas de 50 nm de diâmetro constituídas de um envoltório lipoprotéico envolvendo uma nucleocapsida icosahédrica, contendo um filamento de RNA simples de polaridade positiva.
Um único quadro aberto de leitura (COL) codifica para o conjunto das proteínas virais sob a forma de uma poliproteína. A clivagem e a maturação dessa poliproteína levam à produção de uma dezena de proteínas virais diferentes. As proteínas estruturais são codificadas pela parte 5' do genoma e correspondem à nucleocapsida nomeada C (14 kDa), à glico-proteína de envoltório nomeada E (50 kDa), à proteína de pré-membrana nomeada prM (23 kDa), à proteína de membrana nomeada M (7 kDa). As proteínas não estruturais são codificadas pela parte 3' do genoma e correspondem às proteínas NS1 (40 KDa), NS2A (19 kDa), NS2B (14kDa), NS3 (74 kDa), NS4A (15 kDa), NS4B (29kDa), NS5 (97 kDa).
Parrish C. R. et al. (J. Gen. Virol., 1991, 72, 1645-1653), Kulkarni A.B. et al. (J. Virol., 1992, 66(6), 3583-3592) e Hiil A. B. et al. (J. Gen. Virol., 1992, 73, 1115-1123) construíram, a partir do vírus da vacina, vetores de expressão in vivo contendo diversos enxertos correspondentes a seqüências nucleotídicas codificando para proteínas não estruturais do vírus Kunjin eventualmente associadas a proteínas estruturais. Esses vetores foram administrados no rato para avaliar a resposta imunitária celular. Os autores insistem na importância da resposta celular, resposta que é essencialmente estimulada pelas proteínas não estruturais e, em particular, por NS3, NS4A e NS4B. Esses artigos fazem sobressair a dificuldade de colocar em evidência qual seria uma boa estratégia de vacinação contra a febre do Nilo.
Até hoje, não há vacina para prevenir a infecção pelo vírus WN. A presente invenção tem por objetivo propor um meio de prevenção e/ou de luta contra as doenças causadas pelo vírus WN.
Um outro objetivo da invenção é de propor esse meio que possa ser empregado nas diferentes espécies animais sensíveis à doença causada por esse vírus e, em particular, nas espécies equinas e aviárias.
Um outro objetivo ainda da invenção é de propor métodos de imunização e de vacinação das espécies alvos.
Um outro objetivo da invenção é de propor esses meios e métodos que permitem assegurar um diagnóstico diferencial.
Assim, a invenção tem por primeiro objeto os vetores de expressão in vitro e/ou in vivo, compreendendo um poiinucleotídeo codificando para a proteína de envoltório E do vírus WN. Esses vetores compreendem, além disso, elementos necessários à expressão do poiinucleotídeo na célula hospedeira.
Além do poiinucleotídeo codificando para E, os vetores de expressão, de acordo com a invenção, podem compreender um ou vários outros polinucleotídeos codificando para outras proteínas do vírus WN, de preferência das proteínas estruturais do vírus WN, essas sequências sendo, de preferência, escolhidas dentre aquelas codificando para a proteína de pré-membrana prM e para a proteína de membrana M. O vetor compreende, de preferência, um poiinucleotídeo formando uma só fase codificante correspondente, por exemplo, à prM-E, M-E e mais particularmente à prM-M-E. Um vetor compreendendo vários polinucleotídeos separados codificando para as diferentes proteínas (por exemplo prM e/ou M e E) entra também no quadro da presente invenção. O vetor, em particular, in vivo, pode também compreender polinucleotídeos correspondentes a mais de uma cepa de vírus WN, em particular dois ou mais polinucleotídeos codificando para E ou para prM-M-E de cepas diferentes. Con- forme será visto depois, o vetor, em particular in vivo, pode também compreender uma ou seqüências nucleotfdicas codificando para imunógenos de outros agentes patógenos e/ou para citocinas.
De acordo com um modo de realização preferido da invenção, o vetor de expressão compreende um polinucleotídeo codificando para prM-M-E e isto, de preferência, em uma única fase de leitura.
Por polinucleotídeo codificando para uma proteína do vírus WN, entende-se princípalmente um fragmento de DNA que codifica para essa proteína, ou o filamento complementar desse fragmento de DNA. Um RNA não está excluído.
No sentido da invenção, o termo proteína engloba os fragmentos, aí incluídos peptídeos e polipeptídeos. Por definição, o fragmento de proteína é imunologicamente ativo no sentido de, uma vez administrado no hospedeiro, ser capaz de desencadear uma resposta imunitária de tipo hu-morai e/ou celular dirigida contra a proteína. De preferência, o fragmento de proteína é tal que o mesmo possui substancialmente a mesma atividade imunológica que toda a proteína. Um fragmento de proteína, de acordo com a invenção, compreende, portanto, pelo menos um epitopo ou determinante antigênico. O termo epitopo se refere a um local da proteína capaz de induzir uma reação imunitária de tipo humoral (células B) e/ou de tipo celular (cé-luals T). A estrutura mínima do polinucleotídeo é, portanto, aquela que codifica para um epitopo ou determinante antigênico da proteína considerada. Um polinucleotídeo codificando para um fragmento da proteína total compreende notadamente no mínimo 21 nucleotídeos, notadamente pelo menos 42 nucleotídeos e, de preferência, pelo menos 57, 87 ou 150 nucleotídeos consecutivos da sequência da qual o mesmo é oriundo. As técnicas de determinação dos epitopos são bem conhecidas do técnico, podem-se notadamente utilizar os bancos de peptídeos imbricados (Hemmer B. et al., Immunology today, 1998, 19(4), 163-168), Pepscan (Geysen Η. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1984, 81(13), 3998-4002; Geysen Η. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1985, 82(1), 178-182; Van der Zee R. et al., Eur. J. Immunoí., 1989, 19{1), 43-47; Geysen Η. M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21(4), 523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron), les algorithmes (De Groot A. Et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561).
Em particular, os polinucleotídeos, de acordo com a invenção, compreendem a sequência nucleotídica codificando para um ou os dois domínios transmembranários, de preferência os dois, situados na parte C terminal da proteína E. Para a cepa WNV NY99, esses domínios correspondem às sequências em aminoácidos 742 a 766 e 770 a 791 de GenBank AF196835.
Elementos necessários à expressão do(s) polinucieotídeo(s) estão presentes. Trata-se no mínimo de um códon de iniciação (ATG), de um códon terminal e de um promotor, assim como uma seqüência de polia-deniíação para os plasmídeos e os vetores virais diferentes do poxvirus. Quando o polinucleotídeo codifica para um fragmento da poliproteína, por exemplo prM-E, M-E, prM-M-E, um ATG é colocado em 5' da fase de leitura e um códon terminal é colocado em 3'. Conforme será explicado mais adiante, outros elementos, permitindo o controle da expressão, poderão estar presentes, tais como as seqüências ativadoras melhorador, seqüências es-tabilizadoras, seqüências sinal, permitindo a secreção da proteína. A presente invenção tem também por objeto preparados compreendendo esses vetores de expressão. Mais particularmente, a mesma se refere às preparações que compreendem um ou vários vetores de expressão in vivo, compreendendo e expressando um ou vários dos polinucleotídeos acima, dos quais aquele que codifica para E, em um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
De acordo com uma modalidade da invenção, o(s) outro(s) vetores) na preparação compreendem ou expressam uma ou várias outras proteína(s) do vírus WN, por exemplo, prM, M, prM-M.
De acordo com uma outra modalidade, o(s) outro(s) vetor(es) na preparação compreende(m) ou expressa(m) uma ou várias outras proteí-na(s) de uma ou várias outras cepas de vírus WN. Notadamente, a prepara- ção compreende pelo menos dois vetores que expressam, em particular in vivo, polinucleotídeos de cepas WN diferentes, codificando para as mesmas proteínas e/ou para proteínas diferentes, de preferência para as mesmas proteínas. Trata-se de preferência de vetores que expressam in vivo E ou pr-M-M-E de duas, três ou mais cepas WN diferentes. A presente invenção visa também as misturas de vetores que expressam prM, Μ, E, prM-M, prM-E ou M-E de cepas diferentes.
De acordo com uma outra modalidaae ainda, e conforme será visto mais detalhadamente depois, o(s) outro(s) vetor(es) na preparação compreende(m) e expressa(m) uma ou várias citocina(s) e/ou um ou vários imunógenos de um ou vários outros agentes patógenos. A invenção visa também as diversas combinações dessas diferentes modalidades.
As preparações que compreendem um vetor de expressão in vitro ou in vivo que compreendem e expressam um polinucleotídeo codificando para prM-M-E constituem um modo de realização preferido da invenção.
De acordo com um modo de realização particular da invenção, os vetores de expressão in vivo ou in vitro compreendem, como único(s) po-linucleotídeo(s) do vírus WN, um polinucleotídeo codificando para a proteína E, eventualmente associado à prM e/ou M, de preferência codificando para prM-M-E, e eventualmente uma sequência sinal do vírus WN.
De acordo com um modo de realização particular, uma ou várias das proteínas não estruturais NS2A, NS2B e NS3 são expressas conjuntamente às proteínas estruturais, de acordo com a invenção, seja via o mesmo vetor de expressão, seja via um vetor de expressão próprio. As mesmas são, de preferência, expressas juntas a partir de um polinucleotídeo único. A invenção tem, portanto, também por objeto um vetor de expressão, in vivo ou in vitro, compreendendo o polinucleotídeo codificando para NS2A, NS2B, NS3, suas combinações, e, de preferência, para NS2A-NS2B-NS3. Na base, esse vetor pode ser um dos vetores descritos acima, compreendendo um polinucleotídeo codificando para uma proteína estrutural ou proteínas estruturais, notadamente E ou prM-M-E. Como variante, a invenção refere-se a um preparado tal como descrito acima, comportando, além disso, pelo menos um desses vetores que expressam uma proteína não estrutural e eventualmente um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Para realizar os vetores de expressão, de acordo com a invenção, o técnico dispõe de diferentes cepas do vírus WN e da descrição da seqüência nucleotídica de seu genoma. Ver notadamente Savage Η. M. et al. (Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999, 61 (4), 600-611), tabela 2, que menciona 24 cepas de vírus WN e dá as referências de acesso a sequências polinu-cleotídicas em GenBank.
Pode-se, por exemplo, se referir à cepa NY99 (GenBank AF196835). Em GenBank, é precisado para cada proteína a seqüência de DNA correspondente (nucleotídeos 466-741 para prM, 742-966 para M, 967-2469 para E, seja 466-2469 para prM-M-E, 3526-4218 para NS2A, 4219-4611 para NS2B e 4612-6468 para NS3, seja 3526-6468 para NS2A-NS2B-NS3). Por comparação e alinhamento de seqüências, a determinação de um polinucleotídeo codificando para essa proteína em uma outra cepa de WNV é imediata.
Foi indicado mais acima que, por polinucleotídeo, se entendia a seqüência codificando para a proteína ou um fragmento ou um epitopo, específica do vírus WN. Além disso, por equivalência, o termo polinucleotídeo engloba, também, as seqüências nucleotídicas correspondentes das diferentes cepas de vírus WN e as seqüências nucleotídicas que diferem pela degenerescência do código.
No meio da família dos vírus WN, a identidade entre seqüências em aminoácidos prM-M-E em relação àquela de NY99 é igual ou superior a 90 %. Estão, portanto, compreendidas na invenção os polinucleotídeos codificando para uma seqüência de aminoácidos cuja identidade com a seqüência em aminoácidos nativa é superior ou igual a 90 %, notadamente a 92 %, de preferência a 95 %, e mais particularmente ainda 98 %. Serão também consideradas como equivalentes os fragmentos desses polinucleotídeos homólogos, que são específicos dos vírus WN.
Assim, caso" se fale de um polinucleotídeo do vírus WN, esse termo engloba as sequências equivalentes no sentido da invenção.
Viu-se também que o termo proteína engloba os polipeptídeos e peptídeos imunologicamente ativos. Pelas necessidades da invenção, isto engloba: a) as proteínas correspondentes das diferentes cepas de vírus WN; b) as proteínas que daí diferem, mas que conservam com uma proteína nativa WN uma identidade superior ou igual a 90 %, notadamente a 92 %, de preferência a 95 %, e mais particularmente ainda 98 %.
Assim, caso se fale de uma proteína do vírus WN, esse termo engloba as proteínas equivalentes no sentido da invenção.
Diferentes cepas de vírus WN são acessíveis junto a coleções, notadamente junto a American Typo Culture Collection (ATCC), por exemplo sob os números de acesso VR-82 ou VR-1267. O vírus denominado Kunjin é considerado como sendo na realidade um vírus WN.
De acordo com a invenção, prefere-se que o polinucleotídeo compreenda, além disso, uma sequência nucleotídica codificando para um peptídeo sinal, situado a montante da proteína expressa para assegurar-lhe a secreção. Pode, portanto, tratar-se de uma seqüência endógena, isto é, da seqüência sinal natural, quando a mesma existe (proveniente do mesmo vírus WN ou de uma outra cepa). Por exemplo, para o vírus WN NY99, a seqüência sinal endógeno de E corresponde aos nucleotídeos 922 a 966 seqüência GenBank; para prM, trata-se dos nucleotídeos 421 a 465. Pode também tratar-se de uma seqüência nucleotídica codificando para um peptídeo sinal heterólogo, notadamente aquela codificando para o peptídeo sinal do ativador tissular do plasminógeno humano (tPA) (Hartikka J. et al., Hu-man Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217). A seqüência nucleotídica codificando para o peptídeo sinal é inserida em fase e a montante da seqüência codificando para E ou suas combinações, por exemplo prM-M-E.
De acordo com uma primeira modalidade da invenção, os veto- res de expressão in vivo são vetores virais.
Esses vetores de expressão são vantajosamente poxvirus, por exemplo o vírus da vacina ou dos mutantes atenuados do vírus da vacina, por exemplo, o MVA (cepa Ankara) (Stickl H,. e Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter G, et aí., Proc. Natl. Acad, Sei. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851; cepa comercial ATCC VR-1508; MVA é obtida após mais de 570 passagens da cepa vacina Ankara sobre fibroblastos de embriões de frango) ou o NYVAC (sua construção é descrita em US-A-5 494 807, notadamente nos exemplos 1 a 6; essa patente descreve também a inserção de genes heterólogos nos locais desse recombinante e a utilização de promotores adaptados; se reportar igualmente a WO-A-96/40241), os avipox (em particular canarypox, fowlpox, pigeonpox, quailpox), o swinepox, o racoonpox e o camelpox, adenovirus, tais como os adenovirus aviários, caninos, suínos, bovinos, humanos e vírus do herpes, tais como o vírus do herpes equinos (EHV sorotipos 1 e 4), o vírus do herpes canino (CHV), o vírus do herpes felino (FHV), os vírus do herpes bovinos (BHV sorotipos 1 e 4), o vírus do herpes suíno (PRV), os vírus do Mal de Marek (MDV sorotipos 1 e 2), o vírus do herpes da perua (HVT ou MDV so-rotipo 3), o vírus do herpes do pato. Quando um vírus do herpes é utilizado, para a vacinação da espécie aviária o vetor HVT é preferido, e, para a vacinação dos cavalos, prefere-se o vetor EHV.
De acordo com um dos modos preferidos da invenção, o vetor de expressão poxvirus é um canarypox ou um fowlpox, esses poxvirus podendo ser eventualmente atenuados. Podem-se citar o canarypox comercialmente disponível junto à ATCC sob o número de acesso VR-111, Canarypox atenuados foram descritos em US-A-5.756.103 e no WO-A-01/05934. Numerosas cepas vacinais de vírus fowlpox são acessíveis, por exemplo a vacina DIFTOSEC CT® comercializada por MERIAL e a vacina NOBILIS ® VARIOLE comercializada por Intervet.
Para os poxvirus, o técnico pode se reportar ao WO-A-90/12882, e mais particularmente para o vírus da vacina a US-A-4.769.330; US-A-4.722.848; US-A-4.603.112; US-A-5.110.587; US-A-5.494.807; US-A- 5.762.938; para o fowlpox a US-A-5.174.993; US-A-5.505.941; US- 5.766.599; para o canarypox a US-A-5.756.103; para o swinepox a US-A-5.382.425; para o raccoonpox ao WO-A-00/03030.
Quando o vetor de expressão é um vírus da vacina, os locais de inserção do(s) polinucleotídeo(s) a expressar são, em particular, o gene da timidina quinase (TK), o gene da hemaglutinina (HA), a região do corpo de inclusão de tipo A (ATI). Quando se trata de um canarypox, os locais de inserção ficam, em particular, situados nos, ou são constituídos pelos, COLs C3, C5 e C6. Quando se trata de um fowlpox, os locais de inserção ficam, em particular, situados nos, ou são constituídos pelos, COLs F7 e F8. A inserção de genes no vírus MVA é descrita em diversas publicações das quais Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15(4), 387-394; Stitte-laar K.J. et al., J. Virol., 2000, 74(9), 4236-4243; Sutter G. et al., Vaccine, 1994, 12(11), 1032-1040, aos quais o técnico pode se referir. O genoma completo de MVA é descrito em Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396, o que permite ao técnico utilizar outros locais de inserção ou outros promotores.
De preferência, quando o vetor de expressão é um poxvirus, o polinucieotídeo a expressar é inserido sob o controle de um promotor específico dos poxvirus, notadamente o promotor vacina 7,5 kDa (Cochran et al. J. Virology, 1985, 54, 30-35), o promotor vacina I3L (Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), o promotor vacina HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), o promotor cowpox ATI (Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47) ou ainda o promotor vacina H6 (Taylor J. et al. Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al., J.Virol., 1989, 63, 3829-3836).
De preferência, para a vacinação dos mamíferos, o vetor de expressão é um canarypox. De preferência, para a vacinação dos aviários, em particular dos frangos, dos patos, dos perus e dos gansos, o vetor de expressão é um canarypox ou um fowlpox.
Quando o vetor de expressão é um vírus do herpes HVT, locais de inserção apropriados ficam em particular no fragmento BAMHII ou no fragmento BamHI M de HVT. O fragmento de restrição de BamHil de HVT compreende vários quadros abertos de leitura (COLs) e três regiões intergê-nicas e compreende várias zonas preferidas de inserção, a saber as três regiões intergênicas 1, 2 e 3, que são as regiões preferidas, e o COL UL55 (FR-A-2 728 795, US-A-5 980 906). O fragmento de restrição BamHI M de HVT compreende o COL UL43 que é também um local preferido de inserção (FR-A-2 728 794, US-A-5 733 554).
Quando o vetor de expressão é um vírus herpes EHV-1 ou EHV-4, locais de inserção apropriados são, em particular, TK, UL43 e UL45 (EP-A-0668355).
De preferência, quando o vetor de expressão é um vírus do herpes, o polínucleotídeo a expressar é inserido sob o controle de um promotor eucariote forte, de preferência o promotor CMV-IE. Esses promotores fortes são descritos a seguir na parte da descrição relativa aos plasmídeos.
De acordo com uma segunda modalidade da invenção, os vetores de expressão in vivo são vetores pfasmídicos denominados plasmídeo. O termo plasmídeo é entendido como para recobrir qualquer unidade de transcrição DNA sob a forma de uma seqüência polinucleotídica, compreendendo um polínucleotídeo, de acordo com a invenção, e os elementos necessários a sua expressão in vivo. Prefere-se a forma plasmídea circular, superenrolada ou não. A forma linear entra igualmente no âmbito dessa invenção.
Cada plasmídeo compreende um promotor apto a assegurar, nas células hospedeiras, a expressão do polínucleotídeo inserido sob sua dependência. Trata-se em geral de um promotor eucariote forte. O promotor eucariote muito preferido é o promotor precoce do citomegalovírus (CMV-IE), de origem humana ou murina, ou ainda eventualmente de uma outra origem tal como rato, cobaia. O promotor CMV-IE pode compreender a parte promotora propriamente dita, associada ou não à parte ativadora (melhorador). Pode-se referir à EP-A-260 148, EP-A-323 597, US-A-5 168 062, US-A-5 385 839, US-A-4 968 615, WO-A-87/03905. Prefere-se o CMV-IE humano (Boshart M. et al„ Cell., 1985, 41,521-530) ou rato.
De maneira mais geral, o promotor é seja de origem viral, seja de origem celular. Como promotor viral forte, diferente de CMV-IE, pode-se citar o promotor precoce/tardio do vírus SV40 ou o promotor LTR do vírus do Sarcoma de Rous. Como promotor celular forte, podem-se citar o promotor de um gene do citoesqueleto, tal como, por exemplo o promotor da desmina (Kwissa M.( et ai., Vaccine, 2000, 18 (22) 2337-2344) ou ainda o promotor da actina (Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79(2), 269-277).
Por equivalência, os subfragmentos aesses promotores, conservando uma atividade promotora adequada estão compreendidos na presente invenção, por exemplo, os promotores CMV-IE truncados segundo WO-A-98/00166. A noção de promotor, de acordo com a invenção, inclui, portanto, os derivados e subfragmentos, conservando uma atividade promotora adequada, de preferência substancialmente similar àquela do promotor propriamente dito, das quais são oriundos. Para o CMV-IE, essa noção compreende a parte promotora propriamente dita e/ou a parte ativadora e os derivados e subfragmentos.
De preferência, os plasmídeos compreendem outros elementos de controle da expressão. Em particular, é vantajoso incorporar seqüências estabiiizadoras do tipo intron, de preferência intron II do gene da β-globina de coelho (van Ooyen et al., Science, 1979, 206: 337-344).
Como sinal de poliadenilação (poliA) para os plasmídeos e os vetores virais diferentes do poxvirus, podem-se utilizar notadamente aquele do gene do hormônio de crescimento bovino (bGH) (US-A-5 122 458), aquele do gene da β-globina do coelho ou aquele do vírus SV40.
Os outros elementos de controle da expressão utilizáveis em plasmídeos podem igualmente sê-lo em vetores de expressão vírus do her-pes.
De acordo com uma outra modalidade da invenção, os vetores de expressão são vetores de expressão utilizados para expressar in vitro as proteínas em um sistema celular apropriado. As proteínas podem ser em seguida coletadas no que flutua de cultura, após secreção ou não (se não houver secreção, proceder-se-á a uma lise celular), eventualmente concen- tradas por técnicas clássicas de concentração, notadamente por ultrafiltra-gem e/ou purificadas por meios de purificação clássicos, notadamente as técnicas de cromatografia de tipo afinidade, troca de íon, ou gel-filtragem. A produção é efetuada por transfecção de células de mamífero por plasmídeo, por réplica de vetores virais sobre células de mamíferos ou células aviárias, ou por réplica de Baculovirus (US-A-4 745 051; Vialard J. et al., J. Virol. 1990, 64(1), 37-50; Verne A„ Virology, 1988, 167, 56-71), por exemplo Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV, sobre células de insetos (por exemplo, células Sf9 Spodoptera frigiperda, depósito ATCC CRL 1711). Como células de mamíferos, podem-se utilizar notadamente células de hamster (por exemplo CHO ou BHK-21), células de macaco (por exemplo COS ou VERO). A invenção abrange, portanto, igualmente esses vetores de expressão, incorporando um polinucleotídeo, de acordo com a invenção, as proteínas de WN ou fragmentos assim produzidos e as preparações que os contêm. A presente invenção tem, portanto, também por objeto as preparação purificadas e/ou concentrados de proteínas WN. Quando o polinucleotídeo codifica para várias proteínas, estas são clivadas, e as preparações acima contêm então proteínas clivadas. A invenção tem igual mente por objeto as composições imunóge-nas e as vacinas contra o vírus WN, compreendendo pelo menos um vetor de expressão in vivo, de acordo com a invenção, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável e eventualmente um adjuvante. A noção de composição imunógena abrange qualquer composição capaz de, uma vez administrada na espécie alvo, induzir uma resposta imunitária dirigida contra o vírus WN. Por vacina, entende-se uma composição capaz de induzir uma proteção eficaz. As espécies alvos são os equinos, os caninos, os felinos, os bovinos, os suínos, os pássaros, de preferência o cavalo, o cão, o gato, o porco, e para os pássaros, os gansos, as peruas, os frangos, os patos, o que, por definição, engloba os animais reprodutores, as poedeiras, os animais que fornecem carne.
Os veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são perfeitamente conhecidos do técnico. A título de exemplo, pode tratar-se de solução salina NaCI a 0,9 % ou de tampão fosfato. Os veículos ou excipien-tes farmaceuticamente aceitáveis englobam também qualquer composto ou combinação de compostos, permitindo facilitar a administração do vetor, notadamente da transfecção, e/ou a melhoria da conservação.
As doses e os volumes de dose são definidos mais adiante no âmbito da descrição geral dos métodos de imunização e de vacinação.
As composições imunógenas e as vacinas, de acordo com a invenção, compreendem, de preferência um ou vários adjuvantes, escolhidos notadamente dentre os adjuvantes usuais. São particularmente convenientes no âmbito da presente invenção: (1) polímeros do ácido acrílico ou metacríü-co, polímeros de anidrido maléico e de derivado alcenila, (2) sequências imunoestimuladoras (ISS), notadamente seqüências oligodesóxi-ribonu-cleotídicas tendo um ou vários motivos CpG não metilados (Klinman D.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, 93, 2879-2883; WO-A1-98/16247), (3) uma emulsão óleo-em-água, em particular a emulsão SPT descrita na página 147 de Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, editado por M. Poweli, M. Newman, Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 da mesma obra, (4) lipídeos catiônicos contendo um sal de amô-nio quaternário, (5) citocinas, ou (6) suas combinações ou misturas. A emulsão óleo-em-água (3), que é particularmente adaptada para os vetores virais, pode notadamente ser à base: - de óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopéia Européia); - de óleo isoprenóide tal como a escalana, o escaleno; - de óleo resultante da oligomerização de alcenos, em particular de isobuteno ou de deceno; - de ésteres de ácidos ou de álcoois com grupamento alquila linear; - mais particularmente óleos vegetais, oleato de etila, di(caprilato /caprato) de propiíeno glicol, tri(caprilato / caprato) de glicerol, dioleato de propileno glicol; - de ésteres de ácidos ou de alcoóis graxos ramificados, em par- ticular ésteres do ácido isosteãrico. O óleo é utilizado em associação com emulsionantes para formar a emulsão. Os emulsionantes são, de preferência, tensoativos não-iônicos, em particular: - os ésteres, por um lado, de sorbitano, manida (por exemplo, oleato de anidromanitol), de glicerol, de poliglicerol, ou de propileno glicol e, por outro lado, de ácido oléico, isosteárico, ricinoléico, hidroxiesteárico, esses ésteres sendo eventualmente etoxilados; - os blocos copolímeros polioxipropileno-polioxietileno, em particular os Pluronic ®, notadamente L121.
Dentre os polímeros adjuvantes de tipo (1), preferem-se os polímeros do ácido acrílico ou metacrílico reticulados, notadamente reticulados por éteres polialcenílicos de açúcares ou de poliálcoois. Esses compostos são conhecidos pelo termos carbômero (Pharmeuropa vol. 8 N° 2, junho de 1996). O técnico pode também se referir a US-A-2 909 462 que descreve esses polímeros acrílicos reticulados por um composto poli-hidroxilado tendo pelo menos 3 grupos hidroxila, de preferência não mais de 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxílas sendo substituídos por radicais ali-fáticos insaturados tendo pelo menos 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles que contêm de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem conter outros substituintes, tais como metila. Os produtos vendidos sob a denominação Carbopol ® (BF Goodrich, Ohio, USA) são particularmente apropriados. São notadamente reticulados por uma alil saca-rose ou pelo alilpentaeritritol. Dentre eles, podem-se citar em particular os Carbopol® 974P, 934P e 971P.
Dentre os copolímeros de anidrido maléico e de derivado alce-nila, preferem-se os EMA® (Monsanto) que são copolímeros de anidrido maléico e de etileno, lineares ou reticulados, por exemplo reticulados por diviniléter. Pode-se referira J. Fields et al., Nature, 186: 778-780, 4 de junho de 1960.
No plano de sua estrutura, os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os Ema® sao formados de preferência de motivos de base da seguinte fórmula: na qual: - Ri e R2, idênticos ou diferentes, representam H ou CH3; - x = 0 ou 1, de preferência x = 1 - y = 1 ou 2, com x + y = 2 Para os Ema ®,x = 0ey = 2. Para os carbômeros, x = y = 1.
Esses polímeros são dissolvidos na água ou na água fisiológica . (NaCI a 20 g/l) e o pH é ajustado a 7,3-7,4 pela soda, para dar a solução adjuvante na qual os vetores de expressão serão incorporados. A concentração em polímero na composição vacinai final pode notadamente ir de 0,01 % a 1,5 % PA/, mais particularmente de 0,05 a 1 % P/V, de preferência de 0,1 a 0,4 % P/V.
Os lipídeos catiônícos (4) contendo um sal de amônio quaternário, que são particularmente, mas não exclusivamente adaptados para os plasmídeos, são, de preferência, aqueles que respondem à seguinte fórmula: na qual Rn é um radical alifático linear, saturado ou insaturado, tendo de 12 a 18 átomos de carbono, R2 é um outro radical alifático, contendo 2 ou 3 átomos de carbono, e X um grupamento hidroxila ou amina.
Dentre esses lipídeos catiônicos, prefere-se o DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradecilóxi)-1-propanamônio; WO-A- 96/34109), de preferência associado com um lipídeo neutro, de preferência o DOPE (dioleoilfosfatidil-etanolamina; Behr J.P., 1994, Bioconjugate Chemis-try, 5, 382-389), para formar o DMRIE-DOPE.
De preferência, a mistura plasmídeo com esse adjuvante é feita de maneira extemporânea e se prefere, antes de sua administração, deixar o tempo na mistura assim constituída se compiexar, por exemplo, durante um período de 10 a 60 minutos, notadamente da ordem de 30 minutos.
Quando o DOPE está presente, a razão molar DMRIE : DOPE vai de preferência de 95: 5 a 5: 95, mais particularmente de 1 : 1. A razão ponderai plasmídeo: adjuvante DMRIE ou DMRIE-DOPE pode ir notadamente de 50 : 1 a 1 : 10, em particular de 10 : 1 a 1 : 5, e, de preferência, de 1 : 1 a 1 : 2. A(s) citocina(s) (5) podem ser fomecida(s) sob a forma de proteína à composição ou vacina, ou ser co-expressa(s) no hospedeiro com o(s) imunógeno(s). A preferência será a co-expresão da ou das citocina(s), seja pelo menos vetor que aquele que expressa o imunógeno, seja por um vetor próprio.
As citocinas podem notadamente ser escolhidas dentre: interleu-cina 18 (IL-18), interleuqina 12 (IL-12), interleuqina 15 (IL-15), MIP-1 α (ma-crophage inflammatory protein 1 a; Marshall E. et a!., BR. J. Câncer, 1997, 75(12), 1715- 1720), GM-CSF (fator de estímulo da formação de colônias granulomacrofágicas, ou em inglês Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor)). Podem-se citar, em particular, citocinas aviárias, notadamente aquelas do frango, tais como clL-18 (Schneider K. et al., J. Interfe-ron Cytokine Res., 2000, 20(10), 879-883), clL-15 (Xin K.-Q et al., Vaccine, 1999, 17, 858-866), e citocinas eqüinas, notadamente o GM-CSF equino (WO-A-OO/77210)). De maneira preferida, utilizam-se as citocinas da espécie a vacinar. WO-A-00/77210 descreve a seqüência nucleotídica e a sequência em aminoácidos correspondendo ao GM-CSF eqüino, a produção de GM-CSF in vitro e a construção de vetores (plasmídeos e vetores virais), permitindo a expressão do GM-CSF eqüino in vivo. Essas proteínas, plasmí- deos e vetores virais podem ser utilizados nas composições imunógenas e nas vacinas eqüinas, de acordo com a invenção. A título de exemplo, pode-se utilizar o plasmídeo pJP097 descrito no exemplo 3 desse pedido anterior ou utilizar o ensinamento desse pedido anterior para produzir outros vetores ou para produzir in vitro o GM-CSF eqüino, e incorporar esses vetores ou esse GM-CSF eqüino nas composições imunógenas ou vacinas eqüinas, de acordo com a invenção. A presente invenção tem ainda por oojeto composições imunógenas e vacinas ditas de subunidades, compreendendo a proteína E, e, eventualmente, uma ou várias outras proteína(s) do vírus WN, notadamente prM ou M, de preferência produtos por expressão in vitro conforme descrito acima, e, por outro lado, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Os veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são perfeitamente conhecidos do técnico. A título de exemplo, pode tratar-se de solução salina NaCI a 0,9 % ou de tampão fosfato.
As composições imunógenas e as vacinas de subunidades, de acordo com a invenção, compreendem, de preferência, um ou vários adju-vantes, escolhidos notadamente dentre os adjuvantes usuais. São particularmente convenientes no âmbito da presente invenção: (1) um polímero do ácido acrílico ou metacrílico, um polímero de anidrido maléico e de derivado alcenila, (2) uma seqüência imunoestimuladora (ISS), notadamente uma se-qüência oligodesóxi-ribonucleotídica que tem um ou vários motivos CpG não metilados (Klinman D.M. et al,, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, 93, 2879-2883; WO-A1-98/16247), (3) uma emulsão óleo-em-água em particular a emulsão SPT descrita na página 147 de Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, editado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 da mesma obra, (4) uma emulsão água-em-óleo (EP-A-639 071), (5) a saponina, em particular Quil-A, ou (6) hidróxido de alumina ou equivalente. Os diferentes tipos de adjuvantes definidos sob 1), 2) e 3) foram descritos anteriormente mais em detalhes em relação a vacinas à base de vetores de expressão.
As doses e os volumes de dose são definidos mais adiante no âmbito da descrição geral dos métodos de imunização e de vacinação.
De acordo com a invenção, a vacinação contra o vírus WN pode ser associada a outras vacinações no âmbito de programas de vacinação, sob a forma de kits de imunização ou de vacinação ou ainda sob a forma de composições imunógenas e de vacinas multivalentes, isto é, compreendendo pelo menos um componente de vacina contra o vírus WN e pelo menos um componente de vacina contra pelo menos um outro agente patógeno. Isto inclui também a expressão por um mesmo vetor de expressão de genes de pelo menos dois agentes patógenos, vírus WN inclusive. A invenção tem também por objeto uma composição imunógena multivalente ou uma vacina multivalente contra o vírus WN e contra pelo menos um outro patógeno da espécie alvo, utilizando um mesmo vetor de expressão in vivo contendo e expressando pelo menos um polinucleotídeo do vírus WN, de acordo com a invenção e pelo menos um polinucleotídeo, expressando um imunógeno de um outro patógeno.
Por imunógeno assim expresso, entende-se notadamente uma proteína, glicoproteína, polipeptídeo ou peptídeos, epitopo ou derivado, por exemplo proteína de fusão, induzindo uma resposta imunitária, de preferência protetora.
Conforme foi descrito anteriormente, essas composições ou vacinas multivalentes ou uma vacina multivalente compreendem também um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, e eventualmente um ad-juvante. A invenção tem igualmente por objeto uma composição imunó-gena multivalente ou uma vacina multivalente, compreendendo pelo menos um vetor de expressão in vivo no qual é inserido pelo menos um polinucleotídeo do vírus WN, de acordo com a invenção, e pelo menos um segundo vetor de expressão no qual é inserido um polinucleotídeo codificando para um imunógeno de um outro agente patógeno. Conforme foi descrito anteriormente, essas composições ou vacinas multivalentes compreendem também um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, e eventualmente um adjuvante.
Para as composições imunógenas e as vacinas multivalentes, esses outros patógenos eqüinos são notadamente escolhidos dentre o grupo que compreende os vírus da rinopneumonia eqüina EHV-1 e/ou EHV-4 (de preferência, associam-se imunógenos de EHV-1 e EHV-4), vírus da gripe eqüina EIV, vírus da encefalite do Leste EEV, vírus da encefalite do Oeste WEV, vírus da encefalite Venezuelana VEV (prefere-se uma combinação dos três EEV, WEV e VEV), Clostridium tetani (tétanos), e suas misturas. De preferência, para EHV escolhem-se os genes gB e/ou gD; para EIV os genes HÁ, NP e/ou N; para os vírus das encefaiites C e/ou E2; para Clostridium tetani o gene codificando para toda ou parte da subunidade C da toxina tetâ-nica. Isto inclui a utilização de polinucleotídeos codificando para um fragmento imunologicamente ativo ou um epitopo desse imunógeno Esses outros patógenos aviários são notadamente escolhidos dentre o grupo que compreende os vírus do Mal de Marek MDV (serotipos 1 e 2, de preferência serotípo 1); vírus do Mal de Newcastle NDV, vírus do Mal de Gumboro IBDV, vírus da bronquite infecciosa IBV, vírus da anemia infecciosa CAV, vírus da laringotraqueíte infecciosa ILTV, vírus da encefalomielite AEV (ou ainda vírus da leucose aviária ALV), vírus da enterite hemorrágica das peruas (HEV), vírus da pneumovirose (TRTV), vírus da peste aviária (influenza aviária), vírus da hidropericardite do frango, reovirus aviários, Es-cheríchia coli, Mycoplasma galiinarum, Mycoplasma gallisepticum, Haemo-philus avium, Pasteurella galiinarum, Pasteurella multocida gallicida, e suas misturas. De preferência, para MDV escolhem-se os genes gB e/ou gD; para NDV os genes HN e/ou F; para IBDV o gene VP2; para IBV os genes S (e mais particularmente S1), M e ou N; para CAV para os genes VP1 e/ou VP2, para ILTV, os genes gB ou gD; para AEV os genes env e/ou gag/pro, para HEV os genes 100 K e hexon, para TRTV os genes F e/ou G; para a peste aviária os genes HA, N e/ou NP. Isto inclui a utilização de polinucleotídeos codificando para um fragmento imunologicamente ativo ou um epitopo desse imunógeno. A título de exemplo, em uma composição imunógena multiva- lente ou uma vacina multivalente, de acordo com a invenção, eventualmente adjuvada conforme descrito acima, destinada à espécie equina, pode(m)-se incorporar um ou vários dos plasmídeos descritos no WO-A-98/03198 e, em particular, nos exemplos 8 a 25 desse pedido anterior, e aqueles descritos no WO-A-00/77043 e que se referem à espécie eqüina, em particular aqueles descritos nos exemplos 6 e 7 desse pedido anterior. Para a espécie aviária, podem-se incorporar, por exemplo, um ou vários dos plasmídeo(s) descritos no WO-A1-98/03659 e em particular nos exemplos 7 a 27 desse pedido anterior.
As composições imunógenas ou as vacinas recombinadas, tais como descritas anteriormente podem igualmente ser associadas com pelo menos uma vacina clássica (inatividade, vivo atenuado, subunidades) dirigida contra pelo menos um outro patógeno, Da mesma forma, as composições imunógenas e as vacinas de subunidades, de acordo com a invenção, podem constituir o objeto de vacinação associada. A presente invenção tem também por objeto composições imunógenas multivalentes e vacinas multivalentes, compreendendo uma ou proteína(s), de acordo com a invenção, e um ou vários imunógeno(s) (o termo imunógeno foi definido mais acima) de pelo menos um outro agente patógeno sob a forma inativada ou atenuada. Conforme foi descrito anteriormente, essas composições ou vacinas multivalentes compreendem também um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, e eventualmente um adjuvante. A presente invenção tem também por objeto métodos de imunização e de vacinação das espécies alvos mencionadas acima.
Esses métodos compreendem a administração de uma quantidade eficaz de uma composição imunógena ou de uma vacina, de acordo com a invenção. Essa administração pode ser feita notadamente ou pela via parenteral, por exemplo, por administração subcutânea, intradérmica, intra-muscular, ou pela via ora! e/ou nasal. Uma administração ou várias administrações pode(m) ser realizada(s), notadamente dois.
As diferentes vacinas podem ser injetadas por um injetor com jato líquido sem agulha. Para os plasmídeos, podem-se utilizar também as partículas de ouro revestidas de plasmídeo e projetadas de forma a penetrar nas células da pele do sujeito a imunizar (Tang et al. Nature 1992, 356, 152-154).
As composições imunógenas e as vacinas, de acordo com a invenção, compreendem uma quantidade eficaz de vetor de expressão ou de polipeptídeo.
No caso das composições imunógenas ou das vacinas à base de plasmídeo, uma dose comporta de maneira geral de 10 pg aproximadamente a 2000 pg aproximadamente, notadamente de 50 pg aproximadamente a 1000 pg aproximadamente. Os volumes de dose podem estar compreendidos entre 0,1 e 2 ml, de preferência entre 0,2 e 1 ml.
Essas doses e volumes de dose são bem adaptados para a vacinação dos eqüinos e dos mamíferos.
Para a vacinação da espécie aviária, uma dose está mais particularmente compreendida entre aproximadamente 10 pg e aproximadamente 500 pg, e preferencialmente entre aproximadamente 50 pg e aproximadamente 200 pg. Os volumes de dose podem estar mais particularmente compreendidos entre 0,1 e 1 ml, de preferência entre 0,2 e 0,5 ml. O técnico possui as competências necessárias para otimizar a dose eficaz de plasmídeo a utilizar para cada protocolo de imunização ou de vacinação e para definir a melhor via de administração.
No caso das composições imunógenas ou das vacinas à base de poxvirus, uma dose está de maneira geral compreendida entre aproximadamente 102 pfu e aproximadamente 109 pfu, Para a espécie equina e os mamíferos, quando o vetor é o vírus da vacina, a dose está mais particularmente compreendida entre aproximadamente 104 pfu e aproximadamente 109 pfu, de preferência, entre aproximadamente 106 e aproximadamente 108 pfu; quando o vetor é o vírus cana-rypox, a dose está mais particularmente compreendida entre aproximadamente 105 pfu e aproximadamente 109 pfu, de preferência entre aproximadamente 105·5 ou 106 e aproximadamente 108 pfu.
Para a espécie aviária, quando o vetor é o vírus canarypox, a dose está mais particularmente compreendida entre aproximadamente 103 pfu e aproximadamente 107 pfu, de preferência entre aproximadamente 104 e aproximadamente 106 pfu; quando o vetor é o vírus fowlpox, a dose está mais particularmente compreendida entre aproximadamente 102 pfu e aproximadamente 105 pfu, de preferência entre aproximadamente 103 e aproximadamente 105 pfu.
No caso das composições imunógenas ou das vacinas à base de vetor viral diferentes do poxvirus, notadamente o vírus do herpes, uma dose está de maneira geral compreendida entre aproximadamente 103 pfu e aproximadamente 108 pfu. No caso das composições imunógenas ou das vacinas aviárias uma dose está de maneira geral compreendida entre aproximadamente 103 pfu e aproximadamente 106 pfu. No caso das composições imunógenas ou das vacinas equinas uma dose está de maneira geral compreendida entre aproximadamente 106 pfu e aproximadamente 108 pfu.
Os volumes de dose das composições imunógenas e das vacinas eqüinas à base de vetores virais estão em geral compreendidos entre 0,5 e 2,0 ml, de preferência entre 1,0 e 2,0 ml, preferencialmente de 1,0 ml. Os volumes de dose das composições imunógenas e das vacinas aviárias à base de vetores virais estão em geral compreendidos entre 0,1 e 1,0 ml, de preferência entre 0,1 e 0,5 ml, preferencialmente entre 0,2 e 0,8 ml. O técnico possui também para esse tipo de vacina as competências necessárias para otimizar o número de administrações, a via de administração e as doses a utilizar para cada protocolo de imunização. Em particular, são previstas duas administrações no cavalo, por exemplo com 35 dias de intervalo.
No caso das composições imunógenas ou das vacinas de subu-nidades, uma dose comporta de maneira geral de 10 pg aproximadamente a 2000 pg aproximadamente, notadamente de 50 pg aproximadamente a 100 pg aproximadamente. Os volumes de dose das composições imunógenas e das vacinas eqüinas à base de vetores virais estão em geral compreendidos entre 1,0 e 2,0 ml, de preferência entre 0,5 e 2,0 ml, preferencialmente de 1,0 ml. Os volumes de dose das composições imunógenas e das vacinas aviárias à base de vetores virais estão em geral compreendidas entre 0,1 e 1,0 ml, de preferência entre 0,1 e 0,5 ml, preferencialmente entre 0,2 e 0,3 ml. O técnico possui também para esse tipo de vacina as competências necessárias para otimizar o número de administrações, a via de administração e as doses a utilizar para cada protocolo de imunização. A invenção refere-se também à utilização de um vetor de expressão in vivo ou de um preparo de vetores ou de polipeptídeos, de acordo com a invenção, para o preparo de uma composição imunógena ou de uma vacina destinada a proteger as espécies alvos contra o vírus WN e eventualmente contra pelo menos um outro agente patógeno. As diferentes características enunciadas no resto da descrição se aplicam a esse outro objetivo da invenção.
Uma vacina à base de plasmídeo ou uma vacina viral que expressa uma ou várias proteínas do vírus WN ou uma vacina de subunidades WN, de acordo com a presente invenção, não induzirá no animal vacinado a produção de anticorpos contra as outras proteínas desse vírus que não são representadas na composição imunógena ou vacina. Essa característica pode ser utilizada para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico diferencial, permitindo fazer a distinção entre os animais infectados pelo vírus patógeno WN e os animais vacinados com o auxílio de vacinas, de acordo com a invenção. Nestes, as proteínas e/ou anticorpos dirigidos contra elas estão presentes e podem ser detectados por uma reação antígeno-anticorpos. Não é o caso nos animais vacinados, de acordo com a invenção, que permanecem negativos. Para realizar essa discriminação, utiliza-se uma proteína que não está representada na vacina (não presente ou não expressa), por exemplo a proteína NS1, NS2A, NS2B ou NS3, quando ela não está representada na vacina. A presente invenção tem, portanto, por objetivo a utilização dos vetores, preparados e polipeptídeos, de acordo com a invenção, para o preparo de composições imunógenas e de vacinas, permitindo discriminar entre animais vacinados e animais infectados.
Ela tem também por objetivo um método de imunização e de vacinação associado a um método de diagnóstico, permitindo essa discriminação. A proteína selecionada para o diagnóstico ou um de seus fragmentos ou epitopos é utilizada como antígeno no teste de diagnóstico, e/ou é utilizada para produzir anticorpos, policlonais ou monoclonais. O técnico dispõe dos conhecimentos e da prática para produzir esses anticorpos e para utilizar antígenos e/ou anticorpos nas técnicas de diagnóstico clássicas, por exemplo testados ELISA. A invenção será então ser descrita mais detalhadamente com o auxílio de modos de realização considerados a título de exemplos não limi-tativos.
EXEMPLOS
Todas as construções são realizadas, aplicando-se as técnicas padrões de biologia molecular (clonagem, digestão pelas enzimas de restrição, síntese de um DNA complementar simples filamento, amplificação em cadeia por polimerase, elongação de um oligonucleotídeo por um DNA poli-merase...) descritas por Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A laboratory Manual. 2"d Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Todos os fragmentos de restrição utilizados pela presente invenção, assim como diversos fragmentos de amplificação em cadeia polimerase (=ACP ou PCR), são isolados e purificados utilizando-se o kit Gene-clean® (BIO101 Inc. La Jolla, CA).
Exemplo 1: cultura do vírus da febre do Nilo Para sua amplificação, vírus da febre do Nilo NY99 (Lanciotti R. S. et al., Science, 1999, 286, 2333-7) são cultivadas sobre células VERO (células renais de macaco, acessível junto a American Type Culture Collecti-on (ATCC) sob o número CCL-81), As células VERO são colocadas em cultura em Falcon 25 cm2 com o meio Eagle-MEM suplementado de 1 % de extratos de lêvedo e de 10 % de soro de bezerro contendo aproximadamente 100 000 células por ml. As células são cultivadas a +37 °C, sob atmosfera a 5 % de C02.
Após 3 horas a camada celular chega à confluência. O meio de cultura é então substituído por meio Eagle-MEM suplementado de 1 % de extratos de íêvedo e de 0,1 % de albumina de soro de boi e o vírus da febre do Nilo é acrescentado à razão de 5 pfu/célula.
Quando o efeito citopatógeno (CPE) está completo (geralmente 48-72 horas após o começo da colocação em cultura), as suspensões virais são coletadas, depois clarificadas por centrifugação e congeladas a -70 °C. 3 a 4 passagens sucessivas são geralmente necessárias à produção de um lote viraí. O lote viral é estocado a -70 °C.
Exemplo 2: extração do RNA viral do vírus da febre do Nilo O RNA viral contido em 100 ml de suspensão viral da cepa de vírus da febre do Nilo NY99 é extraído após descongelamento com as soluções do kit High Pure™ Viral RNA Kit Cat # 1 858 882, Roche Molecular Bio-chemicals), seguindo as instruções do fornecedor para as etapas de extração. O resíduo de RNA obtido no final da extração é suspenso novamente com 1 a 2 ml de água destilada estéril sem Rnase.
Exemplo 3: produção do plasmídeo pFC101 O DNA complementar (ADNc) do vírus da febre do Nilo NY99 é sintetizado com o kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USDA), utilizando as condições dadas pelo fornecedor.
Uma reação de transcrição inversa, seguida de uma reação de amplificação em cadeia (Reação TI-ACP ou RT-PCR) é realizada com 50 μΙ da suspensão de RNA viral do vírus da febre do Nilo NY99 (exemplo 2) e com os seguintes oligonucleotídeos: FC101 (30 mer) (SEQ ID NO: 1) 5TTTTTT G AATTCGTT ACCCT CT CT AACTT C 3' e FC102 (33 mer) (SEQ ID NO; 2) 5* TTTTTTTCTAGATTACCTCCGACTGCGTCTTGA 3'.
Esse par de oligonucleotídeos permite a incorporação de um local de restrição EcoRI e de um local de restrição Xbal e de um códon terminai em 3' do enxerto. A síntese do primeiro filamento de ADNc é feita por elongação do oligonucleotídeo FC102, após hibridação deste na matriz de RNA.
As condições de síntese do primeiro filamento de ADNc estão a uma temperatura de 42 °C durante 15 minutos, depois de 99 °C, durante 5 minutos, e enfim de 4°C, durante 5 minutos. As condições da reação ACP em presença do binário de oligonucleotídeos FC101 e FC102 estão a uma temperatura de 95 °C, durante 2 minutos, depois 35 ciclos (95 °C durante 1 minuto, depois 62 °C, durante 1 minuto, e 72 °C, durante 2 minutos) e enfim, 72 °C durante 7 minutos, para produzir um fragmento de 302 pb.
Esse fragmento é digerido por EcoRI, depois por Xbal para isolar, após eletroforese em gel de agarose, o fragmento EcoRl-Xbal de aproximadamente 290 pb. Esse fragmento é denominado fragmento A. O píasmídeo de expressão eucariote pVR1020 (C.J. Luke et al., J. of Infectious Diseases, 1997, 175, 95-97), derivado do píasmídeo pVR1012 (figura 1 e exemplo 7 de WO-A-98/03199; Hartíka J. et al., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-1217), contém a fase codificante da seqüên-cia-sinal do ativador do plasminógeno tissular humano (tPA).
Um píasmídeo pVR120 é modificado por digestão BamHI-BglII e inserção de uma sequência contendo vários locais de clonagem (BamHI, Notl, EcoRI, Xbal, PMII, Pstl, Bglll) e resultante do emparelhamento dos seguintes oligonucleotídeos: PB326 (40 mer) (SEQ ID NO: 3) 5’GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3’ e PB329 (40 mer) (SEQ ID NO: 4) 5’ GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3’. O vetor assim obtido, de um tamanho de aproximadamente 5105 pares de bases (ou pb), é nomeado pAB110. O fragmento A é ligado com o píasmídeo de expressão pAB110 previamente digerido por Xbal e EcoRI, para dar o píasmídeo pFC101 (5376 pb). Esse píasmídeo contém, sob o controle do promotor precoce do citome-galovírus humano ou hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), um enxerto codificando para a seqüência-sinal do ativador do tPA seguida da sequência codificando para a proteína prM.
Exemplo 4: produção do plasmídeo pFC102 O DNA complementar (ADNc) do vírus da febre do Nilo NY99 é sintetizado com o kit Gene Amp RNA PCR kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, Cl 06859 USA), utilizando as condições dadas pelo fornecedor.
Uma reação de transcrição inversa, seguida de uma reação de amplificação em cadeia (Reação TI-ACP ou RT-PCR) é realizada com 50 μΙ da suspensão de RNA viral do vírus da febre do Nilo NY99 (exemplo 2) e com os seguintes oligonucleotídeos: FC103 (30 mer) (SEQ ID NO: 5) 5'TTTTTT G AATT CT CACT G ACAGT G C AG AC A 3' e FC104 (33 mer) (SEQ ID NO: 6) 5' TTTTTTTCT AG ATT AG CT GT AAGCTGGGGCCAC 3'.
Esse binário de oligonucleotídeos permite a incorporação de um local de restrição EcoRI e de um local de restrição Xbal e de um códon terminal em 3' do enxerto. A síntese do primeiro filamento de ADNc é feita por elongação do oligonucleotídeo FC104, após hibridação deste na matriz de RNA.
As condições de síntese do primeiro filamento de ADNc estão a uma temperatura de 42 °C, durante 15 minutos, depois de 99 °C, durante 5 minutos, e enfim de 4 °C, durante 5 minutos. As condições da reação ACP em presença do par de oligonucleotídeos FC103 e FC104 estão a uma temperatura de 95 °C durante 2 minutos, depois 35 ciclos (95 °C, durante 1 minuto, depois 62°C durante (ilegível) e 72 °C, durante 2 minutos) e enfim 72 grau, durante 7 minutos para produzir um fragmento de 252 pb.
Esse fragmento é digerido por EcoRI, depois por Xbal para isolar, após eletroforese em gel de agarose, o fragmento Eco-RI-Xbal de aproximadamente 240 pb. Esse fragmento é ligado com o plasmídeo de expressão pAB110 (exemplo 3) previamente digerido por Xbal e EcoRI, para dar o plasmídeo pFC102 (5326 pb). Esse plasmídeo contém, sob o controle do promotor precoce do citomegalovírus humano ou hCMV-IE (human Cytome-galovirus Immediate Early), um enxerto codificando para a seqüência-sinal do ativador do tPA seguida da sequência codificanie para a proteína M. Exemplo 5: produção do piasmídeo pFC103 O DNA complementar (ADNc) do vírus da febre do Nilo NY99 é sintetizado com o kit Gene Amp RNA PCR kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA), utilizando as condições dadas pelo fornecedor.
Uma reação de transcrição inversa, seguida de uma reação de amplificação em cadeia (Reação TI-ACP ou RT-PCR) é realizada com 50 μΙ da suspensão de RNA viral do vírus da febre do Nilo NY99 (exemplo 2) e com os seguintes oligonucleotídeos: FC105 (30 mer) (SEQ ID NO: 7) 5'TTTTTTG AATTCTTC AACTGCCTTGGAATG 3' e FC106 (33 mer) (SEQ ID NO: 8) 5’ TTTTTTT CT AG ATT AAGCGTGCACGTT CACGGA 3'.
Esse binário de oligonucleotídeos permite a incorporação de um local de restrição EcoRI e de um local de restrição Xbal e de um códon terminal em 3' do enxerto. A síntese do primeiro filamento de ADNc é feita por elongação do oligonucleotídeo FC106, após hibridação deste na matriz de RNA.
As condições de síntese do primeiro filamento de ADNc estão a uma temperatura de 42 °C, durante 15 minutos, depois de 99 °C, durante 5 minutos, e enfim de 4 °C durante 5 minutos. As condições da reação ACP em presença do par de oligonucleotídeos FC105 e FC106 estão a uma temperatura de 95 °C, durante 2 minutos, depois 35 ciclos (95 °C, durante 1 minuto, depois 62 °C durante 1 minuto, e 72 °C durante 2 minutos) e enfim 72°C, durante 7 minutos para produzir um fragmento de 1530 pb.
Esse fragmento é digerido pro EcoRI, depois por Xbal para isolar, após eletroforese em gel de agarose, o fragmento EcoRI-Xbal de aproximadamente 1518 pb. Esse fragmento é ligado com o piasmídeo de expressão pAB110 (exemplo 3) previamente digerido por Xbal e EcoRI, para dar o piasmídeo pFC103 (6604 pb). Esse piasmídeo contém, sob o controle do promotor precoce do citomegalovírus humano ou hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediaíe Early), um enxerto codificando para a seqüên-cia-sinai do ativador do tPA seguida da seqüência codificando para a proteína E.
Exemplo 6: produção do plasmídeo PFC104 O DNA complementar (ADNc) do vírus da febre do Nilo NY99 é sintetizado como kit Gene Amp RN A PCR Kit {Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk CT 06859, USA), utilizando as condições dadas pelo fornecedor.
Uma reação de transcrição inversa, seguida de uma reação de amplificação em cadeia (Reação «TI-ACP» ou «RT-PCR»), é realizada com 50 μΙ da suspensão de RNA viral do vírus da febre do Nilo NY99 (exemplo 2) e com os seguintes oligonucleotídeos: FC101 (30 mer) (SEQ ID NO: 1) e FC106 (33 mer) (SEQ ID NO: 8).
Esse par de oligonucleotídeos permite a incorporação de um local de restrição EcoRI e de um local de restrição Xbal e de um códon terminal em 3' do enxerto. A síntese do primeiro filamento de ADNc é feita por elongação do oligonucleotídeo FC106, após hibridação deste na matriz de RNA.
As condições de síntese do primeiro filamento de ADNc estão a uma temperatura de 42°C, durante 15 minutos, depois de 99 °C, durante 5 minutos, e enfim de 4 °C, durante 5 minutos. As condições da reação ACP em presença do par de oligonucleotídeos FC101 e FC106 estão a uma temperatura de 95 °C, durante 2 minutos) e enfim 72 °C, durante 7 minutos para produzir um fragmento de 2031 pb.
Esse fragmento é digerido por EcoRI, depois por Xbal para isolar, após eletroforese em gel de agarose, o fragmento EcoRI-Xbal de aproximadamente 2019 pb. Esse fragmento é ligado com o plasmídeo de expressão pAB110 (exemplo 3) previamente digerido por Xbal e EcoRI, para dar o plasmídeo pFC104 (7105 pb). Esse plasmídeo contém, sob o controle do promotor precoce do citomegalovírus humano ou hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), um enxerto codificando para a seqüên- cia-sinal do ativador do tPA seguida da seqüência codificando para a proteína prM-M-E.
Exemplo 7: produção do plasmídeo pFC105 O DNA complementar (ADNc) do vírus da febre do Nilo NY99 é sintetizado com o kit Gene Amp RNA PCR kit» (cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA), utilizando as condições dadas pelo fornecedor.
Uma reação de transcrição inversa, seguida de uma reação de amplificação em cadeia (reação «Ti-ACP» ou «RT-PCR») é realizada com 50 μΙ da suspensão de RNA viral do vírus da febre do Nil NY99 (exemplo 2) e com os seguintes oligonucleotídeos: FC107 (33 mer) (SEQ ID NO: 9) 5' TTTTTTGATATCACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' e FC106 (33 mer) (SEQ ID NO: 8).
Esse par de oligonucleotídeos permite a incorporação de um local de restrição EcoRV e de um local de restrição Xbal e de um códon terminal em 3' do enxerto. A síntese do primeiro filamento de ADNc é feita por elongação do oligonucleotídeo FC106, após hibridação deste na matriz de RNA.
As condições de síntese do primeiro filamento de ADNc estão a uma temperatura de 42 °C durante 15 minutos, depois de 99 °C, durante 5 minutos, e enfim de 4°C, durante 5 minutos. As condições da reação ACP em presença do par de oligonucleotídeos FC106 e FC107 estão a uma temperatura de 95 °C, durante 2 minutos, depois 35 ciclos (95 °C, durante 1 minuto, depois 62 °C, durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos) e enfim 72 °C, durante 7 minutos para produzir um fragmento de 2076 pb.
Esse fragmento é digerido por EcoRV, depois por Xbal para isolar, após eletroforese em gel de agarose, o fragmento EcoRV-Xbal de aproximadamente 2058 pb.
Esse fragmento é ligado com o plasmídeo de expressão pVR1012, previamente digerido por Xbal e EcoRV, para dar o plasmídeo pFC105 (6953 pb). Esse plasmídeo contém, sob o controle do promotor pre- coce do citomegalovírus humano ou hCMV-IE (human Cytomegalovirus Im-mediate Eariy), um enxerto codificando para a poiiproteína prM-M-E.
Exemplo 8: produção do plasmfdeo pFC106 O DNA complementar (ADNc) do vírus da febre do Nilo NY99 é sintetizado com o kit Gene Amp RNA PCR kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA), utilizando as condições dadas pelo fornecedor.
Uma reação de transcrição inversa, seguida de uma reação de amplificação em cadeia (Reação «Ti-ACP» ou «Rt-PCR»), é realizada com 50 μΙ da suspensão de RNA viral do vírus da febre do Nilo NY99 (exemplo 2) e com os seguintes oligonucleotídeos: FC108 (36 mer) (SEQ ID NO: 10) 5' TTTTTTG AT AT CAT GT ATAAT G CT G AT ATG ATT G AC 3' e FC109 (36 mer) (SEQ ID NO: 11) 5' TTTTTTTCTAGATTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC 3‘.
Esse par de oligonucleotídeos permite a incorporação de um local de restrição EcoRV e de um local de restrição Xbal, de um códon ATG iniciador em 5’e de um códon terminal em 3' do enxerto. A síntese do primeiro filamento de ADNc é feito por elongação do oligonucleotídeos FC109, após hibridação deste na matriz de RNA.
As condições de síntese do primeiro filamento de ADNc estão a uma temperatura de 42 °C durante 15 minutos, depois de 99 °C durante 5 minutos, e enfim de 4 °C, durante 5 minutos. As condições da reação ACP em presença do par de oligonucleotídeos FC108 e FC109 estão a uma temperatura de 95 °C, durante 2 min, depois 35 ciclos (95 °C durante 1 minuto, depois 62 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos) e enfim 72 °C durante 7 minutos para produzir um fragmento de 2973 pb.
Esse fragmento é digerido por EcoRV, depois por Xbal para isolar, após eletroforese em gel de agarose, o fragmento EcoRV-Xbal de aproximadamente 2955 pb.
Esse fragmento é ligado com o plasmfdeo de expressão pVR1012, previamente digerido por Xbal e EcoRV, para dar o plasmídeo pFC106 (7850 pb). Esse plasmídeo contém, sob o controle do promotor precoce do citomegalovírus humano ou hCMV-IE (human Cytomegalovirus Im-mediate Early), um enxerto codificando para a poliproteína NS2A-NS2B-NS3.
Exemplo 9: produção do plasmídeo doador para a inserção no local C5 do vírus canarvpox ALVAC A figura 16 da patente US-A-5,756.103 mostra a seqüência de um fragmento de 3199 pb do DNA genômico do vírus canarypox. A análise dessa seqüência revelou um quadro aberto de leitura (COL) que foi denominado C5L, que começa na posição 1538 e termina na posição 1859. A produção de um plasmídeo de inserção chegando à deleção do COL C5L e à sua substituição por um local de clonagem múltipla flanqueado de sinais de parada de transcrição e de tradução foi realizada conforme descrito a seguir.
Uma reação ACP foi realizada a partir da matriz constituída pelo DNA genômico do vírus canarypox e com os seguintes oligonucleotídeos: C5C1 (42 mer) (SEQ ID NO: 12) 5’ ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC 3’ e C5B1 (73 mer) (SEQ ID NO: 12) 5’ GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGG I ITTTATAGCTAATTA GTCATTTTTTTGAGAGTACCACTTCAGCTACCTC 3'. para isolar um fragmento ACP de 223 pb (fragmento B).
Uma reação ACP foi realizada a partir da matriz constituída pelo DNA genômico do vírus canarypox e com os seguintes oligonucleotídeos: C5A1 (72 mer) (SEQ ID NO: 14) 5’ CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCA TTATAAA GATCTAAAATGCATAATTTC 3’ e C5D1 (45 mer) (SEQ ID NO: 15) 5’ G AT G AT G GT ACCGT AA AC A AAT AT AAT G AAA AGT ATT CT AA ACTA 3‘. para isolar um fragmento ACP de 482 pb (fragmento C).
Os fragmentos B e C foram hibridados juntos para servir de matriz a uma reação ACP realizada com os oligonucleotídeos C5A1 (SEQ ID Ν°: 12) e C5D1 (SEQ ID N°: 15) para gerar um fragmento ACP de 681 pb. Esse fragmento foi digerido pelas enzimas de restrição SaC! e Kpnl, para isolar, após eletroforese em gel de agarose, um fragmento Sacl-Kpnl de 664 pb. Esse fragmento foi ligado como vetor pBíueScript ® II SK + (Stratagene, La Jolla, CA, USA, Cat # 212205), previamente digerido pelas enzimas de restrição Saci e Kpnl, para dar o plasmídeo pC5L. A seqüência desse plas-mídeo foi verificada por seqüenciação. Esse plasmídeo contém 166 pb de seqüências situadas a montante do COL C5L («braço flanquante esquerdo C5»), um sinal vacina de parada precoce de transcrição, códons stops nas 6 fases de leitura, um local de clonagem múltipla contendo os locais de restrição Smal, Pstl, Xhol e EcoRI, e enfim 425 pb de seqüências situadas a jusante do COL C5I («braço flanqueante direito C5>>). O plasmídeo pMP528HRH (Perkus M et al. J. Virol. 1989. 63.3829-3836) foi utilizado como matriz para amplificar a seqüência completa do promotor vacina H6 (N° de acesso Gen Bank M28351) com os seguintes oligonucleotídeos: JCA291 (34 mer) (SEQ ID NO: 16) 5’ AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3’ e JCA292 (43 mer) (SEQ ID NO: 17) 5' AAAAG AATTCGTCG ACT ACGAT ACAAACTT AACGG AT AT C GCG 3'. para amplificar um fragmento ACP de 149 pb. Esse fragmento foi digerido pelas enzimas de restrição Smal e EcoRI para isolar, após eletroforese em gel de agarose, um fragmento de restrição Smal-Eco-RI de 138 pb. Esse fragmento foi então ligado com o plasmídeo pC5L, previamente digerido por Smal e EcoRI, para dar o plasmídeo pFC107.
Exemplo 10: produção do vírus recombinado vCP1712 Uma reação ACP foi realizada, utilizando-se o plasmídeo pFC105 (exemplo 7) como matriz e os seguintes oligonucleotídeos: FC110 (33 mer) (SEQ ID NO: 18): 5’ TTTTCGCGAACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3’ e FC111 (39 mer) (SEQ ID NO: 19) 5’ TTTTGTCGACGCGGCCGCTTAAGCGTGCACGTTCACGGA 3’. para amplificar um fragmento ACP de aproximadamente 2079 pb. Esse fragmento foi digerido pelas enzimas de restrição Nrul e Sall para isolar, após eletroforese em gel de agarose, um fragmento de restrição Nrul-Sall de aproximadamente 2068 pb. Esse fragmento foi em seguida ligado com o plasmídeo pFC107 (exemplo 9) previamente digerido pelas enzimas de restrição Nrul e Sai! para dar o plasmídeo pFC108. O plasmídeo pFC108 foi linearizado por Notl, depois transfecta-do em células primárias de embriões de frangos infectadas com vírus cana-rypox (cepa ALVAC), segundo a técnica de precipitação ao fosfato de cálcio anteriormente descrita (Panicali et Paoletti Proc. Nat. Acad. Sei. 1982, 79. 4927-4931; Piccini et al. In Methods in Enzimology. 1987.153.545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Faixas positivas foram selecionadas sobre a base de uma hibridação com uma sonda radiomarcada específica da seqüência nucleotídica da glicoproteína de envoltório E. Essas faixas sofreram 4 ciclos sucessivos de seleção/purificação de faixas até que uma população pura tenha sido isolada. Uma faixa representativa da recombina-ção in vitro entre o plasmídeo doador pFC108 e o genoma do vírus cana-rypox ALVAC foi então amplificada e o estoque de vírus recombinado obtido foi designado vCP1712.
Exemplo 11: produção do vírus recombinado vCP1713 O plasmídeo pFC104 (exemplo 6) é digerido pelas enzimas de restrição Sali e Pmll para isolar, após eletroforese em gel de agarose, um fragmento de restrição Pmll-Sall de aproximadamente 2213 pb. Esse fragmento é ligado com o plasmídeo pFC107 (exemplo 9) previamente digerido pelas enzimas de restrição Nrul e Sall para dar o plasmídeo pFC109. O plasmídeo pFC109 foi linearizado por Notl, depois transfecta-do em células primárias de embriões de frangos infectados como vírus cana-rypox (cepa ALVAC) segundo a técnica do exemplo 10. Uma faixa representativa da recombinação in vitro entre o plasmídeo doador pFC109 e o genoma do vírus canarypox ALVAC foi selecionada sobre a base de uma hibridação com uma sonda radiomarcada específica da seqüência nucleotí- dica da glicoproteína de envoltório E e foi em seguida amplificada. O estoque de vírus recombinado obtido foi designada vCP1713.
Exemplo 12: produção do vírus recombinado vCP1714, O piasmídeo pFC103 (exemplo 5) foi digerido pelas enzimas de restrição Sall e Pmll para isolar, após eletroforese em gel de agarose, um fragmento de restrição Pmll-Sall de aproximadamente 1712 pb. Esse fragmento é ligado com o piasmídeo pFC107 (exemplo 9) previamente digerido pelas enzimas de restriçãoΊΜαιΙ e Sall para dar o piasmídeo pFC110. O piasmídeo pFC110 foi linearizado por NoTI, depois transfecta-do em células primárias de embriões de frangos infectadas com vírus cana-rypox (cepa ALVAC), segundo a técnica do exemplo 10. Uma faixa representativa da recombinação in vitro entre o piasmídeo doador pFC110 e o genoma do vírus canarypox ALVAC foi selecionada sobre a base de uma hibridação com uma sonda radiomarcada específica da seqüência nucleotí-dica da glicoproteína de envoltório E e foi em seguida amplificada. O estoque do vírus recombinado obtido foi designado vCP1714.
Exemplo 13: produção do vírus recombinado vCP1715 O piasmídeo pFC102 (exemplo 4) é digerido pelas enzimas de restrição Sall e Pmll para isolar, após eletroforese em gel de agarose, um fragmento de restrição Pmll-Sall de aproximadamente 434 pb. Esse fragmento é ligado com o piasmídeo pFC107 (exemplo 9) previamente digerido pelas enzimas de restrição Nrul e Sall para dar o piasmídeo pFC111. O piasmídeo pFC111 foi linearizado por Notl, depois transfecta-do em células primárias de embriões de frangos infectadas com vírus canarypox (cepa ALVAC), segundo a técnica do exemplo 10. Uma faixa representativa da recombinação in vitro entre o piasmídeo doador pFC111 e o genoma do vírus canarypox ALVAC foi selecionada sobre a base de uma hibridação com uma sonda radiomarcada específica da seqüência nucleotí-dica da glicoproteína de membrana M e foi em seguida amplificada. O estoque de vírus recombinado obtido foi designado VCP1715.
Exemplo 14: produção do vírus recombinado vCP1716 O piasmídeo pFC101 (exemplo 3) foi digerido pelas enzimas de restrição Sall e Pmll para isolar, após eletroforese em gel de agarose, um fragmento de restrição pmlI-Sall de aproximadamente 484 pb. Esse fragmento é ligado com o plasmídeo pFC107 (exemplo 9) previamente digerido pelas enzimas de restrição Nrul e Sall para dar o plasmídeo pFC112. O plasmídeo pFC112 foi linearizado por Notl, depois transfecta-do em células primárias de embriões de frangos infectadas com vírus cana-rypox (cepa ALVAC), segundo a técnica do exemplo 10. Uma faixa representativa da recombinação in vitro entre o plasmídeo doador pFC112 e o genoma do vírus canarypox ALVAC foi selecionada sobre a base de uma hibridação com uma sonda radiomarcada específica da seqüência nucleotí-dica da glicoproteína de pré-membrana prM e foi em seguida amplificada. O estoque de vírus recombinado obtido foi designado vCP1716.
Exemplo 15: Produção do plasmídeo doador pela inserção no local C6 do vírus canarypox ALVAC A figura 4 da patente WO-A-01 /05934 mostra a seqüência de um fragmento de 3700 pb do DNA genômico do vírus canarypox. A análise dessa seqüência revelou um quadro aberto de leitura (COL) que foi denominado C6L, que começa na posição 377 e termina na posição 2254. A construção de um plasmídeo de inserção chegando à deleção do COL C6L e a sua substituição por um local de clonagem múltipla flanqueada de sinais de parada de transcrição e de tradução foi realizada conforme descrito a seguir.
Uma reação ACP foi realizada a partir da matriz constituída pelo DNA genômico do vírus canarypox e com os seguintes oligonucleotídeos: C6A1 (42 mer) (SEQ ID NO: 20): 5’ AT CAT CG AG CT CG CG G CC GCCT ATC AAAAGT CTTAAT G AGTT 3’ e C6B1 (73 mer) (SEQ ID NO: 21): 5’ GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTA GTCATTTTTTCGTAAGTAAGTAT Τ Ι ΓΤΑΤΤΤΑΑ 3’. para isolar um fragmento ACP de 432 pb (fragmento D).
Uma reação ACP foi realizada a partir da matriz constituída pelo DNA genômico do vírus canarypox e com os seguintes oligonucleotídeos: C6C1 (72 mer) (SEQ ID NO: 22): 5’ CCCGG GCTG C AG CTCG AG G AATTCTTTTTATTG ATTAACTA GTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA 3’ e C6D1 (45 mer) (SEQ ID NO: 23): 5’ GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAA GTTG 3’. para isolar um fragmento ACP de 1210 pb (fragmento E) Os fragmentos D e E foram hibridados juntos para servir de matriz para uma reação ACP realizada com os oligonucleotídeos C6A1 (SEQ ID N° 20) e C6D1 (SEQ ID N° 23) para gerar um fragmento ACP de 1630 pb. Esse fragmento foi digerido pelas enzimas de restrição Saci e Kpnl, para isolar, após eletroforese em gel de agarose, um fragmento Sacl-Kpnl de 1613 pb. Esse fragmento foi ligado como vetor pBlueScript ® II SK + (Stra-tagene, La Jolla, CA, USA, Cat # 212205), previamente digerido pelas enzimas de restrição Saci e KpnS, para dar o plasmídeo pC6L. A sequência desse plasmídeo foi verificada por seqüenctação. Esse plasmídeo contém 370 pb de sequências situadas a montante do COL C6L («braços flaqueando esquerda C6»), um sinal vacina de parada precoce de transcrição, códons stops nas 6 fases de leitura, um local de clonagem múltipla contendo os locais de restrição Smal, Pstl, Xhol e EcoRI, e enfim 1156 pb de seqüências localizadas a jusante do COL C6L («braço flaqueando direita C6>>). O plasmídeo pMPIVC (Schmitt J. F. C. et al., J. Virol., 1988, 62, 1889-1897; Saiki R.K. et al. Science 1988, 239, 487-491) foi utilizado como matriz para amplificar a sequência completa do promotor vacina I3L com os seguintes oligonucleotídeos: FC112 (33 mer) (SEQ ID NO: 24): 5’ AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT 3’ e FC113 (43 mer) (SEQ ID NO: 25): 5' AAAAG AATTCG G AT CCG ATT AAACCT AAAT A ATT GT ACTTT GT 3'. para amplificar um fragmento ACP de 151 pb. Esse fragmento foi digerido pelas enzimas de restrição Smal e EcoRI para isolar, após eletroforese em gel de agarose, um fragmento de restrição Smal-EcoRI de aproximadamente 136 pb. Esse fragmento foi então ligado como plasmídeo pC6L, previamente digerido por Smal e EcoRI, para dar o plasmídeo pFC113..
Exemplo 16: produção dos vírus recombinados vCP1717 e vCP1718 Uma reação ACP foi realizada, utilizando-se o plasmídeo pFc106 (exemplo 8) como matriz e os seguintes oligonucleotídeos: FC114 (33 mer) (SEQ ID NO: 26): 5’ TTT C ACGT G ATGTATAAT G CT G AT AT G ATT G AC 3' e FC115 (42 mer) (SEQ ID NO: 27): 5' TTTTGGATCCGCGGCCGCTTAACGTTTTCCCGAGGCGAA GTC 3'. para amplificar um fragmento ACP aproximadamente 2973 pb. Esse fragmento foi digerido com as enzimas de restrição Pmll e BamHI para isolar, após eletroforese em gel de agarose, o fragmento de restrição Pmll e BamHI para isolar, após eletroforese em gel de agarose, o fragmento de restrição PmlI-BamHI de aproximadamente 2958 pb (fragmento F). O plasmídeo pFC113 (exemplo 15) foi digerido pelas enzimas de restrição Pmll e BamHI para isolar, após eletroforese em gel de agarose, o fragmento de restrição PmlI-BamHI de aproximadamente 4500 pb (fragmento G). Os fragmentos F e G foram então ligados juntos para dar o plasmídeo pFC114. O plasmídeo pFC114 foi linearizado por Notl, depois transfecta-do em células primárias de embriões de frangos infectados com vírus cana-rypox vCP1713 (exemplo 11), segundo a técnica de precipitação ao fosfato de cálcio anteriormente descrita (Panicali et Paoletti Proc. Nat. Acad. Sei. 1982. 79. 4927-4931; Piccini et al. In Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Faixas positivas foram selecionadas sobre a base de uma hibridação com uma sonda radio-marcada específica da seqüência nucleotídica da glicoproteína de envoltório E. Essas faixas sofreram 4 ciclos sucessivos de seleção/purificação de faixas até que uma população pura tenha sido isolada. Uma faixa representativa da recombinação in vitro entre o plasmídeo doador pFC114 e o genoma do vírus canarypox ALVAC foi então amplificada e o estoque de vírus re- combinado obtido foi designado VCP1717. O píasmídeo pFC114 linearizado por Notl serviu igualmente para transfectar células primárias de embriões de frangos infectadas com vírus canarypox vCP1712 (exemplo 10), segundo a técnica descrita acima. O estoque de vírus recombinado assim obtido foi designado vCP1718.
Exemplo 17: produção do píasmídeo PFC115. O DNA complementar (ADNc) do vírus da febre do Nilo NY99 foi sintetizado com o «kit Gene Amp RNA PCR Kit» (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA), utilizando as condições dadas pelo fornecedor.
Uma reação de transcrição inversa, seguida de uma reação de amplificação em cadeia (Reação «Ti-ACP ou RT-PCR») foi realizada com 50 μΙ da suspensão de RNA viral do vírus da febre do Nilo NY99 (exemplo 2) e com os seguintes oligonucleotídeos: FC116 (39 mer) (SEQ ID NO: 28): 5’ I T I I I IGATATCATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3’ e FC106 (33 mer) (SEQ ID NO: 8): Esse par de oligonucleotídeos permite a incorporação de um local de restrição EcoRV e de um local de restrição Xbal, de um códon inici-ador em 5' e de um códon terminal em 3' do enxerto. A síntese do primeiro filamento de ADNc é feita por elongação do oligonucleotídeo FC106, após hibridação deste na matriz de RNA.
As condições de síntese do primeiro filamento de ADNc estão a uma temperatura de 42 °C durante 15 minutos, depois de 99 °C, durante 5 minutos, e enfim de 4 °C, durante 5 minutos. As condições da reação ACP em presença do par de oligonucleotídeos FC106 e FC116 estão a uma temperatura de 95 °C durante 2 minutos, depois 35 ciclos (95 °C, durante 1 minuto, depois 62 °C, durante 1 minuto, e 72 °C durante 2 minutos) e enfim 72 °C durante 7 minutos para produzir um fragmento de 2079 pb.
Esse fragmento é digerido por EcoRV, depois por Xbal para isolar, após eletroforese em gel de agarose, o fragmento EcoRV-Xbal de aproximadamente 2061 pb.
Esse fragmento é ligado com o plasmídeo de expressão pVR1012, previamente digerido por Xbal e EcoRV, para dar o plasmídeo pFC115 (6956 pb). Esse plasmídeo contém, sob o controle do promotor precoce do citomegaiovírus humano ou hCMV-IE (human Cytomegalovirus Im-mediate Earfy), um enxerto codificando para a poliproteína prM-M-E.
Exemplo 18: produção dos vírus recombinados vCP2017 Uma reação ACP foi realizada utilizando-se o plasmídeo pFC 115 (exemplo 17), como matriz e os seguintes oligonucleotídeos: FC117 (36 mer) (SEQ ID NO: 29): 5’ TTTTCGCGAATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3’ e FC111(39 mer) (SEQ ID NO: 19): para amplificar um fragmento ACP de aproximadamente 2082 pb. Esse fragmento foi digerido pelas enzimas de restrição Nrul e Sall para isolar, após eletroforese em gel de agarose, um fragmento de restrição Nrul-Sall de aproximadamente 2071 pb. Esse fragmento foi em seguida ligado com o plasmídeo pFC107 (exemplo 9) previamente digerido pelas enzimas de restrição Nrul e Sall para dar o plasmídeo pFC116. O Plasmídeo pFC116 foi linearizado por Notl, depois transfecta-do em células primárias de embriões de frangos infectadas com vírus cana-rypox (cepa ALVAC), segundo a técnica do exemplo 10. Uma faixa representativa da recombinação in vitro entre o plasmídeo doador pFC116 e o genoma do vírus canarypox ALVAC foi selecionada sobre a base de uma hibridação com uma sonda radiomarcada específica da seqüência nucleotí-dica da glicoproteína de envoltório E e foi em seguida amplificada. O estoque de vírus recombinado obtido foi designado VCP2017.
Exemplo 19: produção de vacinas recombinadas Para o preparo de vacinas para eqüinos, os vírus recombinado canarypox vCP1712 (exemplo 10) é adjuvado com soluções de carbômero, a saber Carbopoi™ 974P fabricado por V+BF Goodrich, Ohio, USA (peso molecular de aproximadamente 3 000 000).
Uma solução estoque a 1,5 % de carbopoi™ 974P é inicialmente preparada na água destilada, contendo 1 g/l de cloreto de sódio. Essa solu- ção estoque é, então, utilizada para a elaboração de uma solução com 4 mg/ml de Carbopol™ 974P com água fisiológica, A solução estoque é misturada ao volume adequado de água fisiológica, seja em uma etapa única, seja em várias etapas sucessivas, o valor do pH é ajustado a cada etapa com uma solução de hidróxido de sódio 1N (ou ainda mais concentrada) a fim de se obter um valor final de pH de 7,3-7,4. A solução de Carbopol™ 974P pronto para o uso assim obtido é utilizada para retomar vírus recombinados liofiiizauos ou para diluir soluções estoques concentradas de vírus recombinados. Por exemplo, para se obter uma suspensão viral contendo 108 pfu por dose de 1 ml, dilui-se uma solução viral estoque de maneira a se obter um título de 108,3 pfu/ml, depois se dilui em partes iguais com essa solução de Carbopol™ 974P pronta para o uso de 4 mg/ml.
Vacinas recombinadas podem igualmente ser produzidas com vírus recombinados canarypox vCP1713 (exemplo 11) ou vCP1717 (exemplo 16) ou vCP1718 (exemplo 16) ou vCP2017 (exemplo 18) ou uma mistura dos três vírus canarypox vCP1714 (exemplo 12), VCP1715 (exemplo 13) e vCP1716 (exemplo 14), segundo a técnica descrita acima.
Exemplo 20: produção de vacinas DNA para os eqüinos Uma solução de DNA contendo o plasmídeo pFC104 (exemplo 6) é concentrada por precipitação etanólica conforme descrito em Sambrook et al (1989). O resíduo de DNA é retomado por uma solução de NaCI 0,9 % de forma a obter-se uma concentração de 1 mg/ml. Uma solução de DMRIE-DOPE a 0,75 mM é preparada por retomada de um liofilizado de DMRIE-DOPE por um volume adaptado de H20 estéril. A formação dos complexos DNA plasmídico-lipídeo é realizada por diluição em partes iguais da solução a 0,75 mM de DMRIE-DOPE (1:1) pela solução de DNA a 1 mg/ml em NaCI 0.9 %. A solução de DNA é introduzida progressivamente com o auxílio de uma agulha engastada 26G ao longo da parede do frasco que contém a solução de lipídeo catiônico, de forma a evitar a formação de espuma. Procede-se a uma agitação suave, desde que as duas soluções sejam misturadas. Obtém-se no final uma composição que compreende 0,375 mM de DMRIE-DOPE e 500 pg/ml de plasmídeo. É desejável que o conjunto das soluções utilizadas estejam à temperatura ambiente para o conjunto das operações descritas acima. Dei-xa-se a complexação DNA/DMRIE-DOPE se colocar à temperatura ambiente durante 30 minutos antes de proceder à imunização dos animais.
Vacinas DNA podem igualmente ser produzidas com soluções de DNA contendo os plasmídeos pFC104 (exemplo 6) e pFC106 (exemplo 8), ou contendo os plasmídeo pFC105 (exemplo 7) e pFC106, os plasmídeos pFC115 (exemplo 17) e pFC106, ou contendo os plasmídeos pFC101, pFC102 e pFC103 (exemplos 3 a 5) ou contendo o plasmídeo pFC105 ou pFC115 segundo a técnica descrita no presente exemplo.
Exemplo 21: testes de expressão in vivo A expressão das proteínas WN é testada para cada construção pelos métodos clássicos de imunofluorescência indireta e de Western Blot.
Esses testes são feitos sobre placas de 96 cavidades contendo as células CHO cultivadas em monocamadas e transfectadas por plasmídeo ou contendo as células CEF cultivadas em monocamadas e infectadas por vírus recombinados.
As proteínas WN são detectadas por utilização de soros de cavalos ou de frangos infectados e de anti-soros marcados. O tamanho dos fragmentos obtidos após migração sobre gel de agarose é comparada àquelas esperadas.
Exemplo 22: eficácia sobre animais As vacinas recombinadas e as vacinas plasmídicas são injetadas, duas vezes com aproximadamente duas semanas de intervalo, em frangos EOPS, com aproximadamente 7 dias de nascidos, não vacinados ainda, por via intramuscular sob um volume de aproximadamente 0,1 ml. Um grupo prova não vacinado é incorporado ao estudo.
Os frangos são testados por administração subcutânea no pescoço de 103'4TCID5O de vírus WN patógeno. São observados, por um lado, a vi remia, a resposta em anticorpos, assim como a mortalidade. Autópsias são feitas para observar as lesões.
Exemplo 23: titulação dos anticorpos neutralizantes anti-WNV. Séries de difuição são realizadas para cada soro com uma razão de 3 em meio DMEM adicionado de 10 % de soro de bezerro fetal em placas com 96 cavidades tipo cultura celular. A 0,05 ml do soro diluído é acrescentado 0,05 ml de meio de cultura contendo aproximadamente 100 DICC5o/ml de WNV. Essa mistura é incubada durante 2 horas a 37 °C em estufa em atmosfera contendo 5 % de C02. 0,15 ml de uma suspensão de células VERO, contendo aproximadamente 100 000 células por ml é em seguida acrescentado a cada mistura. O efeito citopático (ECP) é observado por microscopia com contraste de fase após 4-5 dias de cultura a 37 °C em atmosfera contendo 5 % C02. Os títulos neutralizantes de cada soro são calculados a partir do método de Kárber. Os títulos são dados sob a forma da diluição a mais importante que inibe o efeito citopático para 50 % das cavidades. Os títulos são expressos em !og10 VN50. Cada soro é titulado pelo menos duas vezes, de preferência quatro vezes. Exemplo 24: teste sobre cavalos de vCP2017.
Vacinas recombinadas, contendo vCP2017 (exemplo 18) formuladas extemporaneamente com 1 ml do adjuvante carbopol® 974P (4 mg/ml), foram injetadas duas vezes com 35 dias de intervalo em cavalos, com mais de 3 meses de idade, não vacinados, por via intramuscular sob um volume de aproximadamente 1 ml. Três grupos de animais foram vacinados, com doses de 105,8 DICC5o (seja 105,64 pfu) para o grupo 1,106,8DICCso (seja 106,64 pfu) para o grupo 2 e 107,8 DICC5o (seja 107,64 pfu) para o grupo 3. Um grupo prova não vacinado foi incorporado ao estudo. A sorologia foi observada. Os títulos em anticorpos neutralizantes foram estabelecidos e expressos em log10 VN50 conforme indicado no exemplo 23.

Claims (16)

1. Vacina para proteger os equinos, os caninos, os felinos, os bovinos, os suínos, os pássaros contra contra o vírus da febre do Nilo, caracterizada pelo fato de que compreende um ou vários vírus recombinados avipox, NYVAC ou MVA, e expressando as proteínas prM, M e E do vírus da febre do Nilo, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender um vírus recombinado avipox que expressa as três proteínas prM, M e E .
3. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de comportar um vírus recombinado avipox que compreende um polinucleotídeo, formando uma fase de leitura codificando para prM—M-E.
4. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 caracterizada pelo fato de o vírus recombinado ser um canarypox.
5. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 TPt5! 1p€SjLo fato de o vírus recombinado ser um fewlpox.
6. Vacina, de acordo com as reivindicações 1 a 5 caracterizada pelo fato de o polinucleotídeo codificar também para um peptídeo sinal.
7. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de tratar de um peptídeo sinal do vírus da febre do Nilo.
8. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato se tratar de um peptídeo sinal heterólogo.
9. Vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de se tratar de peptídeo sinal do ativador tissular do plasminógeno humano.
10. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de compreender, além disso, um adjuvante.
11. Vacina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato do adjuvante ser escolhido dentre (1) polímeros do ácido acrílico ou metacrílico e os polímeros de anidrido maleico e de derivado alquenila (2) as sequências imunoestimuladoras, (3) uma emulsão óleo-na- água, (4) os lipídios catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, (5) as citocinas.
12. Vacina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato do adjuvante ser um carbômero.
13. Vacina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato da citocina ser uma citocina equina ou uma citocina aviária.
14. Vacina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato da citocina ser escolhida dentre interleucina 10, interleucina 12, interleucina 15, MIP-la, GM-CSF.
15. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato da citocina ser escolhida dentre as interleucinas aviárias cIL-18, cIL-15.
16. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato da citocina ser a GM~CSF equina.
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