BRPI0210771B1

BRPI0210771B1 - construção de dna recombinante, método para a produção de um produto de gene em uma célula, e, uso de uma sequência de dna

Info

Publication number: BRPI0210771B1
Application number: BRPI0210771A
Authority: BR
Inventors: Arie Pieter Otte; Arthur Leo Kruckeberg
Original assignee: Chromagenics Bv
Priority date: 2001-07-04
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2015-12-22
Also published as: AU2002314629B2; ATE466944T1; DK1845162T3; EP1806407A2; US20070031933A1; US20070031935A1; SG143066A1; CA2450020A1; BR0210771A; EP1806407A3; EP1600510A2; DE60236379D1; EP1404872B1; AU2011202193A1; NO338477B1; BRPI0210771B8; US20070128717A1; ES2344072T3; US7749733B2; US7951586B2

Abstract

"métodos para selecionar uma seqüência de dna com uma qualidade moduladora da transcrição de gene, para identificar uma seqüência de dna com uma qualidade repressora da transcrição de gene, para detectar a presença de uma seqüência star e de um elemento star dentro de uma seqüência de ácido nucleico, para determinar se uma seqüência de ácido nucleico compreende uma seqüência star, e, para produzir um produto de gene em uma célula, seqüência de ácido nucleico isolada e/ou recombinante, seqüência de dna, seqüência star, coleção, construção de dna, uso de uma construção ou seqüência de dna, e, biblioteca de ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes". a invenção diz respeito à elucidação e identificação sistemáticas de seqüências reguladoras. a invenção fornece entre outros métodos de triagens e detecção com os quais as seqüências reguladoras podem ser identificadas. a invenção ainda fornece seqüências reguladoras e o uso destas em vários campos tais como, mas não limitados à produção de proteína, diagnósticos, plantas transgênicas e animais e ao campo terapêutico.

Description

‘‘CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE GENE EM UMA CÉLULA, E, USO DE UMA SEQUÊNCIA DE DNA.” A invenção diz respeito aos campos da medicina e da biologia celular. A ínvençao em particular diz respeito a meios e métodos para a regulagem da transcrição de gene. A invenção ainda diz respeito a meios e métodos para determinar se uma sequência de DNA compreende uma qualidade moduladora da transcrição de gene e/ou uma qualidade repressora da transcrição de gene.

Com a progressão dos vários projetos genômicos, as sequências genomas de organismos inteiros tem se tomado disponível A enxurrada de dados tem causado o interesse de muitos investigadores. Uma das descobertas mais notáveis foi a observação de que o genoma humano não codifica significantemente mais genes do que o genoma de organismos simples como a mosca das frutas. O foco de muitos investigadores está agora mudando da identificação de genes para a determinação da expressão dc gene c função de gene. Os exemplos de tais tecnologias são microsscrics de DNA, aplicações genômicas funcionais e proteômico. Estas tecnologias têm em Segue-se a página 2. comum que elas são centralizadas em tomo da função e expressão de sequências codifícadoras. Entretanto, embora o nosso conhecimento de genes aumente dramaticamente, o entendimento de como a expressão dos genes é regulada é que limita a capacidade para aplicar este conhecimento rapidamente crescente. Isto é por exemplo o caso na geração de plantas e animais transgênicos e na terapia de gene humano. Nestas aplicações o ácido nucleico estranho é tipicamente introduzido nas células para se obter a expressão de seqüências codifícadoras. freqüentemente a integração do ácido nucleico estranho no genoma da célula é requerido para a função prolongada das seqüências introduzidas. Entretanto, a integração de seqüências no genoma leva à não prognosticabilidade de expressão porque o DNA circundante influencia a transcrição das seqüências integradas. Esta não prognosticabilidade é em parte devido ao fato de que as seqüências introduzidas não podem ser fornecidas ainda com informação genética suficiente para isolar funcionalmente as seqüências integradas a partir dos efeitos que influenciam a transcrição do DNA circundante. Em uma outra parte isto é devido ao fato de que não é conhecido o suficiente a cerca dos efeitos que influenciam a transcrição de DNA circundante. A presente invenção diz respeito às seqüências de DNA que compreendem uma capacidade para influenciar a transcrição de genes em cis. Tipicamente, embora não necessariamente, as seqüências investigadas não codificam por si só uma proteína funcional. Vários elementos de seqüência com a capacidade para afetar a transcrição de gene em cis, foram identificados. Estes elementos variam de promotores, intensificadores e silenciadores até elementos limítrofes e regiões de ligação de matriz. O fato de que muitos tipos diferentes de seqüências reguladoras tenham sido descobertas dá a impressão de que é muito fácil planejar cassetes de expressão eficazes. Entretanto, exatamente o contrário é verdadeiro. O planejamento de cassetes de expressão é ainda freqüentemente direcionado por tentativa e erro. É muito freqüentemente possível se obter algum tipo de expressão de um gene estranho em uma célula alvo ou sua progênie. Entretanto, muito freqüentemente é difícil prognosticar com qualquer tipo de precisão o nível de expressão ou a persistência de expressão que um cassete de expressão pode demonstrar em uma célula alvo. A presente invenção fornece entre outros meios e métodos para detectar e isolar novos elementos reguladores de transcrição. Um método de detectar e opcionalmente selecionar, uma seqüência de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene é fornecido, que compreende fornecer um sistema de transcrição com uma variedade de vetores que compreendem fragmento, os ditos vetores compreendendo i) um elemento com uma qualidade repressora da transcrição de gene e ii) um promotor que direciona a transcrição de um gene repórter, o método ainda compreendendo realizar uma etapa de seleção no dito sistema de transcrição de modo a identificar a dita seqüência de DNA com a dita qualidade moduladora da transcrição de gene. Em uma forma de realização preferida os ditos fragmentos estão localizados entre i) o dito elemento com uma qualidade repressora da transcrição de gene e ii) o dito promotor que direciona ? transcrição do dito gene repórter. A RNA polimerase inicia o processo de transcrição depois da ligação a uma seqüência específica, chamada de promotora, que sinaliza onde a síntese de RNA deve começar. Uma qualidade moduladora pode realçar a transcrição do dito promotor em cis, em uma dado tipo de célula e/ou um dado promotor, a mesma seqüência de DNA pode compreender uma qualidade intensificadora em um tipo de célula ou com um tipo de promotor, ao passo que ela pode compreender uma outra ou nenhuma qualidade moduladora da transcrição de gene em outra célula ou com um outro tipo de promotor. A transcrição pode ser influenciada através de um efeito direto do elemento regulador (ou da(s) proteína(s) que se ligam a ela) na transcrição de um promotor particular. A transcrição entretanto, também pode ser influenciada por um efeito indireto, por exemplo porque o elemento regulador afeta a função de um ou mais outros elementos reguladores. Uma qualidade moduladora da transcrição de gene também pode compreender uma transcrição estável da qualidade do gene. Com estável é intencionado que o nível de transcrição observado não é significantemente mudado em pelo menos 30 divisões celulares. Uma qualidade estável é útil em situações em que as características de expressão devem ser prognosticável em muitas divisões celulares. Os exemplos típicos são linhas de célula transfectadas com genes estranhos. Outros exemplos são animais e plantas transgênicas e terapias de gene. Muito freqüentemente, cassetes de expressão introduzidos funcionam diferentemente depois de aumentar os números de divisões celulares ou gerações de planta ou animal. Em uma forma de realização preferida uma qualidade estável compreende uma capacidade para manter a transcrição de gene em gerações subseqüentes de uma planta ou animal transgênico. Naturalmente no caso em que a expressão é indutível a dita qualidade compreende a qualidade para manter a indutibilidade da expressão em gerações subseqüentes de uma planta ou animal transgênico. Freqüentemente, os níveis de expressão caem dramaticamente com o aumento dos números de divisões celulares. Com um método da invenção é possível detectar e opcionalmente selecionar uma seqüência de DNA que seja capaz de pelo menos em parte prevenir a queda dramática nos níveis de transcrição com o aumento de números de divisões celulares. Assim em uma forma de realização preferida a dita qualidade moduladora da transcrição de gene compreende uma transcrição estável da qualidade do gene. Surpreendentemente, os fragmentos que compreendem uma seqüência de DNA com a dita qualidade de transcrição de gene estável podem ser detectados e opcionalmente selecionados com um método da invenção, a despeito do fato de que o dito método não necessariamente mede a estabilidade de longa duração da transcrição. Em um forma de realização preferida da invenção a dita qualidade moduladora da transcrição de gene compreende uma qualidade intensificadora da transcrição de gene estável. Foi observado que a incorporação de uma seqüência de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene em um vetor de expressão com um gene de interesse, resulta em um nível mais alto de transcrição do dito gene de interesse, na integração do vetor de expressão no genoma de uma célula e além disso que o dito nível de expressão de gene mais alto é também mais estável do que na ausência da dita seqüência de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene.

Nos experimentos planejados para introduzir um gene de interesse no genoma de uma célula e para se obter a expressão do dito gene de interesse, o seguinte foi observado. Se junto com o dito gene de interesse também uma seqüência de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene foi introduzida, mais clones podem ser detectados que expressaram mais do que uma certa quantidade de produto de gene do dito gene de interesse, do que quando a dita seqüência de DNA não foi introduzida junto com o dito gene de interesse. Assim a presente invenção também fornece um método para aumentar o número de células que expressam mais do que um certo nível de um produto de gene de um gene de interesse no fornecimento do dito gene de interesse ao genoma das ditas células, que compreende fornecer a dita célula com uma seqüência de DNA que compreende uma qualidade moduladora da transcrição de gene junto com o dito gene de interesse.

As chances de detectar um fragmento com uma qualidade moduladora da transcrição de gene varia com a fonte a partir da qual os fragmentos são derivados. Tipicamente, não existe nenhum conhecimento anterior da presença ou ausência de fragmentos com a dita qualidade. Nestas situações muitos fragmentos não compreenderão uma seqüência de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene. Em uma destas situações uma etapa de seleção formal para seqüências de DNA com a dita qualidade é introduzida. Isto é feito pelos vetores de seleção que compreendam a dita seqüência com base em uma característica de um produto do dito gene repórter, que pode ser selecionado para ou contra. Por exemplo, o dito produto de gene pode induzir fluorescência ou um depósito de cor (por exemplo proteína fluorescente verde e derivados, luciferase ou alcalino fosfatase) ou conferir resistência a antibiótico ou induzir apoptose e a morte celular.

Um método da invenção é particularmente adaptado para detectar e opcionalmente selecionar uma seqüência de DNA que compreende uma qualidade intensificadora da transcrição de gene. Foi observado que pelo menos algumas das seqüências de DNA selecionadas, quando incorporadas em um vetor de expressão que compreende um gene de interesse, podem aumentar dramaticamente a transcrição de gene do dito gene de interesse em uma célula hospedeira mesmo quando o vetor não compreende um elemento com uma qualidade que reprima a transcrição de gene. Esta qualidade intensificadora da transcrição de gene é muito útil em linhas de célula transfectadas com genes estranhos ou em animais e plantas transgênicas. O dito sistema de transcrição pode ser um sistema de transcrição in vitro isento de célula. Com a perícia corrente em automação tais sistemas isentos de célula podem ser precisos e rápidos. Entretanto, para a presente invenção o dito sistema de transcrição preferivelmente compreende célula hospedeiras. O uso de células hospedeiras permite que fragmentos sejam detectados e opcionalmente selecionados com atividade em células.

Um elemento com uma qualidade repressora da transcrição de gene, em um método da invenção, reprimirá a transcrição de um promotor no sistema de transcrição usado. A dita repressão não tem que levar a níveis de expressão indetectáveis. Importante é que a diferença nos níveis de expressão na ausência ou na presença de repressão seja detectável e opcionalmente selecionável. Em uma forma de realização preferida a repressão na transcrição de gene nos ditos vetores resulta na cromatina que reprime a transcrição de gene. Nesta forma de realização preferida as seqüências de DNA podem ser detectadas e opcionalmente selecionadas de modo que sejam capazes de pelo menos em parte contra-atacar a formação de cromatina que reprime a transcrição de gene. Em um aspecto uma seqüência de DNA capaz de pelo menos em parte contra-atacar a formação da cromatina que reprime a transcrição de gene compreende uma transcrição estável da qualidade do gene. Em uma forma de realização preferida a seqüência de DNA envolvida na repressão da transcrição de gene é uma seqüência de DNA que é reconhecida por um complexo de proteína e em que o dito sistema de transcrição compreende o dito complexo. Preferivelmente o dito complexo compreende uma proteína que liga a heterocromatina que compreende HP1, uma proteína grupo Policomb (Pc-G), uma atividade de histona desacetilase ou MeCP2 (proteína de ligação de metil-CpG). Muitos organismos compreendem uma ou mais destas proteínas. Estas proteínas freqüentemente também exibem atividade em outra espécie. O dito complexo pode assim compreender também proteínas de duas ou mais espécies. O conjunto mencionado de complexos de proteína associados com a cromatina conhecidos são capazes de comunicar a repressão de faixa longa em muitos pares de base. Os complexos também estão envolvidos em transferir estavelmente a situação reprimida dos genes para as células filhas na divisão celular. As seqüências selecionadas deste modo são capazes de comunicar a anti-repressão de faixa longa em muitos pares de base (van der Vlag et al., 2000). O vetor usado pode ser qualquer vetor que seja adequado para clonar DNA e que possa ser usado em um sistema de transcrição. Quando células hospedeiras são usadas é preferido que o vetor seja um vetor que replique epissomicamente. Deste modo, os efeitos devido a sítios diferentes de integração do vetor são evitados. Os elementos de DNA que flanqueiam o vetor no sítio de integração pode ter efeitos no nível de transcrição do promotor e desse modo imitar os efeitos de fragmentos que compreendem seqüências de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene. Em um forma de realização preferida o dito vetor compreende uma origem de replicação do vírus de Epstein-Barr (EBV), OriP e um antígeno nuclear (EBNA-1). Tais vetores são capazes de replicar em muitos tipos de células eucarióticas e agregar na cromatina sob condições apropriadas.

Em um outro aspecto a invenção fornece uma seqüência de DNA que compreende i) uma seqüência de DNA isolada de uma planta ou vertebrado ou derivados desta ou ii) uma seqüência de DNA sintética ou uma construída por meio da engenharia genética, seqüência de DNA esta que é uma seqüência inibidora de repressão que, pelo método de acordo com a presente invenção pode ser detectada, selecionada e opcionalmente clonada. Em um outro aspecto a invenção fornece uma seqüência de DNA que compreende i) uma seqüência de DNA isolada de uma planta ou vertebrado ou derivados desta ou ii) uma seqüência de DNA sintética ou uma construída por meio da engenharia genética, seqüência de DNA esta que é detectada, selecionada e opcionalmente clonada por meio do método da invenção. Preferivelmente a dita seqüência de DNA compreende uma seqüência como representada na Tabela 4A ou um homólogo funcional desta. Um homólogo funcional de uma seqüência como representada na Tabela 4 é um derivado de seqüência com a informação dada na Tabela 4 (seja ela a tabela 4A ou tabela 4B). Por exemplo, uma seqüência que pode ser derivada de uma seqüência na Tabela 4 suprimindo-se, modificando-se e/ou inserindo-se bases em ou de uma seqüência listada na Tabela 4, em que a dita seqüência derivada compreende a mesma atividade em tipo, não necessariamente em quantidade, de uma seqüência como representada na Tabela 4. Um homólogo funcional é ainda uma seqüência que compreende uma parte de duas ou mais seqüências representadas na Tabela 4. Uma seqüência de DNA sintética é uma seqüência que não é derivada direta ou indiretamente de uma seqüência presente em um organismo. Por exemplo uma seqüência que compreenda uma seqüência scs ou scs’ de drosófila não é uma seqüência sintética, mesmo quando as seqüências scs ou scs’ foram artificialmente geradas.

Em um aspecto, a invenção diz respeito a aumentar o conhecimento da regulagem de gene de ordem superior e a meios e métodos para utilizar este conhecimento. Visto que elementos, tais como promotores e intensificadores clássicos, foram caracterizados que direcionam e regulam a transcrição de genes únicos, elementos reguladores de ordem superior que controlam as capacidades de transcrição de gene de regiões cromossômicas inteiras têm até agora recebido pouca atenção. Muito do nosso conhecimento com respeito a tais elementos de ordem superior vem do estudo da embriogênese. Durante a embriogênese as células tomam-se comprometidas com caminhos de desenvolvimento diferentes. Uma vez comprometidas, as células raramente mudam seus destinos, mesmo depois de muitas divisões celulares.

De modo crescente tem se tomado claro que a transmissão estável dos padrões de transcrição de gene específicos do tipo de célula não é dependente do contexto de um promotor, mas é ao invés disso mediada pelas mudanças na estrutura do DNA e proteínas associadas, denominadas cromatina. A regulagem de gene ao nível cromossômico envolve modificações de DNA (por exemplo metilação), histonas, (por exemplo acetilação e/ou metilação) e interações de longa duração entre elementos cromossômicos distantes. O padrão de cromatina é um complexo altamente condensado de DNA, proteínas de histonas e que não de histona, que é capaz de empacotar o genoma inteiro no núcleo e simultaneamente permite a transcrição apropriada de genes específicos. O cromossoma eucariótico não é um padrão uniforme para a ativação da transcrição de gene. Tipos diferentes de cromatina e regiões de cromatina podem ser distinguidas, que diferencialmente afetam a transcrição de gene. As chamadas regiões de heterocromatina identificam estruturas de cromatina ‘fechada’ ao passo que a eucromatina está associada com uma estrutura de cromatina mais difusa e ‘aberta’. A região de eucromatina pode ser submetida às mudanças estruturais, que resultam em estruturas mais ou menos condensadas, aludidas como heterocromatina e eucromatina facultativas. Acredita-se que a formação de eucromatina ou heterocromatina facultativas represente o mecanismo subjacente da regulagem de gene mediada pela cromatina, mantendo os genes em um estado ativo ou um reprimido, em uma maneira específica do tipo de célula.

Em todos os eucariotas diversos complexos de proteína associados com a cromatina foram identificados que são envolvidos na manutenção da especificidade do tipo de célula, um dos quais é o complexo do grupo Policomb (PcG). O complexo PcG está envolvido na repressão estável de genes, nos quais acredita-se que as mudanças na estrutura da cromatina desempenhe um papel importante. Similarmente, uma segunda classe de proteínas, denominadas o grupo tritorax (TrG), foram identificadas que contra-atacam a ação das proteínas PcG. As proteínas TrG estão envolvidas na manutenção da transcrição de gene. Com base nos seus respectivos modos de ação, as proteínas PcG e TrG representam portanto um sistema de memória celular que é importante para a transmissão hereditária dos padrões de transcrição de gene.

Como os complexos de PcG e TrG estão associados com os seus genes alvo é ainda incerto. Estudos genéticos têm caracterizado sequências reguladoras que atuam em cis que mantêm estados transcricionalmente inativos de genes. O silenciamento mediado por estas seqüências reguladoras que atuam em cis é dependente da presença de proteínas PcG funcionais e por este motivo estas seqüências foram denominadas elementos de resposta PeG (PREs). As seqüências foram identificadas que são envolvidas na repressão mediada pela PcG de cromatina. Até agora entretanto, (tanto em vertebrados quanto em plantas) PREs completos que compreendam toda a informação de seqüência requerida para mediar a repressão da cromatina não foram descobertos.

Além disso, até agora, não foi possível estudar seqüências com capacidades de repressão de faixa longa em uma maneira coerente. Isto é em grande parte devido à incapacidade para triar sistematicamente quanto a tais seqüências que atuam em faixa longa. Em um aspecto a invenção fornece meios e métodos para detectar sistematicamente detectar tais seqüências em DNA. Em uma forma de realização a invenção fornece um método para identificar uma seqüência de DNA com uma qualidade repressora da transcrição de gene que compreende, - fornecer uma coleção de ácidos nucleicos de teste, - gerar uma coleção de vetores de expressão que compreende ácidos nucleicos de teste e um primeiro gene repórter sob o controle transcricional de um promotor, - fornecer células com a dita coleção de vetores de expressão, - selecionar uma célula ou progênie contendo vetor desta em que a transcrição do dito primeiro gene repórter é reprimida, e - identificar o dito ácido nucleico de teste na dita célula. O dito ácido nucleico de teste identificado compreende a capacidade para reprimir a dita função promotora e assim compreende uma qualidade repressora da transcrição de gene. Preferivelmente, o dito ácido nucleico de teste identificado também é recuperado e clonado. A dita qualidade compreende pelo menos em parte, a capacidade para reduzir o nível de transcrição do dito promotor quando fisicamente ligado ao dito promotor, comparado com o nível na ausência da seqüência de DNA com a dita qualidade. Em uma forma de realização preferida a dita qualidade repressora da transcrição de gene compreende uma qualidade de cromatina que reprime a transcrição de gene. Isto é, em que a dita redução do nível de transcrição é o resultado da cromatina tendo uma transcrição de gene que reprime a configuração. Esta configuração preferivelmente abrange o dito promotor. Entretanto, também é possível que a dita configuração abranja um intensificador ou coisa parecida desse modo inativando pelo menos em parte o efeito intensificador da transcrição do dito intensificador sobre o dito promotor. Em uma forma de realização particularmente preferida a dita seqüência de DNA com uma qualidade de cromatina que reprime a transcrição de gene compreende um elemento responsivo igual ao grupo policomb.

Usando o método mencionado acima é possível recuperar diversas seqüências de ácido nucleico que compreendem a capacidade para reduzir o nível de transcrição de um promotor e assim as seqüências de ácido nucleico que compreendem uma qualidade repressora da transcrição de gene. As seqüências com função análogas podem ser comparadas entre si quanto às similaridades de seqüência tal que uma ou mais seqüências de consenso para elementos com uma qualidade repressora da transcrição de gene tais como elementos responsivos iguais ao grupo policomb, podem ser deduzidas. Além disso, considerando que seqüências inteiras de genomas de organismo são conhecidas e mais seguirão em breve, é possível triar estes genomas ou partes destes e prognosticar a ocorrência destas seqüências no genoma. O conhecimento da ocorrência e localização de seqüências de DNA que compreendem qualidades moduladoras da transcrição de gene e/ou qualidades que reprimem a transcrição de gene no genoma aumentará enormemente o nosso conhecimento de regulagem de ordem superior de transcrição de gene no genoma.

Um elemento de resposta do grupo Policomb é um elemento que é capaz de reprimir a transcrição de um promotor em resposta à interação direta e/ou indireta de uma ou mais proteínas do grupo Policomb com o dito elemento. Um elemento de resposta igual ao grupo policomb é um elemento de resposta do grupo Policomb ou altemativamente ele é um elemento capaz de reprimir a transcrição de um promotor na interação direta e/ou indireta de uma ou mais proteínas com o dito elemento, em que a dita uma ou mais proteínas não pertencem ao grupo Policomb, mas em que como um resultado da dita interação a cromatina que reprime a transcrição de gene é formada. Os exemplos de tais proteínas são proteínas associadas à cromatina tais como proteína 1 de heterocromatina (HP1) (Eisenberg et al, 1990). Uma outra proteína associada à cromatina que reprime a atividade do gene é a proteína de ligação de metil-CpG, MeCP2 (Nan et al., 1997). Em um forma de realização preferida um elemento responsivo igual ao grupo policomb da invenção compreende a capacidade para reprimir a transcrição de um promotor em distâncias longas, preferivelmente em mais do que 2000 pares de base (van der Vlag et al., 2000).

Uma coleção de ácidos nucleicos de teste pode ser gerada de muitas maneiras. Usando seqüências artificiais como ácidos nucleicos de teste é possível se obter uma seqüência de consenso para uma qualidade repressora da transcrição de gene. Qualidades diferentes podem compreender seqüências de consenso diferentes. Preferivelmente a dita coleção é gerada a partir de DNA cromossômico. Deste modo uma qualidade repressora da transcrição de gene que compreende uma seqüência que ocorre naturalmente no cromossoma é encontrada. Esta tem a vantagem de que a localização destas qualidades no cromossoma pode ser determinada depois do que a sua influência sobre a transcrição de gene de ordem superior na dita localização pode ser resolvida.

Um gene repórter é um gene que codifica um produto de expressão a presença do qual pode ser detectada direta ou indiretamente em uma célula. Nos métodos para detectar uma transcrição de gene, que reprima a qualidade, a transferência de um vetor de expressão dentro de uma célula levará à expressão do dito gene repórter. Entretanto, no caso em que o ácido nucleico de teste compreende uma qualidade repressora da transcrição de gene, tal como um elemento responsivo igual ao grupo policomb, a expressão será reprimida na dita célula levando desse modo a uma expressão reduzida pelo menos em parte do dito gene repórter. A presença ou ausência de um ácido nucleico capaz de reprimir a transcrição do dito promotor pode ser assim detectada detectando-se o dito produto de expressão na dita célula, por meio da qual a detecção reduzida ou nenhuma detecção indica a presença de uma qualidade repressora da transcrição de gene. Um gene repórter pode codificar uma proteína repórter fluorescente. A expressão reduzida pode ser depois detectada por meio fluorimétrico por exemplo em um citômetro de fluxo. As células que não demonstram nenhuma ou baixa fluorescência podem ser selecionadas usando um selecionador de célula ativado por fluorescência e o vetor de expressão e/ou o ácido nucleico de teste isolado, por exemplo por meio de uma reação de amplificação. Preferivelmente, o dito primeiro gene repórter compreende um gene repórter selecionável, a expressão do qual direta ou indiretamente fornece a dita célula com pelo menos uma desvantagem de desenvolvimento em relação às células que não expressam ou que expressam níveis baixos do dito primeiro gene repórter. Nos casos onde as seqüências de DNA com uma qualidade repressora da transcrição de gene são triadas, a expressão do dito primeiro gene repórter é, preferivelmente, direta ou indiretamente tóxica à dita célula. Exemplos não limitantes de um tal produto de expressão tóxico é a ricina ou variantes tóxicas desta. Em um outro exemplo, o dito primeiro gene repórter codifica um produto de gene que induz a apoptose. Preferivelmente o dito produto de gene que induz a apoptose compreende o adenovírus 13S EIA ou um equivalente funcional deste (Breckenridge e Shore, 2000). Em uma outra forma de realização o dito produto de gene que induz a apoptose compreende apoptina ou um equivalente funcional desta (Pietersen e Notebom, 2000).

Um outro exemplo é um gene que codifica um assim chamado de produto suicida tal como a timidina quinase do vírus simples do herpes (HSV tk). A adição de ganciclovir às culturas de células que expressam HSV-tk resultará na formação de uma substância tóxica nestas células e portanto matará estas células. Em uma forma de realização particularmente preferida o dito gene suicida compreende a citosina desaminase. A citosina desaminase converte a citosina para uracila. Esta atividade de enzima é encontrada em procariotas e eucariotas inferiores, mas é ausente em eucariotas superiores. O gene é usado como um gene suicida metabólico em combinação com o pró medicamento 5-fluorocitosina (5-FC). A citosina desaminase é capaz de converter a 5-FC não tóxica em 5-fluorouracila, que mata as células pela interrupção da síntese de DNA, deflagrando desse modo a apoptose (Mullen et al., 1992; Wei e Huber, 1996).

Um promotor que controla a transcrição do dito primeiro gene repórter pode ser qualquer promotor que seja ativo ou possa ser ativado nas ditas células. Selecionando-se um promotor particular, é possível selecionar uma qualidade repressora da transcrição de gene tal como um elemento responsivo igual ao grupo policomb capaz de reprimir a transcrição do dito promotor particular. Deste modo é possível selecionar qualidades que especificamente reprimam a classe de promotores à qual o dito promotor particular pertence. Em uma forma de realização preferida o dito promotor compreende um promotor do qual a atividade pode ser induzida fornecendo uma célula que compreenda o dito promotor com um sinal. Um tal promotor indutível preferivelmente compreende um promotor responsivo pela tetraciclina. O sinal aqui sendo tetraciclina, doxiciclina e compostos equivalentes. Tais promotores também podem ser adaptados para a responsividade à tetraciclina em células eucarióticas (Yin et al., 1996). As moléculas promotoras e condutoras são disponíveis que induzem ou reprimem a expressão de um gene, na adição de tetraciclina ou equivalentes desta.

As células transfectadas com um vetor de expressão da invenção não podem, com uma ffeqüência tipicamente baixa e por razões não associadas com a presença de uma seqüência de DNA com uma qualidade repressora da transcrição de gene, expressar quantidades detectáveis de produto de expressão do dito primeiro gene repórter. Isto pode ser devido, por exemplo, a uma evento de recombinação que interrompe a seqüência codificadora do dito primeiro gene repórter. Em uma forma de realização preferida da invenção a dita coleção de vetores de expressão ainda compreende um segundo gene repórter. A expressão do dito segundo gene repórter está preferivelmente sob o controle de um segundo promotor. Os métodos para a detecção da expressão de um produto de expressão do dito segundo gene repórter podem ser usados para confirmar a expressão que reprime a atividade do dito ácido nucleico de teste, desse modo reduzindo pelo menos em parte o número de células que falsamente não expressam o dito primeiro gene repórter. Em uma forma de realização preferida o dito segundo gene repórter é usado para selecionar células que compreendam um cassete de expressão. Deste modo, as células que não compreendam o dito cassete de expressão podem ser facilmente desconsideradas. Para esta finalidade o dito produto de expressão do dito segundo gene repórter preferivelmente compreende um gene repórter selecionável dominante positivo. Preferivelmente, o dito gene repórter selecionável dominante positivo codifica um produto de expressão capaz de conferir resistência a um composto de outro modo tóxico. Os exemplos não limitante são resistência à G418 e resistência à higromicina.

Considerando que uma qualidade repressora da transcrição de gene possa suprimir a transcrição é preferido que nesta forma de realização um vetor de expressão ainda compreenda pelo menos uma seqüência de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene, capaz de contra- atacar os efeitos que reprimem a transcrição de uma seqüência de DNA com uma qualidade repressora da transcrição de gene. A colocação do dito elemento que contra-ataca a transcrição no vetor de expressão é preferivelmente tal que ele eficazmente interfere com um efeito redutor da dita qualidade repressora da transcrição de gene que podería ter ao nível de transcrição do dito segundo gene repórter. Em uma forma de realização preferida a dita seqüência de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene funcionalmente separa os cassetes de expressão que compreendem o dito primeiro e o dito segundo genes repórter. Preferivelmente, o dito segundo gene repórter (e o promotor que controla a transcrição do dito segundo gene repórter) é flanqueado pelas seqüências de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene. Os exemplos de seqüências de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene são o assim chamado de elementos STAR listados nas Tabelas 1 e 2.

Os métodos da invenção resultam na clonagem e identificação de vários elementos que compreendem uma modulação da transcrição de gene e/ou uma qualidade repressora da transcrição de gene. Um tal elemento pode conter ácido nucleico irrelevante que não é útil na realização da dita qualidade, por exemplo não envolvido na formação da cromatina que reprime a transcrição de gene. As seqüências funcionais em tais elementos podem ser delineadas por vários métodos conhecidos na técnica. Em uma forma de realização as supressões e/ou substituições são feitas em uma seqüência de DNA com uma modulação da transcrição de gene ou uma qualidade repressora da transcrição de gene. O DNA que é modificado de um tal modo é testado quanto a atividade em um método da invenção. Isto pode ser feito usando um único ácido nucleico modificado ou gerando-se uma coleção de ácidos nucleicos de teste que compreendam o dito ácido nucleico modificado. A elucidação de seqüências funcionais dentro de seqüências de DNA da invenção permite a elucidação de seqüências de consenso para os elementos com uma qualidade moduladora da transcrição de gene e/ou uma repressora da transcrição de gene. Considerando que existem diversos complexos iguais ao grupo policomb que cada um compreende funcionalidades e padrões de expressão diferentes, é esperado que mais do que um tipo de seqüência de consenso seja encontrado com um método da invenção. Analogamente é esperado que mais do que um tipo de seqüência de consenso seja encontrado para um elemento que compreenda uma qualidade moduladora da transcrição de gene. A invenção assim ainda fornece uma biblioteca de ácidos nucleicos isolada e/ou recombinante que compreenda qualidades moduladoras da transcrição de gene e/ou repressoras da transcrição de gene tais como elementos de resposta iguais ao grupo policomb. Em uma forma de realização a dita biblioteca compreende ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes que compreendem a mesma seqüência de consenso. Em uma forma de realização preferida a dita biblioteca compreende mais do que um tipo de seqüência de consenso. A dita biblioteca pode ser usada por exemplo para determinar se uma dada molécula de DNA compreende uma qualidade moduladora de DNA. Em uma forma de realização preferida a dita biblioteca compreende essencialmente todos os elementos com uma função intensificadora da transcrição de gene, elementos que compreendem uma transcrição estável da qualidade do gene e/ou elementos com uma qualidade repressora da transcrição de gene tais como os elementos de resposta iguais ao grupo policomb, de um cromossoma. Junto com o conhecimento sobre a localização destes elementos em um cromossoma isto permite que uma pessoa habilitada na técnica gere um prognóstico para a regulagem de ordem superior da expressão de gene de genes naturalmente presentes no dito cromossoma e para genes (ácido nucleico estranho) introduzidos no dito cromossoma por meios recombinantes. Um tal prognóstico pode ser usado por exemplo para selecionar uma localização candidata adequada no dito cromossoma para a inserção de DNA estranho. Uma localização adequada pode ser uma localização esperada ser especificamente expressada em uma certa célula, tipo de célula e/ou tecido. Preferivelmente, o dito cromossoma compreende o cromossoma 21 ou o cromossoma 22. Em uma forma de realização particularmente preferida todas as seqüências de DNA que compreendem uma modulação da transcrição de gene ou uma qualidade repressora da transcrição de gene em uma célula, estão na biblioteca. Nesta forma de realização o genoma inteiro pode ser usado para o prognóstico de uma localização candidata adequada. Em uma forma de realização a dita biblioteca foi gerada em linhas de célula diferentes de espécies que variam de plantas a seres humanos. Em linhas de célula diferentes e/ou espécies diferentes proteínas (ou complexos de proteína) capazes de interagir com as seqüências de DNA com uma qualidade repressora da transcrição de gene, serão expressadas, resultando em elementos de DNA diferentes com uma qualidade repressora da transcrição de gene. Similarmente proteínas diferentes que interagem direta ou indiretamente com as seqüências de DNA que compreendem uma qualidade moduladora da transcrição de gene serão expressadas. Portanto a composição da biblioteca é dependente do tipo de célula e dependente da presença das proteínas relevantes. Isto também é o caso com elementos de resposta iguais ao grupo policomb. Se HP1 é expressado em célula do tipo um, os elementos que dependem de HP1 serão detectados pelo método da invenção. Se HP1 não é expressado em célula do tipo dois, o método da invenção não detectará o elemento que foi recuperado da célula do tipo um.

Em um aspecto da invenção a dita biblioteca compreende pelo menos um elemento capaz de contra-atacar pelo menos em parte a formação da cromatina que reprime a transcrição de gene. Junto com o conhecimento da localização de seqüências de DNA com uma qualidade repressora da transcrição de gene em um cromossoma ou genoma, o conhecimento da localização de tais elementos contra-atacantes permite o prognóstico mais preciso da regulagem de ordem superior da transcrição de gene de genes (inseridos) no dito cromossoma ou genoma. Preferivelmente, a dita biblioteca ainda compreende outros elementos reguladores da transcrição tais como intensificadores e silenciadores. Embora tais seqüências tenham influência limitada sobre a regulagem de gene de ordem superior, a informação sobre a localização de tais outras seqüências aumenta ainda mais a precisão do prognóstico em localizações adequadas no genoma para a expressão de seqüências estranhas introduzidas nele. Preferivelmente, a dita biblioteca compreende essencialmente todas as seqüências de DNA que compreendem uma qualidade moduladora da transcrição de gene e/ou todas as outras seqüências reguladoras de um cromossoma.

Considerando que um cromossoma tipicamente já consiste de diversas dezenas de milhões de bases, é preferido que a informação que a biblioteca pode dar na regulagem de gene de ordem superior é incorporada em um sistema pelo menos parcialmente auto-conjugado.

Um outro uso de uma biblioteca da invenção é a geração de um prognóstico na transcrição de genes na modificação alvejada de seqüências em um cromossoma tal que seqüências reguladoras de “ordem superior” sejam mutadas. Por exemplo, um ou mais elementos responsivos iguais ao grupo policomb da invenção e/ou outros elementos reguladores no dito cromossoma podem ser mutados. Isto é esperado mudar os níveis de transcrição dos genes que estão na vicinidade dos elementos responsivos iguais ao grupo policomb e/ou outros elementos moduladores da expressão. Já um outro uso de uma biblioteca ou sistema da invenção é o prognóstico da expressão de gene que resulta de mutações no genoma. Nos casos onde uma mutação resulta na transcrição de gene alterada, a detecção de tal transcrição de gene alterada pode indicar a presença da dita mutação que ocorre naturalmente. Este método é útil por exemplo na limitação do número de seqüências ou proteínas a serem testadas em um ensaio de diagnóstico. Isto é particularmente importante em métodos de microssérie porque nestes métodos o número de seqüências expressadas a serem testadas é limitado pelo número de seqüências que uma série pode maximamente manter. Com meios e métodos da invenção é possível limitar o número de seqüências a serem testadas em métodos de microssérie. Já um outro uso de um sistema ou biblioteca da invenção é a descoberta de alvos de medicamento. Elementos reguladores, sejam eles elementos de “ordem superior” ou não, funcionam por causa da proteína (complexos) que podem ligar-se a eles. Um sistema da invenção pode ser usado para determinar se o alvejamento de medicamentos para interferir com a ligação ou função de uma proteína particular (complexo) mantém o compromisso quanto a alteração da expressão de um gene particular. A invenção ainda fornece uma seqüência de DNA que compreende uma qualidade que reprima a transcrição de gene obtenível por um método da invenção. Em uma forma de realização preferida a dita seqüência de DNA que compreende uma qualidade repressora da transcrição de gene é derivada de um vertebrado de uma planta. Mais preferivelmente, a dita seqüência de DNA que compreende uma qualidade repressora da transcrição de gene compreende uma seqüência de acordo com a tabela 4 B ou um homólogo funcional desta. Também é possível fornecer uma construção de DNA com uma seqüência de DNA da invenção ou modificar uma tal seqüência de DNA. Em uma forma de realização preferida uma construção de DNA é fornecida que compreende um promotor operavelmente ligado com um ácido nucleico de interesse. Preferivelmente, a quantidade de atividade de uma qualidade da dita seqüência de DNA com uma modulação da transcrição de gene e/ou que reprime a qualidade, é dependente da orientação da dita seqüência de DNA na dita construção, comparado com o dito promotor. Preferivelmente a dita modulação da transcrição de gene e/ou que reprime a qualidade é dependente da presença de um sinal. Preferivelmente, o dito sinal compreende uma proteína de ligação de DNA.

Preferivelmente, o dito sinal compreende uma proteína TAT do vírus da imunodeficiência humana.

Um dos usos de uma seqüência de DNA que compreende uma qualidade moduladora da transcrição de gene ou uma qualidade repressora da transcrição de gene é naturalmente a regulagem da transcrição de um gene de interesse. A transcrição de um gene de interesse pode ser alterado alterando-se seqüências na vicinidade do dito gene tal que uma seqüência de DNA com a dita qualidade seja fornecida ou removida. As características de expressão específicas podem ser planejadas combinando-se (partes de) seqüências de DNA com uma modulação da transcrição de gene e/ou uma qualidade repressora da transcrição de gene. Por exemplo, a duplicação de uma seqüência com uma transcrição estável da qualidade do gene em um vetor de expressão levará à estabilidade melhorada da expressão em uma célula alvo ou progênie na introdução do dito vetor na dita célula alvo. Combinando-se as seqüências de DNA com as qualidades de modulação da transcrição de gene alteradas, qualidades de modulação da transcrição de gene podem ser geradas em tipo ou quantidade ou ambas.

Também é possível planejar seqüências de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene e/ou uma repressora da transcrição de gene desejada. As proteínas de ligação de DNA junto com outras proteínas e seqüências de DNA determinam as qualidades da seqüência de DNA. É possível inserir uma ou mais outras seqüências de DNA de ligação de proteína em uma seqüência de DNA com uma qualidade. Permitindo-se a ligação da(s) proteína(s) de ligação é possível interferir com ou direcionar, a qualidade, permitindo assim a geração de seqüências de DNA com qualidades planejadas. Também é naturalmente possível remover sítios de ligação de proteína de uma seqüência de DNA com uma modulação particular da transcrição de gene e/ou uma qualidade repressora da transcrição de gene alterando desse modo a qualidade da seqüências de DNA resultante. A combinação de adição e remoção também é possível. A modulação particular da transcrição de gene e/ou qualidades que reprimem a transcrição de gene pode ser selecionada sintonizando-se métodos de detecção descritos na r presente invenção. E possível, por exemplo sintetizar seqüências de DNA com a modulação indutível das qualidades de transcrição de gene e/ou que reprimem a transcrição de gene. Pela inclusão, por exemplo de elementos de ligação de TAT em uma seqüência de DNA que compreende uma qualidade repressora da transcrição de gene, é possível pelo menos em parte inativar a qualidade que reprime a transcrição de gene em uma célula que compreende TAT. Similarmente existem proteínas de ligação de DNA disponíveis que apenas se ligam à sua seqüência alvo na ausência ou presença de um sinal. Exemplos não limitantes de tais proteínas são o repressor TET e as várias mutações deste, o repressor lac, os receptores de hormônio esteróide, o receptor de ácido retinóico e derivados. É possível por exemplo planejar uma seqüência de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene e/ou repressora da transcrição de gene específica do tipo de célula. Por exemplo, no caso do exemplo TAT mencionado acima. A seqüência de DNA aludida pode ser feita específica para células infectadas por HIV que expressam TAT. Altemativamente, a seqüência de DNA pode ser feita específica para um complexo de proteína que é expressado em uma maneira específica do tipo de célula.

As construções de expressão compreendendo uma seqüência de DNA que compreende uma qualidade moduladora da transcrição de gene e/ou repressora da transcrição de gene são adequadas para se obter a expressão da dita construção em células que compreendem mais do que uma cópia da dita construção de expressão. Também quando a construção de expressão está presente no genoma da dita célula e, também quando o cassete de expressão está presente em mais do que uma cópia na dita célula. Além disso, elas ainda funcionam quando integradas na mesma posição em mais do que uma cópia.

Em uma forma de realização preferida da invenção a dita seqüência de DNA com uma qualidade moduladora da transcrição de gene compreende uma seqüência chamada de STAR, (Estabilizadora Anti-Repressão). Uma seqüência STAR como aqui usado refere-se a uma seqüência de DNA que compreende uma ou mais das qualidades de modulação da transcrição de gene mencionadas.

Diversos métodos são disponíveis na técnica para extrair identificadores de seqüência de uma família de seqüências de DNA que compartilham uma certa característica comum. Tais identificadores de seqüência podem ser subseqüentemente usados para identificar seqüências que compartilham um ou mais identificadores. As seqüências que compartilham tal um ou mais identificadores são prováveis de serem um membro da mesma família de seqüências, isto é são prováveis de compartilhar a característica comum da família. No presente pedido um número grande de seqüências que compreendem a atividade STAR (chamadas de seqüências STAR) foram usadas para se obter identificadores de seqüência (padrões) que são característicos para as seqüências que compreendem a atividade STAR. Estes padrões podem ser usados para determinar se uma seqüência de teste é provável conter a atividade STAR. Em um aspecto a invenção fornece assim um método para detectar a presença de uma seqüência STAR dentro de uma seqüência de ácido nucleico de cerca de 50 a 5000 pares de base, que compreende determinar a ffeqüência de ocorrência na dita seqüência de pelo menos um padrão de seqüência e determinar que a dita ffeqüência de ocorrência é representativa da ffeqüência de ocorrência do dito pelo menos um padrão de seqüência em pelo menos uma seqüência que compreende uma seqüência STAR. Em princípio qualquer método é adaptado para determinar se um padrão de seqüência é representativo de uma seqüência STAR. Muitos métodos diferentes são disponíveis na técnica. Em uma forma de realização preferida da invenção a etapa de determinar que a dita ocorrência é representativa da frequência de ocorrência do dito pelo menos um padrão de seqüência em pelo menos uma seqüência compreendendo uma seqüência STAR compreende, determinar que a freqüência de ocorrência do dito pelo menos um padrão de seqüência significantemente difere entre a dita pelo menos uma seqüência STAR e pelo menos uma seqüência de controle. Em princípio qualquer diferença significante é discriminativa quanto a presença de uma seqüência STAR. Entretanto, em uma forma de realização particularmente preferida a freqüência de ocorrência do dito pelo menos um padrão de seqüência é significantemente mais alto na dita pelo menos uma seqüência que compreende uma seqüência STAR comparada à dita pelo menos uma seqüência de controle.

Um número considerável de seqüências que compreendem uma seqüência STAR foi identificado na presente invenção. É possível usar estas seqüências para testar quão eficiente um padrão é na discriminação entre uma seqüência de controle e uma seqüência que compreende uma seqüência STAR. Usando assim a chamada análise discriminante é possível determinar, com base em qualquer conjunto de seqüências STAR em uma espécie, os padrões de seqüência discriminativa mais ótima ou combinação destes. Assim, preferivelmente, pelo menos um dos ditos padrões é selecionado com base em uma discriminação desejada e preferivelmente uma ótima entre a dita pelo menos uma seqüência que compreende uma seqüência STAR e uma seqüência de controle. Uma discriminação desejada pode ser um certo fator de significância associado com o padrão através da bioinformática.

Em uma forma de realização preferida a freqüência de ocorrência de um padrão de seqüência em um ácido nucleico de teste é comparada com a freqüência de ocorrência em uma seqüência conhecida conter uma seqüência STAR. Neste caso um padrão é considerado representativo para uma seqüência que compreende uma seqüência STAR se as freqüências de ocorrência são similares. Em uma forma de realização preferida um outro critério é usado. A freqüência de ocorrência de um padrão em uma seqüência que compreende uma seqüência STAR é comparada com a freqüência de ocorrência do dito padrão em uma seqüência de controle. Comparando-se as duas freqüências é possível determinar para cada padrão assim analisado, se a freqüência na seqüência que compreende a seqüência STAR é significantemente diferente da freqüência na seqüência de controle. Nesta forma de realização um padrão de seqüência é considerado ser representativo de uma seqüência que compreende uma seqüência STAR, se a freqüência de ocorrência do padrão em pelo menos uma seqüência que compreende uma seqüência STAR é significantemente diferente da freqüência de ocorrência do mesmo padrão em uma seqüência de controle. Usando-se números maiores de seqüências que compreendam uma seqüência STAR o número de padrões para os quais uma diferença estatística pode ser estabelecida aumenta, ampliando assim o número de padrões para os quais a freqüência de ocorrência é representativa para uma seqüência que compreende uma seqüência STAR. Preferivelmente a dita freqüência de ocorrência é representativa da freqüência de ocorrência do dito pelo menos um padrão de seqüência em pelo menos 2 seqüências que compreendem uma seqüência STAR, mais preferivelmente em pelo menos 5 seqüências que compreendem uma seqüência STAR. Mais preferivelmente em pelo menos 10 seqüências que compreendem uma seqüência STAR. Mais preferivelmente, a dita freqüência de ocorrência é representativa da freqüência de ocorrência do dito pelo menos um padrão de seqüência em pelo menos 20 seqüências que compreendem uma seqüência STAR. Em uma forma de realização particularmente preferida a dita freqüência de ocorrência é representativa da freqüência de ocorrência do dito pelo menos um padrão de seqüência em pelo menos 50 seqüências que compreendem uma seqüência STAR.

Os padrões que são indicativos para uma seqüência que compreende uma seqüência STAR também são dependentes do tipo de ácido nucleico de controle usado. O tipo de seqüência de controle usado é preferivelmente selecionado com base na seqüência na qual a presença de uma seqüência STAR deva ser detectada. Em uma forma de realização preferida a dita seqüência de controle compreende uma seqüência aleatória que compreende um teor de AT/CG similar como a dita pelo menos uma seqüência que compreende uma seqüência STAR. Em uma outra forma de realização preferida a seqüência de controle é derivada da mesma espécie como a dita seqüência que compreende a dita seqüência STAR. Por exemplo, se uma seqüência de teste é examinada quanto a presença de uma seqüência STAR, ativa em uma célula vegetal, então preferivelmente a seqüência de controle também é derivada de uma célula vegetal. Similarmente, para testar quanto a atividade STAR em uma célula humana, o ácido nucleico de controle também é preferivelmente derivado de um genoma humano. Em uma forma de realização preferida a seqüência de controle compreende entre 50% e 150% das bases da dita pelo menos uma seqüência que compreende uma seqüência STAR. Em uma forma de realização particularmente preferida a dita seqüência de controle compreende entre 90% e 110% das bases da dita pelo menos uma seqüência que compreende uma seqüência STAR. Mais preferivelmente, entre 95% e 105%.

Um padrão pode compreender qualquer número de bases maior do que dois. Preferivelmente, o pelo menos um padrão de seqüência compreende pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 6 bases. Em uma outra forma de realização o pelo menos um padrão de seqüência compreende pelo menos 8 bases. Em uma forma de realização preferida o dito pelo menos um padrão de seqüência compreende um padrão listado na tabela 9 e/ou tabela 10. Um padrão pode consistir de uma lista consecutiva de bases. Entretanto, o padrão também pode compreender bases que são interrompidas uma ou mais vezes por várias bases que não são ou são apenas parcialmente discriminativas. Uma base parcialmente discriminativa é por exemplo indicada como uma purina.

Preferivelmente, a presença da atividade STAR é verificada usando um ensaio funcional. Diversos métodos são apresentados aqui para determinar se uma seqüência compreende a atividade STAR. A atividade STAR é confirmada se a seqüência é capaz de realizar pelo menos uma das seguintes funções: (i) pelo menos em parte inibir o efeito da seqüência que compreende um elemento que reprime a transcrição de gene da invenção, (ii) pelo menos em parte bloquear a repressão associada com a cromatina, (iii) pelo menos em parte bloquear a atividade de um intensificador, (iv) conferir em um ácido nucleico operavelmente ligado que codifica uma unidade de transcrição comparado com o mesmo ácido nucleico sozinho, (iv-a) um prognosticabilidade mais alta da transcrição, (iv-b) uma transcrição mais alta, e/ou (iv-c) uma estabilidade mais alta da transcrição com o tempo. O número grande de seqüências que compreendem a atividade STAR identificada na presente invenção abre uma ampla variedade de possibilidades para gerar e identificar seqüências que compreendem a mesma atividade em tipo não necessariamente em quantidade. Por exemplo, está bem dentro da capacidade de uma pessoa habilitada alterar as seqüências identificadas na presente invenção e testar as seqüências alteradas quanto a atividade STAR. Tais seqüências alteradas também são portanto parte da presente invenção. A alteração pode incluir supressão, inserção e mutação de uma ou mais bases nas seqüências.

As seqüências que compreendem a atividade STAR foram identificadas em trechos de 400 bases. Entretanto, é esperado que nem todas destas 400 bases sejam requeridas para reter a atividade STAR. Métodos para delimitar as seqüências que conferem uma certa propriedade a um fragmento dentre 400 e 5000 bases são bem conhecidos. O comprimento de seqüência mínimo de um fragmento que compreende a atividade STAR é estimado ser de cerca de 50 bases. A tabela 9 e a tabela 10 listam padrões de 6 bases que foram descobertos serem super representados em moléculas de ácido nucleico que compreendem a atividade STAR. Esta super representação é considerada ser representativa para uma seqüência STAR. As tabelas foram geradas para uma família de 65 sequências STAR. Tabelas similares podem ser geradas partindo-se de um conjunto diferente de seqüências STAR ou de um conjunto menor ou maior de seqüências STAR. Um padrão é representativo para uma seqüência STAR se ele é super representado na dita seqüência STAR comparado com uma seqüência que não compreende um elemento STAR. Este pode ser uma seqüência aleatória. Entretanto, para excluir uma tendência não relevante, a seqüência que compreende uma seqüência STAR é preferivelmente comparada a um genoma ou uma parte significante deste. Preferivelmente um genoma de um vertebrado ou planta, mais preferivelmente um genoma humano. Uma parte significante de um genoma é por exemplo um cromossoma. Preferivelmente a seqüência que compreende uma seqüência STAR e a dita seqüência de controle são derivadas de ácido nucleico da mesma espécie.

Quanto mais seqüências STAR são usadas para a determinação da ffeqüência de ocorrência de padrões de seqüência, mais representativos para STARs os padrões são que são super- ou inffa-representados. Considerando que muitas das características funcionais que podem ser expressadas pelos ácidos nucleicos são mediadas pela ligação de moléculas proteináceas a eles, é preferido que o padrão representativo seja super-representado nas seqüências STAR. Tal padrão super-representado pode ser parte de um sítio de ligação para uma tal molécula proteinácea. Preferivelmente a dita ffeqüência de ocorrência é representativa da ffeqüência de ocorrência do dito pelo menos um padrão de seqüência em pelo menos 2 seqüências que compreendem uma seqüência STAR, mais preferivelmente em pelo menos 5 seqüências que compreendem uma seqüência STAR. Mais preferivelmente em pelo menos 10 seqüências que compreendem uma seqüência STAR. Mais preferivelmente, a dita freqüência de ocorrência é representativa da freqüência de ocorrência do dito pelo menos um padrão de seqüência em pelo menos 20 seqüências que compreendem uma seqüência STAR. Em uma forma de realização particularmente preferida a dita freqüência de ocorrência é representativa da freqüência de ocorrência do dito pelo menos um padrão de seqüência em pelo menos 50 seqüências que compreendem uma STAR. Preferivelmente, as ditas seqüências que compreendem uma seqüência STAR compreende pelo menos uma das seqüências representadas na figura 26. A atividade STAR é característica compartilhada pelas seqüências listadas na figura 26. Entretanto, isto não significa que elas devam todas compartilhar a mesma seqüência identificadora. É muito bem possível que identificadores diferentes existam. Os identificadores podem conferir esta característica comum em um fragmento que os contenham, embora isto não seja necessariamente assim.

Usando-se mais seqüências que compreendam a atividade STAR para determinar a freqüência de ocorrência de um padrão ou padrões de seqüência, é possível selecionar padrões que sejam mais freqüentemente do que outros presentes ou ausentes em uma tal seqüência STAR. Deste modo é possível encontrar padrões que sejam muito freqüentemente super ou infra representados nas seqüências STAR. Freqüentemente padrões super ou infra representados são mais prováveis para identificar seqüências STAR candidatas em conjuntos de teste. Uma outra maneira de usar um conjunto de padrões super ou infra representados é para determinar qual padrão ou combinação de padrões é melhor adaptado para identificar um STAR em uma seqüência. Usando a chamada estatística discriminativa nós identificamos um conjunto de padrões que desempenha melhor na identificação de uma seqüência que compreende um elemento STAR. Em uma forma de realização preferida pelo menos um dos ditos padrões de seqüência para detectar uma seqüência STAR compreende um padrão de seqüência GGACCC, CCCTGC, AAGCCC, CCCCCA e/ou AGCACC. Em uma outra forma de realização pelo menos um dos ditos padrões de seqüência para detectar uma seqüência STAR compreende um padrão de seqüência CCCN{16}AGC, GGCN{9}GAC, CACN{13}AGG, CTGN{4}GCC.

Uma lista de seqüências STAR também pode ser usada para determinar uma ou mais seqüências de consenso nesse ponto. A invenção portanto também fornece uma seqüência de consenso para um elemento STAR. Esta seqüência de consenso pode ser naturalmente usada para identificar elementos STAR candidatos em uma seqüência de teste.

Além disso, uma vez que uma seqüência que compreende um elemento STAR foi identificada em um vertebrado ela pode ser usada por meio da homologia de seqüência para identificar seqüências que compreendem um elemento STAR em outra espécie pertencente a vertebrado. Preferivelmente uma seqüência STAR de mamífero é usada para triar seqüências STAR em outra espécie de mamífero. Similarmente, uma vez que uma seqüência STAR foi identificada em uma espécie vegetal ela pode ser usada para triar quanto a seqüências homólogas com função similar em outra espécie vegetal. A invenção em um aspecto fornece uma seqüência STAR obtenível por um método de acordo com a invenção. É ainda fornecida uma coleção de seqüências STAR. Preferivelmente a dita seqüência STAR é uma seqüência STAR de vertebrado ou de planta. Mais preferivelmente, a dita seqüência STAR é uma seqüência STAR de mamífero ou um angiosperma (monocotilédone, tal como arroz ou dicotilédone tal como Arabidopsis). Mais preferivelmente, a dita seqüência STAR é uma seqüência STAR de primata e/ou humana.

Uma lista de seqüências que compreendem a atividade STAR pode ser usada para determinar se uma seqüência de teste compreende um elemento STAR. Existem, como mencionado acima, muitos métodos diferentes para se usar uma tal lista para este propósito. Em uma forma de realização preferida a invenção fornece um método para determinar se uma seqüência de ácido nucleico de cerca de 50 a 5000 pares de base compreende uma seqüência STAR, o dito método compreendendo, gerar uma primeira tabela de padrões de seqüência que compreendam a ffeqüência de ocorrência dos ditos padrões em uma coleção de seqüências STAR da invenção, gerar uma segunda tabela dos ditos padrões compreendendo a ffeqüência de ocorrência dos ditos padrões em pelo menos uma seqüência de referência, selecionar pelo menos um padrão do qual a dita ffeqüência de ocorrência difere entre as duas tabelas, determinar, dentro da dita seqüência de ácido nucleico de cerca de 50 a 5000 pares de base, a ffeqüência de ocorrência de pelo menos um dos ditos padrões selecionados e determinar se a ocorrência no dito ácido nucleico de teste é representativo da ocorrência do dito padrão selecionado na dita coleção de seqüências STAR. Altemativamente, a dita determinação compreende determinar se a ffeqüência de ocorrência no dito ácido nucleico teste é representativo da ffeqüência de ocorrência do dito padrão selecionado na dita coleção de seqüências STAR. Preferivelmente o dito método ainda compreende determinar se o dito candidato STAR compreende uma qualidade moduladora da transcrição de gene usando um método da invenção. Preferivelmente, a dita coleção de STARS compreende a seqüência como representada na figura 26.

Em um outro aspecto a invenção fornece uma seqüência de ácido nucleico isolada e/ou recombinante que compreende uma seqüência STAR obtenível por um método da invenção.

Como mencionado acima, uma seqüência STAR pode exercer a sua atividade em uma maneira direcional, isto é mais para um lado do ffagmento que a contém do que para o outro. Além disso, a atividade STAR pode ser amplificada em quantidade multiplicando-se o número de elementos STAR. O mencionado em segundo lugar sugere que um elemento STAR pode compreender um ou mais elementos que compreendem a atividade STAR. Uma outra maneira de identificar uma seqüência capaz de conferir atividade STAR em um fragmento que a contenha compreende selecionar de uma seqüência de vertebrado ou planta, uma seqüência que compreenda a atividade STAR e identificar se as seqüências que flanqueiam a seqüência selecionada são conservadas em outra espécie. Tais seqüências flanqueadoras conservadas são prováveis de serem seqüências funcionais. Em um aspecto a invenção fornece portanto um método para identificar uma seqüência compreendendo um elemento STAR que compreende selecionar uma seqüência de cerca de 50 a 5000 pares de base de uma espécie de vertebrado ou planta que compreenda um elemento STAR e identificar se as seqüências que flanqueiam a dita seqüência selecionada na dita espécie são conservadas em pelo menos uma outra espécie. A invenção portanto ainda fornece um método para detectar a presença de uma seqüência STAR dentro de uma seqüência de ácido nucleico de cerca de 50 a 5000 pares de base, compreendendo identificar uma seqüência que compreende uma seqüência STAR em uma parte de um cromossoma de uma célula de uma espécie e detectar homologia significante entre a dita seqüência e uma seqüência de um cromossoma de uma espécie diferente. Preferivelmente, a dita espécie compreende uma espécie vegetal ou vertebrada, preferivelmente uma espécie mamífera. A invenção também fornece um método para detectar a presença de um elemento STAR dentro de uma seqüência de ácido nucleico de cerca de 50 a 6000 pares de base de uma espécie vertebrada ou vegetal, que compreende identificar se uma seqüência flanqueadora da dita seqüência de ácido nucleico é conservada em pelo menos uma outra espécie.

E importante mencionar que os métodos da invenção para detectar a presença de uma seqüência que compreende uma seqüência STAR usando informação de bioinformática são iterativos por natureza. Quanto mais sequências que compreendem uma seqüência STAR são identificadas com um método da invenção mais padrões são encontrados como sendo discriminativos entre uma seqüência que compreende uma seqüência STAR e uma seqüência de controle. Usando estes padrões discriminativos recém descobertos mais seqüências compreendendo uma seqüência STAR podem ser identificadas que por sua vez amplia o conjunto de padrões que podem discriminar e assim por diante. Este aspecto iterativo é um aspecto importante dos métodos fornecidos na presente invenção. O termo qualidade em relação a uma seqüência refere-se a uma atividade da dita seqüência. O termo STAR, seqüência STAR ou elemento STAR, como aqui usado, refere-se a uma seqüência de DNA que compreende uma ou mais das qualidades moduladoras da transcrição de gene mencionadas. O termo SINC ou elemento SINC como listado abaixo refere-se a uma seqüência de DNA que compreende uma ou mais das qualidades mencionadas que reprimem a transcrição de gene. O termo “seqüência de DNA” como aqui usado, a menos que de outro modo especificado, não se refere a uma listagem de ordem específica de bases mas antes um pedaço físico de DNA. Uma qualidade de transcrição com referência a uma seqüência de DNA refere-se a um efeito que a dita seqüência de DNA tem sobre a transcrição de um gene de interesse. “Qualidade” como aqui usada refere-se às propriedades ou atributos detectáveis de um ácido nucleico ou proteína em um sistema de transcrição.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Métodos para isolar elementos STAR e SINC Materiais e métodos Plasmídeos e cenas. O vetor de seleção para os elementos STAR, pSelect-SV40-zeo (“pSelect”, Figura 1) é construído como segue: o vetor pREP4 (Invitrogen V004-50) é usado como a espinha dorsal peptídica.

Ele fornece a origem oriP de Epstein Barr de replicação e o antígeno nuclear EBNA-1 para a replicação epissômica de cópia alta em linhas de célula de primata; o gene de resistência à higromicina com o promotor da timidina cinase e o sítio de poliadenilação, para a seleção em células de mamífero; e o gene de resistência à ampicilina e a origem colEl de replicação para a manutenção em Escherichia coli. O vetor contém quatro sítios operadores LexA consecutivos entre os sítios de restrição Xbal e NheI (Bunker e Kingston, 1994). Embutido entre os operadores LexA e o sítio Nhel está um poliligador que consiste dos seguintes sítios de restrição: Hlnálll-Ascl-BamHl-Ascl-ΗΙηάΙΠ. Entre o sítio Nhel e um sítio Sall está o gene de resistência à zeocina com o promotor SV40 e o sítio de poliadenilação, derivado de pSV40/Zeo (Invitrogen V502-20); este é o marcador selecionável para a triagem de STAR. O vetor pSDH (Figura 2) é construído como segue: O gene repórter de luciferase de pGL3-Control (Promega El741) é amplificado pela PCR e inserido no pUHD10-3 digerido com SacIVBamHl (Gossen e Bujard, 1992). Isto coloca o luciferase sob o controle do promotor Tet-Off e a montante do sinal de poliadenilação de SV40. Sítios de clonagem múltiplos são introduzidos pela PCR, a montante do promotor Tet-Off (MCSI, Xhol-Notl-EcoBl-Sall) e a jusante sinal de poliadenilação (MCSH, Nhel-Bglll-EcoRN-Hinálll). As bibliotecas de gene são construídas pela digestão com Sau3Al de DNA genômico humano, purificado a partir de placenta (Clontech 6550-1) ou transportado em cromossomas artificiais bacterianos/Pl (BAC/PAC). Os clones BAC/PAC contêm DNA genômico da região citogenética lql2 (clones RP1154H19 e RP3328E19) ou do cacho HOX de genes homeóticos (clones RP1167F23, RP1170019 e RP11387A1). Os DNAs são fracionados em tamanho e a fração de tamanho 0,5 a 2 kb é ligada no vetor pSelect digerido com BamHl, pelas técnicas padrão (Sambrook et al., 1989). A construção das cepas hospedeiras foi descrita (van der Vlag et al., 2000). Em resumo, elas são fundamentadas na linha de célula de osteossarcoma humano U-2 OS (American Type Culture Colection HTB-96). A U-2 OS é estavelmente transfectada com o plasmídeo pTet-Off (Clontech Kl 620-A), que codifica uma quimera protéica que consiste do domínio de ligação de DNA do repressor Tet e o domínio de transativação VP16. A linha de célula é subsequentemente transfectada de modo estável com os genes da proteína de fusão contendo o domínio de ligação de DNA LexA e as regiões codificadoras de HP1 ou HPC2 (duas proteínas de Drosófila do grupo Policomb que reprimem a expressão de gene quando amarrado ao DNA). Os genes repressores LexA estão sob o controle do sistema regulador transcricional Tet-Off (Gossen e Bujard, 1992).

Triagem de biblioteca e caracterização do elemento STAR. As bibliotecas de gene no pSelect são transfectadas na linha de célula repressora U-2 OS/Tet-Off/LexA pela precipitação com fosfato de cálcio (Graham e van der Eb, 1973; Wigler et al., 1978) como recomendado pelo fornecedor do regente de transfecção (Life Technologies). As Células transfectadas são cultivadas sob seleção com higromicina (25 pg/ml) e repressão com tetraciclina (doxiciclina, 10 ng/ml) durante 1 semana (50% de confluência). Depois a concentração de doxiciclina é reduzida para 0,1 ng/ml para induzir os genes repressores LexA e depois de 2 dias a zeocina é adicionada a 250 pg/ml. As células são cultivadas por um adicional de 4 a 5 semanas, até que as culturas do controle (transfectadas com pSelect vazio) são mortas pela zeocina. As colônias resistentes à zeocina da transfecção de biblioteca são propagadas e o DNA plasmídico é isolado e resgatado na E. coli pelas técnicas padrão (Sambrook et al., 1989). Os elementos STAR candidatos no DNA resgatado são analisados pelo mapeamento de endonuclease de restrição (Sambrook et al., 1989), análise de seqüência de DNA (Sanger et al., 1977) e quanto a atividade STAR (resistência à zeocina) depois da re-transfecção para U-2 OS/Tet-Off/repressor LexA e diminuição da concentração de doxiciclina. Os elementos STAR candidatos que têm a seqüência de DNA que corresponde à seqüência conhecida no genoma humano são identificados pelas procuras de BLAST (Altschul et al., 1990) da base de dados do genoma humano (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genoma/seq/HsBlast.html 20 de Junho de 2001). A localizações cromossômicas dos elementos são registrados, junto com a proporção de DNA repetitivo e a identidade de genes adjacentes. Aqueles candidatos que mostram atividade STAR na re-transfecção são caracterizados ainda mais pela subclonagem dos fragmentos STAR no plasmídeo pSDH e a integração estável no DNA cromossômico U-2 OS. Os plasmídeos PSDH são co-transfectados em células U-2 OS com pBABE-puro (Morgenstem e Land, 1990) e selecionados quanto a resistência à puromicina. Por elemento STAR, as populações de aproximadamente 30 clones individuais são isolados e cultivados. Os clones são periodicamente ensaiados quanto a atividade de luciferase de acordo com as instruções do fabricante (Roche 1669893).

Resultados Caracterização funcional do elemento STAR. As triagens de DNA genômico humano e dos locais HOX e lql2 produziram 17 elementos STAR legítimos. Os critérios são que (1) os elementos demonstraram atividade STAR na re-transfecção dos clones com base em pSelect na linha de célula de osteossarcoma humano U-2 OS hospedeira (indicando que a atividade anti-repressora expressada na triagem inicial é específica de plasmídeo e não devido às mudanças artefactuais nas células hospedeiras); (2) os elementos contêm a seqüência de DNA que se iguala à seqüência na base de dados da seqüência do genoma humano (indicando que o clone não contém seqüência de DNA contaminadora, por exemplo de fontes bacterianas ou vetoriais).

Os elementos STAR são subclonados no plasmídeo pSDH e integrado no genoma da célula hospedeira. A expressão dos genes repórteres é ensaiada em populações de transfectantes estáveis para demonstrar a capacidade dos elementos STAR para proteger genes repórteres do silenciamento depois da integração ao acaso no genoma. Isto fornece a informação (1) na proporção de clones que demonstram expressão alta e (2) no grau de super-expressão evocado pelos elementos STAR. A expressão do gene repórter de luciferase por um clone é considerada significante se ela está duas vezes acima do nível médio para os plasmídeos que não contenham nenhum elemento STAR (o nível de referência). Para todos os plasmídeos uma distribuição no nível de expressão é observada entre os clones: de nenhuma expressão até expressão significantemente acima do nível de referência e de poucos super-expressadores até muitos super-expressadores. A atividade STAR superior é manifestada pelos plasmídeos que resultam em muitos clones super-expressores, incluindo alguns clones altamente super-expressores. Os resultados de um experimento representativo estão mostrados na Tabela 1 e nas Figuras de 3 a 5: Os resultados indicam que os elementos STAR humanos que são testados produzem uma proporção muito mais alta de clones super-expressores do que o gene repórter não protegido ou o gene repórter protegido pelo elemento SCS de Drosófila (Kellum e Schedl, 1992). Além disso, o grau de super-expressão por estes plasmídeos é muito maior a partir do gene repórter protegido por STAR do que do repórter não protegido ou protegido por SCS.

Seqüência do elemento STAR e dados de posição genômica. A Tabela 2 lista as localizações cromossômicas de cada um dos 17 elementos STAR, assim como a identidade de genes vizinhos e o teor repetitivo de DNA dos elementos. Os elementos STAR são distribuídos em vários cromossomas. Eles são diversos na sua seqüência de DNA real e no teor repetitivo de DNA e demonstram vários graus de associação com os genes vizinhos.

Triagem de elemento SINC Materiais e métodos O plasmídeo para a triagem de SINC, pSINC-Select (“pSS”, Figura 6) é construído como segue: o vetor pREP4 (Invitrogen V004-50) é usado como a espinha dorsal peptídica. Ele fornece a origem oriP de Epstein Barr de replicação e o antígeno nuclear EBNA-1 para a replicação epissômica de cópia alta em linhas de célula de primata; o gene de resistência à higromicina com o promotor da timidina cinase e o sítio de poliadenilação, para a seleção em células de mamífero; e o gene de resistência à ampicilina e a origem colEl de replicação para a manutenção na Escherichia coli. O vetor contém um promotor Tet-Off, que consiste de Elementos Responsivos em Tet (TREs) aleatórios do plasmídeo pUDH10-3 (Gossen e Bujard, 1992), para a regulagem pelo sistema regulador transcricional Tet-Off. Os TREs regulam a expressão do gene codA::upp que codifica uma proteína de fusão (citosina desaminase/uracil fosforibosiltransferase; Invivogen porf-codaupp). Este é um chamado de “gene suicida”; a atividade da enzima codA::upp converte um pró medicamento, a 5-fluorocitosina (5-FC) em um medicamento tóxico, a 5-fluorouracila (5-FU), causando desse modo a apoptose e a morte celular (Mullen et al., 1992; Tiraby et al., 1998; Wei e Huber, 1996). A montante do promotor Tet-Off está um sítio de restrição Bglll para clonar o DNA genômico digerido com Sau3Al para triagem. O DNA pREP4 é separado do DNA genômico e do gene suicida pelos elementos STAR de modo a impedir o silenciamento de elementos plasmídicos essenciais no componente pREP4 pelos elementos SINC clonados. O DNA genômico de uma biblioteca de clones BAC que compreende o cromossoma 22 humano (Invitrogen/Research Genetics 96010-22) é parcialmente digerido com Sau3 Al e ligado no pSS digerido com Bglll (Sambrook et al., 1989). A biblioteca de plasmídeos recombinantes é transfectada na linha de célula U-2 OS/Tet-Off pela precipitação com fosfato de cálcio (Graham e van der Eb, 1973; Wigler et al., 1978) como recomendado pelo fornecedor do reagente de transfecção (Life Technologies). As células transfectadas são cultivadas sob seleção com higromicina (25 pg/ml) e repressão com tetraciclina (doxiciclina, 10 ng/ml) durante 3 semanas. Depois 5-FC é adicionado a uma concentração de 1 pg/ml e as células são cultivadas por um adicional de 3 semanas para selecionar quanto a elementos SINC.

As colônias contendo SINC candidatas são colhidas e usadas em uma reação de cadeia de polimerase com preparadores PCR1 e PCR2 (Figura 6); os produtos de PCR são digeridos com endonucleases de restrição Hinálll e Xhol e clonados no pBluescript II SK(+) (Stratagene 212207) pelas técnicas convencionais (Sambrook et al., 1989). As seqüências de DNA dos elementos SINC candidatos são determinadas (Sanger et al., 1977) e as seqüências correspondentes no genoma humano são identificadas pelas procuras BLAST (Altschul et al., 1990) da base de dados do genoma humano (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genoma/seq/HsBlast.html 20 de junho de 2001). As localizações cromossômicas dos elementos são registrados, junto com a proporção de DNA repetitivo e a identidade de genes adjacentes. Resultados No final do período de seleção nenhuma das colônias estão evidentes nas culturas de controle (pSS vazio) e várias colônias são evidentes nas culturas contendo pSS com DNA genômico. Estes clones sobreviventes contêm elementos SINC candidatos. Os elementos são recuperados pela PCR e subclonados em um vetor de clonagem padrão, pBluescript. As seqüências de DNA dos elementos são determinadas e comparadas com a seqüência do genoma humano (Tabela 3). em todos os casos, os elementos seqüenciados são encontrados no cromossoma 22, como esperado.

Exemplo 2. Características de expressão do transgene que são devidas ao STAR, ao SING ou a STAR/SINC combinados.

Fundamentos: a recombinação específica de sítio é usada para remover precisamente DNAs heterólogos das suas localizações cromossômicas. Isto é rotineiramente realizado por um de dois sistemas: a cre recombinase e o alvo loxP do bacteriofago PI (Feng et al., 1999) ou a FLP recombinase e FRT (alvo da FLP recombinase) de levedura (Wigley et al., 1994). Nestes sistemas, uma região de DNA (usualmente contendo um gene repórter e/ou um marcador selecionável) é flanqueado no cromossoma pelo alvo loxP ou FRT. A atividade da recombinase depois catalisa a excisão precisa da região de DNA do cromossoma. A recombinase resolve as suas duas seqüências de reconhecimento a um único sítio, suprimindo a seqüência entre elas. Assim, uma extensão de DNA deve ser flanqueado pelos sítios alvo a serem subseqüentemente suprimidos in vivo na introdução ou ativação da recombinase (Schwenk et al., 1995; Dymecki, 1996). As recombinases Cre e Flp catalisam a recombinação entre duas repetições invertidas de 13 pares de base, separadas por um espaçador com um mínimo de 6 pares de base (loxP) ou 8 (FRI) (Senecoff et al., 1985). A seqüência loxP é ATAACTTCGTATA e a seqüência FRT é GAAGTTCCTATAC.

Protocolo: Usando a clonagem de DNA convencional (Sambrook et al., 1989), um gene repórter (que codifica uma proteína repórter, por exemplo a proteína fluorescente verde (GFP) (Bierhuizen et al., 1997) ou luciferase (Himes e Shannon, 2000) é construída que é flanqueada em um plasmídeo por um par de elementos ST AR, por um par de elementos SINC ou por um par de elementos de combinação STAR/SINC. Em cada caso, os elementos são eles próprios flanqueados pelos sítios alvo de recombinase. Um elemento é flanqueado por um par de sítios loxP e o outro é flanqueado por um par de sítios FRT (Figura 1). Na transfecção o plasmídeo integra no cromossoma hospedeiro em uma porcentagem pequena de células e os integrantes são selecionados pela resistência a antibiótico, construções similares são fabricadas para cada um dos três elementos de teste (STAR, SINC, STAR/SINC).

Usando técnicas convencionais, (“SuperFect Transfection Reagent Handbook,” Qiagen, Novembro, 1997) estes plasmídeos são transfectados na linha de célula de osteossarcoma humano U-2 OS e selecionados quanto a resistência à higromicina. Os isolados resistentes à higromicina têm o plasmídeo estavelmente integrado no genoma da linha de célula. Os isolados individuais são propagados em meio de cultura de célula e a expressão do gene repórter transgênico é ensaiada, por exemplo pela citometria de fluxo (Stull et al., 2000).

Depois usando técnicas convencionais (transfecção ou estímulo de hormônio), os isolados estáveis do acima são tratados de modo a introduzir ou ativar a atividade de recombinase. Isto é feito sequencialmente, tal que por exemplo a atividade de recombinase cre catalisa a excisão de STAR1 e subseqüentemente a atividade de recombinase FLP catalisa a excisão de STAR2. O nível de expressão do gene repórter nestas células é ensaiado e o valor comparado com o valor de referência do isolado precursor, contendo STAR.

Exemplo 3. Análise de seqüência de STARS; determinação da seqüência essencial mínima para a função de elemento; a conservação de seqüência entre os elementos; e as propriedades de tandem e elementos múltiplos Fundamentos: Fragmentos de DNA contendo elementos STAR ou SINC são isolados pela seleção genética usando os plasmídeos pSelect (Figura 1) ou pSS (Figura 6), respectivamente. Esta seção descreve o método para caracterizar as seqüências de DNA dentro destes fragmentos que têm atividade STAR ou SINC.

Protocolos: Seqüência de DNA: Os oligonucleotídeos são planejados com base na seqüência dos plasmídeos de seleção pSelect e pSS para o seqüenciamento dos fragmentos de DNA. Os fragmentos são seqüenciados usando a técnica de término de cadeia de didesóxi (Sanger et al., 1977). As seqüências de DNA são depois localizadas na posição de cromossoma usando a base de dados publica da seqüência do genoma humano (http://www.ncbi.nlm.nih. gov:80/cgi-bin/Entrez/hum_ srch?chr=hum_chr. inf&query). Os genes e a densidade de gene na vicinidade da seqüência de fragmento são registrados a partir da anotação da seqüência do genoma. A atividade transcricional destes genes é determinada a partir das bases de dados públicas de microssérie de DNA (http://arrays. rockefeller.edu/xenopus/linki3.html) e dados da SAGE (Análise Serial da Expressão de Gene; http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi). Uma vez que a informação posicionai sobre as seqüências STAR e SINC é compilada, os dados são analisados em termos de seqüências de consenso subjacentes. As seqüências de consenso ou tendências (entendido por isto são as áreas locais ricas em combinações de nucleotídeo particulares, por exemplo ricas em bases C e G) são detectadas usando os algoritmos de similaridade de procura tais como clustalw (Higgins et al., 1996) e pontuação de similaridade blosum (Altschul e Gish, 1996). Quaisquer consensos ou tendências subjacentes encontrados são depois usados para identificar outros STARS potenciais em uma escala genômica realizando-se procuras BLAST (Altschul et al., 1990). A pesquisa prévia identificou proteínas reguladoras transcricionais que se ligam a isoladores e elementos limítrofes conhecidos (Gaszner et al., 1999; Gerasimova e Corces, 1998). Nos exemplos descritos, os sítios de ligação de proteína coincide com os sítios hipersensíveis de DNase I que são essenciais para a função isoladora ou limítrofe. A hipótese de que os elementos STAR também estejam ligados por proteínas reguladoras conhecidas é examinada pesquisando-se a base de dados TRANSFAC de fatores de transcrição (http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/) quanto a motivos de seqüência que ocorrem nos elementos STAR. Os motivos de seqüência que são comuns entre os membros das coleções STAR ou SING são indicadores de que o fator de transcrição correspondente se liga àquele elemento.

Seqüência essencial mínima: Usando este conhecimento de seqüência, os elementos STAR (ou SINC) são truncados e testados quanto a funcionalidade. Isto é feito usando a reação de cadeia de polimerase (PCR) para clonar sub-ffagmentos dos fragmentos contendo STAR ou SINC no pSelect ou pSS pelas técnicas padrão (Sambrook et al., 1989). Os plasmídeos contendo os sub-ffagmentos são transfectados em células U-2 OS e testados quanto à funcionalidade ensaiando-se quanto à resistência a antibiótico (elementos STAR) ou resistência a pró medicamento (elementos SINC).

Direcionalidade: Os elementos STAR e SINC são testados quanto à sua direcionalidade usando os plasmídeos pSelect e pSS, respectivamente. Por exemplo, a direção de elementos STAR isolados pela triagem com pSelect é aludida como orientação 5’3’. A orientação do elemento é revertida pelas técnicas de DNA recombinante convencionais (Sambrook et al., 1989). Os plasmídeos resultantes são transfectados na linha de célula U-2 OS e a expressão do gene repórter é ensaiada (Bierhuizen et al., 1997; Himes e Shannon, 2000). O nível de expressão do plasmídeo com o elemento de orientação reversa é comparada àquele com a orientação 5’3’. Se o plasmídeo de orientação reversa tem níveis de expressão similares, então o elemento STAR não demonstra direcionalidade.

Combinações e múltiplos de elementos: Para determinar se os elementos STAR são capazes de funcionar em pares mistos, elementos diferentes são combinados e testados. A análise é realizada no plasmídeo pSDH inserindo-se um elemento STAR em MCSI e um STAR diferente em MCSII pelas técnicas de DNA recombinante (Sambrook et al., 1989). Os plasmídeos resultantes são transfectados e a expressão do gene repórter é ensaiada (Bierhuizen et al., 1997; Himes e Shannon, 2000); os resultados são comparados com a expressão de plasmídeos contendo o mesmo elemento em MCSI e MCSII; se a expressão é similar para os dois tipos de plasmídeos, então é concluído que elementos STAR diferentes não interferem entre si. A concentração de elementos STAR ou SINC únicos é comparada com repetições em tandem de elementos. Isto é feito pela concatamerização dos elementos STAR ou SINC de interesse com DNA ligase e inserção do produto de ligação nos plasmídeos pSDH ou pSS pelas técnicas de DNA recombinante (Sambrook et al., 1989). Os plasmídeos resultantes são transfectados nas células U-2 OS e a expressão do gene repórter é ensaiada (Bierhuizen et al., 1997; Himes e Shannon, 2000); os resultados são comparados com a expressão de plasmídeos contendo elementos STAR ou SINC únicos.

Exemplo 4. Determinação da distância em que um STAR, um SINC ou uma combinação destes funciona.

Fundamentos: Elementos STAR são usados para otimizar a expressão de transgenes únicos e múltiplos. Para determinar se um único par de elementos STAR pode proteger transgenes grandes ou múltiplos do silenciamento é necessário determinar a faixa em que os elementos STAR atuam. Informação Similar é determinada para os elementos SINC e combinações STAR/SINC.

Protocolo: Elementos STAR e SINC são testados quanto a sua funcionalidade em relação à distância usando plasmídeos derivados com base em pSelect ou pSS respectivamente, como segue. Uma biblioteca de fragmentos de DNA aleatórios de 500 pares de base a 10 kb é montada pelas técnicas de clonagem de DNA padrão (Sambrook et al., 1989). Fragmentos são selecionados desta biblioteca que não possui atividade STAR ou SINC, testando-se nos plasmídeos pSelect e pSS como descrito acima. Para os elementos STAR e combinações STAR/SINC, estes fragmentos são inseridos entre o sítio de clonagem e o promotor do gene repórter no plasmídeo pSelect apropriado (Figura 1). Este conjunto de plasmídeos é transfectado na linha de célula U-2 OS e a expressão medida como descrito acima. A concentração da expressão de gene repórter está correlacionada com o comprimento do fragmento de DNA aleatório que separa o elemento STAR do promotor. Os elementos SINC são ensaiados em uma maneira análoga: os fragmentos de DNA aleatórios são inseridos entre o elemento SINC e o promotor do plasmídeo pSS apropriado e o grau de repressão do gene repórter está correlacionado com o comprimento do fragmento de DNA aleatório.

Exemplo 5. (a) Uso de um elemento SINC que ocorre naturalmente na seleção genética para os elementos STAR.

Fundamentos: As triagens correntes para os elementos STAR usam proteínas lexA-PcG quiméricas para fornecer a repressão do marcador selecionável no plasmídeo de seleção. Repetindo-se a seleção usando elementos SINC que ocorrem naturalmente, elementos STAR são identificados que são específicos para a atividade repressiva devido a estes elementos SINC que ocorre naturalmente. A triagem do elemento SINC está fundamentada na capacidade de seleção genética para identificar fragmentos aleatoriamente gerados de DNA genômico que são capazes de silenciar um promotor “tet-off e bloquear a expressão do gene suicida codA::upp. Os elementos SINC recuperados desta seleção representa uma amostragem aleatória de elementos de silenciamento genômico e classes diferentes de elementos são recuperados. Para este protocolo, estes diversos elementos SINC são usados para recuperar classes diferentes de elementos STAR do que aqueles recuperados nas seleções com base em lexA-PcG anteriormente mencionadas.

Protocolo: Elementos SINC da seleção corrente são caracterizados e classificados em classes com base nas características funcionais e de seqüência de DNA (as características funcionais incluem intensidade de repressão; as características de seqüência incluem motivos conservados identificáveis; ver o exemplo 3). Os elementos representativos de cada classe são usados para substituir os sítios de ligação de lexA no plasmídeo pSelect por intermédio de técnicas de clonagem de DNA padrão (Sambrook et al., 1989). Um banco de gene é fabricado com cada um destes novos plasmídeos e usados para identificar novos elementos STAR, específicos de SINC, como descrito (van der Vlag et al., 2000). Isto é feito com DNA genômico inteiro e com DNA do clone BAC que também contém o elemento SINC que é usado.

Exemplo 5 (b) Determinação do comprimento máximo de elementos STAR e SINC

Fundamentos: Os elementos STAR são clonados como fragmentos de DNA recuperados usando o plasmídeo pSelect, que é fabricado com fragmentos de DNA genômico de menos do que 2 kb. Entretanto, estes poderíam ser porções de um elemento STAR mais prolongado. A atividade STAR prolongada é examinada pelos seguintes experimentos.

Protocolo: Os elementos STAR clonados no pSelect são mapeados para a seqüência do genoma humano. De modo a determinar se eles são porções de um elemento STAR mais prolongado, regiões de 4 kb que abrangem os clones são amplificadas pela PCR e clonadas no plasmídeo pSelect e/ou pSDH pelas técnicas de DNA recombinante padrão (Sambrook et al., 1989). Os plasmídeos resultantes são transfectados em células U-2 OS e ensaiados quanto a expressão de gene repórter como descrito acima; os plasmídeos contendo o elemento STAR de 2 kb original são incluídos como um controle. Três resultados possíveis podem ser esperados: (1) expressão similar pelo controle e isolados STAR prolongados, demonstrando que o elemento STAR está confinado ao fragmento de 2 kb original; (2) expressão mais baixa pelos isolados STAR prolongados, sugerindo que o elemento STAR está contido dentro do fragmento de 2 kb e não atua eficazmente em uma distância ou que o fragmento prolongado contém um elemento SINC; (3) expressão mais alta pelos isolados STAR prolongados, sugerindo que a região prolongada contém um elemento STAR mais completo. No caso do resultado (3), o uso é reiterado com um fragmento de PCR maior de 6 kb.

Um elemento STAR também pode ser um compósito de sítios aos quais várias proteínas se ligam. Portanto fragmentos de DNA grandes com atividade STAR podem ser divisíveis em fragmentos menores com atividade STAR (ver o exemplo 3). Os elementos que são maiores do que 2 kb são reconhecidos como elementos STAR se eles ainda demonstram a atividade STAR depois da truncagem a menos do que 2 kb (incluindo pela supressão interna).

Exemplo 6. Estados de metilação e acetilação de histona de elementos STAR, elementos SINC ou combinações destes e dos transgenes adjacentes.

Fundamentos: As propriedades reguladoras de elementos STAR e SINC são associadas com a estrutura da cromatina local, que é determinada pelo próprio DNA e pelas proteínas de DNA associadas. As mudanças na estrutura da cromatina que estão associadas com as mudanças na expressão de gene são frequentemente produzidas por modificações secundárias das macromoléculas, especialmente metilação de DNA ou acetilação de proteínas de histona. A identificação das modificações secundárias que ocorrem nos elementos STAR e SINC e nos transgenes adjacentes fornece marcas registradas para estes elementos.

Protocolo: Metilação de DNA: Elementos STAR ou SINC ou combinações destes são clonados no plasmídeo pSelect pelas técnicas padrão (Sambrook et ai, 1989). Células U-2 OS são transfectadas de modo estável com estes plasmídeos e com pSelect que carece de um elemento STAR ou SINC como um controle para determinar a metilação de DNA basal no gene repórter. As células são colhidas e a cromatina purificada pelos procedimentos padrão (Thomas, 1998). O DNA é digerido com as endonucleases de restrição Hpall e MspI em reações separadas (Sambrook et ai., 1989). Ambas destas enzimas de restrição são capazes de cortar a seqüência CCGG não metilada. Quando o C externo é metilado, tanto o Mapl quanto o Hpall não podem clivar. Entretanto, diferente Hpall, MspI podem clivar a seqüência quando o C interno é metilado. O DNA é submetido ao Southern blotting e a mancha é analisada pela rotulação de extremidade indireta (Pazin e Kadonaga, 1998). Como um controle, o plasmídeo pSelect correspondente como DNA nu, não metilado, também é cortado com as enzimas descritas e submetido ao Southern blotting. A comparação dos tamanhos diferentes dos fragmentos de DNA revela se o DNA é metilado in vivo ou não.

Acetilação de histona: As mesmas linhas de célula transfectadas usadas para a análise de metilação de DNA são usadas para estes experimentos. O método descrito abaixo produz um mapa de alta resolução do padrão de acetilação de histona nos elementos STAR e SINC e no gene repórter (Litt et al., 2001). Digestos de nuclease microcócica de núcleos são fracionados em gradientes de sacarose e monômeros e dímeros de nucleossoma purificados são enriquecidos quanto às histonas acetiladas pela imunoprecipitação com anticorpos anti-acetilistona. A fração de nucleossoma e imunoprecipitados são submetidos à análise, por exemplo pela PCR em tempo real (Jung et al., 2000) usando preparadores e uma sonda Taqman que recoze ao gene repórter ou ao elemento STAR ou SINC para produzir produtos de 0,2 kb, com uma janela de movimento de 0,1 kb. A taxa de aumento do sinal fluorescente de sonda Taqman durante a PCR (que é proporcional à abundância do DNA padrão na amostra) é depois medida. A relação da abundância do DNA padrão na fração de nucleossoma e os imunoprecipitados fornece um mapa fino do padrão de acetilação de histona para cada 0,1 kb no gene repórter e elemento STAR ou SINC (ou no gene repórter na ausência de um elemento).

Exemplo 7. Posicionamento de nucleossoma in vivo e sítios hipersensíveis de DNAse I

Fundamentos: A cromatina é compreendida de DNA, histonas e proteínas que não de histona. As histonas formam uma partícula de núcleo que é enrolada por ~ 150 pares de base de DNA para compor um nucleossoma. Os nucleossomas são separados por 50 a 75 pares de base de DNA ligador. Os nucleossomas estavelmente posicionados no DNA cromossômico reprimem a expressão de gene e fatores que excluem os nucleossomas ou de outro modo remodelam a cromatina podem dominar esta repressão. O posicionamento de nucleossomas em uma região cromossômica é analisada pelo ensaio de nuclease microcócica (MNase); a MNase corta a cromatina preferencialmente no DNA ligador. Similarmente, algumas áreas de DNA são constitutivamente expostas às proteínas que não de histona e estas são frequentemente regiões reguladoras, isto é sítios onde fatores reguladores que atuam em cis se ligam. Experimentalmente, estes sítios são hipersensíveis à digestão pela enzima DNase I.

Protocolo: Para determinar a posição de nucleossomas no gene repórter e nos elementos STAR ou SINC, a MNase é usada (Saluz e Jost, 1993). Os núcleos são purificados a partir de células U-2 OS cultivadas e digeridos com MNase como descrito acima (acetilação de histona). Para a procura quanto a sítios hipersensíveis à DNase I nos elementos STAR e SINC ou o gene repórter, os núcleos purificados são tratados com DNase I em uma concentração apropriada (por exemplo 100 pg/ml de DNA genômico e 20 a 100 U/ml de DNasel), como descrito (Wallrath et al., 1998). O DNA nu é digerido com DNase I como um controle. Para ambas as técnicas, o gene repórter e os elementos STAR ou SINC são mapeados finos usando extensão de preparador ou rotulação de extremidade indireta e Southern blotting, como descrito (Tanaka et al., 1996; van der Vlag et al., 2000). O ensaio de MNase revela uma escada de faixas separadas em um autorradiograma que corresponde às posições de nucleossomas nos elementos STAR ou SINC ou no gene repórter. Os sítios hipersensíveis à DNase I são manifestados como faixas separadas no autorradiograma resultante que são ausentes ou menos proeminentes no controle de DNA nu.

Exemplo 8. Tipo de célula, dependência de tecido e dependência de promotor de elementos STAR e SINC.

Fundamentos: Foi relatado que alguns isoladores ou elementos limítrofes podem demonstrar especificidade de tecido (Takada et al., 2000). Os elementos STAR têm muitas características em comum com isoladores e elementos limítrofes. Elementos STAR e SING tanto promíscuos quanto específicos de tecido têm valor biotecnológico nas aplicações transgênicas. O ensaio descrito abaixo é realizado para avaliar a dependência ao tipo de célula. A especificidade de célula e tecido dos elementos é examinada ainda mais examinando-se a expressão de genes na vicinidade dos elementos no genoma humano, usando bases de dados públicas de dados de microssérie de DNA (http://arrays.rockefeller.edu/xenopus&nks.html) e SAGE (Análise Serial da Expressão de Gene; http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi).

Protocolo: Os elementos STAR são testados no plasmídeo pSDH e os elementos SINC no plasmídeo pSS. Três linhas de célula são transfectadas usando protocolos padrão: a linha de célula U-2 OS de osteossarcoma humano (Heldin et al., 1986), a linha de célula Vero de rim do macaco verde africano (Simizu et al, 1967) e a linha de célula CHO de ovário de hamster chinês (Kao e Puck, 1968). Os elementos capazes de funcionar em todos os três tipos de célula são categorizados como promíscuos. Aqueles que apenas demonstram atividade em uma ou duas das linhas de célula são categorizadas como restritas na sua funcionalidade ao tipo de célula.

Especificidade de promotor: Os elementos STAR e SINC são correntemente selecionados e testados no contexto da função com dois promotores, o promotor de citomegalovírus (CMV) inteiro ou o Elemento de Resposta à Tetraciclina e o promotor CMV mínimo (em combinação com o ativador transcricional tTA). Para avaliar a especificidade de promotor, a função STAR e SINC são testadas com outros promotores virais habitualmente usados, a saber os promotores do vírus símio tipo 40 (SV40) precoce e tardio, os promotores adenovirais EIA e tardio principal e a repetição de terminal longo do vírus do sarcoma de Rous (RSV) (Doll et al., 1996; Smith et al., 2000; Weaver e Kadan, 2000; Xu et al., 1995). Cada um destes promotores são clonados separadamente nos plasmídeos pSelect e pSS pelas técnicas padrão (Sambrook et al., 1989) junto com elementos STAR ou SINC, respectivamente. Os plasmídeos resultantes são transfectados na linha de célula U-2 OS e ensaiados quanto a expressão de gene repórter, como descrito acima. A capacidade dos elementos SINC para silenciar estes promotores ou elementos STAR para proteger contra o silenciamento, é determinada pela comparação com os plasmídeos que carecem dos elementos STAR ou SINC.

Exemplo 9. Métodos para melhoria dos elementos STAR e SINC

Fundamentos: os elementos STAR e SING melhorados são desenvolvidos. As melhorias produzem intensidade aumentada de atividade anti-repressiva ou repressiva e elementos com atividade indutível e específica de tecido. Estas melhorias são feitas por uma combinação de técnicas. Protocolos Evolução forçada: a PCR propensa a erro (Cherry et al., 1999; Henke e Bomscheuer, 1999) é usada para introduzir uma média de uma a duas mutações de ponto por elemento. Os elementos mutagenizados são triados usando plasmídeos pSelect (ou pSS) contendo proteínas de fusão selecionáveis por marcador repórter por exemplo pela classificação de célula ativada por fluorescência e resistência a antibiótico (Bennett et al., 1998). As rodadas subseqüentes de PCR propensa a erro e seleção são realizadas para derivar elementos com outras melhorias na atividade.

Combinações em tandem e heterólogas: Como descrito acima, as combinações em tandem e heterólogas de elementos são testadas quanto a atividade em comparação com os elementos únicos (exemplo 3). A dominância relativa de elementos STAR e SINC é testada em uma base de caso para casa. Ela é usada para testar a concentração de um elemento; por exemplo, se um novo elemento STAR é dominante a um elemento SINC conhecido, forte, então o STAR é classificado como muito forte. A possibilidade de que a relação de dominância entre um STAR e um SINC seja específica do tipo de célula, tecido ou promotor também é considerada (exemplo 8). O teste de dominância utiliza o plasmídeo pSelect, com elementos SINC individuais colocados a montante de elementos STAR individuais pelas técnicas de DNA recombinante padrão (Sambrook et al., 1989). Os plasmídeos são transfectados em células U-2 OS e a expressão de gene repórter é ensaiada. A dominância SINC é manifestada pela expressão mais baixa do que a do plasmídeo com apenas um elemento STAR, enquanto a dominância STAR é manifestada por expressão mais alta do que a do plasmídeo com apenas um elemento SINC.

Introdução de sítios de ligação para outras proteínas de ligação de DNA aos elementos STAR e SINC para adicionar novas características (por exemplo indutibilidade, especificidade de tecido) Fundamentos: Elementos STAR e SINC reguláveis são criados combinando-os com sítios de ligação para as proteínas de ligação de DNA dependentes de sinal. Em um exemplo isto pode envolver a justaposição de um STAR ou SING ou combinação STAR/SINC e um elemento de resposta de glicocorticóide (GRE). Na ausência de estímulo de glicocorticóide o elemento STAR ou SINC pode funcionar como descrito. No estímulo, o receptor de glicocorticóide que ocorre naturalmente se liga ao GRE e interfere com a função STAR ou SINC.

Protocolo: Usando a clonagem de DNA convencional (Sambrook et al., 1989), um GRE é introduzido no vetor pSelect ou pSS adjacente aos elementos STAR ou SINC, respectivamente. O plasmídeo é transfectado em células U-2 OS como descrito acima. As células são divididas em duas culturas; uma é tratada com glicocorticóide (10 μΜ). A expressão do gene repórter é medida e comparada entre as duas culturas. As diferenças na expressão demonstra a capacidade para regular a função de STAR e SINC pela ação de uma proteína de ligação de DNA dependente de sinal. Elementos STAR e SING promíscuos: Testar ou realçar estas características envolvem o cultivo em linhas de célula diferentes e cultivo de longa duração sem seleção de antibiótico (exemplos 8 e 10).

Exemplo 10. Os elementos STAR e SINC removem a necessidade para a seleção contínua para a manutenção do transgene.

Fundamentos: Na transgênese, a dependência em marcadores de seleção tem duas desvantagens: o agente de seleção é usualmente caro e carrega um custo metabólico para as células e existem objeções reguladoras e éticas para incluir marcadores selecionáveis em aplicações transgênicas, especialmente se o próprio transgene está no produto (por exemplo plantas de safra, vetores de terapia de gene). Os elementos STAR e SINC reduzem ou eliminam a necessidade para manter a seleção depois de estabelecer o isolado transgênico. Conseqüentemente, o gene de resistência pode ser removido do genoma transgênico pela recombinação específica de sítio com perda diminuída da expressão de transgene.

Protocolo: Linhas de célula U-2 OS estavelmente transfectadas contendo elementos STAR cromossomicamente integrados que flanqueiam genes repórteres são produzidas pela co-transfecção do plasmídeo pSDH com um plasmídeo de resistência a antibiótico que atua em trans como descrito acima. O experimento envolve testar a estabilidade do nível de expressão de gene repórter nestas linhas de célula durante o cultivo prolongado (3 a 6 meses) na ausência de seleção. Isto é testado com elementos STAR que flanqueiam os genes repórteres de luciferase ou GFP em plasmídeos pSDH. O gene de resistência a antibiótico é removido construindo-se um plasmídeo de expressão (com base no pSDH) no qual o marcador de seleção antibiótico é flanqueado pelos sítios alvo de recombinase. O marcador selecionável é subseqüentemente excisado pela atividade de recombinase, como descrito acima (exemplo 2).

Exemplo 11 A prognosticabilidade e o rendimento são melhorados pela aplicação de elementos STAR em sistemas de expressão Elementos STAR funcionam para bloquear o efeito de influências de repressão transcricional sobre a expressão de unidades de transgene. Estas influências de repressão podem ser devido à heterocromatina (“efeitos de posição”, (Boivin & Dura, 1998)) ou às cópias adjacentes do transgene (“silenciamento de gene induzido pela repetição”, (Garrick et al., 1998)). Dois dos benefícios dos elementos STAR para a produção de proteína heteróloga são a prognosticabilidade aumentada de encontrar célula hospedeiras recombinantes primárias de alta expressão e rendimento aumentado durante ciclos de produção. Estes benefícios são ilustrados neste exemplo.

Materiais e Métodos Construção dos vetores pSDH e derivados contendo STAR: O vetor pSDH-Tet foi construído pela amplificação da reação de cadeia de polimerase (PCR) da matriz de leitura aberta de luciferase dos plasmídeo pREP4-HSF-Luc (van der Vlag et al., 2000) usando preparadores C67 e C68 (todos os preparadores de PCR e oligonucleotídeos mutagênicos são listados na Tabela 5) e a inserção do fragmento SacII/ifcwwHI no pUHD10-3 digerido com SacII/itamHI (Gossen & Bujard, 1992). A unidade de expressão da luciferase foi re-amplificada com os preparadores C65 e C66 e re-inserida no pUHD10-3 de modo a flanqueá-la com dois sítios de clonagem múltiplos (MCSI e MCSII). Um sítio Ascl foi depois introduzido no MCSI pela digestão com ücoRI e inserção de um ligador (compreendido de oligonucleotídeos D93 e D94 recozidos). O promotor CMV foi amplificado a partir do plasmídeo pCMV-Bsd (Invitrogen K510-01) com preparadores D90 e D91 e usado para substituir o promotor Tet-Off em pSDH-Tet pela digestão com Stf/I/SacII e ligação para criar o vetor pSDH-CMV. A matriz de leitura aberta de luciferase neste vetor foi substituída por SEAP (Fosfatase Alcalina Secretada) como segue: o vetor pSDH-CMY foi digerido com SacII e BamHl e feito abrupto; a matriz de leitura aberta de SEAP foi isolada de pSEAP-básico (Clontech 6037-1) pela digestão com EcoKI/Sall, feita abrupta e ligada no pSDH-CMV para criar o vetor pSDH-CS. O gene de resistência à puromicina sob o controle do promotor SV40 foi isolado do plasmídeo pBabe-Puro (Morgenstem & Land, 1990) pela PCR, usando os preparadores C81 e C82. Este foi ligado no vetor pGL3-controle (removido pelo sítio BamEl) (Promega El741) digerido com Ncol/Xbal, para criar pGL3-puro. O pGL3-puro foi digerido com BglU/SaB para isolar o gene de resistência ao SV40-puro, que foi feito abrupto e ligado no pSDH-CS digerido com NheI, terminado abrupto. O vetor resultante, pSDH-CSP, é mostrado na FIG 7. Todas as etapas de clonagem foram realizadas seguindo as instruções fornecidas pelos fabricantes dos reagentes, de acordo com métodos conhecidos na técnica (Sambrook et al., 1989).

Os elementos STAR foram inseridos no MCSI e MCSII em duas etapas, pela digestão do elemento STAR e do vetor pSDH-CSP com uma enzima de restrição apropriada, seguido por ligação. A orientação dos elementos STAR em vetores pSDH recombinantes foi determinada pelo mapeamento de restrição. A identidade e a orientação dos insertos foram verificadas pela análise de seqüência de DNA. O seqüenciamento foi realizado pelo método de didesóxi (Sanger et al., 1977) usando um seqüenciador de DNA automatizado Beckman CEQ2000, de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, o DNA foi purificado a partir da E. coli usando os conjuntos QIAprep Spin Miniprep e Plasmid Midi (QIAGEN 27106 e 12145, respectivamente). O seqüenciamento de ciclo foi realizado usando oligonucleotídeos C85, E25 e E42 (Tabela 5) feitos de encomenda, na presença de terminadores corantes (Conjunto de Seqüenciamento de Ciclo CEQ Dye Terminator, Beckman 608000).

Transfecção e cultura de células CHO com plasmídeos pSDH: A linha de célula do ovário de hamster chinês CHO-K1 (ATCC CCL-61) foi cultivada em meio HAMS-F12 + 10% de Soro de Bezerro Fetal contendo 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina e 100 microgramas/ml de estreptomicina aa 37° C/5% de C02. As células foram transfectadas com o vetor pSDH-CSP e seus derivados contendo STAR6 ou STAR49 em MCSI e MCSII, usando SuperFect (QIAGEN) como descrito pelo fabricante. Em resumo, as células foram semeadas em vasos de cultura e cultivadas durante a noite até 70 a 90% de confluência. O reagente SuperFect foi combinado com DNA plasmídico (linearizado neste exemplo pela digestão com Pvul) a uma relação de 6 microlitros por micrograma (por exemplo para uma placa de petri de 10 cm, 20 microgramas de DNA e 120 microlitros de SuperFect) e adicionado às células. Depois da incubação durante a noite a mistura de transfecção foi substituída com meio fresco e as células transfectadas foram incubadas ainda mais. Depois do cultivo durante a noite, 5 microgramas/ml de puromicina foram adicionados. A seleção com puromicina foi completa em 2 semanas, tempo depois do qual clones CHO/pSDH-CSP resistentes à puromicina individuais foram isolados ao acaso e cultivados ainda mais.

Ensaio de Fosfatase Alcalina Secretada (SEAP): A atividade de SEAP (Berger et al., 1988, Henthom et al., 1988, Kain, 1997, Yang et al., 1997) no meio de cultura de clones CHO/pSDH-CSP foi determinada como descrito pelo fabricante (conjunto Great EscAPe da Clontech #X2041). Em resumo, uma alíquota de meio foi inativado pelo calor a 65° C, depois combinada com tampão de ensaio e, substrato quimioluminescente CSPD e incubado na temperatura ambiente durante 10 minutos. A taxa de conversão de substrato foi depois determinada em um luminômetro (Tumer 20/20TD). A densidade celular foi determinada pela contagem de células tripsinizadas em um contador de célula Coulter ACT10.

Transfecção e cultura de células U-2 OS com plasmídeos pSDH: A linha de célula U-2 OS de osteossarcoma humano (ATCC #HTB-96) foi cultivada em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco + 10% de Soro de Bezerro Fetal contendo glutamina, penicilina e estreptomicina (acima) a 37° C/5% de CO2. As células foram co-transfectadas com o vetor pSDH-CMV e seus derivados contendo STAR6 ou STAR8 em MCSI e MCSII, (junto com 0 plasmídeo pBabe-Puro) usando SuperFect (acima). A seleção em puromicina foi completa em 2 semanas, tempo depois do qual os clones U-2 OS/pSDH-CMV resistentes à puromicina individuais foram isolados ao acaso e cultivados ainda mais.

Ensaio de Luciferase: A atividade de luciferase (Himes & Shannon, 2000) foi ensaiada em células recolocadas em suspensão de acordo com as instruções do fabricante do conjunto de ensaio (Roche 1669893), usando um luminômetro (Tumer 20/20TD). A concentração de proteína celular total foi determinada pelo método do ácido bicinconínico de acordo com as instruções do fabricante (Sigma B-9643) e usada para normalizar os dados de luciferase.

Resultados Os clones de célula CHO recombinantes contendo 0 vetor pSDH-CSP ou plasmídeos pSDH-CSP contendo STAR6 ou STAR49 (Tabela 6), foram cultivados durante 3 semanas. A atividade SEAP nos sobrenadantes de cultura foi depois determinada e é expressada com base no número de célula (FIG 8). Como pode ser observado, clones com elementos STAR nas unidades de expressão foram isolados que expressam atividade SEAP 2 a 3 vezes mais altas do que os clones cujas unidades de expressão não incluem elementos STAR. Além disso, 0 número de clones contendo STAR que expressam a atividade SEAP na ou acima da atividade máxima dos clones sem STAR é bastante alta: 25% a 40% das populações de clone STAR excederam a expressão SEAP mais alta dos clones pSDH-CSP.

Clones de célula U-2 OS recombinante contendo o vetor pSDH-CMV ou plasmídeos pSDH-CMV contendo STAR6 ou STAR8 (Tabela 6), foram cultivados durante 3 semanas. A atividade de luciferase nas célula hospedeiras foi depois determinada e é expressada como unidades de luciferase relativas (FIG 9), normalizadas para a proteína celular total. Os clones U-2 OS recombinantes com elementos STAR que flanqueiam as unidades de expressão tiveram rendimentos mais altos do que os clones sem STAR: a expressão mais alta observada de clones STAR8 foi 2 a 3 vezes mais alta do que a expressão de clones sem STAR. Os clones STAR6 tiveram níveis máximos de expressão 5 vezes mais altos do que os clones sem STAR. Os elementos STAR conferiram também prognosticabilidade maior: para ambos os elementos STAR, 15 a 20% dos clones demonstraram expressão de luciferase em níveis comparáveis ou maiores do que o clone sem STAR com o nível de expressão mais alto.

Estes resultados demonstram que, quando usados com o promotor CMV forte, os elementos STAR aumentam a produção de proteínas heterólogas (luciferase e SEAP). Todos os três dos elementos STAR introduzidos neste exemplo fornecem rendimentos elevados. A prognosticabilidade aumentada conferida pelos elementos STAR é manifestada pela proporção grande dos clones com rendimentos iguais ou maiores do que os rendimentos mais altos demonstrados pelos clones sem STAR.

Exemplo 12 Os elementos STAR melhoram a estabilidade da expressão de transgene Durante o cultivo de células hospedeiras recombinantes, é prática comum manter a seleção antibiótica. Isto é intencionado a impedir o silenciamento transcricional do transgene ou a perda do transgene do genoma pelos processos tais como a recombinação. Entretanto é indesejável para a produção de proteínas heterólogas, por várias razões. Primeiro, os antibióticos que são usados são muito caros e contribuem significantemente para o custo unitário do produto. Segundo, para o uso biofarmacêutico, a proteína deve ser demonstravelmente pura, sem nenhum traço do antibiótico no produto. Uma vantagem dos elementos STAR para a produção de proteína heteróloga é que eles conferem a expressão estável em transgenes durante o cultivo prolongado, mesmo na ausência de seleção de antibiótico; esta propriedade é demonstrada neste exemplo.

Materiais e Métodos A linha de célula U-2 OS foi transfectada com o plasmídeo pSDH-Tet-STAR6 e cultivada como descrito no Exemplo 11. Clones resistentes à puromicina individuais foram isolados e cultivados ainda na ausência de doxiciclina. Em intervalos semanais as células foram transferidas para vasos de cultura novos a uma diluição de 1:20. A atividade de luciferase foi medida em intervalos periódicos como descrito no Exemplo 11. Depois de 15 semanas as culturas foram divididas em duas réplicas; uma réplica continuou a receber puromicina, enquanto a outra réplica não recebeu nenhum antibiótico durante o resto do experimento (25 semanas totais).

Resultados A Tabela 7 apresentas os dados sobre a expressão de luciferase por uma unidade de expressão flanqueada com STAR6 durante o cultivo prolongado com ou sem antibiótico. Como pode ser observado, a expressão do transgene repórter, luciferase, permanece estável nas células hospedeiras U-2 OS pela duração do experimento. Depois as culturas foram divididas em dois tratamentos (acrescido de antibiótico e sem antibiótico) a expressão de luciferase foi essencialmente estável na ausência da seleção de antibiótico. Isto demonstra a capacidade de elementos STAR para proteger transgenes do silenciamento ou perda durante o cultivo prolongado. Isto também demonstra que esta propriedade é independente da seleção de antibiótico. Portanto a produção de proteínas heterólogas é possível sem incorrer nos custos do antibiótico ou de dificuldade de processamento a jusante.

Exemplo 13 Seqüências essenciais mínimas de elementos STAR

Elementos STAR são isolados da triagem genética descrita no Exemplo 1. A triagem usa bibliotecas construídas com DNA genômico humano que foi fracionada por tamanho até aproximadamente 0,5 a 2 quilobases (acima). Os elementos STAR variam de 500 a 2361 pares de base (Tabela 6). É provável que, para muitos dos elementos STAR que foram isolados, a atividade STAR é conferida por um fragmento de DNA menor do que o clone inicialmente isolado. É útil determinar estes tamanhos de fragmento mínimos que são essenciais para a atividade STAR, por duas razões. Primeiro, elementos STAR funcionais menores podem ser vantajosos no planejamento de vetores de expressão compactos, visto que vetores menores transfectam células hospedeiras com eficiência mais alta. Segundo, a determinação das seqüências STAR essenciais mínimas permite a modificação daquelas seqüências quanto a funcionalidade realçada. Dois elementos STAR foram finamente mapeados para determinar as suas seqüências essenciais mínimas.

Materiais e Métodos: STAR10 (1167 pares de base) e STAR27 (1520 pares de base) foram finamente mapeados. Eles foram amplificados pela PCR para produzir sub-fragmentos de comprimento aproximadamente igual (legenda da FIG 10). Para o teste inicial, estes foram clonados no vetor pSelect no sítio BamHI e transfectadas em células U-2 OS/Tet-Off/LexA-HPl como descrito no Exemplo 1. Depois da seleção quanto a resistência à higromicina, LexA-HPl foi induzido pela diminuição da concentração de doxiciclina. As células transfectadas foram depois incubadas com zeocina para testar a capacidade dos fragmentos STAR para proteger a unidade de expressão SV40-Zeo da repressão devido à ligação de LexA-HPl.

Resultados Neste experimento STAR10 e STAR 27 conferem boa proteção contra o silenciamento de gene, como esperado (FIG 10). Isto é manifestado pelo desenvolvimento robusto na presença de zeocina.

Dos 3 sub-fragmentos de STAR10, 10A (-400 pares de base) confere nas células transfectadas desenvolvimento vigoroso na presença de zeocina, excedendo aquele do elemento STAR de comprimento completo. As células transfectadas com construções pSelect contendo os outros 2 sub-fragmentos não desenvolveram na presença de zeocina. estes resultados identificam o fragmento 10A de -400 pares de base como abrangendo a seqüência de DNA responsável pela atividade anti-repressão de STAR10. STAR27 confere desenvolvimento moderado em zeocina para as células transfectadas neste experimento (FIG 10). Um dos sub-fragmentos deste STAR, 27B (-500 pares de base), permite o desenvolvimento fraco das células hospedeiras em meio contendo zeocina. Isto sugere que a atividade anti-repressão deste STAR está parcialmente localizada no sub-fragmento 27B, mas a atividade completa requer também as seqüências de 27A e/ou 27C (cada uma de - 500 pares de base).

Exemplo 14 Elementos STAR funcionam em diversas cepas de células de mamífero cultivadas A escolha da linha de célula hospedeira para a expressão de proteína heteróloga é um parâmetro critico para a qualidade, rendimento e custo por unidade da proteína. Considerações tais como modificações pós translacionais, capacidade do caminho secretor e imortalidade da linha de célula impõe a linha de célula apropriada para um sistema de produção biofarmacêutico particular. Por esta razão, as vantagens fornecidas pelos elementos STAR em termos de rendimento, prognosticabilidade e estabilidade devem ser obteníveis em diversas linhas de célula. Isto foi testado comparando-se a função de STAR6 na linha de célula U-2 OS humana na qual foi originalmente clonada e a linha de célula CHO que é amplamente aplicada na biotecnologia.

Materiais e Métodos: Os experimentos do Exemplo 11 são aludidos.

Resultados A expressão do gene repórter SEAP em células CHO é apresentada na FIG. 8; a expressão do gene repórter de luciferase em células U-2 OS é apresentado na FIG 9. Pela comparação dos resultados destes dois experimentos, é evidente que o elemento STAR6 é funcional em ambas as linhas de célula: a expressão de gene repórter foi mais prognosticável em ambas delas e os clones de cada linha de célula demonstraram rendimentos mais altos, quando o gene repórter foi protegido dos efeitos de posição pelo STAR6. Estas duas linhas de célula são derivadas de espécies diferentes (humana e hamster) e de tipos de tecido diferentes (osso e ovário), refletindo a ampla faixa de células hospedeiras na qual este elemento STAR pode ser utilizado na melhora da expressão de proteína heteróloga.

Exemplo 15 Os elementos STAR funcionam no contexto de vários promotores transcricionais A transcrição de transgene é obtida colocando-se a matriz de leitura aberta do transgene sob o controle de um promotor exógeno. A escolha do promotor é influenciada pela natureza da proteína heteróloga e o sistema de produção. Na maioria dos casos, promotores constitutivos fortes são preferidos por causa dos altos rendimentos que eles possam fornecer. Alguns promotores virais têm estas propriedades; o promotor/intensificador do gene precoce imediato de citomegalovírus (“promotor CMV”) é no geral observado como o promotor mais forte no uso biotecnológico comum (Boshart et al., 1985, Doll et al., 1996, Foecking & Hofstetter, 1986). O promotor SV40 do vírus símio também é moderadamente forte (Boshart et al, 1985, Foecking & Hofstetter, 1986) e é ffeqüentemente usado para a expressão ectópica em vetores de célula de mamífero. O promotor Tot-Off é indutível: o promotor é reprimido na presença de tetraciclina ou antibióticos relacionados (a doxiciclina é habitualmente usada) em linhas de célula que expressam o plasmídeo tTA (Clontech K1620-A) e a remoção dos resultados de antibiótico na indução transcricional (Deuschle et al., 1996, Gossen & Bujard, 1992, Izumi & Gilbert, 1999, Umana et al., 1999).

Materiais e Métodos: A construção dos vetores pSDH-Tet e pSDH-CMV é descrita no Exemplo 11. PSDH-SV40 foi construído pela amplificação por PCR do promotor SV40 (preparadores D41 e D42) a partir do plasmídeo pSelect-SV40-Zeo (Exemplo 1), seguido pela digestão do produto de PCR com óacll e Sall. O vetor pSDH-CMV foi digerido com Shell e Sall para remover o promotor CMV e o vetor e o fragmento SV40 foram ligados juntos para criar pSDH-SV40. STAR6 foi clonado no MCSI e MCSII como descrito no Exemplo 11. Os plasmídeos pSDH-Tet, pSDH-Tet-STAR6, pSDH-Tet-STAR7, pSDH-SV40 e pSDHSV40-STAR6 foram co-transfectados com pBabe-Puro em U-2 OS usando SuperFect como descrito pelo fabricante. O cultivo de célula, a seleção com puromicina e os ensaios de luciferase foram realizados como descrito no Exemplo 11. Resultados As FIGS 9, 11 e 12 comparam a expressão do gene repórter de luciferase de 3 promotores diferentes: dois promotores fortes e virais constitutivos (CMV e SV40) e o promotor indutível Tet-Off. Todos os três promotores foram testados no contexto do elemento STAR6 em células U-2 OS. Os resultados demonstram que o rendimento e a prognosticabilidade de todos os 3 promotores são aumentados pelo STAR6. Como descrito nos Exemplos 11 e 14, STAR6 é benéfico no contexto do promotor CMV (FIG 9). Melhorias similares são observadas no contexto do promotor SV40 (FIG 11): o rendimento do clone STAR6 de expressão mais alta é de 2 a 3 vezes maior do que os melhores clones pSDH-SV40 e 6 clones STAR (20% da população) têm rendimentos mais altos do que os clones melhores sem STAR. No contexto do promotor Tet-Off sob concentrações indutoras (doxiciclina baixa), STAR6 também melhora o rendimento e a prognosticabilidade da expressão de transgene (FIG 12): o clone STAR6 de expressão mais alta tem um rendimento 20 vezes mais alto do que o melhor clone pSDH-Tet e 9 clones STAR6 (35% da população) têm rendimentos mais altos do que o melhor clone sem STAR. É concluído que este elemento STAR é versátil nas suas propriedades protetoras de transgene, visto que ele funciona no contexto de vários promotores biotecnologicamente úteis de transcrição.

Exemplo 16 A função do elemento STAR pode ser direcional Embora as seqüências de ácido nucleico curtas possam ser simétricas (por exemplo palindrômicas), seqüências que ocorrem naturalmente mais longas são tipicamente assimétricas. Como um resultado, o teor de informação de seqüências de ácido nucleico é direcional e as próprias seqüências podem ser descritas com respeito às suas extremidades 5’ e 3’. A direcionalidade da informação de seqüência de ácido nucleico afeta o arranjo no qual as moléculas de DNA recombinante são montadas usando técnicas de clonagem padrão conhecidas na técnica (Sambrook et al., 1989). Elementos STAR são seqüências de DNA longas, assimétricas e têm uma direcionalidade com base na orientação na qual elas foram originalmente clonadas no vetor pSelect. Nos exemplos dados acima, usando dois elementos STAR nos vetores pSDH, esta direcionalidade foi preservada. Esta orientação é descrita como a orientação natural ou 5’para 3’, em relação ao gene de resistência à zeocina (ver a FIG 13). Neste exemplo a importância da direcionalidade para a função STAR é testada no vetor pSDH-Tet. Visto que os genes repórteres nos vetores pSDH são flanqueados em ambos os lados pelas cópias do elemento STAR de interesse, a orientação de cada cópia STAR deve ser considerada. Este exemplo compara a orientação natural com a orientação oposta (FIG 13).

Materiais e Métodos: O elemento STAR66 foi clonado no pSDH-Tet como descrito no Exemplo 11. As células U-2 OS foram co-transfectadas com plasmídeos pSDH-Tet-STAR66-natural e pSDH-Tet-STAR66-oposto e cultivadas como descrito no Exemplo 11. Clones individuais foram isolados e cultivados; o nível de expressão de luciferase foi determinado como descrito (acima). Resultados Os resultados da comparação da atividade STAR66 na orientação natural e na orientação oposta são mostrados na FIG 14. Quando STAR66 está na orientação oposta, o rendimento de apenas um clone é razoavelmente alto (60 unidades de luciferase). Ao contrário, o rendimento do clone de expressão mais alta quando STAR66 está na orientação natural é consideravelmente mais alto (100 unidades de luciferase) e a prognosticabilidade é também muito mais alta: 7 clones da população de orientação natural (30%) expressam a luciferase acima do nível do clone de expressão mais alta da população de orientação oposta e 15 dos clones na população de orientação natural (60%) expressam a luciferase acima de 10 unidades de luciferase relativas. Portanto é demonstrado que a função de STAR66 é direcional.

Exemplo 17 Expressão de transgene no contexto de elementos STAR é dependente do número de cópia Unidades de expressão de transgene para a expressão de proteína heteróloga são no geral integradas no genoma da célula hospedeira para garantir a retenção estável durante a divisão celular. A integração pode resultar em um cópia ou cópias múltiplas da unidade de expressão que é inserida no genoma; as cópias múltiplas podem ou não estar presentes como séries em tandem. O rendimento aumentado demonstrado para os transgenes protegidos por elementos STAR (acima) sugere que os elementos STAR são capazes de permitir que a expressão de unidades de transgene funcione independentemente de influências na transcrição associada com o sítio de integração no genoma (independência de efeitos de posição (Boivin & Dura, 1998)). Isto sugere ainda que os elementos STAR permitem que cada unidade de expressão funcione independentemente de cópias vizinhas da unidade de expressão quando elas são integradas como uma série em tandem (independência de silenciamento de gene induzido pela repetição (Garrick et al., 1998)). A dependência do número de cópia é determinada a partir de relações entre os níveis de expressão de transgene e número de cópia, como descrito nos exemplos abaixo.

Materiais e Métodos: As células U-2 OS foram co-transfectadas com pSDH-Tet-STAR10 e cultivadas sob seleção de puromicina como descrito (acima). Oito clones individuais foram isolados e ainda cultivados. Depois as células foram colhidas e uma porção foi ensaiada quanto a atividade de luciferase como descrito (acima). As células remanescentes foram lisadas e o DNA genômico purificado usando o Conjunto DNeasy Tissue (QIAGEN 69504) como descrito pelo fabricante. As amostras de DNA foram quantificadas pela espectrometria de UV. Três microgramas de cada amostra de DNA genômico foram digeridos com Pvull e Xhol durante a noite como descrito pelo fabricante (New England Biolabs) e resolvido pela eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos de DNA foram transferidos para uma membrana de náilon como descrito (Sambrook et al., 1989) e hibridizados com uma sonda radioativamente rotulada ao gene de luciferase (isolada de pSDH-Tet digerido com BamEl/SacIl). A mancha foi lavada como descrito (Sambrook et al., 1989) e exposta a uma tela de um aparelho de produção de fosforimagem (Personal FIX, BioRad). O autorradiograma resultante (FIG 15) foi analisado pela densitometria para determinar a intensidade relativa das faixas de DNA de luciferase, que representa o número de cópia de transgene.

Resultados As atividades de enzima e os números de cópia (intensidades de faixa de DNA) de luciferase nos clones da população do clone pSDH-Tet-STARlO é mostrado na FIG 16. O número de cópia de transgene está altamente correlacionado com o nível de expressão de luciferase nestes clones pSDH-Tet-STARlO (r = 0,86). Isto sugere que STAR10 confere dependência do número de cópia na expressão de unidades de transgene, tomando a expressão de transgene independente de outras cópias de transgene nas séries em tandem e independente das influências de silenciamento de gene no sítio de integração.

Exemplo 18 Elementos STAR funcionam como bloqueadores de intensificador mas não como intensilicadores Os promotores de gene são submetidos tanto a influências positivas quanto negativas na sua capacidade para iniciar a transcrição. Uma classe importante de elementos que exercem influências positivas são intensificadores. Intensificadores são caracteristicamente capazes para afetar promotores mesmo quando eles estão localizados longe (muitos quilopares de base) do promotor. As influências negativas que atuam pela formação de heterocromatina (por exemplo proteínas do grupo Policomb) foram descritas acima e estas são o alvo de atividade STAR. As bases bioquímicas para a função intensificadora e para a formação de heterocromatina são fundamentalmente similares, visto que elas envolvem ambas a ligação de proteínas ao DNA. Portanto é importante determinar se elementos STAR são capazes de bloquear as influências positivas assim como as influências negativas, em outras palavras, para proteger os transgenes de intensificadores genômicos na vicinidade do sítio de integração. A capacidade para proteger transgenes da atividade intensificadora garante o desempenho estável e prognosticável de transgenes em aplicações biotecnológicas. Este exemplo examina o desempenho de elementos STAR em um ensaio de bloqueio de intensificador.

Uma outra característica de atividade STAR que é importante para a sua função é o rendimento aumentado que elas conferem aos transgenes (Exemplo 11). Os STARS são isolados com base na sua capacidade para manter altos níveis de expressão de zeocina quando as proteínas que formam heterocromatina estão ligadas adjacentes aos elementos STAR candidatos. A alta expressão é prognosticada ocorrer porque espera-se que os STARS bloqueiem a disseminação de heterocromatina na unidade de expressão de zeocina. Entretanto, um segundo cenário é que os fragmentos de DNA em intensificadores contendo clones resistentes à zeocina. Os intensificadores demonstraram ter a capacidade para superar os efeitos repressivos das proteínas do grupo Policomb tais como aqueles usados no método da triagem de STAR (Zink & Paro, 1996). Os intensificadores isolados por este fenômeno podem ser considerados falsos positivos, visto que os intensificadores não têm as propriedades aqui reivindicadas para STARs. De modo a demonstrar que os elementos STAR não são intensificadores, eles foram testados em um ensaio de intensificador. O ensaio de bloquear intensificador e o ensaio de intensificador são metodológica e conceitualmente similares, os ensaios são mostrados esquematicamente na FIG 17. A capacidade dos elementos STAR para bloquear intensificadores é realizada usando o sistema intensificador E47/E-box. A proteína E47 é capaz de ativar a transcrição pelos promotores quando ela está ligada a uma seqüência de DNA E-box localizada na vicinidade destes promotores (Quong et al., 2002). A E47 está normalmente envolvida na regulagem da diferenciação de linfócitos B e T (Quong et al., 2002), mas ela é capaz de funcionar em diversos tipos de célula quando ectopicamente expressada (Petersson et al., 2002). A E-box é uma seqüência de DNA palindrômica, CANNTG (Knofler et al., 2002). No ensaio de bloqueio de intensificador, uma E-box é colocada a montante de um gene repórter de luciferase (incluindo um promotor mínimo) em um vetor de expressão. Um sítio de clonagem para os elementos STAR é colocado entre a E-box e o promotor. A proteína E47 é codificada em um segundo plasmídeo. O ensaio é realizado transfectando-se tanto o plasmídeo E47 quanto o vetor de expressão de luciferase em células; a proteína E47 é expressada e se liga à E-box e o complexo E47/E-box é capaz de atuar como um intensificador. Quando o vetor de expressão de luciferase não contém um elemento STAR, o complexo E47/E-box realçam a expressão de luciferase (FIG 17A, situação 1). Quando elementos STAR são inseridos entre a E-box e o promotor, a sua capacidade para bloquear o intensificador é demonstrada pela expressão reduzida da atividade de luciferase (FIG 17A, situação 2); se STARS não podem bloquear intensificadores, a expressão de luciferase é ativada (FIG 17A, situação 3). A capacidade dos elementos STAR para atuarem como intensificadores utiliza o mesmo vetor de expressão de luciferase. Na ausência de E47, a própria E-box não afeta a transcrição. Ao invés disso, o comportamento intensificador pelos elementos STAR resultarão na ativação da transcrição de luciferase. O ensaio é realizado transfectando-se o vetor de expressão de luciferase sem o plasmídeo E47. Quando o vetor de expressão não contém elementos STAR, a expressão de luciferase é baixa (FIG 17B, situação 1). Se elementos STAR não têm propriedades intensificadoras, a expressão de luciferase é baixa quando um elemento ST AR está presente no vetor (FIG 17B, situação 2). Se elementos STAR têm propriedades intensificadoras, a expressão de luciferase será ativada nos vetores contendo STAR (FIG 17B, situação 3).

Materiais e Métodos: O vetor de expressão de luciferase foi construído inserindo-se a E-box e um promotor mínimo da alcalino fosfatase humana do plasmídeo mu-E5+E2x6cat(x) (Ruezinsky et al., 1991) a montante do gene de luciferase no plasmídeo pGL3-básico (Promega El 751), para criar pGL3-E-box-luciferase (presente de W. Romanow). O plasmídeo de expressão de E47 contém a matriz de leitura aberta de E47 son o controle de um promotor de beta-actina no plasmídeo pHBAPr-l-neo; a E47 é constitutivamente expressada a partir deste plasmídeo (presente de W. Romanow). Os elementos STAR 1, 2, 3,6, 10, 11, 18 e 27 foram clonados no vetor de expressão de luciferase. Os clones contendo o elemento scs de Drosófila e o elemento de núcleo da beta-globina HS4-6x de galinha (“HS4”) foram incluídos como controles positivos (eles são conhecidos por bloquear intensificadores e não ter nenhuma das propriedades intensificadoras intrínsecas (Chung et al., 1993, Kellum & Schedl, 1992)) e o vetor de expressão de luciferase vazio foi incluído como um controle negativo. Todos os ensaios foram realizados usando a linha de célula U-2 OS. No ensaio de bloqueio de intensificador, o plasmídeo E47 foi co-transfectado com os vetores de expressão de luciferase (vetor vazio ou contendo STAR ou elementos de controle positivo). No ensaio intensificador, o plasmídeo E47 foi co-transfectado com vetor de expressão de luciferase sem STAR como um controle positivo para a atividade intensificadora; todas as outras amostras receberam um plasmídeo falso durante a co-transfecção. As células transitoriamente transfectadas foram ensaiadas quanto a atividade de luciferase 48 horas depois da transfecção de plasmídeo (acima). A atividade de luciferase expressada a partir de um plasmídeo não contendo nenhuma E-box ou elementos STAR/controle foi subtraída e as atividades de luciferase foram normalizadas para o teor de proteína como descrito (acima).

Resultados. A FIG 18 mostra os resultados do ensaio de bloqueio de intensifícador. Na ausência de elementos STAR (ou dos elementos bloqueadores de intensifícador conhecidos scs e HS4), o complexo intensifícador E47/E-box ativa a expressão de luciferase (“vetor”); este nível realçado de expressão foi normalizado a 100. A atividade intensificadora é bloqueada por todos elementos STAR testados. A atividade intensificadora também é bloqueada pelos elementos HS4 e scs, como esperado (Bell et al., 2001, Gerasimova & Corces, 2001). Estes resultados demonstram que além da sua capacidade para bloquear a disseminação do silenciamento transcricional (influências negativas), os elementos STAR são capazes de bloquear a ação de intensificadores (influências positivas). A FIG 19 mostra os resultados do ensaio intensifícador. O nível de expressão de luciferase devido ao realce pelo complexo E47/E-box é ajustado a 100 (“E47”). Por comparação, nenhum dos elementos STAR realizam ativação significante da expressão de luciferase. Como esperado, os elementos scs e HS4 também não realizam a ativação do gene repórter. Portanto é concluído que pelo menos os elementos STAR testados não possuem propriedades intensificadoras.

Exemplo 19 Caracterização de um Elemento de Cromatina Indutor de Silenciamento (SINC) Materiais e Métodos As características gerais da triagem de SINC foram descritas no Exemplo 1 e alguns aspectos destas são aqui recapitulados. Uma versão do vetor pSS usado para a triagem de elementos SINC em DNA genômico é o pSS-codA::upp (FIG 20). Este consiste da unidade de expressão do gene suicida, flanqueada por dois elementos STAR6. A unidade de expressão, que consiste do gene suicida codA::upp sob o controle do promotor Tet-Off, está a jusante de um sítio de restrição Bglll. Uma segunda versão do vetor pSS, pSS-hrGFP (FIG 21), foi criada pela substituição de um elemento STAR6 com STAR8 e a substituição do gene suicida com o gene hrGFP, que codifica a proteína fluorescente verde (Stratagene 240059). O DNA genômico humano a partir do cromossoma 22 (Research Genetics 96010-22) foi parcialmente digerido com Sau3AI e fracionado no tamanho. A fração de 0,5 a 10 quilopares de base foi ligada no sítio Bglll de pSS-codA::upp. Esta biblioteca representou 20.000 clones independentes com um tamanho de inserto médio de 1,2 quilopares de base. A biblioteca foi amplificada em Escherichia coli. O DNA purificado a partir da biblioteca amplificada foi transfectado em células U-2 OS/Tet-Off (van der Vlag et al., 2000) pelas técnicas padrão (fosfato de cálcio; Life Technologies 18306-019). Uma transfecção de controle foi realizada usando o DNA de vetor pSS-codA::upp vazio, produzindo 2400 colônias resistentes à higromicina. As células transfectadas foram selecionadas quanto a resistência à higromicina (25 mg/ml) em um período de 3 semanas em doxiciclina alta (10 ng/ml) e 1800 colônias resistentes à higromicina foram recuperadas da transfecção da biblioteca. Estas colônias foram depois incubadas com o pró medicamento 5-fluorocitosina (5-FC) a 1 mg/ml, com um reforço de 5 mg/ml durante 4 dias, a uma concentração de doxiciclina de 10 ng/ml. Depois de 3 semanas aproximadamente 3 colônias de controle de desenvolvimento fraco (transfectadas com pSScodA::upp vazio) morreram; 58 das colônias transfectadas da biblioteca sobreviveram. Estas colônias foram deixadas recuperar do tratamento com pró medicamento e mais cultivadas. Os isolados resistentes a 5-FC foram colhidos, as células foram lisadas e uma porção do DNA foi submetido à amplificação por PCR usando preparadores D30 e D51 para recuperar os elementos SINC. Os produtos de PCR de seis colônias resistentes a 5-FC foram clonados entre os sítios //mdlll e Xhol do plasmídeo SK(+)de pBluescript II (Stratagene 212207) pelos métodos convencionais (Sambrook et al., 1989). As seqüências de DNA dos elementos SINC candidatos foram determinadas como descrito (acima) usando preparadores comercialmente disponíveis para o vetor pBluescript (Stratagene 300301 e 300302). As seqüências destes elementos SINC são apresentadas na Tabela 4B.

Os 6 elementos SINC candidatos foram clonados no plasmídeo pSS-hrGFP nas suas orientações naturais e os plasmídeos resultantes foram transfectados em células U-2 OS/Tet-Off. Depois da seleção quanto a resistência à higromicina, as populações de transfectantes pSS-hrGFP-SINC foram cultivados ainda mais em uma concentração de doxiciclina alta (10 ng/ml). O RNA celular total foi extraído usando o Conjunto RNeasy Mini (QIAGEN 74104) como descrito pelo fabricante. A análise de Northern blot da abundância de GFP mRNA nestas populações foi ensaiada usando técnicas padrão (Sambrook et al., 1989). A sonda de GFP foi um fragmento BamHl-EcoRI que abrange 690 a 1419 pares de base no phrGFP-1. As manchas também foram sondadas quanto ao mRNA de higromicina como um controle para o número de cópia de plasmídeo derivado de PSS-hrGFP e para beta-actina como um controle para a quantidade de mRNA genomicamente codificada. A sonda de higromicina foi um fragmento Sful-SaB. que se estende de 8219 a 10144 no pREP4 (Invitrogen) e a sonda de beta-actina foi da Clontech, #9800-1. Depois da hibridização e lavagem, as manchas foram expostas às telas de aparelho produtor de fosforimagem e os sinais radioativos foram visualizados e quantificados usando um aparelho produtor de fosforimagem BioRad Personal F/X.

Resultados Os elementos SINC clonados adjacentes ao gene repórter GFP induzirá o silenciamento da transcrição de gene repórter, mas não afetará a transcrição de outros genes. A medição precisa da atividade SINC leva vantagem deste fato determinando-se a expressão de GFP relativo à expressão de dois genes de referência, em vez de simplesmente medir a expressão de GFP absoluta. Um gene de referência é o gene de resistência à higromicina no plasmídeo pSS-hrGFP (fora do domínio definido pelos elementos STAR; FIG 21) e o outro é o gene da beta-actina genômico. A atividade SINC é quantificada pela análise de mancha de RNA como uma redução na relação do sinal de GFP para os sinais de higromicina e beta-actina. Entre os elementos SING candidatos que foram caracterizados, alguns demonstram uma redução relativa significante na transcrição de GFP, indicando que estes DNAs são capazes de induzir a formação de cromatina silenciosa. O elemento SINC35 (rotulado PSINKS35 na Tabela 4B) tem a atividade mais forte destes candidatos. Ele causa uma redução de cerca de 69% na relação de GFP/higromicina e uma redução de 75% no sinal de GFP/beta-actina. A concentração da atividade de SINC nos outros 5 candidatos descritos na aplicação original e nos vários outros elementos SINC candidatos que foram isolados e caracterizados subsequente à submissão daquela aplicação é menor. Portanto SINC35 tem desempenho superior como um elemento genético potente para a indução de cromatina silenciosa em diversas aplicações biotecnológicas.

Exemplo 20 Os elementos STAR são conservados entre camundongo e ser humano A análise BLAT da seqüência de DNA de STAR contra a base de dados do genoma humano (http://genoma.ucsc.edu/ cgi-bin/hgGateway) revela que algumas destas seqüências têm alta conservação de seqüência com outras regiões do genoma humano. Estas regiões duplicadas são elementos STAR candidatos; se elas apresentam atividade STAR, elas podem ser consideradas parálogos dos STARS clonados (dois genes ou elementos genéticos são ditos serem parálogos se eles são derivados de um evento de duplicação (Li, 1997)). A análise de BLAST das STARS humanas contra o genoma de camundongo (http://www.ensembl.org/ Mus_musculus/blastview) também revela regiões de alta conservação de seqüência entre camundongo e ser humano, esta conservação de seqüência foi mostrada para fragmentos de 15 dos 65 elementos STAR humanos. As faixas de conservação de 64% a 89%, em comprimentos de 141 pares de base a 909 pares de base (Tabela 8). Estes graus de conservação de seqüência são extraordinários e sugerem que estas seqüências de DNA podem conferir atividade STAR também dentro do genoma de camundongo. Algumas das seqüências dos genomas de camundongo e ser humano na Tabela 8 podem ser estritamente definidas como ortólogas (dois genes ou elementos genéticos são ditos serem ortólogos se eles são derivados de um evento de evolução de novas espécies (Li, 1997)). Por exemplo, STAR6 está entre os genes SLC8A1 e HAAO tanto no genoma de camundongo quanto no de ser humano. Em outros casos, um STAR humano clonado tem um parálogo dentro do genoma humano e o seu ortólogo foi identificado no genoma de camundongo. Por exemplo, STAR3a é um fragmento da região 15ql 1.2 do cromossoma humano 15. Esta região é 96,9% idêntica (paráloga) com um fragmento de DNA em 5q33.3 no cromossoma 5 humano, que está próximo ao gene da interleucina IL12B. Estes DNAs humanos compartilham aproximadamente 80% de identidade com um fragmento da região 11B2 no cromossoma de camundongo 11.0 fragmento 11B2 também está próximo ao gene da interleucina IL12B (camundongo). Portanto STAR3a e o fragmento 11B2 de camundongo podem ser estritamente definidos como parálogos. De modo a testar a hipótese de que a atividade STAR é compartilhada entre regiões de conservação de seqüência alta no genoma de camundongo e de ser humano, um dos STARS humanos com uma seqüência conservada em camundongo, STAR18, foi analisado em maiores detalhes. A conservação de seqüência no genoma de camundongo detectada com o clone STAR18 original estende à esquerda do cromossoma 2 humano por cerca de 500 pares de base (FIG 22; esquerda e direita dizem respeito à descrição padrão dos braços do cromossoma 2). Neste exemplo nós examinamos se a região de conservação de seqüência define um elemento STAR “que ocorre naturalmente” em ser humano que é mais extenso em comprimento do que o clone original. Nós também examinamos se a função STAR deste elemento STAR é conservada entre camundongo e ser humano. Materiais e Métodos A região de conservação de seqüência de camundongo/humana em tomo de STAR 18 foi recuperada do clone BAC humano RP11-387Al pela amplificação por PCR, em três fragmentos: a região inteira (preparadores E93 e E94), a metade á esquerda (preparadores E93 e E92) e a metade à direita (preparadores E57 e E94). Os fragmentos correspondentes da região de camundongo homóloga foram recuperados do clone BAC RP23-400H17 da mesma maneira (preparadores E95 e E98, E95 e E96 e E97 e E98, respectivamente). Todos os fragmentos foram clonados no vetor pSelect e transfectados em uma linha de célula U-2 OS/Tet-Off/LexA-HPl (acima). Seguinte à transfecção, a seleção com higromicina foi realizada para selecionar quanto às células transfectadas. A proteína LexA-HPl foi induzida pela diminuição da concentração de doxiciclina e a capacidade das células transfectadas para suportar o antibiótico zeocina (uma medida da atividade STAR) foi avaliada pelo monitoramento do desenvolvimento celular. Resultados O clone STAR18 original foi isolado de DNA humano digerido com Sau3Al ligado no vetor pSelect com base na sua capacidade para impedir o silenciamento de um gene de resistência à zeocina. O alinhamento do clone STAR 18 humano (497 pares de base) com o genoma de camundongo revelou alta similaridade de seqüência (72%) entre as regiões STAR 18 humana e de camundongo ortólogas. Isto também revelou alta similaridade (73%) na região que se estende por 488 pares de base imediatamente à esquerda do sítio Sau3AI que define a extremidade esquerda da região clonada (FIG 22). Fora destas regiões a similaridade de seqüência entre DNA humano e de camundongo cai abaixo dos 60%.

Como indicado na FIG 22, tanto o elemento STAR18 humano quanto o de camundongo conferem sobrevivência em zeocina para as células hospedeiras que expressam a proteína repressora lexA-HPl. O clone STAR18 de 497 pares de base original e seu ortólogo de camundongo conferem ambos a capacidade para desenvolver (FIG 22, a e d). As regiões de 488 pares de base adjacentes de alta similaridade de ambos os genomas também conferem a capacidade para desenvolver e de fato o seu fenótipo de desenvolvimento é mais vigoroso do que aquele do clone STAR18 original (FIG 22, b e e). Quando a região inteira de similaridade de seqüência foi testada, estes DNAs tanto de camundongo quanto de ser humano conferem desenvolvimento e o fenótipo de desenvolvimento é mais vigoroso do que os dois sub-fragmentos (FIG 22, c e t). Estes resultados demonstram que a atividade STAR de STAR18 humano é conservada no seu ortólogo de camundongo. A alta conservação de seqüência entre estas regiões ortólogas é particularmente digna de nota porque elas não são seqüências codificadoras de proteína, levando á conclusão de que elas têm alguma função reguladora tem impedido a sua divergência evolucionária através da mutação.

Esta análise demonstra que elementos STAR clonados identificados pelo programa de triagem original podem em alguns casos representar elementos STAR parciais e que a análise do DNA genômico no qual eles são embutidos pode identificar seqüências com atividade STAR mais forte.

Exemplo 21 Os elementos STAR contêm motivos de seqüência de DNA característicos Os elementos STAR são isolados com base no seu fenótipo anti-repressão com respeito à expressão de transgene. Este fenótipo anti-repressão reflete processos bioquímicos subjacentes que regulam a formação da cromatina que está associada com os elementos STAR. Estes processos são tipicamente específicos de seqüência e resultam da ligação de proteína ou estrutura de DNA. Isto sugere que os elementos STAR compartilharão a similaridade de seqüência de DNA. A identificação da similaridade de seqüência entre os elementos STAR fornecerá motivos de seqüência que são característicos dos elementos que já foram identificados pelas triagens e testes funcionais. Os motivos de seqüência também serão úteis para reconhecer e reivindicar novos elementos STAR que funcionam conforme as reivindicações desta patente. As funções incluem rendimento e estabilidade melhorados de transgenes expressados em células hospedeiras eucarióticas.

Outros benefícios de identificar motivos de seqüência que caracterizam elementos STAR incluem: (1) fornecimento de motivos de procura para o prognóstico e identificação de novos elementos STAR em bases de dados de genoma, (2) fornecimento de uma base lógica para a modificação dos elementos e (3) fornecimento de informação para a análise funcional da atividade STAR. Usando a bio-informática, as similaridades de seqüência entre os elementos STAR foram identificadas; os resultados estão apresentados neste exemplo.

Bio-informática e Fundamentos Estatísticos. Os elementos reguladores de DNA tipicamente funcionam por intermédio da interação com as proteínas de ligação de DNA específicas de seqüência. A análise bio-informática de elementos de DNA tais como elementos STAR cujas propriedades reguladoras foram identificadas, mas cujas proteínas interventoras são desconhecidas, requer um método estatístico para a identificação de motivos de seqüência. Isto pode ser obtido por um método que detecta padrões de seqüência de DNA curtos que são super-representados em um conjunto de elementos reguladores de DNA (por exemplo os elementos STAR) comparados a um seqüência de referência (por exemplo o genoma humano completo). O método determina o número de ocorrências observadas e esperadas dos padrões em cada elemento regulador. O número de ocorrências esperadas é calculado a partir do número de ocorrências observadas de cada padrão na seqüência de referência.

Os padrões de seqüência de DNA podem ser oligonucleotídeos de um dado comprimento, por exemplo seis pares de base. Na análise mais simples, para um oligonucleotídeo de 6 pares de base (hexâmero) composto dos quatro nucleotídeos (A, C, G e T) existem 4Λ6 = 4096 oligonucleotídeos distintos (todas as combinações de AAAAAA até TTTTTT). Se as seqüências reguladora e de referência foram completamente aleatórias e tiveram proporções iguais dos nucleotídeos A, C, G e T, então a ffeqüência esperada de cada hexâmero pode ser 1/4096 (0,00024). Entretanto, a ffeqüência atual de cada hexâmero na seqüência de referência é tipicamente diferente do que isto devido às tendências no teor de pares de base G:C, etc. Portanto a ffeqüência de cada oligonucleotídeo na seqüência de referência é determinada empiricamente pela contagem, para criar uma “tabela de ffeqüência” para os padrões. A tabela de ffeqüência padrão da seqüência de referência é depois usada para calcular a ffeqüência esperada de ocorrência de cada padrão no conjunto de elemento regulador. As ffeqüências esperadas são comparadas com as ffeqüências observadas de ocorrência dos padrões. Os padrões que são “super-representados” no conjunto são identificados; por exemplo, se o hexâmero ACGTGA é esperado ocorrer 5 vezes em 20 quilopares de base de seqüência, mas é observada ocorrer 15 vezes, então é três vezes super-representada. Dez das 15 ocorrências das quais o padrão hexamérico de seqüência não seria esperado nos elementos reguladores se os elementos tivessem a mesma composição de hexâmero como o genoma inteiro. Uma vez que os padrões super-representados são identificados, um teste estatístico é aplicado para determinar se a sua super-representação é significante ou pode ser devido ao acaso. Para este teste, um índice de significância, “sig”, é calculado para cada padrão. O índice de significância é derivado da probabilidade de ocorrência de cada padrão, que é estimada por uma distribuição binomial. A probabilidade leva em conta o número de padrões possíveis (4096 para hexâmeros). Os valores sig mais altos correspondem aos oligonucleotídeos mais super-representados (van Helden et al., 1998). Em termos práticos, oligonucleotídeos com sig > 0 são considerados como super-representados. Um padrão com sig > 0 é provável ser super-representado devido ao acaso uma vez (= 10Λ0) no conjunto de seqüências de elemento regulador. Entretanto, em sig > 1 um padrão é esperado ser super-representado uma vez em dez (= 10Λ1) conjuntos de seqüência, sig > 2 uma vez em 100 (= 10A2) conjuntos de seqüência, etc. Os padrões que são significantemente super-representados no conjunto de elemento regulador são usados para desenvolver um modelo para a classificação e prognóstico de seqüências de elemento regulador. Isto utiliza a Análise Discriminante, um método chamado de “supervisionado” de classificação estatística conhecido por uma pessoa de habilidade na técnica (Huberty, 1994). Na Análise Discriminante, conjuntos de itens conhecidos ou classificados (por exemplo elementos STAR) são usados para “treinar” um modelo para reconhecer estes itens com base nas variáveis específicas (por exemplo padrões de seqüência tais como hexâmeros). O modelo treinado é depois usado para prognosticar se outros itens devem ser classificados como pertencentes ao conjunto de itens conhecidos (por exemplo é uma seqüência de DNA de um elemento STAR). Neste exemplo, os itens conhecidos no conjunto de treinamento são elementos STAR (conjunto de treinamento positivo). Eles são comparados com seqüências que são aleatoriamente são selecionadas do genoma (conjunto de treinamento negativo) que têm o mesmo comprimento como os elementos STAR. A Análise Discriminante estabelece critérios para descriminar positivos de negativos com base em um conjunto de variáveis que distinguem os positivos; neste exemplo, as variáveis são os padrões significantemente super-representados (por exemplo hexâmeros).

Quando o número de padrões super-representados é alto comparado com o tamanho do conjunto de treinamento, o modelo pode vir a ser tendencioso devido ao super-treinamento. O super-treinamento é enganado aplicando-se uma seleção escalonada avançada de variáveis (Huberty, 1994). A meta da Análise Discriminante Escalonada é selecionar o número mínimo de variáveis que fornecem a discriminação máxima entre os positivos e negativos. O modelo é treinado avaliando-se as variáveis uma a uma quanto a sua capacidade para classificar apropriadamente os itens nos conjuntos de treinamento positivo e negativo. Isto é feito até que a adição de novas variáveis ao modelo não aumenta significantemente o poder prognosticativo do modelo (isto é até que a taxa de erro de classificação seja minimizada). Este modelo otimizado é depois usado para testar, de modo a prognosticar se “novos” itens são positivos ou negativos (Huberty, 1994). É inerente nas estatísticas de classificação que para itens complexos tais como seqüências de DNA, alguns elementos do conjunto de treinamento positivo serão classificados como negativos (negativos falsos) e alguns membros do conjunto de treinamento negativos serão classificados como positivos (positivos falsos). Quando um modelo treinado é aplicado para testar novos itens, os mesmos tipos de más classificações são esperados ocorrer. No método bio-informático aqui descrito, a primeira etapa, a análise da ffeqüência padrão, reduz um conjunto grande de padrões de seqüência (por exemplo todos os 4096 hexâmeros) a um conjunto menor de padrões significantemente super-representados (por exemplo 100 hexâmeros); na segunda etapa, a Análise Discriminante Escalonada reduz o conjunto de padrões super-representados ao subconjunto daqueles padrões que têm poder discriminante máximo (por exemplo 6 a 10 hexâmeros). Portanto este método fornece critérios simples e robustos para identificar elementos reguladores de DNA tais como elementos STAR.

As proteínas de ligação de DNA podem ser distinguidas com base no tipo de sítio de ligação que elas ocupam. Algumas reconhecem seqüências contíguas; para este tipo de proteína, padrões que são oligonucleotídeos de 6 pares de base de comprimento (hexâmeros) são proveitosos para a análise de bio-informática (van Helden et al., 1998). Outras proteínas se ligam a pares de seqüência: o contato é feito entre os pares de trinucleotídeos altamente conservados separados por uma região não conservada de largura fixa (van Helden et al., 2000). De modo a identificar seqüências em elementos STAR que pode ser ligadas pelas proteínas de ligação díade, a análise de freqüência também foi conduzida para este tipo de padrão, onde o espaçamento entre os dois trinucleotídeos foi variada de 0 a 20 (isto é XXXN{0-20}XXX onde os X’s são nucleotídeos específicos que compõe os trinucleotídeos e os Ν’s são nucleotídeos aleatórios de 0 a 20 pares de base no comprimento). Os resultados da análise de freqüência díade também são usados para a Análise Discriminante Linear como descrito acima. Materiais e Métodos Usando a triagem genética descrita no pedido de patente original, sessenta e seis (66) elementos STAR foram inicialmente isolados de DNA genômico humano e caracterizados em detalhes (Tabela 6). A triagem foi realizada em bibliotecas de gene construídas pela digestão de Sau3Al de DNA genômico humano, purificado a partir de placenta (Clontech 6550-1) ou transportado em cromossomas artificiais bacterianos/Pl (BAC/PAC). Os clones BAC/PAC contêm DNA genômico de regiões do cromossoma 1 (clones RP1154H19 e RP3328E19), do cacho HOX de genes homeóticos (clones RP1167F23, RP1170019 e RP11387A1) ou do cromossoma 22 humano (Research Genetics 96010-22). Os DNAs foram fracionados por tamanho e a fração de 0,5 a 2 kb de tamanho foi ligada no vetor pSelect digerido com BamHI, pelas técnicas padrão (Sambrook et ai, 1989). Os plasmídeos PSelect contendo DNA genômico humano que conferiu resistência à zeocina em concentrações de doxiciclina baixas foram isolados e propagados na Escherichia coli. As triagens que produziram os elementos STAR da Tabela 6 ensaiaram aproximadamente 1 a 2% do genoma humano.

Os insertos de DNA genômico humano nestes 66 plasmídeos foram seqüenciados pelo método de didesóxi (Sanger et al., 1977) usando um seqüenciador de DNA autoconjugado Beckman CEQ2000, usando as instruções do fabricante. Em resumo, o DNA foi purificado a partir da E. coli usando os conjuntos QIAprep Spin Miniprep e Plasmid Midi (QIAGEN 27106 e 12145, respectivamente). O seqüenciamento de ciclo foi realizado usando oligonucleotídeos de encomenda correspondendo ao vetor pSelect (preparadores D89 e D95, Tabela 5), na presença de terminadores de corante (Conjunto de Seqüenciamento de Ciclo CEQ Dye Terminator, Beckman 608000). As seqüências de DNA STAR montadas foram localizadas no genoma humano (construções de base de dados de agosto e dezembro de 2001) usando BLAT (Ferramenta de Alinhamento Local Básico (Kent, 2002); http://genoma.ucsc.edulcgi-bin/hgGateway; Tabela 6). No agregado, as seqüências STAR combinadas compreendem 86,6 quilopares de base, com um comprimento médio de 1,3 quilopares de base.

Os motivos de seqüência que distinguem os elementos STAR dentro do DNA genômico humano foram identificados pela análise de bio-informática usando um procedimento de etapa dupla, como segue (ver a FIG 23 para um diagrama esquemático). A análise tem dois conjuntos de dados de entrada: (1) as seqüências de DNA dos elementos STAR (STAR1 a STAR65 foram usadas; Tabela 6); e (2) a seqüência de DNA do genoma humano (exceto para o cromossoma 1, que não foi praticável incluir devido ao seu tamanho grande; para a análise de díade um subconjunto aleatório de seqüência de DNA genômico humano (~27 Mb) foi usado).

Análise de Padrão de Freqüência. A primeira etapa na análise usa o software RSA-Tools (Ferramentas de Análise de Seqüência Reguladora; http://www.ucmb.ulb.ac.be/bioinformatics/rsa-tools/; referências (van Helden et al., 1998, van Helden et al., 2000, van Helden et al., 2000)) para determinar a seguinte informação: (1) as freqüências de todos os oligonucleotídeos díades e hexaméricos no genoma humano; (2) as freqüências dos oligonucleotídeos e díades nos 65 elementos STAR; e (3) os índices de significância daqueles oligonucleotídeos e díades que são super-representados nos elementos STAR comparados ao genoma. Uma análise de controle foi feita com 65 seqüências que foram selecionadas ao acaso a partir do genoma humano (isto é de 2689 x 10Λ3 quilopares de base) que se igualam ao comprimento dos elementos STAR da Tabela 6.

Análise Discriminante. Os oligonucleotídeos e díades super-representados foram usados para treinar modelos para prognóstico de elementos STAR pela Análise Discriminante Linear (Huberty, 1994). Uma pré seleção de variáveis foi realizada selecionando-se os 50 padrões com o poder descriminatório individual mais alto dos oligos ou díades super-representados das análises de freqüência. Estas variáveis pré selecionadas foram depois usadas para o treinamento de modelo em uma Análise Discriminante Linear Escalonada para selecionar a combinação mais discriminante de variáveis (Huberty, 1994). A seleção de variável foi com base na minimização da taxa de erro de classificação (porcentagem de classificações negativas falsas). Além disso, a taxa de erro esperada foi estimada aplicando-se o mesmo método discriminante ao conjunto de controle de seqüências aleatórias (minimizando a porcentagem de classificações positivas falsas).

Os modelos prognosticativos da fase de treinamento da Análise Discriminante foram testados de dois modos. Primeiro, os elementos STAR e as seqüências aleatórias que foram usados para gerar o modelo (os conjuntos de treinamento) foram classificados. Segundo, as seqüências em uma coleção de 19 elementos STAR candidatos (recentemente clonados pela seleção de zeocina como descrito acima) foram classificados. Estes elementos STAR candidatos são listados na Tabela 11 (SEQ ID: 67 a 84).

Resultados A análise de ffeqüência padrão foi realizada com RSA-Tools em 65 elementos STAR, usando o genoma humano como a seqüência de referência. Cento e sessenta e seis (166) oligonucleotídeos hexaméricos foram descobertos ser super-representados no conjunto de elementos STAR (sig > 0) comparados com o genoma inteiro (Tabela 9). O oligonucleotídeo mais significantemente super-representado, CCCCAC, ocorre 107 vezes entre os 65 elementos STAR, mas é esperado ocorrer apenas 49 vezes. Ele tem um coeficiente de significância de 8,76; em outras palavras, a probabilidade de que a sua super-representação seja devida ao acaso aleatório é de 1/10A8,76, isto é menos do que um em 500 milhões.

Noventa e cinco dos oligonucleotídeos têm um coeficiente de significância maior do que 1 e são portanto altamente super-representados nos elementos STAR. Entre os oligonucleotídeos super-representados, as suas ocorrências observadas e esperadas, respectivamente, variam de 6 e 1 (para oligo 163, CGCGAA, sig = 0,02) to 133 e 95 (para oligo 120, CCCAGG, sig = 0,49). As diferenças nas ocorrências esperadas refletem fatores tais como o teor de G:C do genoma humano. Portanto as diferenças entre os oligonucleotídeos nos seus números de ocorrências são menos importantes do que a sua super-representação; por exemplo, oligo 2 (CAGCGG) é 36 / 9 = 4 vezes super-representado, que tem uma probabilidade de ser devido ao acaso aleatório de um em cinquenta milhões (sig = 7,75). A Tabela 9 também apresenta o número de elementos STAR nos quais cada oligonucleotídeo super-representado é encontrado. Por exemplo, o oligonucleotídeo mais signifícante, oligo l(CCCCAC), ocorre 107 vezes, mas é encontrado em apenas 51 STARS, isto é na média ele ocorre como duas cópias por STAR. O oligonucleotídeo menos abundante, o número 166 (AATCGG), ocorre em média como uma cópia única por STAR (treze ocorrências em onze STARS); oligonucleotídeos de cópia única ocorrem freqüentemente, em especial para oligos de abundância mais baixa. No outro extremo, o oligo 4 (CAGCCC) ocorre em média 3 vezes naqueles STARS nos quais ele é encontrado (37 STARS). O oligonucleotídeo mais amplamente disseminado é o número 120 (CCCAGG), que ocorre em 58 STARS (em média duas vezes por STAR) e oligonucleotídeo menos amplamente disseminado é o número 114 (CGTCGC), que ocorre em apenas 6 STARS (e em média apenas uma vez por STAR).

Os resultados da análise de freqüência de díade são dados na Tabela 10. Setecentos e trinta (730) díades foram descobertos serem super-representados no conjunto de elementos STAR (sig > 0) comparados com a seqüência de referência. O díade mais significantemente super-representado, CCCN(2)CGG, ocorre 36 vezes entre os 66 elementos STAR, mas é esperado ocorrer apenas 7 vezes. Ele tem um coeficiente de significância de 9,31; em outras palavras, a probabilidade de que a sua super-representação seja devido ao acaso é de 1/10Λ9,31, isto é menos do que um em 2 bilhão.

Trezentos e noventa e sete dos díades têm um coeficiente de significância maior do que 1 e são portanto altamente super-representados nos elementos STAR. Entre os díades super-representados, as suas ocorrências observadas e esperadas, respectivamente, variam de 9 e 1 (para cinco díades (números 380, 435, 493, 640 e 665)) para 118 e 63 (para o número 30 (AGGN{2}GGG), sig = 4,44).

Os oligonucleotídeos e díades descobertos serem super-representados nos elementos STAR pela análise de freqüência padrão foram testados quanto ao seu poder de discriminação pela Análise Discriminante Linear. Os modelos discriminantes foram treinados pela seleção escalonada da melhor combinação entre os 50 padrões de oligonucleotídeo (Tabela 9) ou díade (Tabela 10) mais discriminantes. Os modelos obtiveram taxas de erro ótimo depois da incorporação de 4 (díade) ou 5 variáveis. As variáveis de discriminação da análise de oligo são os números 11, 30, 94, 122 e 160 (Tabela 9); aqueles da análise de díade são os números 73, 194, 419 e 497 (Tabela 10).

Os modelos discriminantes foram depois usados para classificar os 65 elementos STAR no conjunto de treinamento e as suas seqüências aleatórias associadas. O modelo usando variáveis de oligonucleotídeo classifica 46 dos 65 elementos STAR como elementos STAR (positivos verdadeiros); o modelo de díade classifica 49 dos elementos STAR como positivos verdadeiros. Em combinação, os modelos classificam 59 dos 65 elementos STAR como elementos STAR (91%; FIG 24). As taxas de positivo falso (seqüências aleatórias classificadas como STARS) foram 7 para o modelo de díade, 8 para o modelo de oligonucleotídeo e 13 para os prognósticos combinados dos dois modelos (20%). Os elementos STAR da Tabela 6 que não foram classificados como STARS pela LDA são STARS 7, 22, 35, 44, 46 e 65. Estes elementos demonstram a estabilização da atividade anti-repressora em ensaios funcionais, assim o fato de que eles não são classificados como STARS pela LDA sugere que eles representam uma outra classe (ou classes) de elementos STAR.

Os modelos foram depois usados para classificar os 19 elementos STAR candidatos no conjunto de teste listado na Tabela 11. O modelo de díade classifica 12 destes STARs candidatos como elementos STAR e o modelo de oligonucleotídeo classifica 14 como STARS. O número combinado dos candidatos que são classificados como elementos STAR é 15 (79%). Esta é uma taxa mais baixa de classificação do que obtida com o conjunto de treinamento de 66 STARS; isto é esperado por duas razões.

Primeiro, os modelos discriminantes foram treinados com os 65 STARS da Tabela 6 e as variáveis de discriminação com base neste conjunto de treinamento podem ser menos bem representadas no conjunto de teste. Segundo, as seqüências STARs candidatas no conjunto de teste não foi ainda completamente caracterizado em termos de função in vivo e pode incluir elementos apenas com propriedades anti-repressão fracas. Esta análise demonstra o poder de um método estatístico para classificação bio-informática de elementos STAR. As seqüências STARs contêm vários padrões de díades e oligonucleotídeos hexaméricos que são significantemente super-representados em comparação com o genoma humano como um todo. Estes padrões podem representar sítios de ligação para proteínas que conferem a atividade STAR; em qualquer caso eles formam um conjunto de motivos de seqüência que podem ser usados para reconhecer seqüências do elemento STAR.

Usando estes padrões para reconhecer elementos STAR pela Análise Discriminante, uma alta proporção dos elementos obtidos pela triagem genética da invenção são de fato classificados como STARS. Isto reflete similaridades de seqüência e funcionais subjacentes entre estes elementos. Um aspecto importante do método aqui descrito (análise de freqüência padrão seguido pela Análise Discriminante) é que ele pode ser reiterado; por exemplo, incluindo-se os 19 elementos STAR candidatos da Tabela 11 com os 66 elementos STAR da Tabela 6 em um conjunto de treinamento, um modelo discriminante melhorado pode ser treinado. Este modelo melhorado pode ser depois usado para classificar outros elementos reguladores candidatos como STARS. A triagem in vivo de larga escala de seqüências genômicas usando o método da invenção, combinado com a reiteração da análise de bio-informática, fornecerá um meio de discriminar elementos STAR que assintoticamente aproximam-se de 100% de reconhecimento e prognóstico de elementos conforme o genoma é triado na sua totalidade. Estes prognósticos severos e compreensivos da função STAR garantirá que todos os elementos STAR humanos sejam reconhecidos e estejam disponíveis para o uso na melhora da expressão de transgene. Exemplo 22 Clonagem e caracterização de elementos STAR a partir de Arabidopsis thaliana O silenciamento de transgene ocorre em plantas transgênicas tanto ao nível transcricional quanto pós transcricional (Meyer, 2000, Vance & Vaucheret, 2001). Em cada um dos casos, o resultado desejado de expressão de transgene pode ser comprometido pelo silenciamento; a expressão baixa e a instabilidade do transgene resulta na expressão deficiente de características desejáveis (por exemplo resistência a praga) ou produções baixas de proteínas recombinantes. Isto também resulta em prognosticabilidade deficiente: a proporção de plantas transgênicas que expressam o transgene em níveis biotecnologicamente úteis é baixa, que necessita triagem laboriosa e cara de indivíduos transformados quanto aqueles com características de expressão benéficas. Este exemplo descreve a isolação de elementos STAR a partir do genoma da planta dicotiledônea Arabidopsis thaliana para o uso na prevenção do silenciamento de transgene transcricional em plantas transgênicas. A Arabidopsis foi escolhida para este exemplo porque ela é um organismo modelo bem estudado: ela tem um genoma compacto, ela é sensível às manipulações genéticas e de DNA recombinante e o seu genoma foi seqüenciado (Bevan et al., 2001, Initiative, 2000, Meinke et al., 1998). Materiais e Métodos: O DNA genômico foi isolado do ecotipo Columbia da Arabidopsis thaliana como descrito (Stain et al., 1998) e parcialmente digerido com Mbol. O DNA digerido foi ffacionado em tamanho até 0,5 a 2 quilopares de base pela eletroforese em gel de agarose e purificação a partir do gel do Conjunto de Extração em Gel QIAquick, (QIAGEN 28706), seguido pela ligação no vetor pSelect (acima). A transfecção na linha de célula U-2 OS/Tet-Off/LexA-HPl e a seleção quanto a resistência à zeocina em concentração de doxiciclina baixa foi realizada como descrito (acima). Os plasmídeos foram isolados das colônias resistentes á zeocina e retransfectados na linha de célula U-2 OS/Tet-Off/LexA-HPl. O seqüenciamento de fragmentos do DNA genômico de Arabidopsis que conferiu resistência à zeocina na re-transfecção foi realizado como descrito (acima). As seqüências de DNA foram comparadas com a seqüência do genoma de Arabidopsis pela análise de BLAST ((Altschul et al., 1990); URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast). A atividade STAR foi testada ainda medindo-se os níveis de mRNA para os genes de resistência à higromicina e zeocina em células hospedeiras recombinantes pela PCR de transcrição reversa (RT-PCR). As células da linha de célula U-2 OS/Tet-Off/lexA-HP 1 foram transfectadas com plasmídeos pSelect contendo elementos STAR da Arabidopsis, o elemento scs de Drosófila ou não contendo nenhum inserto (acima). Estes foram cultivados em higromicina durante 2 semanas em alta concentração de doxiciclina, depois a concentração de doxiciclina foi diminuída para 0,1 ng/ml para induzir a proteína repressora lexA-HPl. Depois de 10 dias, o RNA total foi isolado pelo conjunto RNeasy mini (QIAGEN 74104) como descrito pelo fabricante. A síntese do primeiro filamento de cDNA foi realizado usando o conjunto RevertAid First Strand cDNA Synthesis (MBI Fermentas 1622) usando o preparador oligo(dT)18 como descrito pelo fabricante. Uma alíquota do cDNA foi usada como o padrão em uma reação de PCR usando preparadores D58 e D80 (para o marcador de zeocina) e D70 e D71 (para o marcador de higromicina) e Taq DNA polimerase (Promega M2661). As condições de reação foram de 15 a 20 ciclos de 94° C durante 1 minuto, 54° C durante 1 minuto e 72° C durante 90 segundos. Estas condições resultam em uma relação linear entre o RNA de entrada e o DNA produto da PCR. Os produtos da PCR foram resolvidos pela eletroforese em gel de agarose e as faixas de zeocina e higromicina foram detectadas pelo Southern blotting como descrito (Sambrook et al., 1989), usando produtos da PCR produzidos como acima com o plasmídeo pSelect purificado como padrão. A relação dos sinais de zeocina e higromicina corresponde ao nível de expressão normalizado do gene da zeocina.

Resultados A biblioteca de DNA genômico de Arabidopsis no vetor pSelect compreendeu 69.000 clones primários na E. coli, 80% dos quais transportaram insertos. O tamanho de inserto médio foi aproximadamente 1000 pares de base; a biblioteca portanto representa aproximadamente 40% do genoma da Arabidopsis.

Uma porção desta biblioteca (que representa aproximadamente 16% do genoma da Arabidopsis) foi transfectada na linha de célula U-2 OS/Tet-Off/LexA-HPl. A seleção com higromicina foi imposta para isolar transfectantes, que resultou em 27.000 colônias sobreviventes. Estas foram depois submetidas à seleção com zeocina em concentração de doxiciclina baixa. Os plasmídeos contendo STAR putativos de 56 colônias resistentes à zeocina foram resgatados em E. coli e re-transfectados em células U-2 OS/Tet-Off/LexA-HPl. Quarenta e quatro destes plasmídeos (79% dos plasmídeos testados) conferiram resistência à zeocina nas células hospedeiras em baixas concentrações de doxiciclina, demonstrando que os plasmídeos transportaram elementos STAR. Isto indica que a triagem de pSelect em células U-2 OS humana é altamente eficiente na detecção de elementos STAR a partir de DNA genômico vegetal.

As seqüências de DNA destes 44 elementos STAR candidatos foram determinadas. Trinta e cinco delas foram identificadas como locais únicos na base de dados da seqüência genômica nuclear de Arabidopsis (Tabela 12; SEQ ID: 85 a SEQ ID: 119). Quatro outros foram identificados como vindo do genoma de cloroplasto, quatro foram quimeras de fragmentos de DNA de dois locais e um não foi encontrado na base de dados do genoma de Arabidopsis. A concentração dos elementos STAR de Arabidopsis clonados foi testada avaliando-se a sua capacidade para impedir a repressão transcricional do gene de resistência à zeocina, usando um ensaio de RT-PCR. Como um controle para a entrada de RNA entre as amostras, os níveis de transcrito do gene de resistência à higromicina para cada transfecção STAR também foram avaliados. Esta análise foi realizada em 12 dos elementos STAR de Arabidopsis. Os resultados (FIG 25) demonstram que os elementos STAR de Arabidopsis são superiores ao elemento scs de Drosófila (controle positivo) e ao vetor vazio (“SV40”; controle negativo) na sua capacidade para proteger o gene de resistência à zeocina da repressão transcricional. Em particular, STAR-A28 e STAR-A30 permitem níveis 2 vezes mais altos de expressão do gene de resistência à zeocina do que o elemento scs (normalizado para o controle interno do mRNA do gene de resistência à higromicina) quando o repressor lexA-HPl é expressado. Estes resultados demonstram que o método da invenção pode ser aplicado com sucesso para a recuperação de elementos STAR a partir de genomas de outras espécie que não a humana. A sua aplicação bem sucedida aos elementos STAR de um genoma vegetal é particularmente significante porque demonstra a faixa taxonômica ampla em que o método da invenção é aplicável e porque as plantas são um alvo importante do desenvolvimento biotecnológico.

Descrição Resumida dos Desenhos Figura 1. A família pSelect de plasmídeos para selecionar e caracterizar elementos STAR. Um marcador de resistência (zeocina ou puromicina) ou gene repórter (GFP ou luciferase) sob o controle do promotor SV40 promíscuo é adjacente a um sítio de clonagem BamHl flanqueado pelos sítios Ascl e Hinálll. A montante do sítio de clonagem estão os operadores lexA aos quais a proteína lexA pode ligar. A ligação de proteínas lexA quiméricas do grupo Policomb aos operadores causa a repressão do gene marcador ou repórter. Os fragmentos de DNA inseridos no sítio de clonagem que bloqueia a repressão são identificados pela expressão persistente do gene marcador ou repórter. Os plasmídeo duplicam epissomicamente em células de mamífero cultivadas devido à seqüência oriP.

Figura 2. A família pSDH de plasmídeos para testar elementos STAR. Dois sítios de clonagem múltiplos (MCSI e MCSII) flanqueiam um gene repórter (GFP ou luciferase) cuja expressão é direcionada por um promotor a montante (CMV, Tet-off ou SV40). Os elementos STAR a serem testados são inseridos em MCSI e MCSII. Estes contêm sítios de restrição únicos (MCSI: Xhol, Notl, EcoRl e SaÍl; MCSII: Hindlll, EcoRV, Bglll e NheI). O plasmídeo duplica depois da integração ao acaso no genoma de células de mamífero.

Figura 3. Proporção de clones super-expressores luciferase. Células de osteossarcoma humano U-2 OS foram transfectadas de modo estável com plasmídeos pSDH (contendo o gene repórter de luciferase sob o controle do promotor tet-off) e clones transfectados individuais foram isolados e cultivados. A expressão de luciferase foi enzimaticamente medida. A expressão de luciferase média pelos clones contendo o pSDH sem STAR (“nível de referência”) foi determinada. Clones dos conjuntos para todos os plasmídeos foram classificados como “super-expressores” se a sua atividade de luciferase foi mais do que 2 vezes mais alta do que o nível de referência. A porcentagem de clones super-expressores em cada conjunto de plasmídeo é plotada.

Figura 4. Vezes de super-expressão pelos clones super-expressores. A faixa de super-expressão nos plasmídeos pSDH contendo STAR integrados no DNA genômico foi determinada dividindo-se as atividades de luciferase de cada clone pelo nível de referência. Para aqueles que demonstram expressão significante (mais do que 2 vezes acima do nível de referência), as vezes de aumento real foram anotadas; os valores mínimo e médio destes dados são plotados para cada plasmídeo.

Figura 5. Vezes de super-expressão pelos clones super-expressores. A faixa de super-expressão em plasmídeos pSDH contendo STAR integrados no DNA genômico foi determinada dividindo-se as atividades de luciferase de cada clone pelo nível de referência. Para aqueles que demonstram expressão significante (mais do que 2 vezes acima do nível de referência), as vezes de aumento real foram anotadas; os valores máximos destes dados são plotados para cada plasmídeo.

Figura 6. O plasmídeo pSS (SINC-Select) para selecionar e caracterizar elementos SINC. O gene codA::upp suicida codifica uma proteína que converte o pró medicamento 5-fluorocitosina ao medicamento tóxico 6-fluorouracila. Na indução pela concentração de tetraciclina diminuída, as célula hospedeiras tomam-se sensíveis ao pró medicamento. Os fragmentos de DNA genômico inseridos no sítio de clonagem (Bglll-Xhol) que têm atividade de silenciamento impedirão a expressão do gene suicida e permite a formação de colônias resistentes a pró medicamento. Os elementos STAR flanqueiam os componentes de seleção para impedir a disseminação da cromatina silenciadora para os componentes funcionais do plasmídeo. O plasmídeo duplica epissomicamente em células de mamífero cultivadas devido à seqüência oriP. FIG 7. O plasmídeo pSDH-CSP usado para testar a atividade STAR. O gene repórter da Fosfatase Alcalina Secretada (SEAP) está sob o controle do promotor CMY e o marcador selecionável de resistência à puromicina (puro) está sob o controle do promotor SV40. Flanqueando estes dois genes estão os sítios de clonagem múltiplos nos quais os elementos STAR podem ser clonados. O plasmídeo também tem uma origem de replicação (ori) e gene de resistência á ampicilina (ampR) para a propagação em Escherichia coli. FIG 8. STAR6 e STAR49 melhoram a prognosticabilidade e o rendimento da expressão de transgene. A expressão de SEAP do promotor CMV pelas células CHO transfectadas com pSDH-CSP, pSDH-CSP-STAR6 ou pSDH-CSP-STAR49 foi determinada. As construções contendo STAR conferem maiores prognosticabilidade e rendimentos elevados em relação à construção pSDH-CSP sozinha. FIG 9. STAR6 e STAR8 melhoram a prognosticabilidade e o rendimento da expressão de transgene. A expressão de luciferase a partir do promotor CMV pelas células U-2 OS transfectadas com pSDH-CMV, pSDH-CMV-STAR6 ou pSDH-CMV-STAR8 foi determinada. As construções contendo STAR conferem maior prognosticabilidade e rendimento elevado em relação à construção pSDH-CMV sozinha. FIG 10. Seqüências essenciais mínimas de STAR10 e STAR27. Porções dos elementos STAR foram amplificados pela PCR: STAR 10 foi amplificado com preparadores E23 e El2 para produzir o fragmento 10A, El3 e El4 para produzir o fragmento 10B e El5 e E16 para produzir o fragmento 10C. STAR27 foi amplificado com preparadores El7 e El8 para produzir o fragmento 27A, El9 e E20 para produzir o fragmento 27B e E21 e E22 para produzir o fragmento 27C. Estes sub-fragmentos foram clonados no vetor pSelect. Depois da transfecção nas células U-2 OS/Tet-OffrLexA-HPl, o desenvolvimento das culturas na presença de zeocina foi monitorado. As taxas de desenvolvimento variaram de vigoroso (+++) até deficiente (+/-), enquanto algumas culturas falharam em sobreviver ao tratamento com zeocina (-) devido à ausência de atividade STAR no fragmento de DNA testado. FIG 11.0 elemento STAR funciona no contexto do promotor SV40. PSDHSV40 e pSDH-SV40-STAR6 foram transfectadas na linha de célula U-2 OS de osteossarcoma humano e a expressão de luciferase foi ensaiada com ou sem a proteção do silenciamento do gene pelo STAR6 em clones resistentes à puromicina. FIG 12. O elemento STAR funciona no contexto do promotor Tet-Off. PSDH-Tet e pSDH-Tet-STAR6 foram transfectados na linha de célula U-2 OS de osteossarcoma humano e a expressão de luciferase foi ensaiada com ou sem a proteção do silenciamento de gene pelo STAR6 em clones resistentes à puromicina. FIG 13. Diagrama esquemático da orientação dos elementos STAR conforme eles são clonados no vetor pSelect (painel A), conforme eles são clonados nos vetores pSDH para preservar a sua orientação natural (painel B) e conforme eles são clonados no vetor pSDH na orientação oposta (painel C) . FIG 14. Direcionalidade da função STAR66. O elemento STAR66 foi clonado no pSDH-Tet na orientação natural (STAR66 natural) ou na orientação oposta (STAR66 oposto) e transfectadas em células U-2 OS. A atividade de luciferase foi ensaiada em clones resistentes à puromicina. FIG 15. Dependência do número de cópia da função STAR. O Southern blot de unidades de expressão de luciferase em pSDH-Tet-STARlO, integrado no DNA genômico de U-2 OS. A sonda de DNA luciferase radioativa foi usada para detectar a quantidade de DNA transgênico no genoma de cada clone, que foi depois quantificado com um aparelho produtor de fosforimagem. FIG 16. A dependência do número de cópia da função STAR. O número de cópia de unidades de expressão pSDH-Tet-STARlO em cada clone foi determinado pela produção de fosforimagem e comparado com a atividade da enzima repórter de luciferase expressada por cada clone. FIG 17. Ensaios intensificador-bloqueador e intensificador. Os vetores de expressão de luciferase usados para testar STARS quanto a atividade intensificadora-bloqueadora e intensificadora são mostrados esquematicamente. O sítio de ligação E-box para a proteína intensificadora E47 está a montante de um sítio de clonagem para os elementos STAR. A jusante do sítio de clonagem STAR está o gene da luciferase sob o controle de um promotor mínimo da alcalino fosfatase humana (mp). Os histogramas indicam os resultados esperados para as três situações experimentais possíveis (ver o texto). Painel A: Ensaio de bloqueio de intensificador. Painel B: Ensaio de intensificador. FIG 18. Ensaio de bloqueio de intensificador. A expressão de luciferase a partir de um promotor mínimo é ativada pelo intensificador E47/E-box no vetor vazio (vetor). A inserção de intensificador-bloqueadores (scs, HS4) ou elementos STAR (elementos STAR 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18 e 27) bloqueiam a ativação da luciferase pelo intensificador E47/E-box. FIG 19. Ensaio Intensificador. A expressão de luciferase a partir de um promotor mínimo é ativada pelo intensificador E47/E-box no vetor vazio (E47). A inserção dos elementos scs e HS4 ou vários elementos STAR (STARS 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18 e 27) não ativam a transcrição do gene repórter. FIG 20. O vetor pSS-codA::upp usado para a isolação de elementos SINC. O gene suicida codA::upp codifica uma proteína que converte o pró medicamento 5-fluorocitosina ao medicamento tóxico 5-fluorouracila. Na indução pela concentração de doxiciclina diminuída, as célula hospedeiras tomam-se sensíveis ao pró medicamento. Fragmentos de DNA genômico inseridos no sítio de clonagem BglII que têm atividade de silenciamento impedirão a expressão do gene suicida e permitem a formação de colônias resistentes ao pró medicamento. Elementos STAR flanqueiam os componentes de seleção para impedir a disseminação de cromatina silenciadora para os componentes funcionais do plasmídeo. O plasmídeo é selecionado depois da transfecção em células de mamífero com o gene de resistência à higromicina e depois da transformação na E. coli com o gene de resistência à ampicilina. Ele duplica epissomicamente na células de mamífero cultivada devido às seqüências oriP e EBNA-1 e na E. coli devido à seqüência ori. FIG 21. O plasmídeo pSS-hrGFP é idêntico ao plasmídeo pSS-codA::upp, exceto para a substituição do gene suicida com hrGFP (que codifica a proteína fluorescente verde) e de STAR6 com STAR8 a jusante do gene repórter GFP. FIG 22. Conservação da seqüência STAR18 entre camundongo e ser humano. A região do genoma humano contendo 497 pares de base STAR18 é mostrado (caixas pretas); o elemento ocorre entre os genes de homeocaixa HOXD8 e HOXD4 no cromossoma 2 humano. Ela é alinhada com uma região no cromossoma de camundongo 2 que compartilha 72% de identidade de seqüência. A região do cromossoma 2 humano imediatamente à esquerda de STAR18 também é altamente conservada com o cromossoma de camundongo 2 (73% de identidade; caixas cinza); além desta região, a identidade cai abaixo de 60%. A capacidade destas regiões de ser humano e camundongo, separadamente ou em combinação, para conferir desenvolvimento em zeocina é indicado: -, nenhum desenvolvimento; +, desenvolvimento moderado; ++, desenvolvimento vigoroso; +++, desenvolvimento rápido. FIG 23. Diagrama esquemático de análise do fluxo de trabalho da bio-informática. Para detalhes, ver o texto. FIG 24. Resultados da análise discriminante na classificação do conjunto de treinamento de 66 elementos STAR. Elementos STAR que são corretamente classificados como STARs pela Análise Discriminante Linear escalonada (LDA) são mostrados em um diagrama de Venn. As variáveis para LDA foram selecionadas de resultados da análise de ffeqüência para oligonucleotídeos hexaméricos (“oligos”) e para díades. O diagrama indica a concordância dos dois conjuntos de variáveis em STARS corretamente classificadas. FIG 25. As células U-2 OS/Tet-Off/lexA-HPl foram transfectadas com elementos STAR de Arabidopsis candidatos e cultivados em concentrações de doxiciclina baixas. O RNA total foi isolado e submetido à RT-PCR; as faixas que correspondem aos mRNAs de resistência à zeocina e higromicina foram detectadas pelo Southern blotting e quantificadas com um aparelho produtor de fosforimagem. A relação dos sinais de zeocina para higromicina é mostrada para os transfectantes contendo unidades de expressão de zeocina flanqueadas por 12 elementos STAR de Arabidopsis diferentes, o elemento scs de Drosófila ou nenhum elemento flanqueador. FIGURA 26 Seqüências que compreendem STAR6 a STAR65 (SEQ ID: 1 a 65) Seqüências que compreendem STAR66 e conjunto de teste (SEQ ID: 66 a 84), Seqüências que compreendem STAR Al a A35 de Arabidopsis (SEQ ID: 85 a 119).

Referências Altschul, S. F. e Gish, W. (1996) Local alignment statistics. Methods Enzymol, 266,460 a 480.

Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. e Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215, 403 a 410.

Bell, A C, West, A G, e Felsenfeld, G. (2001) Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome Science 291, 447 a 450.

Bennett, R. P., Cox, C. A. e Hoeffier, J. P. (1998) Fusion of green fluorescent protein with the Zeocin-resistance marker allows visual screening and drug selection of transfected eukaryotic cells. Biotechniques, 24,478 a 482.

Berger, J, Hauber, J, Hauber, R, Geiger, R, e Cullen, B R. (1988) Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells Gene 66, 1-10.

Bevan, M, Mayer, K, White, O, Eisen, J A, Preuss, D, Bureau, T, Salzberg, S L, e Mewes, H W. (2001) Sequence and analysis of the Arabidopsis genome Curr Opin Plant Biol 4, 105 a 110.

Bierhuizen, M. F., Westerman, Y., Visser, T. P., Wognum, A. W. e Wagemaker, G. (1997) Green fluorescent protein variants as markers of retroviral-mediated gene transfer in primary hematopoietic cells and cell lines. Biochem Biophys Res Commun, 234, 371 a 375.

Boivin, A, e Dura, J M. (1998) In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila Genetics 150,1639 a 1649.

Boshart, M, Weber, F, Jahn, G, Dorsch-Hasler, K, Fleckenstein, B, e Schaffner, W. (1985) A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus Cell 41, 521 a 530. Breckenridge, D. G. e Shore, G. C. (2000) Regulation of apoptosis by EIA and Myc oncoproteins. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 10, 273 a 280.

Bunker, C A. e Kingston, R. E. (1994) Transcriptional repression by Drosophila and mammalian Polycomb group proteins in transfected mammalian cells. Mol Cell Biol, 14, 1721 a 1732.

Cherry, J. R., Lamsa, Μ. H., Schneider, P., Vind, J., Svendsen, A., Jones, A. e Pedersen, A. H. (1999) Directed evolution of a fungai peroxidase. Nat Biotechnol, 17, 379 a 384.

Chung, J H, Whiteley, M, e Felsenfeld, G. (1993) A 5’ elemento of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila Cell 74, 505 a 514.

Deuschle, U, Meyer, W K, e Thiesen, H J. (1995) Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters Mol Cell Biol 15,1907 a 1914.

Doll, R. F., Crandall, J. E., Dyer, C A., Aucoin, J. M. e Smith, F. I. (1996) Comparison of promoter strengths on gene delivery into mammalian brain cells using AAV vectors. Gene Ther, 3, 437 a 447.

Eissenberg, J. C., James T. C.5 Foster-Hartnett D. M., Hartnett T., Ngan V., e Elgin S. C. R. (1990) Mutation in a heterochromatin-specific chromosomal protein is associated with suppression of position-effect variegation in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sei (USA) 87: 9923 a 9927.

Feng, Y. Q., Seibler, J., Alami, R., Eisen, A., Westerman, K A., Leboulch, P., Fiering, S. e Bouhassira, E. E. (1999) Site-specific chromosomal integration in mammalian cells: highly efficient CRE recombinasemediated cassette exchange. J Mol Biol, 292,779 a 785.

Foecking, Μ K, e Hofstetter, H. (1986) Powerful and versatile enhancer-promoter unit for mammalian expression vectors Gene 45, 101 a 105.

Garrick, D, Fiering, S, Martin, D I, e Whitelaw, E. (1998) Repeat-induced gene silencing in mammals Nat Genet 18, 56 a 59.

Gaszner, M., Vazquez, J. e Schedl, P. (1999) The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. Genes Dev, 13, 2098 a 2107.

Gerasimova, T. I. e Corces, V. G. (1998) Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell, 92, 511 a 521. Gerasimova, TI, e Corces, V G. (2001) Chromatin insulators and boundaries: effects on transcription and nuclear organization Annu Rev Genet 35, 193 a 208.

Gossen, M. e Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracychne-responsive promoters. Proc Natl Acad Sei U S A, 89, 5547 a 5551.

Graham, F. L. e van der Eb, A. J. (1973) Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5. Virology, 54, 536 a 539.

Heldin, C. H., Johnsson, A., Wennergren, S., Wemstedt, C., Betsholtz, C. e Westermark, B. (1986) A human osteosarcoma cell line secretes a growth factor structurally related to a homodimer of PDGF A-chains. Nature, 319, 511 a514.

Henke, E. e Bomscheuer, U. T. (1999) Directed evolution of an esterase from Pseudomonas fluorescens. Random mutagenesis by error-prone PCR or a mutator strain and Identification of mutants showing enhanced enantioselectivity by a resorufin-based fluorescence assay. Biol Chem, 380, 1029 a 1033.

Henthom, P, Zervos, P, Raducha, M, Harris, H, e Kadesch, T. (1988) Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: use as a repórter for studies of gene expression Proc Natl Acad Sei U S A 85, 6342 a 6346.

Higgins, D. G., Thompson, J. D. e Gibson, T. J. (1996) Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Methods Enzymol, 266, 383 a 402.

Himes, S. R. e Shannon, M. F. (2000) Assays for transcriptional activity based on the luciferase repórter gene. Methods Mol Biol, 130, 165 a 174. Huberty, C J (1994) Applied discriminant analysis, Wiley and Sons, Nova Iorque.

Initiative, A G. (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana Nature 408, 796 a 815.

Izumi, M, e Gilbert, D M. (1999) Homogeneous tetracycline-regulatable gene expression in mammalian fibroblasts J Cell Biochem 76, 280 a 289.

Jung, R., Soondrum, K. e Neumaier, M. (2000) Quantitative PCR. Clin Chem Lab Med, 38, 833 a 836.

Kain, S R. (1997) Use of secreted alkaline phosphatase as a repórter of gone expression in mammalian cells Methods Mol Biol 63,49 a 60.

Kao, F. T. e Puck, T. T. (1968) Genetics of somatic mammalian cells, VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells. Proc Natl Acad Sei USA, 60, 1275 a 1281.

Kellum, R. e Schedl, P. (1992) A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol Cell Biol, 12, 2424 a 2431.

Kent, W J. (2002) BLAT—the BLAST-like alignment tool Genome Res 12, 656 a 664.

Rnofier, M, Meinhardt, G, Bauer, S, Loregger, T, Vasicek, R, Bloor, D J, Kimber, S J, e Husslein, P. (2002) Human Handl basic helix-loop-helix (bHLH) protein: extra-embryonic expression pattem, interaction partners and Identification of its transcriptional repressor domains Biochem J361, 641-51. Li, W-H (1997) Molecular Evolution, Sinauer Associates, Sunderland Μ A., Meinke, D W, Cherry, J M, Dean, C, Rounsley, S D, e Koomneef, M. (1998) Arabidopsis thaliana: a model plant for genome analysis Science 282, 662, 679 a 682.

Litt, M. D., Simpson, M., Recillas-Targa, F., Prioleau, Μ. N. e Felsenfeld, G. (2001) Transitions in histone acetylation reveal boundaries of three separately regulated neighboring loci. EMBO J, 20, 2224 a 2235.

Meyer, P. (2000) Transcriptional transgene silencing and chromatin components Plant Mol Biol 43, 221 a 234.

Morgenstem, J. P. e Land, H. (1990) Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-ffee packaging cell line. Nucleic Acids Res, 18, 3687 a 3696.

Mullen, C. A., Kilstrup, M. e Blaese, R. M. (1992) Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5-fluorocytosine: a negative selection system. Proc Natl Acad Sei USA, 89, 33 a 37.

Nan, X., Javier Campoy, F., e Bird A. (1997) MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. Cell 88, 471 a 481.

Petersson, K, Ivars, F, e Sigvardsson, M. (2002) The pT alpha promoter and enhancer are direct targets for transactivation by E box-binding proteins Eur J Immunol 32, 911 a 920.

Pazin, M. J. e Kadonaga, J. T. (1998) Transcriptional and structural analysis of chromatin assembled in vitro. In Gould, H. (ed.) Chromatin: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, pp. 172 a 194.

Pietersen, A. e Η. M. Notebom. (2000) Apoptin. Adv Exp Med Biol 465, 153 a 161.

Quong, M W, Romanow, W J, e Murre, C. (2002) E protein function in lymphocyte development Annu Rev Immunol 20, 301 a 322. Ruezinsky, D, Beckmann, H, e Kadesch, T. (1991) Modulation of the IgH enhancer's cell type specificity through a genetic switch Genes Dev 5, 29 a 37.

Saluz, Η. P. e Jost, J. P. (1993) Approaches to characterize protein-DNA interactions in vivo. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 3, 1 a 29.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with Chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sei U 8 A, 74, 5463 a 5467. Simizu, B., Rhim, J. S. e Wiebenga, N. H. (1967) Characterization of the Tacaribe group of arboviruses. I. Propagation and plaque assay of Tacaribe virus in a line of African green monkey kidney cells (Vero). Proc Soc Exp Biol Med, 125, 119 a 123.

Smith, R. L., Traul, D. L., Schaack, J., Clayton, G. H., Staley, Y J. e Wilcox, C. L. (2000) Characterization of promoter function and cell-type-specific expression ffom viral vectors in the nervous system. J Virol, 74, 11254 a 11261.

Stam, M, Viterbo, A, Mol, J N, e Kooter, J M. (1998) Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted TDNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes inplants Mol Cell, Biol 18,6165 a 6177.

Stull, R. A., Hyun, W. C. e Pallavicini, M. G. (2000) Simultaneous flow cytometric analyses of enhanced green and yellow fluorescent proteins and cell surface antigens in doubly transduced immature hematopoietic cell populations. Cytometry, 40, 126 a 134.

Takada, T., lida, K., Akasaka, K., Yasue, H., Torii, R., Tsujimoto, G., Taira, M. e Kimura, H. (2000) Evaluation of heterologous insulator function with regard to chromosomal position effect in the mouse blastocyst and fetus. Mol Reprod Dev, 57, 232 a 237.

Tanaka, S., Livingstone-Zatchej, M. e Thoma, F. (1996) Chromatin structure of the yeast URA3 gene at high resolution provides insight into structure and positioning of nucleosomes in the chromosomal context. J ol Biol, 257, 919 a 934.

Thomas, J. O. (1998) Isolation and ffactionation of chromatin and linker histones. In Gould, H. (ed.) Chromatin: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, pp. 1 a 34.

Tiraby, M., Cazaux, C., Baron, M., Drocourt, D., Reynes, J. P. e Tiraby, G. (1998) Concomitant expression of E. coli cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase improves the cytotoxicity of 5-fluorocytosine. FEMS Microbiol Lett, 167, 41 a 49.

Umana, P, Jean-Mairet, J, e Bailey, J E. (1999) Tetracycline-regulated overexpression of glycosyltransferases in Chinese hamster ovary cens Biotechnol Bioeng 65, 542 a 549. van der Vlag, J., den Blaauwen, J. L., Sewalt, R. G., van Driel, R. e Otte, A. P. (2000) Transcriptional repression mediated by polycomb group proteins and other chromatin-associated repressors is selectively blocked by insulators. J Biol Chem, 275, 697 a 704. van Helden, J, Andre, B, e Collado-Vides, J. (1998) Extracting regulatory sites from the upstream region of yeast genes by computational analysis of ohgonucleotide freqüencies J Mol Biol 281, 827 a 842. van Helden, J, Andre, B, e Collado-Vides, J. (2000) A web site for the computational analysis of yeast regulatory sequences Yeast 16,177 a 187. van Helden, J, Rios, A F, e Collado-Vides, J. (2000) Discovering regulatory elements in non-coding sequences by analysis of spaced dyads Nucleic Acids Res 28, 1808 a 1818.

Vance, V, e Vaucheret, H. (2001) RNA silencing in plants-defense and counterdefense Science 292,2277 a 2280.

Wallrath, L. L., Swede, M. J. e Elgin, S. C. R. (1998) Mapping chromatin structure in Drosophila. In Gould, H. (ed.) Chromatin: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, pp. 59 a 77.

Weaver, L. S. e Kadan, M. J. (2000) Evaluation of adenoviral vectors by flow cytometty. Methods, 21,297 a 312.

Wei, K. e Huber, B. E. (1996) Cytosine deaminase gene as a positive selectionmarker. JBiol Chem271,3812a3816.

Wigler, M, Pelhcer, A., Silverstein, S. and Axel, R. (1978). Biochemical transfer of single-copy eukaryotic genes using total cellular DNA as donor. Cell 14, 725 a 731.

Wigley, P., Becker, C., Beltrame, J., Blake, T., Crocker, L., Harrison, S., Lyons, I., McKenzie, Z., Tearle, R., Crawford, R. e et al. (1994) Site-specifíc transgene insertion: an approach. Reprod Fértil Dev, 6, 585 a 588.

Xu, Z. Z., Kroughak, V., Prevec, L., Graham, F. L. e Both, G. W. (1995) Investigation of promoter function in human and animal cells infected with human recombinant adenovirus expressing rotavirus antigen VP7sc. J Gen Virol, 76, 1971 a 1980.

Yang, T T, Sinai, P, Kitts, P A, e Kain, S R. (1997) Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase repórter system Biotechniques 23, 1110 a 1114.

Yin, D X, Zhu, L., e Schinike R. T. (1996) Tetracychn-controlled gene expression system achieves high-level and quantitative control of gene expression. Analyt Biochem 235, 195 a 201.

Zink, D, e Paro, R. (1995) Drosophila Polycomb-group regulated chromatin inhibits the accessibility of a trans-activator to its target DNA Embo J 14,5660 a 5671. A expressão do gene repórter de luciferase é medida em linhas de célula contendo plasmídeos pSDH integrados, sem (“vazio,” o controle negativo) ou contendo elementos STAR (incluindo o elemento de controle positivo, SCS de Drosófila). O nível de expressão médio do controle negativo é definido como o nível de referência e clones são considerados que super-expressam se seu nível de expressão é > 2-vezes acima do nível de referência. A porcentagem de clones super-expressores para cada plasmídeo e as vezes de super-expressão são relatadas, junto com o número de clones analisados para cada plasmídeo.

Tabela 2. Elemento STAR clonado. ‘Localização cromossômica é determinada pela procura de BLAST de dados de seqüência de DNA a partir de clones STAR contra a base de dados do genoma humano. A localização é dada de acordo com a nomenclatura padrão que refere ao ideograma citogenético de cada cromossoma; por exemplo lp2.3 é a terceira sub-faixa citogenética da segunda faixa citogenética do braço curto do cromossoma 1 (http://www.ncbi.alm.nih. gov/Class/MLACourse/Genetics/chrombanding.html). F, resultado de reação de seqüenciamento avançado; R, resultado de reação de seqüenciamento reverso. N.d., ainda não determinado. 2Com base na Construção de Vista do Mapa da Genoma Humano 22 (http://www.ncbi.alm.nih.gov/cgibin/Entrez/hum_srch?chr=hurn_chr.inf& query Abril 2001). L, esquerda; R, direita. *Posição ambígua, diversos acertos 1 A localização cromossômica é determinada pela procura BLAST de dados de sequência de DNA dos clones ST AR contra a base de dados do genoma humano. A localização é dada de acordo com a nomenclatura padrão que se refere ao ideograma citogenético de cada cromossoma; por exemplo lp2.3 é a terceira sub-faixa citogenética da segunda faixa citogenética do braço curto do cromossoma 1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/MLACourse/ Genetics/chrombanding.html).

Tabela 4 A: Seqüência de vários elementos star em um filamento (avançado) ou o filamento oposto (reverso). STAR3 avançado ACGTNCTAAGNAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGC

GTATCACGAGGCCCITrCGTCTTCACTCGAGCGGCCAGCTTGGATCTCGA

GTACTGAAATAGGAGTAAATCTGAAGAGCAAATAAGATGAGCCAGAAAAC

CATGAAAAGAAGAGGGACTACCAGTTGATTCCACAAGGACATTCCCAAGG

TGAGAAGGCCATATACCTCCACTACCTGAACCAATTCTCTGTATGCAGATT

TAGCAAGGTTATAAGGrAGCAAAAGATTAGACCCAAGAAAATAGAGAACT

TCCAATCCAGTAAAAATCATAGCAAATTTATTGATGATAACAATTGTCTCC

AAAGGAACCAGGCAGAGTCGTGCTAGCAGAGGAAGCACGTGAGCTGAAA

ACAGCCAAATCTGCTTTGTTTTCATGACACAGGAGCATAAAGTACACACCA

CCAACTGACCTATTAAGGCTGTGGTAAACCGATTCATAGAGAGAGGTTCT

AAATACATTGGTC C CTCATAGGCAAACCGCAGTTCACTCCGÁACGTAGTC

CCTGGAAATTTGATGTCCAGNATAGAAAAGCANAGCAGNCNNNNNNTAT

ANATNNNGNTGANCCANATGNTNNCTGNNC STAR3 reverso GAGCTAGCGGCGCGCCAAGCTTGGATCCCGCCCCGCCCCCTCCGCCCTCG

AGCCCCGCCCCTTGCCCTAGAGGCCCTGCCGAGGGGCGGGGCCTGTCCC

TCCTCCCCTTTCCCCCGCCCCCTACCGTCACGCTCAGGGGCAGCCTGACC

CCGAGCGGCCCCGCGGTGACCCTCGCGCAGAGGCCTGTGGGAGGGGCGT

CGCAAGCCCCTGAATCCCCCCCCGTCTGTTCCCCCCTCCCGCCCAGTCTC

CTCCCCCTGGGAACGCGCGGGGTGGGTGACAGACCTGGCTGCGCGCCAC

CGCCACCGCGCCTGCCGGGGGCGCTGCCGCTGCCTGAGAAACTGCGGCT

GCCGCCTGGAGGAGGTGCCGTCGCCTCCGCCACCGCTGCCGCCGCCGCC

AGGGGTAGGAGCTAAGCCGCCGCCATTTTGTGTCCCCCTGTTGTTGTCGT

TGACATGAATCCGACATGACACTGATTACAGCCCAATGGAGTCTCATTAA

ACCCGAGTCGCGGTCCCGCCCCGCCGCTGCTCCATTGGAGGAGACCAAAG

ACACTTAAGGCCACCCGTTGGCCTACGGGTCTGTCTGTCACCCACTCACT

AACCACTCTGCAGCCCATTGGGGCAGGTTCCTGCCGGTCATNTCGCTTCC

AATAAACACACCCCTTCGACCCCATNATTCCCCCCCTTCGGGAACCACCC

CCGGGGGAGGGGTCCACTGGNCAATACCAATTNAANAGAACCGCTNGGG

TCCGCCTNTTTNCGGGCNCCCTATTGGGTT STAR4 avançado GGGGAGGATTCTTTTGGCTGCTGAGTTGAGATTAGGTTGAGGGTAGTGAA

GGTAAAGGCAGTGAGACCACGTAGGGGTCATTGCAGTAATCCAGGCTGG

AGATGATGGTGGTTCAGTTGGAATAGCAGTGCATGTGCTGTAACAACCTC

AGCTGGGAAGCAGTATATGTGGCGTTATGACCTCAGCTGGAACAGCAATG

CATGTGGTGGTGTAATGACCCCAGCTGGGTAGGGTGCATGTGATGGAACA

ACCTCAGCTGGGTAGCAGTGTACTTGATAAAATGTTGGCATACTCTACATT

TGTTATGAGGGTAGTGCCATTAAATTTCTCCACAAATTGGTTGTCACGTAT

GAGTGAAAAGAGGAAGTGATGGAAGACTTCAGTGCTTTTGGCCTGAATAA

ATAGAAGACGTCATTTTCAGTAATGGAGACAGGGAAGACTAANGNAGGGT

GGATTCAGTAGAGCAGGTGTTCAGTTTTGAATATGATGAACTCTGAGAGA

GGAAAAACTTTTTCTACCTCTTAGTTTTTGNGNCTGGACTTAANATTAAAG

GACATANGACNGAGANCAGACCAAATNTGCGANGTTTTTATATTTTACTT

GCNGAGGGAATTTNCAAGAAAAAGAAGACCCAANANCCATTGGTCAAAA

CTATNTGCCTTTTAANAAAAAGANAATTACAATGGANANANAAGTGTTGN

CTNGGCAAAAATTGGG STAR4 reverso GGATTNGAGCTAGCGGCGCGCCAAGCTTGGATCTTAGAAGGACAGAGTG

GGGCATGGAAATGCACCACCAGGGCAGTGCAGCTTGGTCACTGCCAGCTC

CNCTCATGGGCAGAGGGCTGGCCTCTTGCAGCCGACCAGGCACTGAGCG

CCATCCCAGGGCCCTCGCCAGCCCTCAGCAGGGCCAGGACACACAAGCCT

TTGACTTCCTCCTGTCACTGCTGCTGCCATTCCTGTTTTGTGGTCATCACT

CCTTCCCTGTCCTCAGACTGCCCAGCACTCAAGGATGTCCTGTGGTGGCA

TCAGACCATATGCCCCTGAANAGGAGTGAGTTGGTGTTTTTTGCCGCGCC

CANAGAGCTGCTGTCCCCTGAAAGATGCAAGTGGGAATGATGATGNTCAC

CATCNTCTGACACCAAGCCCTTTGGATAGAGGCCCCAACAGTGAGGATGG

GGCTGCACTGCATTGCCAAGGCAACTCTGTNNTGACTGCTACANGACANT

CCCAGGACCTGNGAAGNNCTATANATNTGATGCNAGGCACCT STAR6 avançado CCACCACAGACATCCCCTCTGGCCTCCTGAGTGGTTTCTTCAGCACAGCTT

CCAGAGCCAAATTAAACGTTCACTCTATGTCTATAGACAAAAAGGGTTTTG

ACTAAACTCTGTGTTTTAGAGAGGGAGTTAAATGCTGTTAACTTTTTAGGG

GTGGGCGAGAGGAATGACAAATAACAACTTGTCTGAATGTTTTACATTTC

TCCCCACTGCCTCAAGAAGGTTCACAACGAGGTCATCCATGATAAGGAGT

AAGACCTCCCAGCCGGACTGTCCCTCGGCCCCCAGAGGACACTCCACAGA

GATATGCTAACTGGACTTGGAGACTGGCTCACACTCCAGAGAAAAGCATG

GAGCACGAGCGCACAGAGÇANGGGCCAAGGTCCCAGGGACNGAATGTCT

AGGAGGGAGATTGGGGTGAGGGTANTCTGATGCAATTACTGNGCAGCTC

AACATTCAAGGGAGGGGAAGAAAGAAACNGTCCCTGTAAGTAAGTTGTNC

ANCAGAGATGGTAAGCTCCAAATTTNAACTTTGGCTGCTGGAAAGTTTNN

GGGCCNANANAANAAACANAAANATTTGAGGTTTANACCCACTAACCCN

TATNANTANTTATTAATACCCCTAATTANACCTTGGATANCCTTAAAATAT

CNTNTNAAACGGAACCCTCNTTCCCNTTTNNAAATNNNAAAGGCCATTN

NGNNCNAGTAAAAATCTNNNTTAAGNNNTGGGCCCNAACAAACNTNTTC

CNAGACACNTTTTTTNTCCNGGNATTTNTAATTTATTTCTAANCC STAR6 reverso ATCGTGTCCTTTCCAGGGACATGGATGAAGCTGGAAGCCATCATCCTCAG

CAAACTAACACAGGAACAGAAAACCAAATACCACATGTTCTCACTCATAAG

TGGGAGCTGAACAGTGAGAACACATGGACACAGGGAGGGGAACATCACA

CACCAAGGCCTGTCTGGTGTGGGGAGGGGAGGGAGAGCATCAGGACAAA

TAGCTAATGCATGTGGGGCTTAAACCTAGATGACGGGTTGATAGGTGCAG CAATCCACTATGGACACATATACCTATGTAACAACCCNACCTTNTTGACAT GTATCC C AGAACTTAAAGGAAAATAAAAATTAAAAAAAATTN C CCTGGAA TAAAAAAGAGTGTGGACTTTGGTGAGATN STAR8 avançado GGATCACCTCGAAGAGAGTCTAACGTCCGTAGGAACGCTCTCGGGTTCAC

AAGGATTGACCGAACCCCAGGATACGTCGCTCTCCATCTGAGGCTTGNTC

CAAATGGCCCTCCACTATTCCAGGCACGTGGGTGTCTCCCCTAACTCTCC

CTGCTCTCCTGAGCCCATGCTGCCTATCACCCATCGGTGCAGGTCCTTTCT

GAANAGCTCGGGTGGATTCTCTCCATCCCACTTCCTTTCCCAAGAAAGAA

GCCACCGTTCCAAGACACCCAATGGGACATTCCCNTTCCACCTCCTTNTC

NAAAGTTNGCCCAGGTGTTCNTAACAGGTTAGGGAGAGAANCCCCCAGG

TTTNAGTTNCAAGGCATAGGACGCTGGCTTGAACACACACACACNCTC STAR8 reverso GGATCCCGACTCTGCACCGCAAACTCTACGGCGCCCTGCAGGACGGCGGC

CTCCTGCCGCTTGGACGCCAGNCAGGAGCTCCCCGGCAGCAGCAGAGCA

GAAAGAAGGATGGCCCCGCCCCACTTCGCCTCCCGGCGGTCTCCCTCCCG

CCGGCTCACGGACATAGATGGCTGCCTAGCTCCGGAAGCCTAGCTCTTGT

TCCGGGCATCCTAAGGAAGACACGGTTTTTCCTCCCGGGGCCTCACCACA

TCTGGGACTTTGACGACTCGGACCTCTCTCCATTGAATGGTTGCGCGTTC

TCTGGGAAAG STAR18 avançado TGGATCCTGCCGCTCGCGTCTTAGTGTTTCTCCCTCAAGACTTTCCTTCTG

TTTTGTTGTCTTGTGCAGTATTTTACAGCCCCTCTTGTGTTTTTCTTTATTT

CTCGTACACACACGCAGTTTTAAGGGTGATGTGTGTATAATTAAAAGGAC

CCTTGGCCCATACTTTCCTAATTCTTTAGGGACTGGGATTGGGTTTGACTG

AAATATGTTTTGGTGGGGATGGGACGGTGGACTTCCATTCTCCCTAAACT GGAGTTTTGGTCGGTAATCAAAACTAAAAGAAACCTCTGGGAGACTGGAA ACCTGATTGGAGCACTGAGGAACAAGGGAATGAAAAGGCAGACTCTCTGA ACGTTTGATGAAATGGACTCTTGTGAAAATTAACAGTGAATATTCACTGTT GCACTGTACGAAGTCTCTGAAATGTAATTAAAAGTTTTTATTGAGCCCCCG AGCTTTGGCTTGCGCGTATTTTTCCGGTCGCGGACATCCCACCGCGCAGA GCCTCGCCTCCCCGCTGNCCTCAGCTCCGATGACTTCCCCGCCCCCGCCC TGCTCGGTGACAGACGTTCTACTGCTTCCAATCGGAGGCACCCTTCGCGG STAR18 reverso TGGATCCTGCCGCTCGCGTCTTAGTGTTTCTCCCTCAAGACTTTCCTTCTG

TTTTGTTGTCTTGTGCAGTATTTTACAGCCCCTCTTGTGTTTTTCTTTATTT

CTCGTACACACACGCAGTTTTAAGGGTGATGTGTGTATAATTAAAAGGAC

CCTTGGCCCATACTTTCCTAATTCTTTAGGGACTGGGATTGGGTTTGACTG

AAATATGTTTTGGTGGGGATGGGACGGTGGACTTCCATTCTCCCTAAACT

GGAGTTTTGGTCGGTAATCAAAACTAAAAGAAACCTCTGGGAGACTGGAA

ACCTGATTGGAGCACTGAGGAACAAGGGAATGAAAAGGCAGACTCTCTGA

ACGTTTGATGAAATGGACTCTTGTGAAAATTAACAGTGAATATTCACTGTT

GCACTGTACGAAGTCTCTGAAATGTAATTAAAAGTTTTTATTGAGCCCCCG

AGCTTTGGC

Tabela 4 B: A seqüência de vários elementos sinc PSINKS9 GATCAGGA TAATAAGTAC GCTGGGAAGA CAACAAAATG ATTTAAATCT TAGACAAGTC ATTCTAGGTG TCTCCACTGT TTCAGTTCTT GCATTCATTC TTGTGGTATC TTTTCCCTTT TACCAATAAA AAAGCTCCCT GACATCACAT TGTGGCAGTC CCCATGGTTT GCCGCAGTTA CTGCGGGACT GAACGAAGGA GGACGAATGA AGAAATGAAA ACCAAGGAAA AAAGGAGCTG TTTAAAGAAG GGTCCAGGGA AGAAGAAGAG GGCTCCCAGC TTCTAGTGAG CAAGGGCAGC AGCCCTGAGC TTCTACAGCC CTTCATATTT ATTGAGTAGA AAGAGCAGGG AGCAGGAGGT AATGATTGGT CAGCTTCTCA ATTGATCACA GGTTCACATT ATTGCTAACA GATTTCACAT GTGCCTAATC TCAAGAAACG CCGCGCCTGG GGCATGACTG CCCTCAGCAT TCCCTCTGGG TGGCAGACGC AGTTTGCCAA CATTCTGCAT TCATGAGAAC AGTTTACTGT TTACTCATAT AACCTCCAGT GGTACACCGA GTTGATC PSINKS 12 GATCTAA TTTCTCTGTA TTTAATTCCC ATGTCTATTT TGTCTATTTT CAAGATTGAT TTACATTGCA GGTTCCGATG CAACCACTGA CTTACATTGC AGGTTCTAAT GTAACCACTG TCCTTAACGA GTACATAGAT TTGTTTCCTT CTCTCCAGGA GCATGAGATT TGTTGCCTCC AGGAAAGGCA ACAAATCTAC TATTCCTTA AGGACAGTGG TTCTCAAAGG ATTGTCCTGG GAACAGCAGC ATCACCTACA CAGTAGTTAG AAATGCACAT TCTGAGGCCT CCCAAGACCT GCTAACTCAG ACACTTGGGG

AGAAGAAGGG GTTCCAACAA GCCTTCTAGG TCATTCTGAT GCATGCTGGA GTTTGAGAAT CGATGCTCTA GGAAAAACAC CAGTACTAT CTACCATCAA CTTGACCACT CAAGTGTCAC CATTCACTGA AGTTTAACTA CAATGTCCAG AGAATTAATT GTGTACCAGG CACTATGCGG AAGGCTGAAT GCTGCCTCAC AATCCANAGT GGTATGTGTG TAAATGACTA AATAAAATGC AAAATGGGAT GACATG PSINKS 19 G ATCCTCCATC TGCTCCACCC ACTTCCATGT AAGTGATCCT GGGCTGATCA CTTCCTCTCT CTAGACTTCG TTTCTTTTTT TTCTTTTTTA GACCGAGTCT CACTCTGTCA CCCAGGCTGG AGTGCAGTGG TGAGATCTTG GCTCACTGCA ACCTCCACCT CCTGGGTTCA AGCAATTCTC CTGTCTCAGG CTCCTGAGTA GATAGGACTA TAGGTGCACA CCACCATACC TAGCTAATTT TTGTTTTTTT AGTAGAGATG GGGTTTCACC ATATTGGTCA GCCTGTTCTC AAACTCCTGA CCTCAGGTGA TCCACCCACC TCAGCCTCCC AAAGTGCTGG GATTACAGGT GTGAGCCACC GAGCCGGGCT GCCCTTCTCT GGACTTTGAT TTCCTCATCT ATAAAACAGA CAACAATCCC TACTATGACC ATCCAGAAGG GTTAATCTAT GCTTCATTGC AATCCTAATC AAAAATCCCA ACATTTTGGC CGTGGAGCCT GCCCAGATGG TTCTAGGATT TATTTGGATG GGAAAATAGT CAAGACAAGC TT PSINKS 28 GAT CATGGAGGGA GAGAACAACC AACCACACAC TGACTGGTCA CCCCTGAAGT TCACAGCCAC TACCCTGTAG AGGCCCCGAG GTTGCCGGCA AGCCCAGTAT ACTTCCATCT

AAACTCCCCT TGCACCTGCT CCTCCTGTTC CAGACAATGA GCTGTAACAC GCACATCCAC ACCACACATC ACCCACAGCA GGGGCAGGAG GCAGCTAAGC ATGGGCTTCA GAGTCCTCCC ACCAGCAGCG CCTACCAGCT ACAAGCCTGA CGTCTCTGTG TGTGTGTGTA AATTTCACTA AATATTTCTT CCTTTGTTTT TTAAAAATTT ACATGAAATG CACATTTTTG CTGTGACAGA AGCATGTAAC TGTGATCCTA ACACACCTAC TCCTCCGCCT TTTACTGCCG TCTGCTTCCC TCTCTTCTCC ACGCCCACTC GACTGCAGTA TCGATGCCAA CAACATGATG TGTGTCCTTC CATGTTTCCC TGCTCATGCA TTCGCATGTA AGCCACCGCA CATGTCACTG TATGTACACA CAGGGGATTC TGAGGCCAAT GTTTTACAAG GATTACGTTA TACACCCTTT TCTGCAGTGA GTTTTTCCCA GGCAACCTCC CAGGCCCCAT GGTGTAGCTC TGGGTCAATC CTTTTTTTTT TTTTTGGAGA CAGAGTCTCA CTCTGTCGCC CAGGCTGGAG TGCAGTGGTG CAATTTGGGC TCACTGCAAC CTCCGCCTCC CGGGTTCAAG CGATTCTCCT GCCTCAGCCT CCTGAGTAGC TGACATTACA AGCGCGCACT ACCACACCCG GCTAATTTTT GTATTTTTAG TAGAGATACA GTTTCACCAT GTTGGTCAGG CTGGTCTTGA ACTCCTGAGC TCGTGATC PSINKS 30 GATCC ACCCGCCTCG GACTCCCAAA GTGCTGGGAT TACAGGTGTG AGCCACTGTG CTTGGCCCGA ATCAGGAATA ATTCTGATGG CTAAGGAAGA CAGCTTCCGA GAGAGTAGGA GAAAGGGCAG AGGATTCCAG GCAGAAGGCC CATCTAGGGC AAAGGCGAAG GTGTGGCTCA GCCTGCCTCC TTTGGGGAAT GGCGAGTGTG TTCTGGGCTC AGGGTTCTTG GTAAGGGACA GAGAAGACTC GGGAAAGATC AGTTGAGCTG GAATGTGCAG

GCTCTTGAGT ACCCTGCTCA GGAGCTGGAG GTGGGCTAC C CTGCAAACTC CAGGCCATGA AGCCCAGGAA GATGTCAGGC TGGTCTTCCC ATGCCCTTGT GTATCTGAGA CCAACTGTCA CTAAATGTTT CCTTTACGCC CTGGACACAC AGCTAGACTC TACTTCTCAG ATTCTCTTGA AATACAAGTC TTTAGCCAGA GGGTGTGGAG GGAAATGCTG TGTATCACTT TGAGGTTGAG GCCATCAAAG CCTCCCACAG GTGGCCCCCT CTTTCTCTCC CCACGTACTT ATGATGTTGA TGCCCAAGGC AGCTTGAGTA CTACCTGCTG AAGGCAGGGC CTCTGTCACC ATAGATC PSINKS 35 GATCCAC CTGCCTCGGC CTCCCAAAGT GCTGGGATTA CAGGCATGAG CCACCATGCC TGGCCAAAAA CTTCTACCTG CTTGGAAAGT TGACTGGTCA CACAGCCTAG CAAATGAGGT TGGGATGTGG GATGTGCCTG GTTCCAATCC CAGCCCTTTA CTGTTCCCAT AGGAGGTGGG GACAGGCCTC ACCCAGGCGT CCAGCATCCT GCAGCTGAAT CTTGAGCATT TCCATGGGAC AGGTCACCAC GACCTGGCAC ATCCCAGCCC CACACCCGGC AAGCATCTCC ATCTTCAGGT TCCGCTGCAT CCTATGGGAA CAGGCGTCAG GCTCCTTCAG CCGCAGGCCA CAGGCCTGCC GTGGTGCAGC TGCCCTCTTG TGAGAGGGGG ACTTTCCCTG GATGGCACCC GTGGCTGCCA CTCACCCAGC TGGTCAAGTC ATCAGCTAGC CCTTAGGTGT GGTCTCTGTA CGGACAGGGG ACTAAGTTTA AAACAAAGCC TGCTAGGGAG GTAGCACCGC ATGGAAGCTG AAACAGTGAC AGAGAAAACT ACCCAGACCA GGCGTTGTCC TTGATC

Tabela 5. Oligonucleotídeos usados para as reações de cadeia de polimerase (preparadores de PCR) ou mutagênese de DNA

Tabela 6: Elementos STAR da invenção, incluindo a localização e comprimento genômicos A localização cromossômica é determinada pela procura BLAST de dados seqüência de DNA dos elementos ST AR contra a base de dados do genoma humano. A localização é dada de acordo com a nomenclatura padrão que refere ao ideograma citogenético de cada cromossoma; por exemplo lp2.3 é a terceira sub-faixa citogenética da segunda faixa citogenética do braço curto do cromossoma 1 (http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/MLACourse/ Genetics/chrombanding.html). Nos casos onde as reações de seqüenciamento avançado e reverso identificaram DNAs de locais genéticos diferentes, ambos os locais são mostrados. 2Comprimentos exatos são determinados pela análise de seqüência de DNA; comprimentos aproximados são determinados pelo mapeamento de restrição. 3A seqüência e localização de STARS foram refinadas desde a montagem das Tabelas 2 e 4. 4As STARS com estes números nas Tabelas 2 e 4 foram ajustadas à parte (a seguir aludidas como “oldSTAR5” etc.) e seus números designados aos elementos STAR mostrados no anexo de seqüência de DNA. No caso de oldSTAR5, oldSTAR14 e oldSTARló, os DNAs clonados foram quimeras de mais do que duas localizações cromossômicas; no caso de oldSTAR9 e oldSTAR13, os DNAs clonados foram idênticos ao STAR4. 5Idêntico à Tabela 4 “STAR18”.

Tabela 7. Elementos STAR comunicam estabilidade com o tempo na expressão de transgene1 Divisões Expressão de Celulares2 Luciferase3 STAR6 mais puromicina 42 18.000 60 23.000 84 20.000 108 16.000 STAR6 sem puromicina4 84 12.000 108 15.000 144 12.000 'O plasmídeo pSDH-Tet-STAR6 foi transfectado em células U-2 OS e clones foram isolados e cultivados em meio sem doxiciclina como descrito no Exemplo 1. As células foram transferidas para vasos de cultura novos semanalmente a uma diluição de 1:20. 20 número de divisões celulares está fundamentado na estimativa de que em uma semana a cultura atinge a confluência de célula, que representa ~6 divisões celulares. 3A luciferase foi ensaiada como descrito no Exemplo 1. 4Depois de 60 divisões celulares as células foram transferidas a dois vasos de cultura; um foi fornecido com meio de cultura meio que conteve puromicina, como para as primeiras 60 divisões celulares e o segundo foi fornecido com meio de cultura carecendo de antibiótico.

Tabela 8. Elementos STAR Humanos e seus ortólogos e parálogos de camundongo putativo_________________________________________ ‘Localizador cito genético de elemento STAR no genoma humano. 2Localizador citogenético de elemento STAR ortólogo no genoma de camundongo. 3Comprimento de região(ões) que demonstram alta similaridade de seqüência e similaridade de porcentagem. Em alguns casos mais do que um bloco de alta similaridade ocorre; nestes casos, cada bloco é descrito separadamente. Similaridade < 60% não é considerada significante.

Tabela 9. Padrões de oligonucleotídeo (6 pares de base) super-representados em elementos STAR.

Os padrões são classificados de acordo com o coeficiente de significância. Estes foram determinados usando RSA-Ferramentas com a seqüência do 5 genoma humano como referência. Os padrões que compreendem as variáveis mais discriminantes na Análise Discriminante Linear estão indicados com um asterisco.

Tabela 10. Padrões de díade super-representados em elementos STAR.

Os padrões são classificados de acordo com o coeficiente de significância. Estes foram determinados usando RSA-Ferramentas com a seqüência aleatória do genoma humano como referência. Os padrões que compreendem as variáveis mais discriminantes na Análise Discriminante Linear estão indicados com um asterisco.

Tabela 11. Elementos STAR candidatos testados pela Análise Discriminante Linear 1A localização cromossômica é determinada pela procura BLAT de dado de seqüência de DNA a partir dos elementos STAR contra a base de dados do genoma humano. A localização é dada de acordo com a nomenclatura padrão que refere ao ideograma citogenético de cada cromossoma; por exemplo lp2.3 é a terceira sub-faixa citogenética da segunda faixa citogenética do braço curto do cromossoma 1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/MLACourse/Genetics/chrombanding.html). F, resultado de reação de seqüenciamento avançado; R, resultado de reação de seqüenciamento reverso. Quando os resultados de seqüenciamento avançado e reverso mapeados para localizações genômicas diferentes, cada seqüência foi prolongada até o comprimento completo do clone original (como determinado pelo mapeamento de restrição) com base na informação de seqüência a partir da base de dados do genoma humano. 2ND: Não Determinado.

Claims

1. Construção de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende: uma sequência de DNA isolada e/ ou recombinante como definida na SEQ ID NO:7; e um promotor operavelmente ligado a um ácido nucleico de interesse; em que o referido promotor é um promotor exógeno; e em que a atividade anti-repressora da dita sequência de DNA isolada e/ ou recombinante confere a uma célula humana de osteossarcoma U-2 OS a capacidade de crescer após 4-5 semanas de cultivo na presença de 250 pg/mL de zeocina e 0,1 ng/mL de doxiciclina, em que a dita célula compreende uma proteína de fusão repressora LexA contendo o domínio de ligação de DNA LexA e uma região codificadora de HPl ou HPC2 sob controle do sistema regulador transcricional Tet-Off, quando a dita sequência DNA isolada e/ ou recombinante é clonada em uma sequência de poliligador em um plasmídeo, dito poliligador sendo posicionado entre quatro sítios operadores LexA e o promotor SV40 que controla o gene de resistência à zeocina, quando o plasmídeo está presente na dita célula.

2. Construção de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita sequência de ácido nucleico de interesse é um quadro aberto de leitura de um transgene.

3. Construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que dito promotor é um promotor constitutivo, preferivelmente um promotor viral, ou um promotor induzível.

4. Construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que dito promotor é um promotor CMV, um promotor SV40 ou um promotor Tet-Off.

5. Construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de compreender, na seguinte ordem: i) uma sequência de DNA isolada e/ ou recombinante como definida em SEQID NO:7, ii) um promotor exógeno operavelmente ligado com a sequência de ácido nucleico de interesse; e (iii) uma sequência de DNA isolada e/ou recombinante como definida em SEQ ID NO:7, preferivelmente, em orientação oposta de (i).

6. Método para a produção de um produto de gene em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer um cassete de expressão que compreende: i) um transgene que codifica o dito produto de gene; e ii) uma sequência de DNA isolada e/ ou recombinante como definida em SEQ ID NO:7; e permitir a transcrição do dito cassete de expressão em uma célula.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula CHO.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende, na seguinte ordem: (i) uma sequência de DNA isolada e/ou recombinante como definida em SEQ ID NO:7; (ii) o transgene compreendendo um promotor exógeno operavelmente ligado com uma janela aberta de leitura que codifica o dito produto de gene; e (iii) uma sequência de DNA isolada e/ou recombinante como definida em SEQ ID NO:7, preferivelmente, em orientação oposta de (i).

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que múltiplos dos ditos cassetes de expressão são providos e a transcrição dos mesmos é permitida na dita célula, e a expressão do dito transgene é dependente do número de cópias.

10. Uso de uma sequência de DNA isolada e/ ou recombinante como definida em SEQID NO:7, caracterizado pelo fato de que é para regular a transcrição de um ácido nucleico de interesse.