BRPI0307092B1

BRPI0307092B1 - formulação veterinária para estimular o crescimento e a resistência a enfermidades em peixes e crustáceos

Info

Publication number: BRPI0307092B1
Application number: BRPI0307092A
Authority: BR
Inventors: Espinosa Vázquez Alexander; Arenal Cruz Amilcar; Morales Rojas Antonio; Aday García Molina Carmen; Zaldivar Muñoz Claudina; Cabrera González Edenaida; Pimentel Vázquez Eulogio; Pablo Estrada Garcia Mario; Vinjoy Campa Mirta; Carrillo Farnés Olimpia; Marcos Pimentel Pérez Rafael; Martínez Rodríguez Rebeca; Toledo Pérez Sergio
Original assignee: Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia
Priority date: 2002-01-24
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2018-11-21
Also published as: WO2003080102A1; ES2277097T3; KR20040094676A; US8852601B2; CA2473973A1; CU23016A1; US20060234905A1; ATE347369T1; JP4195865B2; ECSP045186A; BR0307092A; CN1622821B; DK1477181T3; AR038310A1; EP1477181B1; KR100953778B1; AU2003210124A1; DE60310203D1; CA2473973C; JP2005519972A

Abstract

"método para estimular o crescimento e a resistência a enfermidades em organismos aquáticos e formulação veterinária para estimular o crescimento e a resistência a enfermidades em peixes e crustáceos". a invenção diz respeito à síntese química para aumentar a taxa de crescimento em peixes e crustáceos comercializáveis. o objetivo da invenção é fornecer ghrp-6 para induzir direta ou indiretamente a liberação do hormônio do crescimento ou coisa semelhante, e produzir o aumento do nível do nível de hormônio do crescimento circulante no sangue dos peixes. o peptídeo é estável, solúvel e biologicamente ativo. o peptídeo é capaz de estimular o crescimento, melhorar a qualidade das larvas e aumentar as defesas contra agentes patogênicos, o peso seco, a concentração de proteínas e o rna no músculo de peixes e crustáceos.

Description

(54) Título: FORMULAÇÃO VETERINÁRIA PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO Ε A RESISTÊNCIA A ENFERMIDADES EM PEIXES E CRUSTÁCEOS (73) Titular: CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGIA. Endereço: Ave. 31 entre 158 Y 190, Cubanacán, Playa C. Habana 12100, CUBA(CU), Cubana (72) Inventor: MARIO PABLO ESTRADA GARCIA; REBECA MARTÍNEZ RODRÍGUEZ; AMILCAR ARENAL CRUZ; RAFAEL MARCOS PIMENTEL PÉREZ; ANTONIO MORALES ROJAS; EULOGIO PIMENTEL VÁZQUEZ;

ALEXANDER ESPINOSA VÁZQUEZ; CARMEN ADAY GARCIA MOLINA; EDENAIDA CABRERA GONZÁLEZ; MIRTA VINJOY CAMPA; SÉRGIO TOLEDO PÉREZ; OLÍMPIA CARRILLO FARNÉS; CLAUDINA ZALDIVAR MUNOZ.

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 21/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 21/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados “FORMULAÇÃO VETERINÁRIA PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO E A RESISTÊNCIA A ENFERMIDADES EM PEIXES E CRUSTÁCEOS”

CAMPO TÉCNICO

A invenção diz respeito à aplicação da síntese química para incrementar a eficiência do crescimento de peixes e crustáceos de valor comercial. A síntese de peptídeos análogos do tipo Leu-encefalina e Metencefalina foi relatada e foi demonstrada sua capacidade de estimular a liberação do hormônio do crescimento em mamíferos e aves (Bowers, C., Reynolds, G. e A. Hong. 1984. Endocrinology. 114: 1537-1545).

TÉCNICA ANTERIOR

Estudos para se entender a relação de estrutura-atividade de peptídeos liberadores do hormônio do crescimento foram desenvolvidos em mamíferos e aves, identificando-se que o hexâmero GHRP-6 (His-D-Trp-AlaTrp-D-Phe-Lys-NH2) é extremamente potente e seguro para provocar a liberação do hormônio do crescimento, inclusive no homem (Bowers, C., Momany, G., Reynolds, G. e A. Hong. 1984. Endocrinology, 114: 15371545), não obstante não existirem relatos anteriores do uso deste composto em organismo aquáticos.

Levando-se em conta que não existem evidências em crustáceos, até o presente, de que exista uma cascata de sinais que interfiram no estímulo do crescimento (hipotálamo-hipófise-órgão alvo), demonstra-se pela primeira vez que o peptídeo GHRP-6, por si só, é capaz de exercer uma função biológica semelhante nos crustáceos.

A aqüicultura é dominada pela produção de peixes de água doce; não obstante, desde a década passada se vem incrementando a contribuição das algas marinhas, dos moluscos e dos crustáceos à produção global da aqüicultura. Uma melhor compreensão da genética, da reprodução, da nutrição e da fisiologia do organismo selecionado é o primeiro passo para que se contribua em seu desenvolvimento produtivo (Gómez-Chiarri, M., Smith, G. J., de la Fuente, J. e Powers, D. A. 1998. Em de la Fuente, J. e Castro, F. O., editores, Gene transfer in aquatic organisms. Austin, Texas: R. G. Landes Company, e Alemanha: Springer Verlag; pp. 107-125).

O conhecimento das características moleculares dos hormônios com influência no crescimento de espécies marinhas de importância econômica pode ser utilizado para que se alcance um melhor comportamento produtivo destas espécies em cultivo.

Como exemplo do anteriormente expresso, pode-se mencionar o uso do hormônio liberador da gonadotropina (GnRH) e um antagonista do receptor da dopamina utilizado por Silverstein e colaboradores em 1999 (Silverstein, J. T., Bosworth, B. G. e Wolters, W. R. 1999. Journal of the World Aquaculture Society., Volume 30, n² 2, junho, 263-268), para regular e induzir a reprodução nos peixes gato (Ictalarus punctatus), espécie de grande importância econômica na aqüicultura mundial.

Outro resultado interessante da utilização de peptídeos sintéticos para o aumento da produtividade em animais de granja foi o relatado por Hashizune e colaboradores, em 1997 (Hashizume, T., Sasaki, M., Tauchi, S. e Masuda, H. 1997. Animal Science and Technology. Vol. 68, n² 3, março, 247-256). quando demonstraram o uso do hormônio do crescimento em cabras, mediante a aplicação de injeções com um novo peptídeo sintético liberador do hormônio do crescimento.

A administração de hormônios como a insulina foi experimentada também em peixes pela via oral, demonstrando-se que produz trocas de sinais de receptores e hormônios que interferem na adaptação das carpas a diferentes temperaturas (Vera, M. I., Romero, F., Figueroa, J., Amthauer, R., Leon, G., Villanueva e Krauskopf, M. 1993. Comp. Biochem. Physiol. Vol. 106A, n² 4, 677-682).

Nos mamíferos também foram estudadas outras variantes sintéticas do peptídeo liberador de hormônio do crescimento, como o relatado em 1995 por Patchett e colaboradores com o peptídeo MK-0677, designado como potente ativador oral do hormônio do crescimento em cães, sem 5 provocar efeitos nos níveis nos níveis da tirosina e da prolactina após a sua aplicação (Patchett, A. A., Nargund, R. P., Tata, J. R., Chen, Μ. H., Barakat, K. J., Johnston, D. B. R., Cheng, K., Chan, W. W. S., Butler, B., Hickey, G., Jacks, T., Schleim, K., Pong, S. S., Chaung, L. Y. P., Chen, Η. Y., Frazier, E., Leung, K. H., Chiu, S. H. L. e Smith, R. G., 1995. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 10 Vol. 92, 7001-7005).

Também foram experimentados hormônios liberadores do hormônio do crescimento em vacas com a finalidade de se incrementar a produção de leite, já que o aumento dos níveis circulantes de GH estimula, entre outras coisas, a produção de leite (Soliman, E. B., Hashizume, T., 15 Ohashi, S. e Kanematsu, S. 1997. Domestic animal endocrinology. Vol. 14(1), 39-46).

Quanto aos peixes não existem notícias anteriores sobre a utilização do peptídeo GHRP-6, motivo pelo qual sua utilização para estimular o crescimento, aumentar a sobrevida, aumentar a resistência a 20 agentes patogênicos, que são relatados neste documento, constitui uma grande solução para a intensificação e o aumento da produtividade do cultivo de organismos aquáticos.

Não obstante se tenha dado alguns passos de progresso na domesticação e cruzamento genético de algumas espécies de camarões, como 25 os Penaeus japonicus e o Litopenaeus vannamei, não houve progresso suficiente pela falta de compreensão dos processos genéticos e bioquímicos destas espécies (Benzie, J. A. H., 1998. Penaeid geneties and biotechnology. Aquaculture 164, 23-47; Fjalestadl, K. T., Carr, W. H., Lotz, J. L., Sweeney, J. N., 1999. Aquaculture 173, 10), pois que uma das aplicações de maior

importância nos camarões peneídeos podería ser a engenharia genética focalizada no melhoramento do crescimento e no aumento de sua resistência a agentes patogênicos (Bachere, E., Mialhe, E., Noel, D., Boulo, V., Morvan, A., Rodriguez, J. {1995} Aquaculture. 132, 17-32).

Esta invenção diz respeito ao fato de que o peptídeo GHRP-6 seja capaz de, por si só, estimular o crescimento, melhorar a qualidade das larvas, aumentar as defesas contra agentes patogênicos, aumentar o peso seco, a concentração de proteínas e RNA no músculo de peixes, crustáceos e moluscos.

VANTAGENS DA SOLUÇÃO PROPOSTA

Na presente invenção apresenta-se, pela primeira vez, a utilização do peptídeo GHRP-6 para estimular o crescimento e a resistência a agentes patogênicos e outras enfermidades. Demonstra-se, além disso, que o secretagogo GHRP-6 por si só estimula o crescimento em peixes e nos crustáceos mediante a injeção, por via oral ou por imersão. Demonstra-se, além disso, seu efeito na defesa contra agentes patogênicos, o incremento do peso seco no músculo dos organismos aquáticos tratados, o aumento da

concentração de proteínas e de RNA no tecido, e a manutenção dos eritrócitos, como demonstração de sua inocuidade na tilápia.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Níveis de GH no soro e de RNA mensageiro de IGF1 no fígado de tilápias jovens injetadas com o secretagogo GHRP-6. Cada grupo de três animais foi injetado intraperitonealmente. Amostras de soro e do fígado foram colhidas aos 15, 30, 60 e 360 minutos após a injeção. Amostras de soro foram colhidas de cada animal antes da injeção. *diferença significativa sobre o grupo de controle (p < 0,001 ANOVA, Duncan tesí). tiGH: Hormônio do crescimento de tilápia. As barras indicam o erro padrão.

Figura 2. Crescimento líquido e específico das tilápias com o peptídeo GHRP-6 por via intraperitoneal e um grupo de controle durante três • ·

semanas. * teste t p = 0,029. As barras indicam a variação no peso ± o erro padrão (EP) e os triângulos indicam a velocidade específica de crescimento de ambos os grupos.

Figura 3. Crescimento líquido e específico das tilápias tratadas com o peptídeo GHRP-6 por via oral em solução aquosa, e seu grupo de controle. A duração da experiência foi de três semanas. * teste t p = 0,015. As barras indicam a variação no peso (±EP) e os triângulos, a velocidade específica de crescimento de ambos os grupos (±EP).

Figura 4. Crescimento líquido e específico das tilápias tratadas 10 com o peptídeo GHRP-6 em cápsulas por via oral e seu grupo de controle. A duração da experiência foi de três semanas. * teste t p = 0,005, ** teste t p = 0,007. As barras indicam a variação no peso (±EP) e os triângulos, a velocidade específica de crescimento de ambos os grupos (±EP).

Figura 5. Experiência de crescimento em camarões

Litopenaeus Schmitti tratados com o peptídeo GHRP-6. A: Perfil de aumento do peso, em miligramas, dos camarões nos três grupos tratados com o peptídeo e no grupo de controle. B: Perfil de aumento do comprimento, em milímetros, dos camarões nos três grupos tratados com o peptídeo e no grupo de controle. C: Distribuição da freqüência absoluta das ramificações 20 branquiais de três grupos tratados com o peptídeo e do grupo de controle. D: Distribuição da freqüência absoluta das modificações rostrais de três grupos tratados com o peptídeo e do grupo de controle.

I, II, III: Grupos tratados com diferentes concentrações do peptídeo.

Grupo de controle tratado com BSA.

*** p<0,001. As barras indicam a variação no peso (±DS),

ANOVA, seguido por um DUNCAN no caso do tamanho e do peso.

Kolmogorov-Smmimov nas ramificações branquiais e modificações rostrais.

Figura 6. Perfil do peso seco em animais tratados com o

peptídeo, e controles. *** teste t p<0,001. As barras indicam a variação no peso (±DS).

Figura 7. Relações entre RNA, proteína e DNA. Como se observa na figura, existem diferenças significativas no que respeita à hipertrofia destes parâmetros nos animais tratados com o peptídeo. *** teste t p<0,001. As barras indicam a variação no peso (±DS).

Figura 8. Crescimento líquido em condições de produção de camarões tratados com banhos de imersão com o peptídeo GHRP-6 em seu estado larval e do grupo de controle com BSA. A duração da experiência foi 10 de seis semanas. *** teste t p<0,001. As barras indicam a variação no peso (±DS).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para demonstrar o estímulo do crescimento, em organismos aquáticos, mais especificamente em peixes, crustáceos e moluscos, 15 empregando somente o hexapeptídeo GHRP-6 “peptídeo de liberação do hormônio do crescimento” de seqüência: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂, primeiramente foi demonstrado que, nos peixes, se era capaz de efetuar uma atividade biológica semelhante à apresentada nos mamíferos e aves (Bowers, C., Momany, G., Reynolds, G. e A. Hong. 1984. Endocrinology. 20 114: 1537-1545).

Para isso, foram administradas injeções do peptídeo a tilápias jovens e foram obtidas amostras de soro e do fígado das referidas tilápias em tempos diferentes, demonstrando-se que, da mesma forma que nos mamíferos e aves, depois da injeção do peptídeo aumentam os níveis circulantes do 25 hormônio do crescimento no soro em 15 minutos, e meia hora após foi observado um aumento do RNA mensageiro do IGF-1 no fígado (Exemplo 1).

Levando em conta que não existem evidências, até o presente, de que a cascata dos sinais que interferem no estímulo do crescimento, hipotálamo-hipófise-órgão alvo (fígado), se conserve exatamente igual nos

organismos aquáticos como nos mamíferos e aves, se revela pela primeira vez que o peptídeo GHRP-6, por si só, e administrado por diferentes vias, é capaz de exercer sua atividade em peixes.

Realizaram-se experiências de comparação do crescimento em tilápias jovens, administrando-se a um grupo experimental o GHRP-6 e ao grupo de controle foi administrada solução salina, em cada caso na dependência da via de administração. Foram utilizadas três vias de administração: a) Injeção intraperitoneal; b) Oral; c) Imersão.

Nos três casos observou-se um incremento significativo do aumento do peso diário das tilápias tratadas com o peptídeo GHRP-6, em comparação com o seu grupo de controle em cada caso (Exemplo 2).

Outra experiência de grande valor para demonstrar o efeito do peptídeo GHRP-6 em peixes foi demonstrar sua aplicabilidade em tilápias de 1 mg de peso pela via da imersão, e estudar o efeito que esta provocava na 15 defesa contra os patógenos e na qualidade do seu músculo (Exemplo 3).

Os resultados mostram que o grupo de tilápias tratadas com o peptídeo incrementou significativamente o seu peso, apresentou menor índice de intensidade e extensão da invasão de agentes patogênicos que o grupo de controle, e apresentou menor conteúdo de água em seu músculo, bem como maior concentração de proteínas, o que sugere que o aumento de peso provocado pelo peptídeo induz um aumento da síntese protéica e não um aumento do conteúdo de água em seu músculo.

O secretagogo GHRP-6 também foi ensaiado em camarões Litopenaeus scmitti, demonstrando-se ser capaz de, por si só, estimular o 25 crescimento em crustáceos a partir de sua aplicação pelas várias três vias de administração: a) Injeção intramuscular; b) Oral; c) Imersão (Exemplo 4).

O secretagogo GHRP-6 foi ensaiado em camarões Litopenaeus scmitti, demonstrando-se ser capaz de estimular o crescimento em camarões a partir de sua aplicação de 4 banhos de imersão, em diferentes estados larvais.

Ao terminar o ciclo de cultivo das larvas em um centro de desova, os grupos tratados com doses similares às da tilápia apresentaram uma melhor qualidade. Isto ficou evidenciado em um aumento no peso, aumento no tamanho, um maior número de pares de ramificações branquiais e 5 modificações rostrais, um menor conteúdo de água no músculo, o que evidenciou uma maior atividade metabólica.

As larvas tratadas com o peptídeo e o controle foram espalhadas em reservatórios de terra para se observar o seu comportamento

produtivo. No dia da coleta dos reservatórios, os animais tratados com o peptídeo conservaram o aumento do peso, do tamanho e uma maior homogeneidade no peso e no tamanho neste grupo, em comparação com o controle.

(Exemplo 5)

O secretagogo GHRP-6 foi ensaiado em camarões Litopenaeus schmitti, tendo sido demonstrado que é capaz de estimular o crescimento em camarões mediante a injeção intramuscular, em camarões adultos. Ao

concluir os 15 dias da experiência, o peptídeo injetado estimulou o crescimento dos indivíduos entre 100 e 150 % em relação ao controle. Com diferenças significativas (p<0,001).

(Exemplo 6 e 6.1)

O secretagogo GHRP-6 foi ensaiado em camarões Litopenaeus schmitti, tendo sido demonstrado que é capaz de estimular o crescimento em camarões por via oral, em larvas de camarão. O peptídeo GHRP-6 incluído na dieta incrementou o crescimento dos camarões entre uns 30 e 40 %, em 25 relação ao controle. Com diferenças altamente significativas (p<0,001). O secretagogo GHRP-6 bioencapsulado em Artemia salina incrementou o crescimento dos indivíduos entre 30 e 40 % em relação ao controle. Com diferenças altamente significativas (p<0,001).

EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO • ·

Exemplo 1. Demonstração da atividade biológica do GHRP-6 em peixes

Foram determinados os níveis de RNA mensageiro do IGF-1 no fígado de tilápias injetadas intraperitonealmente com GHRP-6, bem como foram monitorados os níveis de GH nos mesmos animais no tempo, ficando demonstrado que o GHRP-6 era capaz, em peixes, de estimular a presença do GH circulante no sangue e, como resposta a esta, de incrementar os níveis do RNA mensageiro do IGF-1 depois de meio hora da injeção do peptídeo (Figura 1).

Quinze tilápias de peso médio de 71 ± 28 g foram utilizadas 10 para a experiência. O peptídeo GHRP-6 foi injetado em uma concentração de

0,1 pg/gpa (microgramas de peptídeo por grama de peso do animal). As amostras do fígado e do sangue foram coletadas antes do tratamento e 15, 30, 60 e 360 minutos após a injeção do peptídeo (utilizaram-se três animais de cada vez). O soro e o sangue foram congelados e guardados a -70 °C, até que 15 fossem utilizados para o ELISA para a quantificação do GH circulante ou para a extração do RNA mensageiro no caso do fígado, para a quantificação por Southem blot dos níveis de IGF-1.

O RNA total do fígado das tilápias utilizadas na experiência foi purificado de acordo com o protocolo descrito por Chomczynski e Sacchi.

20 pg de RNA total foram aplicados e passados em um gel de agarose formaldeído a 1 %, finalmente foram transferidos para uma membrana de náilon (Hybond N, Amersham Reino Unido) e hibridizados com uma sonda marcada correspondente ao DNA complementar do IGF-1 de tilápia (6) e seguidamente reibridizado com uma sonda do gene humano da gliceraldeído25 3-fosfato desidrogenase (GADPH, gentilmente doado pelo Dr. Bryan

Williams, Cleveland Foundation, OH, USA), para a normalização dos sinais.

Os sinais da hibridização foram quantificados a partir do processamento digital da imagem da radiografia, utilizando o “Hewlett Packard Scanjet Plus scanner”. As imagens foram processadas com o •·♦ 9 9 99

9 9 9

9 9 9 • · · · · ♦ · ·· • · ·9 • · «9 • · · ·· • ·· ·· β»“ programa de computação “Bandleader”.

Os níveis de GH no soro das tilápias injetadas foram medidos por um ELISA, utilizando-se dois anticorpos monoclonais contra o TiGH (Munoz e colaboradores, em preparo).

Exemplo 2. Experiência do crescimento nas tilápias jovens tratadas com GHRP-6

2.1 Aceleração do crescimento nas tilápias tratadas com GHRP-6 por via intraperitoneal (ip)

O peptídeo GHRP-6 (BACHEM, Suíça) foi diluído em solução tampão de fosfato de sódio (PBS) e injetado duas vezes por semana durante três semanas a 0,1 pg de peptídeo/g de peso úmido de cada peixe (gpc). O peptídeo foi aplicado a um grupo de 8 tilápias machos com peso médio de 61,41 ± 14,36 g, e foi utilizado um grupo de controle de 7 tilápias machos com peso médio de 61,58 ± 29,67 g, o qual recebeu PBS. Foi determinado o peso médio a cada semana (Figura 1). Todos os animais da experiência foram marcados com microchips (Stoelting Co., Wood Dale, E.U.).

2.2 Aceleração do crescimento nas tilápias tratadas com GHRP-6 por via oral

Para a administração por via oral do peptídeo GHRP-6, foram realizadas duas experiências. A primeira administrando-se o peptídeo na forma líquida dissolvido em PBS e a segunda administrando-se o peptídeo na forma de pequenas pérolas, encapsulado em alginato de cálcio, de acordo com o protocolo anteriormente publicado por Knorr e colaboradores em 1988 (Figuras 2 e 3, respectivamente). Em ambas as experiências foram utilizados grupos de controle, aos quais foi administrada solução salina e, em todos os casos, foram utilizadas tilápias entubadas até a cavidade faríngea.

2.2.1 Peptídeo em solução aquosa

O peptídeo GHRP-6 (BACHEM, Suíça) foi diluído em PBS e administrado por via oral através de um tubo plástico, até a cavidade faríngea, a um grupo de 7 tilápias machos que tinham um peso médio de 84,66 ± 12,2

Λ ·

g. Foi preparado um grupo de controle de 7 tilápias machos com peso médio de 86,38 ± 6,26 g, ao qual de administrou PBS nas mesmas condições do grupo tratado com o peptídeo. O tratamento foi realizado duas vezes por semana, durante três semanas, administrando-se uma dose de 0,1 pg de 5 peptídeo/g de peso úmido de cada peixe (gpc). Mediu-se o peso médio a cada semana (Figura 2). Todos os animais da experiência foram marcados com microchips (Stoelting Co., Wood Dale, E.U.).

2.2.2 Peptídeo encapsulado

Para a encapsulação do peptídeo foram obtidas as cápsulas segundo o relatado por Knorr e colaboradores em 1988. O hexapeptídeo encapsulado foi administrado através de um tubo plástico à cavidade faríngea a sete tilápias com um peso médio de 89,09 ± 8,38 g. Pérolas de polímero sem o peptídeo GHRP-6 foram administradas pela mesma via ao grupo de controle consistente em sete tilápias machos de peso médio de 89,86 ± 13,54 g. O tratamento foi realizado duas vezes por semana durante três semanas, administrando-se em cada ocasião 0,1 pg/gpc.

Exemplo 3. Estímulo do crescimento em tilápias (Oreochromis sp) mediante o peptídeo GHRP-6 através de imersão

Realizou-se a avaliação do crescimento em tilápias 20 Oreochromis sp. de 1,5 g, utilizando-se o peptídeo GHRP-6 na dose de 10 mg/100 ml, determinou-se também o valor do hematócrito para se ter uma idéia do estado da bioquímica sanguínea nos animais tratados com relação aos controles.

Nesta mesma experiência, estudou-se a presença de tricodermas e helmintos monogenéticos nos animais utilizados no ensaio, para se observar e comparar a intensidade e a extensão da invasão destes agentes patogênicos nos grupos tratados.

Por último, realizou-se um estudo da concentração de proteína e do percentual de umidade no músculo das tilápias estudadas.

Três grupos com três réplicas de 15 animais de uma mesma desova, com uma média de peso inicial de 1 g, foram escolhidos para o ensaio, para o qual foram utilizados 9 tanques de 40 litros. Todos os animais foram tratados com o peptídeo através de imersão, uma vez por semana, durante 15 minutos, por 45 dias, e o grupo de controle recebeu a mesma

manipulação, e a imersão foi realizada em solução salina.

Os grupos e tratamentos foram distribuídos da seguinte forma:

Grupo 1 10 μg/100 ml (Tratamento 1)

Grupo 2 100 pg/100 ml (Tratamento 2)

Grupo 3 Controle negativo (Solução salina)

Tabela 1. Estudo do peso, experiência de imersão com o peptídeo GHRP-6 em tilápias de 1 g de peso em um período de 45 dias.

Tratamentos	n	Média do peso (g) ±DS	Comparação entre grupos	Diferença
Grupo I 10 pg/100 ml	25	4,56+1,07	I-II	0,01454
Grupo II 100 pg/100 ml	25	4,54+1,38	II-III	0,07177*
Grupo III Solução salina	25	3,47 + 1,52	III-I	1,08632*

*Diferença estatisticamente significativa. Foi aplicado o teste de classes

múltiplas às amostras

Tabela 2. Estudo dos valores do hematócrito. experiência de imersão com o peptídeo GHRP-6 em tilápias de 1 g de peso em um período de 45 dias.

Tratamentos	n	Média do hematócrito ± DS	Comparação entre grupos	Comparação estatística
Grupo I 10 pg/100 ml	15	27,46 ± 4,53	I-II	(2,4)*
Grupo II 100 pg/100 ml	15	25,06 ± 5,25	II-III	(1,0)*
Grupo III Solução salina	15	26,46 ± 4,08	III-I	(1,4)*

*Não há diferenças significativas entre os grupos. Foi aplicado o teste de classes múltiplas às amostras

Tabela 3. resultados da intensidade da invasão (i) e da extensão da invasão (e) nos organismos tratados, para o protozoário cutâneo Trichodina sp.

·· · • · experiência de imersão com o peptídeo GHRP-6 em tilápias de 1 g de peso em um período de 45 dias.

Tratamento	n	I^a	E ( %)^b	Comparação entre grupos	Comparação estatística
Grupo I 10 pg/100 ml	25	7,73	100	I-II	(4,42)
Grupo II 100 pg/100 ml	25	2,80	84,6	II-III	(5,84)*
Grupo III Solução salina	25	8,76	92,30	III-I	(1,42)

^aI: Intensidade da invasão

^bE: Extensão da invasão *Diferença estatisticamente significativa. Foi aplicado o teste de classes múltiplas às amostras.

Tabela 4. resultados da intensidade da invasão (i) e da extensão da invasão (e) nos organismos tratados segundo os valores do conteúdo de helmintos monogenéticos encontrados nas brânquias de cada peixe, experiência de 10 imersão com o peptídeo GHRP-6 em tilápias de 1 g de peso em um período

de 45 dias.

Tratamento	n	I^a	E ( %)^b	Comparação entre grupos	Comparação estatística
Grupo I 10 pg/100 ml	25	0,39	34,7	I-II	(0,304)
Grupo II 100 pg/100 ml	25	0,66	50	II-III	(0,521)
Grupo III Solução salina	25	1,07	46	III-I	(0,826)*

*Diferença estatisticamente significativa. Foi aplicado o teste de classes múltiplas às amostras.

Tabela 5. valores do percentual de umidade no tecido muscular, experiência 15 de imersão com o peptídeo GHRP-6 em tilápias de 1 g de peso em um período de 45 dias.

Tratamento	n	Média da umidade ± DE (%)	Comparação entre grupos	Comparação estatística
Grupo I 10 pg/100 ml	24	82,96 ± 3,63	I-II	(0,791)
Grupo II 100 pg/100 ml	24	83,5 ±3,31	II-III	(2,666)*

Grupo III Solução salina

24

86,42 ± 3,23

ΠΙ-Ι

(3,458)

DE: desvio padrão

Tabela 6. valores da concentração de proteínas no tecido muscular.

experiência de imersão com peptídeo GHRP-6 em tilápias de 1 g de peso em

um período de 45 dias.

Tratamentos	n	Média da concentração de proteínas ± DE	Comparação entre grupos	Comparação estatística
Grupo I 10 pg/100 ml	23	6,10	I-II	(1,160)*
Grupo II 100 pg/100 ml	23	4,94	II-III	(1,38)*
Grupo III Solução salina	23	3,55	ΠΙ-Ι	(2,64)*

DE: desvio padrão

Exemplo 4. Experiência do crescimento em camarões Litopenaeus schmitti por banhos de imersão com o peptídeo GHRP-6

Foram selecionados quatro grupos de larvas de camarões, aos quais foram aplicados quatro banhos de imersão, um a cada três dias, de uma hora de duração, com diferentes concentrações do peptídeo GHRP-6 a três 15 deles, e um grupo foi separado como controle. As concentrações do peptídeo utilizadas foram: 0,001, 0,01 e 0,1 mg/litro, nos grupos I, II e II, respectivamente; ao grupo de controle foi dada a mesma freqüência de banhos de imersão com BSA a 1 mg/litro.

Como resultado, observou-se que o grupo tratado com a maior concentração de peptídeo, 0,1 mg/litro, melhorava a qualidade das larvas dos camarões Litopenaeus schmitti. Isto ficou evidenciado em um aumento no peso de 125 a 153 %, de 15 a 26 % de aumento no tamanho, um maior número de pares de ramificações branquiais e modificações rostrais para cada β 9β parâmetro foi realizado no teste estatístico correspondente, encontrando-se em todos os casos diferenças altamente significativas (Figura 5). Ademais, observou-se que os animais tratados com GHRP-6 apresentavam menor conteúdo de água no músculo e maiores valores das relações de RNA/DNA, 5 Proteína/DNA, dando a idéia de ativação do metabolismo do músculo destas larvas (Figuras 6 e 7).

Estes resultados são de grande importância, já que, ao acelerarse o crescimento do camarão nos estados iniciais de sua vida, ocasiona-se

uma maior sobrevida na fase da coleta, o que é vital para aumentar a produtividade deste crustáceo de tanto valor comercial no mundo.

A idéia anterior foi corroborada, nas condições de produção, em um aumento da sobrevivência de 20 % nos animais tratados com GHRP-6 em comparação seus irmãos de controle, além disso mantendo-se um estímulo de 115 % no peso e de 37 % no tamanho, apresentando os animais tratados com o peptídeo maior homogeneidade no tamanho do que seus irmãos não tratados, refletindo-se no coeficiente de variação de apenas 24 % e 9 % no peso e no tamanho respectivamente nos animais tratados com o peptídeo, a

diferença de 77 % e 30 % que se observa no peso e no tamanho dos animais irmãos (Figura 8).

Exemplo 5. Estímulo do crescimento em camarões mediante a injeção intramuscular em animais de 15 g

As injeções de 50 microlitros do peptídeo GHRP-6 foram feitas entre o primeiro e o segundo segmento abdominal, usando-se uma pequena seringa de insulina. As injeções foram realizadas 1 vez a cada 3 dias, usando-se 1 micrograma/g de peso de BSA. Foram usados 15 animais em cada grupo. O efeito do peptídeo GHRP-6 foi estimado medindo-se o comprimento da carapaça com um paquímetro e pesando-se em uma balança de 0,1 g de erro. Os animais foram instalados em bolsas de náilon (0,8 cm de abertura de malha) com as dimensões de 2 x 2 x 1 (comprimento x largura x

altura) em um tanque de terra com uma salinidade de 30 g.1.1, 25 °C e fotoperiodicidade natural. O efeito do peptídeo GHRP-6 foi estimado medindo-se o comprimento da carapaça com paquímetro e pesando-se em uma balança de 0,1 g de erro.

O GHRP-6 injetado nas diferentes concentrações aumentou o crescimento dos indivíduos entre 100 e 150 % em relação ao controle. Com diferenças significativas (p<0,001).

Exemplo 6. Estímulo do crescimento em camarões mediante a inclusão na

dieta

O peptídeo GHRP-6 foi incluído em uma dieta para as póslarvas de crustáceos a 1 %. O peptídeo GHRP-6 incluído na dieta foi microencapsulado por um método de coacervação complexa (Knorr, D. e M.

Daly. (1988). Process Biochemistry·, 48-50). Posteriormente, as pós-larvas de

Litopenaeus schmitti foram alimentadas com a dieta mencionada, bem como um controle com BS A foi incluído na alimentação seca. O efeito do tiGH foi estimado medindo-se o comprimento da carapaça das larvas e das pós-larvas com um micrômetro óptico, e pesou-se em uma balança de 0,1 mg de erro.

O peptídeo GHRP-6 incluído na dieta incrementou o crescimento dos camarões entre uns 30 e 40 % em relação ao controle. Com diferenças altamente significativas (p<0,001).

6.1. Encapsulação em artêmia

O peptídeo GHRP-6 foi bioencapsulado em Artemia, com as quais foram alimentadas as pós-larvas de Litopenaeus schmitti e Litopenaeus vanamei. Para encapsular o peptídeo GHRP-6 na Artemia salina, foi-lhe 25 adicionada a uma concentração de 10 mg/litro durante 1 hora, procedeu-se à coleta e à lavagem. Posteriormente, as pós-larvas foram alimentadas de Lipopenaeus schmitti com esta Artemia quatro vezes ao dia durante um mês, de experiência. O grupo de controle foi alimentado com Artemia salina com

BSA bioencapsulada. O efeito do peptídeo GHRP-6 foi avaliado medindo-se

o comprimento da carapaça das larvas e das pós-larvas com um micrômetro óptico, e foram pesadas em uma balança de 0,01 mg de erro.

O peptídeo GHRP-6 bioencapsulado em Artemia salina aumentou o crescimento dos indivíduos entre 30 e 40 % em relação ao controle. Com diferenças altamente significativas (p<0,001).

Exemplo 7. Experiência de crescimento em larvas de salmões (salmo salar) mediante banhos de imersão com o peptídeo GHRP-6

Foram selecionados três grupos de larvas de salmões (salmo sal ar) e foram aplicados a dois deles seis banhos de imersão, um a cada três 10 dias de uma hora de duração com diferentes concentrações do peptídeo GHRP-6, e um grupo foi escolhido como controle. As concentrações do peptídeo utilizadas foram: 0,01 e 0,1 mg/litro, nos grupos I e II respectivamente; ao grupo de controle foi aplicada a mesma freqüência de banhos de imersão com BSA a 1 mg/litro.

Como resultado, observou-se que, no grupo tratado com a maior concentração de peptídeo, 0,1 mg/litro, o peso foi aumentado de 120 a

145 %, tomando-se como referência os 100 % do grupo de controle, e observou-se um aumento de uns 15 a 26 % no tamanho e no peso, em relação ao grupo de controle. Por outro lado, observou-se que os animais tratados com GHRP-6 apresentavam menor conteúdo de água no músculo, aumento nos valores das relações de RNA/DNA, Proteína/DNA, dando a idéia da ativação do metabolismo nos músculos destas larvas.

Estes resultados são de grande importância, já que, ao acelerar o crescimento das larvas de salmões nos estados larvais, ocasiona-se uma 25 maior sobrevida nesta fase do cultivo, o que é vital para aumentar a produtividade desta espécie tão importante no comércio de peixes no mundo.

Exemplo 8. Efetividade do peptídeo GHRP-6 sobre o ectoparasita “piolho do mar” Caligus sp, em trutas (Oncorhynchus mykiss).

Trutas tratadas em seus estados larvais mediante banhos de

• ·' imersão dados a cada três dias, em um total de 6 banhos, com o peptídeo

GHRP-6 em concentrações de 0,01 mg/litro, 0,1 mg/litro e um grupo de controle, foram colocadas em gaiolas de sebe em uma região afetada pelo ectoparasita Caligus sp. De cada gaiola foram amostrados por cinco vezes 20 5 peixes em intervalos de uma semana. Ambos os grupos tratados em seus estados larvais com o peptídeo GHRP-6 reduziram significativamente (p<0,05) a carga de chalimus e Caligus (dois tipos importantes de “piolhos do mar”) adultos em comparação com o grupo de controle, não existindo

diferença entre os grupos tratados.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação veterinária para estimular o crescimento e a resistência a enfermidades em peixes e crustáceos, a formulação caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo GHRP-6 de sequência His-D-Trp-

5 Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂ como o único ingrediente ativo.
2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser para administração como uma injeção, uma formulação oral ou por imersão.

Petição 870180066229, de 31/07/2018, pág. 6/6 ··· « · • ·

1/8 ··· ·· ·♦ ·· · • · ·· ···* tiGH (ng/ml)

Tempo (minutos)

FIGURA 1

2/8

Tratamento intraperitoneal

Crescimento específico (g/dia)

PBS

GHRP-6

FIGURA 2 ··

Crescimento específico (g/dia)

FIGURA
3 • · · · · · · 6 «»t 9 · e ·
4 · • ··«···· • ··· *· ·· ·· • o s s e · • · ··· · • · · ·

Crescimento específico (g/dia)

FIGURA 4
5/8

Tempo (dias) —li

-À-lll

Controle

Freqüência absoluta □i Π m

□ Controle

Número de Ramificações Branquiais

Número de Modificações

FIGURA 5
6/8

Peso Seco

O

U

FIGURA 6
7/8 de RNA/PROTEÍNA o

ira o

Φ D£

Relação de RNA/DNA

Relação de RNA/DNA

2.8 η

Peptídeo BSA érupos < z w ΙΟ (E 0.

z θ'

Φ o o ra o jrç o θ'

Z

Q

Z a

Peptídeo BSA

Relação de RNA/DNA

Peptídeo &upos

BSA

Êrupos

FIGURA 7 »· · · · · ··
8/8

FIGURA 8