BRPI0307976B1

BRPI0307976B1 - Process for the selective connection of an agregative abnormal form of a protein, and, process or test as to the presence of an abormal aggregation form of a protein of a sample

Info

Publication number: BRPI0307976B1
Application number: BRPI0307976-7A
Authority: BR
Inventors: Reza Lane Amin; J. Stanley Christopher; Mark Wilson Stuart
Original assignee: Microsens Biophage Limited
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2017-12-19
Also published as: EP1478931A2; CO5611225A2; MXPA04008275A; EP1478931B2; BRPI0307976A2; CN100526884C; NZ535276A; US20050221404A1; JP4550425B2; WO2003073106A3; US7659076B2; US8460885B2; AU2003214375B2; JP2005519088A; ES2564293T5; EP1478931B1; CN1643381A; CA2477569C; CA2477569A1; RU2309410C2

Description

‘PROCESSO PARA A LIGAÇÃO SELETIVA DE UMA FORMA ANORMAL AGREGATTVA DE UMA PROTEÍNA, E, PROCESSO OU ENSAIO QUANTO À PRESENÇA DE UMA FORMA AGREGATTVA ANORMAL DE UMA PROTEÍNA DE UMA AMOSTRA” A presente invenção refere-se ao uso de agentes de ligação resistentes a protease, tipicamente materiais poliiônicos, tais como materiais polianiônicos incluindo polissulfato de pentosano, sulfato de dextrano ou outros poliglicosídeos polianiônicos ou materiais policatiônicos incluindo polibrene, dendrímero de poliamidoamina ou poli(dialildimetilamônio cloreto), opcionalmente sob condições seletivas para capturar a forma patológica ou camuflada da proteína príon PrP0 e proteínas que são formas anormais, similarmente agregativas, de proteínas que, em sua forma normal, não são agregadas.

As doenças por príon, também referidas como encefalopatias espongiformes transmissíveis ou TSEs, foram somente reconhecidas recentemente. A encefalopatia espongiforme bovina (BSE) foi primeiro relatada em 1985. Os primeiros casos da doença Creutzfeldt Jakob variante (vCJD) foram informados em 1996. A vCJD é uma doença neurodegenerativa fatal em humanos, que se acredita ser causada pelo consumo de carne contaminada com BSE. O tempo de incubação entre a infecção e os sintomas clínicos no humano pode ser de muitos anos. O único componente identificado do príon o agente causador das doenças por príon, é PrPSc, uma isoforma anormal de PrP° (PrPSc é também referido como PrPres e PrPc também referido como PrPSen). A PrPSc foi anteriormente considerada como sendo distinguida de PrP° pelo fato de ser comparativamente resistente à protease. Recentemente, entretanto, foi publicado que há uma forma sensível à protease de PrPSc, isto é que há uma forma infecciosa de PrP, que é sensível à protease.

Pode ser que a PrPSc infecciosa, porém sensível à protease, seja capaz de agregar-se (isto é, ser agregativa por natureza), porém não ainda agregada ou pelo menos somente parcialmente agregada.

Ambas as formas de PrPSc insensível à protease e sensível à protease e as partes de núcleo de PrPSc, deixadas após digestão parcial da protease (com frequência referidas na técnica como PrP27"30), são referidas aqui como PrPSc, exceto onde o contexto indicar que se refere a uma específica destas. Além disso, a expressão 'proteínas agregativas" é usada para incluir tanto PrPSc agregada, resistente à protease, como formas similares de outrás proteínas, bem como formas de PrPSc infecciosas não-agregadas ou parcialmente agregadas ou outras proteínas, o que pode incluir a PrP infecciosa sensível à protease, recentemente observada.

PrPc é uma glicoproteína de função desconhecida, ancorada em glicoproteína. Embora alguns outros marcadores para doenças por príon tenham sido sugeridos, PrPSc permanece não somente um componente príon obrigatório, porém também o único marcador confiável e universalmente aceito para esta família de doenças. A metodologia atualmente favorecida para ensaiar quanto a presença de PrPSc é submeter uma amostra a proteólise com Proteinase K, por um período suficiente para destruir PrPc e, então, determinar a presença da PrPSc sobrevivente por um imunoensaio, utilizando-se um anticorpo que não seja seletivo para PrPSc, na presença de PrPc (Serban e outros, Neurology, Vol. 40, No. 1, Jan 1990). O uso da protease exclui naturalmente a presença de um anticorpo como um agente de captura ou como um agente de detecção, durante a etapa de proteólise. A protease deve ser removida ou desativada antes de o anticorpo poder ser introduzido. Seria desejável evitar esta limitação no procedimento. O ensaio depende da remoção completa da PrPc, para evitarem-se falsos positivos, e das condições não serem de modo a também degradarem PrPSc, para evitarem-se falsos negativos. Tais condições de proteólise seletiva precisam ser desenvolvidas para cada tipo de amostra a ser amostrada. A sensibilidade do ensaio resultante é limitada. Por exemplo, em ensaios de tecido de cérebro bovino, a sensibilidade pode somente ser de modó que um resultado positivo confiável seja obtenível próximo do tempo em que seria provável que o animal mostrasse sintomas clinicamente observáveis de BSE. Assim, o ensaio tem um limite de sensibilidade na região de 1 pg/ml, correspondendo a 104-105 unidades infecciosas por príon. Há necessidade de testes diagnósticos mais sensíveis e específicos para doenças por príon. Em particular, um teste ante-morte, empregando-se sangue ou outros tipos de amostra, é necessário para avaliar a condição da doença de um animal particular. Na ausência de tal método, é necessário abate extenso de gado, uma vez um animal afetado seja identificado dentro do rebanho. É novamente vital que um teste diagnóstico seja desenvolvido para selecionar a população humana e para proteger indivíduos de infecção potencial por sangue doado, procedimentos cirúrgicos e transplantes de órgãos e tecidos.

As US5977324 e US6221614 descrevem ambas métodos de ligar PrPSc usando-se ácido fosfotúngstico (PTA). O PTA é um precipitador de proteína não-específico, que também se liga a e precipita uma larga faixa de proteínas que não PrPSc. A concentração das proteínas na amostra também afeta grandemente a recuperação empregando PTA. O plasminogênio foi relatado ligar PrPSc seletivamente com respeito a PrPc e foi proposto para uso em ensaios diagnósticos (Fischer e outros, Nature, 2000, Nov 23, 408 (6811): 479-83). Entretanto, este método não se provou suficientemente útil na prática. O plasminogênio é também identificado em uma descrição relacionada, US 2002/0004586, como sendo um fator que seletivamente liga PrP .

De acordo com a US 6419916 e descrições relacionadas, o composto de poliamina Superfect® (uma mistura de poliamina ramificada, produzida por degradação induzida por calor de um dendrímero PAM) e outras poliaminas ramificadas similares são capazes de depurar PrPSc das célulãs in vitro. O mecanismo não é claro. Especula-se que tais compostos podein ligar-se diretamente à PrPSc disposta como um amilóide, com porções negativamente carregadas expostas, e induzir uma mudança conformacional sob condições ácidas. Diz-se que o efeito não pode simplesmente envolver a ligação da PrPc e inibir a síntese da PrPSc porque a PrPSc existente é depurada. A poliamina é constatada tomar a protease de PrPSc sensível, desde que o pH esteja abaixo de 4. Deduz-se que as poliaminas atuam em um compartimento celular ácido, nos experimentos de depuração de PrPSc in vitro.

Seria evidente por este trabalho que seria especulativo concluir que tais poliaminas ligam-se a PrP . Numerosas outras possibilidades são adiantadas. Nenhuma seletividade para a ligação de PrPSc sobre PrPc é mostrada ou sugerida. Além disso, não pode ser deduzido que qualquer ligação que ocorra é mais do que transitória, apenas servindo para alterar a conformação de PrPSc, a fim de permitir ataque da protease. Ademais, a ação das poliaminas parece requerer um baixo pH. Nossas próprias investigações, de fato, mostram que tais poliaminas dendrímeras não se ligam a PrPSc em tal baixo pH. O polissulfato de pentosano (poli-b-xilose-2,3-dissulfonato, PPS) é um de uma faixa de grandes poliglicosídeos polissulfonados (PGs) (MW 8.000 - 12.000). Feito de madeira de faia, é um composto barato que tem sido usado por muitos anos como um anticoagulante similar à heparina, também um PG. Os PGs, incluindo PPS e outros poliânions, são sabidos ligarem-se tanto a PrPc como PrP recombinante (recPrP), vide, por exemplo, Brimacombe DB e outros, Biochem J, 15 set. 1999; 342 pt 3, 605-13. O PPS, portanto, foi proposto como um agente terapêutico potencial, para prevenir ou tratar doenças TSE. Ele, entretanto, não demonstrou remover a existente PrPSc in vivo ou in vitro.

Na manufatura, a serragem da madeira de faia é extraída para produzir o polímero de açúcar solúvel de xilose (um açúcar de anel de cinco membros) chamado pentosano. Este polímero é então submetido a uma reação de sulfatação, empregando-se uma mistura de ácido clorossulfônico e piridina, que resulta em 3 de 4 de todas as hidroxilas do anel de açúcar, tendo um éster de sulfato adicionado nelas. O teor total de sulfato é então de cerca de 50 - 55% em peso, o que é mais do que da heparina, em que é de cerca de 30 - 35%. A única outra molécula similar que se aproxima deste alto grau de sulfatação é sulfato de dextrano (40 - 45%). Pentosano tem um MW muito baixo de 3,5 - 7,0 K.

Nenhuma seletividade para ligação por poliânions ou policátions de PrPSc, com respeito à ligação de PrPc, foi relatada. Surpreendentemente, estabeleceu-se agora condições sob as quais os materiais poliiônicos ligam-se às proteínas alteradas agregadas, como PrPSc e ainda estabeleceu-se condições sob as quais tais poliânions ligam-se a estas formas anormais, mas não se ligam a suas formas normais não-agregadas, como PrPc, a ligação sendo suficientemente forte e sob condições preferidas suficientemente seletivas para serem utilizáveis em ensaios quanto à presença da proteína alterada agregada (p. ex. PrP ).

Por conseguinte, é agora fornecido, em um primeiro aspecto da invenção, um processo para a ligação seletiva de uma forma anormal agregativa da proteína, compreendendo contatar, sob condições de ligação seletivas, um material contendo ditas formas tanto anormal como normal com um material poliiônico tendo uma avidez de ligação para dita forma agregativa da proteína quando presente na amostra. As condições de ligação podem incluir a presença de um agente de competição em solução, agente de competição este tendo uma menor avidez de ligação para a forma anormal da proteína do que o material poliiônico. O material poliiônico pode ser em solução ou pode prover uma superfície apresentando grupos de superfície iônicos. No último caso, a superfície pode ser aquela de um polímero tendo ditos grupos iônicos covalentemente ligados dentro da estrutura do polímero ou produzido por modificação de grupos de superfície do polímero. Um exemplo de um polímero polianiônico adequado é Nafion, um polímero de hidrocarboneto perfluoronado sulfonatado, disponível como contas ou como folhas. Os polímeros policatiônicos podem também ser usados.

Altemativamente, a superfície é aquela de um substrato tendo revestida sobre ele ou ligada nele uma substância exibindo ditos grupos iônicos. Um exemplo de um polímero adequado, tendo tais grupos de superfície, é uma superfície plástica não-carregada, ativada com anidrido maleico e derivada com TRIS, para produzir grupos carboxila de superfície, ou com um material policatiônico. Os policátions ou poliânions podem, em vez disso, serem passivamente revestidos nos polímeros, tais como poliestireno.

No caso de um material polianiônico, quer usado em solução ou revestido sobre uma superfície sólida, o material polianiônico pode, preferivelmente, ser um poliglicosídeo polianiônico.

Genericamente, o agente de competição tem uma menor densidade de grupos iônicos do que o material poliiônico. Sem ficarmos presos a teoria, é provável que as descobertas descritas em detalhe aqui são devidas às formas de proteína anormais agregativas, tendo mais sítios de ligação para interação com grupos iônicos do que a forma normal não agregativa da mesma proteína. Um agente de competição, tendo um ou alguns grupos iônicos, é capaz de interagir com uma certa avidez com as formas agregativas ou não-agregativas da proteína, porém um material poliiônico é capaz de ligar-se à forma agregada da proteína simultaneamente através de muitos grupos iônicos, resultando em ter uma mais elevada avidez para a forma agregativa do que para a não-agregativa.

Nossos resultados experimentais com cérebros bovinos infectados indicam que tanto poliânions imobilizados (tais como sulfato de dextrano) como policátions (tais como polietilenoimina) são capazes de capturar a forma anormal da proteína príon PrPSc de homogeneizados de cérebro. O sinal obtido utilizando-se um conjugado de enzima/anticorpo de proteína anti-príon é de aproximadamente 3 a 5 vezes mais elevado para a melhor superfície de captura policatiônica do que para a melhor superfície de captura polianiônica.

Em ambos os casos o detergente Sarkosyl (N-lauroil-sarcosina) pode atuar como um agente de competição útil para melhorar a especificidade de captura da proteína anormal e evitar um sinal da proteína príon normal, quando utilizando um anticorpo de proteína anti-príon não-específica. Parcialmente digerindo a amostra com tripsina aumenta-se também substancialmente o sinal de PrPSc, quando utilizando-se compostos policatiônicos ou polianiônicos, porém não tem nenhum efeito na especificidade (indicando que, sob as condições empregadas, a tripsina está removendo um inibidor de ligação poliiônica de PrPSc, em vez de preferencialmente digerindo PrPc, como foi observado para a proteinase K). É relatado na literatura científica que PrPSc é nativamente Γ associada com poliânions, tais como heparans. E provável que estes polímeros negativamente carregados estejam interagindo com uma região positivamente carregada da estrutura PrPSc e podería haver múltiplas interações com as proteínas agregadas.

Foi proposto que um poliânion, tal como sulfato de dextrano ou polissulfato de pentosano, seja capaz de ligar-se à estrutura de PrPSc com muito mais elevada avidez do que os heparans nativos e, assim, pode deslocar os compostos endógenos. Assim, polímeros altamente carregados negãtivamente, imobilizados em uma superfície, podem capturar especificamente a proteína príon anormal. A proteína príon normal não é agregativa e não tem uma tal interação de afinidade elevada com os heparans endógenos ou com poliânions, tais como sulfato de dextrano. Sob as condições de ensaio escolhidas, a presença de ânions de mais baixa afinidade, tais como o detergente Sarkosyl, melhora a especificidade de captura ainda mais competindo com o poliânion imobilizado para os sítios de interação de PrPc de mais baixa afinidade.

Ao contrário, sugere-se que um policátion não pode deslocar os heparans endógenos da estrutura PrPSc. Sugere-se que ele deve, em vez disso, complexar diretamente com o agregado PrPSc/heparan endógeno -formando uma interação iônica com as cargas negativas livres do heparan. Assim, nesta configuração o complexo PrPSc/heparan intacto é ligado estreitamente ao policátion imobilizado, enquanto, no caso de um poliânion imobilizado, a estrutura de PrPSc não-nativa, 'deslocada' é capturada em seu lugar. Isto provê uma explicação para o sinal mais elevado que obteve-se com as melhores superfícies de captura policatiônicas, pelo fato de que a competição por poliânions para heparans endógenos pode não ser 100% eficiente e, assim, nem todos os agregados PrPSc são ligados por polímeros negativamente carregados.

Agentes de captura aniônicos podem ser preferíveis quando se espera que a proteína agregativa seja ligada nativamente por heparan nativo, p. ex., quando a amostra é sangue ou soro ou semelhante, em vez de tecido.

Além das interações iônicas propostas, pode haver ligação hidrofóbica adicional entre outras regiões do agregado PrPSc e dos polímeros empregados. Isto fortalecerá mais as interações de ligação. "Avidez" aqui é usada no significado usual de força de ligação total de uma molécula com muitos sítios de ligação com um agente de ligação multivalente e ao contrário de "afinidade", sendo a força de ligação entre cada sítio de ligação individual e da molécula e o agente de ligação. O agente de competição, se usado, é preferivelmente uma amida de aminoácido de um ácido graxo, tal como n-lauroil sarcosina. Tais materiais têm propriedades de detergência, porém, neste contexto, podem bem simplesmente estar atuando como agentes de ligação monovalente, via seu grupo COO' terminal ou como agentes parcialmente polivalentes, através da formação de micelas.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê um processo para a ligação seletiva de uma forma anormal agregada de uma proteína, na presença da forma normal não-agregada da proteína, compreendendo contatar um material contendo ditas formas tanto anormal como normal com um poliglicosídeo polianiônico, sob condições de modo a prover ligação seletiva de dita forma anormal.

Nas versões preferidas de cada aspecto da invenção, dita forma anormal de uma proteína é PrPSc e dita forma normal é PrPc. Entretanto, a invenção, em todas suas formas, é largamente aplicável à ligação seletiva de formas agregativas anormais de proteínas.

Agentes de ligação seletiva policatiônicos, que podem ser usados, incluem polietilenoiminas, poliaminas, incluindo polilisinas, poliamidoaminas, p. ex., dendrímeros PAM, aminas poliquatemárias, tais como poli(dialildimetilamônio cloreto) e l,5-dimetil-l,5-diazaundecametileno poli-metobrometo (também conhecido como brometo de hexadimetrina ou Polibrene). O poliglicosídeo polianiônico preferido é um poliglicosídeo polissulfonado. Entretanto, outros sítios aniônicos, tais como grupos ácido carboxílico ou grupos fosfato, podem ser usados também ou altemativamente.

Preferivelmente, o poliglicosídeo polissulfonado é polissulfato de pentosano (PPS) ou sulfato de dextrano.

Outros derivados de pentosano ou dextrano polianiônicos podem ser usados como o poliglicosídeo polianiônico.

Um alto nível de sulfònação (ou outro grupo aniônico) é preferido.

Os níveis de sulfònação das carragenanos, dextranos e pentosano são elevados. Se uma baixa proporção dos sítios de sulfonação potenciais for realmente absorvido pelos grupos sulfato, então pode ser constatado que os compostos não interagem com os sítios de ligação da PrPSc seletivamente.

Agentes de ligação seletivos aniônicos adequados podem incluir: Polissulfato de pentosano (PM 3500 - 5000), sulfato de dextrano 500 (MW 500.000), Iota-carragenano, Lambda-carragenano e carragenanos, p. ex., Capa-carragenano, Heparinas e heparans, sulfato de dextrano 8 (MW 8000), poliglicosídeos sulfonados, tais como fucoidano, sulfato de ceratina, polissulfato de ácido hialurônico, ácido colomínico (ácido polisiálico bacteriano), carragenanos tipos iii e iv, sulfato de dermatan, sulfato de heparan, furcelaran, polissacarídeos sulfatados comercialmente disponíveis, p. ex., polissorbato, sizofiran, goma xantana, amido, compostos de celulose, pectina, mucina gástrica, ceratonia, ágar, goma arábica, Glicosídeo sulfatado 1, Glicosídeo Sulfatado 2, N-acetil-D-glicosaminas ou ácido L-idurônico de sulfato de dermatan. O material poliiônico pode ser selecionado tendo a capacidade, sob condições não-seletivas, de ligar-se a formas alteradas ou camufladas agregativas de uma proteína e também à forma normal não-agregativa da proteína, bem como a capacidade de ligar-se à forma agregativa seletivamente, sob condições apropriadas. A desejada seletividade é obtenível por ajuste adequado das condições de reação, particularmente a presença e concentração do agente de competição, do pH e da detergência. Preferivelmente, portanto, o pH é selecionado de modo a prover dita ligação seletiva. O pH é preferivelmente de 5,6 a 9, p. ex., de 7 a 9, mais preferivelmente 8 a 9, p. ex. de 8,2 a 8,6, especialmente 8,4, particularmente quando os detergentes descritos abaixo são usados. Tampões adequados incluem tampões de fosfato e tampões Tris. A concentração de sal é preferivelmente não mais elevada do que 250 mM e é preferivelmente significativamente menor, p. ex., não acima de 100 mM.

Preferivelmente, um detergente está presente que promove dita ligação seletiva, quer em virtude da detergência ou atuando como um agente de competição.

Particularmente preferido para esta finalidade são os detergentes que são uma amida de aminoácido de um ácido graxo, p. ex., n-laurõilsarcosina ou outras sarcosinas de ácido graxo. A presença de tal detergente/agente de competição é especialmente preferida quando o agente de ligação seletiva é polianiônico.

Preferivelmente, a concentração deste detergente é de pelo menos 0,05 % em peso, material poliiônico pelo menos 0,1%, preferivelmente pelo menos 0,2%, p. ex., 0,2 a 2%, material poliiônico 0,5 a 1,5%, porém maiores quantidades podem ser usadas.

Outros detergentes tendo um efeito similar podem ser usados, incluindo CHAPS, Brij, Octil-P-glicosídeo, Tween 20, Triton X-100 e Nonidet P-40. O uso de altas concentrações de dodecilsulfato de sódio (SDS) é, entretanto, indesejável. Combinações de n-lauroil sarcosina (ou similar) com outros detergentes são adequadas, preferivelmente contendo 0,5 a 2%, p. ex., cerca de 1% de detergente sarcosina, p. e., com 0,5 a 2%, p. ex., cerca de 1%, de um dos detergentes listados acima, particularmente Triton X-100 ou Nonidet P-40.

Verificou-se que a presença de tripsina, quimotripsina, protèinase K ou outra tal protease pode ser proveitosa para impedir a inibição, por materiais desconhecidos da proteína agregativa, dos agentes de ligação seletiva polianiônicos ou policatiônicos. Isto é especialmente o caso em que a amostra contém um nível relativamente elevado de outras proteínas, tal como é o caso se uma amostra de cérebro positiva PrPSc for diluída com um material de cérebro negativo PrPSc. Prevenção de inibição de matriz adicional pode ser conseguida pela inclusão de outras enzimas de uma natureza degradativa, incluindo Dnase e colagenase. O agente de ligação seletiva, após ligar-se a dita forma anormal agregativa da proteína, pode ser capturado com um agente de captura imobilizado e a presença ou quantidade de um complexo formado entre dito agente de ligação seletiva e dito agente captura pode ser determinada.

Dito agente de captura pode ser uma lecitina (em que o agente de ligação é adequado, p. ex., é um poliglicosídeo) ou um anticorpo reativo com dito agente de ligação seletiva. Dito agente de ligação seletiva pode ser provido com uma porção marcadora seletivamente ligável e dito agente de captura pode então ligar-se a dita porção marcadora.

Opcional e altemativamente, o agente de ligação seletiva é imobilizado em um meio sólido antes da exposição a dita amostra. O agente de ligação seletiva pode ser provido com uma porção marcadora seletivamente ligável e pode ser imobilizado em dito meio sólido via dito marcador.

Onde uma porção marcadora ligável estiver presente, pode ser, por exemplo, biotina, fluoresceína, dinitrofenol, digoxigenina, ou (His)6. O agente de ligação seletiva pode ser imobilizado diretamente em um sólido em vez de através de um marcador ligável. Por exemplo, os PG's podem ser diretamente acoplados por acoplamento covalente através de grupos hidroxila remanescentes do PG utilizando fases sólidas, derivadas com, por exemplo, grupos sulfona epóxi ou vinila.

Em cada aspecto da invenção, quer a ligação da proteína anormal ocorra antes ou após a imobilização ou captura do agente de ligação seletiva, os complexos de agente de ligação seletiva imobilizado/proteína anormal são preferivelmente submetidos a uma etapa de lavagem para remover proteína normal, para melhorar a seletividade. A etapa de lavagem é preferivelmente conduzida usando-se uma solução contendo um dito agente de competição, que pode ser uma solução detergente, que preferivelmente compreenda um detergente que, quer em virtude de sua detergência ou de outro modo promova a ligação seletiva. Isto é preferivelmente uma amino amida de um ácido graxo, p. ex., n-lauroil sarcosina ou outra sarcosina de ácido graxo. Preferivelmente, a concentração do detergente sarcosina na etapa de lavagem é de pelo menos 0,05%, preferivelmente pelo menos 0,1%, mais preferivelmente pelo menos 0,2%, p. ex., 0,2 a 2%, preferivelmente 0,5 a 1,5%. Outros detergentes podem também estar presentes e a lavagem é preferivelmente tamponada a um pH na faixa de 5,6 a 8,4.

Dita ligação de PrPSc (ou outra proteína anormal) pode ser qualitativa ou quantitativamente determinada conduzindo-se um imunoensaio para PrPSc (ou outra proteína agregativa), após separação da PrPSc ligada da PrPc não ligada (ou outra proteína de forma normal).

Além disso, uma vez a forma agregativa da proteína tenha sido seletivamente ligada e opcionalmente após a forma normal ter sido removido, mais material polianiônico, p. ex., poliglicosídeo aniônico (adequadamente rotulado com um marcador ou rótulo detectável) pode ser ligado à proteína agregativa já ligada, para formar um sanduíche (p. ex., poliglicosídeo-proteína agregada- rótulo de poliglicosídeo), que pode então ser quantificado ou detectado. Condições de ligação seletivas podem não ser necessárias quando realizando a segunda parte da formação de sanduíche.

Como mencionado acima, o agente de ligação seletiva pode ser imobilizado em um material sólido, antes ou após ser contatado com a protèína alterada. A separação da amostra do material sólido pode então ser usada para remover a forma normal da proteína do ensaio, deixando somente a forma alterada para determinação adicional.

Neste contexto, materiais de suporte sólidos incluem não somente materiais macroscópicos ou manuseáveis, tais como placas de microtitulação, hastes de imersão e dispositivos de fluxo laminar, porém também microcontas e microcontas superparamagnéticas, que podem ser separadas por filtragem ou por captura magnética. Biotina ou outros marcadores podem ser conjugados ao sulfato de dextrano ou PPS e materiais similares, por métodos químicos padrão. Cerca de um em dez dos resíduos de cadeia principal de açúcar do PPS é um metil éster do ácido urônico e isto fornece uma rota para acoplamento, via seus resíduos carboxila. Outras rotas conhecidas para acoplamento são hidroxila (um em quatro está ainda livre após a reação de sulfatação) ou açúcar redutor do grupo terminal. A biotina é uma porção marcadora ligável conveniente para empregar-se para ligação do material polianiônico ou outro agente de ligação seletiva a um material sólido derivado com avidina ou um material com propriedades de ligação de avidina, tal como estreptavidina, Neutravidina ou Captavidina.

Outras moléculas adequadas para uso como porções marcadoras ligáveis incluirão todas aquelas que são prontamente conjugadas no material poliônico e que prestam-se para captura por um agente de captura adequado. Por exemplo, uma molécula tal como fluoresceína pode ser unida com PPS ou moléculas similares, reagindo-se um derivado de amino fluoresceína com as cadeias urônicas e laterais do polissulfato de pentosano, na presença de carbodiimida EDC(l-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida) e pode ser capturada por um anticorpo adequado prontamente disponível, que pode ele próprio ser imobilizado no material sólido. Outros marcadores adequados para captura de anticorpo, desta maneira, incluem dinitrofenol DNP, digoxigenina, ácido nucleico ou seqüências análogas de ácido nucleico, e (His)6. Agentes de ligação que não anticorpos podem também ser usados, p. ex., ácido nucleico complementar ou seqüências análogas de ácido nucleico.

Altemativamente, entretanto, um agente de captura pode ser usado que se liga seletivamente ao próprio material poliônico, em vez de através de uma porção marcadora. Por exemplo, os poliglicosídeos podem ser ligados por uma lecitina adequada ou por um anticorpo adequado. Anticorpos para; ligarem-se a PPS são, por exemplo, descritos em Kongtawelert e outros; J. Immunol. Methods, 24 jan. 1990; 126(1); 39-49. Técnicas padrão para imobilizar tais anticorpos são bem conhecidas na técnica.

Qualquer método conhecido ou no futuro imaginado, para determinar a presença ou quantidade de proteínas alteradas agregadas ou agregativas, tais como PrPSc (sem necessitar excluir seletivamente a forma normal, tal como PrPc), pode ser usado para determinar a presença ou quantidade da forma agregativa, uma vez tenha sido seletivamente ligada pelo agente de ligação seletiva e a proteína de forma normal não ligada tenha sido separada dela, adequadamente por imobilização da ligada e retirada por lavagem da não-ligada residual. Tais métodos incluem as formas conhecidas de imunoensaio ELISA, RIA, IRMA e outras, por exemplo, o método corporificado no kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia® e descrito em Serban e outros.

Dependendo da forma do ensaio usado, pode ser desejado ou requerido eluir a proteína de forma anormal capturada do agente de ligação seletiva antes do ensaio. Na condução de tal etapa de eluição, a presença de um caótropo, tal como tiocinanato de guanidina, pode ser desejável em uma concentração de pelo menos 1M, preferivelmente 2 a 6 M, p. ex., 4 a 6 M. Caótropos alternativos podem ser usados incluindo uréia.

Adicional ou altemativamente, um agente de competição, tendo uma ainda mais elevada avidez, pode ser usado para deslocar a proteína do agente de ligação seletiva. Dodecil sulfato de sódio (SDS) é adequado para isto e é preferivelmente usado em uma concentração de 0,5 a 1 % em peso, preferivelmente acima de 0,75%.

Outras proteínas que podem ser seletivamente ligadas e determinadas de acordo com a invenção incluem a proteína β-amilóide e a proteína tau, que forma placas na doença de Alzheimer.

Sem ficar preso a seguinte teoria, pensa-se que o PPS e moléculas similares funcionam na invenção pela ligação de pares de grupos sulfato negativos a pares de amino ácidos positivos (Lys e Arg) das proteínas relevantes ou via os sítios de ligação de metal de poliistidina das proteínas. A ligação às formas agregadas pode ser mais forte devido ao número aumentado de sítios de ligação apresentados pela proteína agregativa. Detergentes aniônicos adequados podem competir mais eficazmente para ligação com a forma não agregativa, para aumentar a seletividade. Adequadamente, a seletividade obtida é de modo que a avidez para ligação à proteína agregativa seja pelo menos três vezes aquela para a forma normal, preferivelmente pelo menos 10:1.

Em um outro aspecto, a invenção inclui um processo para separar PrPSc de PrPc, compreendendo seletivamente ligar PrPSc a um agente de ligação, na presença de uma amida de aminoácido de um ácido graxo. Condições preferidas para tal ligação são como expostas em detalhe acima e a proteína ligada pode ser ensaiada como descrito. A invenção será ainda descrita e ilustrada pelos seguintes exemplos, fazendo-se referência ao desenho anexo, em que: A Figura 1 mostra curvas de diluição obtidas no Exemplo 9. Exemplo 1: Separação de príon normal de proteína príon camuflada, utilizando-se polissulfato de pentosano biotinilado e subseaüente captura de afinidade Introdução Biotina foi unida a polissulfato de pentosano, empregando-se métodos químicos padrão. O polissulfato de pentosano biotinilado foi permitido ligar-se à proteína príon camuflada de homogeneizados de cérebro e, ápós ligação, complexos de polissulfato de pentosano/príon foram capturados utilizando-se contas superparamagnéticas derivadas de estreptavidina. O príon camuflado capturado foi subseqüentemente eluído das contas e detectado utilizando-se o kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia® imuno-baseado; o último kit é incapaz de diferenciar a proteína príon normal e cámuflada dará um sinal com ambas as proteínas. Um banco de dois cérebros bovinos infectados-BSE e dois não infectados foi investigado e usado para demonstrar que o polissulfato de pentosano, sob as condições específicas descritas, podia ser usado para especificamente capturar proteína príon camuflada dos homogeneizados de cérebro. Método Preparação das contas supermagnéticas. 1. Logo antes do uso, 400 μΐ de contas de superparamagnéticas de estreptavidina (Sigma-Aldrich Company Ltd., S-2415) foram lavados por captura magnética em três volumes de 1 ml consecutivos de TBST (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5, 0,05% (v/v) Tween 20 [Sigma-Aldrich Company Ltd, P-7949]). 2. As contas foram finalmente ressuspensas em 400 μΐ de TBST. 3. Alíquotas de 100 μΐ foram preparadas em quatro tubos e o líquido removido. As contas estavam então prontas para uso.

Preparação dos homogeneizados de cérebro 1. 300 - 500 mg de cada tecido de cérebro foram adicionados aos tubos de moagem contendo contas de moagem, como supridas no BSE Purification Kit (Bio-Rad). O líquido originalmente suprido nestes tubos do kit foi aspirado e descartado antes do uso. 2. Um volume de 150 mM de NaCl, que foi calculado gerar um homogeneizado de cérebro de 50% (p/v) após homogeneização, foi adicionado em cada tubo. 3. Os tubos foram homogeneizados por 45 segundos em ajuste de velocidade de 6,5 em um ribolizador (comprado da Bio-Rad). 4. Os homogeneizados foram diluídos 1:1 com 150 mM NaCl. 5. Volumes de 50 μΐ de cada homogeneizado foram colocados dentro de tubos separados.

Captura Específica da proteína príon camuflada 6. 10 μΐ de 20% (p/v) N-lauroilsarcosina (Sigma-Aldrich Company Ltd., L-9150) foram então adicionados a cada tubo de homogeneizado e misturados. 7. 50 μΐ de polissulfato de pentosano biotinilado (10 pg/ml em água destilada estéril) foram então adicionados em cada tubo, misturados e incubados em temperatura ambiente por 30 minutos. 8. Cada reação foi então adicionada em um tubo de contas superparamagnéticas de estreptavidina lavadas e incubada em temperatura ambiente por 30 min. 9. As contas foram então lavadas por captura magnética em três volumes de 1 ml de TBST.

Eluição da proteína príon camuflada e imunodetecção 1. Finalmente, após a última lavagem, as contas de cada reação foram ressuspensas em 10 μΐ de Cl (suprido com o kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia®). 2. 5 μΐ de 0,2% (p/v) SDS foram adicionados a cada suspensão de contas e misturados. 3. 5 μΐ de tiocianato de guanidina 1M (Sigma-Aldrich Company Ltd., G-9277) foram adicionados a cada suspensão de contas e misturados. 4. A reação foi aquecida a 100°C por 5 minutos. 5. 100 μΐ de R6 (suprido com o kit de detecção de BSE Bio- Rad Platelia®) foram então adicionados e misturados. 6. 600 μΐ de cada eluado foi então usado no kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia®, empregando-se o protocolo e os reagentes supridos com este kit. Resumidamente, este kit envolve imunocaptura de proteína normal e/ou príon camuflado e imunodetecção com um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano silvestre.

Resultados Após realizar a imunodetecção no ensaio Platelia® baseado em placa de microtitulação, o sinal de cada poço foi medido em um comprimento de onda de 450 nm, empregando-se uma leitora ELISA. O sinal dos homogeneizados de cérebro infectado por BSE, contendo príon camuflado, é significativamente mais elevado do que nos homogeneizados de cérebro normal não-infectado.

Discussão O kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia® não pode diferenciar entre proteína príon normal ou camuflada. Normalmente, a especificidade para proteína príon camuflada é conseguida por digestão anterior da amostra com proteinase K, que remove a proteína príon normal susceptível a protease. Qualquer proteína príon camuflada da amostra é mais resistente à digestão de protease e permanece e é subseqüentemente detectada pelo ensaio Platelia®' Neste experimento demonstrou-se uma abordagem alternativa para digestão por protease da amostra. Utilizou-se condições definidas sob as quais o polissulfato de pentosano biotinilado em solução pode especificamente ligar-se à proteína príon camuflada da amostra. O complexo de príon camuflado/polissulfato de pentosano pode então ser capturado utilizando-se contas superparamagnéticas de estreptavidina. Após lavagem, a proteína príon camuflada pode subseqüentemente ser eluída e detectada no imunoensaio. A proteína príon normal não é capturada por este protocolo e é retirada por lavagem e, portanto, não é detectada no imunoensaio. Demonstrou-se que, utilizando-se esta técnica, poder-se-ia corretamente detectar a proteína príon camuflada em dois cérebros bovinos infectados-BSE e não foram observado sinal em dois cérebros bovinos normais.

Exemplo 1: Separação de proteína príon normal de príon camuflado, utilizando-se polissulfato de pentosano biotinilado imobilizado Introdução A biotina foi conjugada com polissulfato de pentosano, empregando-se métodos químicos padrão. O polissulfato de pentosano biotinilado foi usado para revestir as contas superparamagnéticas derivadas de estreptavidina. As contas revestidas foram então usadas para especificamente capturar a proteína príon camuflada dos homogeneizados de cérebro. A proteína príon camuflada capturada foi subseqüentemente eluída das contas e detectada usando-se o kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia® imuno-baseado; o último kit é incapaz de diferenciar a proteína príon normal e camuflada e fornece um sinal com ambas as proteínas. Um banco de três cérebros bovinos infectados por BSE e três não-infectados foram investigados e usados para demonstrar que o polissulfato de pentosano, sob as condições específicas descritas, poderíam especificamente capturar a proteína príon camuflada dos homogeneizados de cérebro. Método Preparação de contas magnéticas revestidas com polissulfato de pentosano 1. 600 pl das contas superparamagnéticas de estreptavidina (Sigma-Aldrich Company Ltd., S-2415) foram lavadas por captura magnética em três volumes de 1 ml consecutivos de TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5). 2. As contas foram finalmente ressuspensas em 540 μΐ de TBS e adicionados 60 μΐ de 10 mg/ml de polissulfato de pentosano biotinilado em TBS. As contas foram incubadas em temperatura ambiente por 1 hora com balanço suave, para permitir que o polissulfato de pentosano revestisse as contas. 3. Após revestimento, as contas foram lavadas por captura magnética em três consecutivos volumes de 1 mm de 5% (p/v) de albumina bovina (Sigma-Aldrich Company Ltd., A-7906), 50 mM de tampão de fosfato pH 8,4 e finalmente ressuspensas em 60 μΐ do mesmo tampão. As contas estavam então prontas para uso.

Preparação dos homogeneizados de cérebro 1. 300 - 500 mg de cada tecido de cérebro foram adicionados aos tubos de moagem contendo contas de moagem, como suprido no Kit de Purificação BSE (Bio-Rad). O líquido originalmente suprido nestes tubos do kit foi aspirado e descartado antes do uso. 2. Um volume de NaCl 150 mM, que foi calculado gerar um homogeneizado de cérebro de 50% (p/v) após homogeneização, foi adicionado em cada tubo. 3. Os tubos foram homogeneizados por 45 segundos em ajuste de velocidade de 6,5 em um ribolizador (comprado da Bio-Rad). 4. Os homogeneizados foram diluídos 5-vezes com 5% (p/v) de albumina bovina, tampão de fosfato 50 mM pH 8,4. 5. Volumes de 45 μΐ de cada homogeneizado foram colocados dentro de tubos separados. 6. 5 μΐ de 20% (p/v) SDS (dodecil sulfato de sódio) (Sigma-Aldrich Company Ltd., L-5750) foram adicionados em cada tubo e misturados completamente. 7. 450 μΐ de 5% (p/v) de albumina bovina, tampão de fosfato 50 mM, pH 8,4, foram então adicionados em cada tubo e misturados. 8. 50 μΐ de 20% (p/v) de N-lauroilsarcosina (Sigma-Aldrich Company Ltd., L-9150) foram então adicionados e misturados.

Captura Específica da proteína príon camuflada 1. 10 μΐ de polissulfato de contas superparamagnéticas revestidas com polissulfato de pentosano preparadas foram adicionadas em cada homogeneizado de cérebro diluído e incubadas com balanço por 1 h em temperatura ambiente. 2. Cada reação foi então lavada por captura magnética com 3x volumes de 100 μΐ de TBS.

Eluição da proteína príon camuflada e imunodetecção. 1. As contas de cada reação foram ressuspensas em 10 μΐ de Cl (suprido com o kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia®). 2. 5 μΐ de 0,2% (p/v) SDS foram adicionados a cada suspensão de contas e misturados. 3. 5 μΐ de tiocianato de guanidina 1M (Sigma-Aldrich Company Ltd., G-9277) foram adicionados em cada suspensão de contas e misturados. 4. A reação foi aquecida a 100°C por 5 minutos. 5. 100 μΐ de R6 (suprido com o kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia®) foram então adicionados e misturados. 6. 100 μΐ de cada eluado foram então usados no Bio-Rad. 7. O kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia® utilizam o protocolo e reagentes supridos com este kit. Resumidamente, este kit envolve imunocaptura de proteína príon normal e camuflada e imunodetecção com um anticorpo conjugado do peroxidase de rábano silvestre.

Resultados Após realizar a imunodetecção no ensaio Platelia® baseado em placa de microtitulação, o sinal de cada poço foi medido em um comprimento de cinda de 450 nm, utilizando-se uma leitora ELISA.

Os sinais dos três homogeneizados de cérebro infectado por BSE, contendo proteína príon camuflada, são significativamente mais elevados do que nos homogeneizados de cérebro normal não infectado. Discussão O kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia® não pode ser diferenciado entre proteína príon normal ou camuflada. Normalmente, a especificidade para proteína príon camuflada é conseguida por digestão anterior da amostra com proteinase K, que remove a proteína príon normal susceptível a protease. Qualquer proteína príon camuflada da amostra é mais resistente à digestão por protease e permanece e é subseqüentemente detectada pelo ensaio Platelia®. Neste experimento demonstra-se uma abordagem alternativa para digestão por protease da amostra. Utiliza-se condições definidas sob as quais o polissulfato de pentosano pode especificamente capturar a proteína príon camuflada da amostra. Esta proteína príon camuflada é eluída e detectada no imunoensaio. A proteína príon normal não é capturada pelo polissulfato de pentosano e é retirada por lavagem e, portanto, não é detectada no imunoensaio. Demonstrou-se que, utilizando-se esta técnica, pôde-se detectar corretamente a proteína príon camuflada em três cérebros bovinos infectados por BSE e nenhum sinal foi observado em três cérebros bovinos normais.

Exemplo 3: Biotinilacão de PPS Princípio do Método Aproximadamente um em dez dos resíduos de açúcar da cadeia principal de poli-xilose de sulfato de pentosano é substituído por um resíduo de ácido urônico, este, por sua vez, é substituído por um éster metílico em alguns dos grupos carboxila, assim numerosos grupos carboxila livres existindo na molécula e podendo ser derivados com carbodiimida para formar ésteres ativos. Estes, por sua vez, podem ser substituídos por espécies amino, para gerar uma ligação amida. Neste caso particular, EDC e NHS são escolhidos para formar o éster ativo e hidrazida de biotina é escolhida como a espécie amino. Duas reações foram realizadas, uma reação de uma etapa, em que a hidrazida de biotina está presente inicialmente e nenhum NHS é adicionado, e uma segunda reação em que NHS/EDC são permitidos reagir simultaneamente com PS e hidrazida de biotina.

Materiais Sulfato de pentosano (Norton Healthcare) foi um presente de Stephen Dealler Hidrazida de biotina 100 mg, Pierce#21339 mw 258.33 batelada AH41461 EDG [l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida metio-deto] Sigma #26.534-4, 1 g, NHS [N-hidroxissuccinimida] Sigma #H7377 5 gmw 115,1 Tubulação de diálise mwco 3,5k Pierce # 68035 DMSO Sigma Método As duas reações foram conduzidas utilizando-se os seguintes protocolos em duas versões, com e sem NHS: Dissolver 100 mg de hidrazida de biotina em 6 ml de DMSO em um frasco de vidro, isto pode requerer aquecido e/ou ultrassonicação. A concentração final é assim 16,7 mg/ml ou 65 mM. Pegar 1000 mg de sulfato de pentosano e dissolver em 10 ml de uma mistura 50/50 de DMSO e água, isto podendo ser realizado em um recipiente universal de plástico. Dissolver 100 mg de EDC em 1 ml de DMSO em um frasco de vidro, isto podendo necessitar aquecimento. Dissolver NHS (aproximadamente 40 - 50 mg) em 1,0 ml de água.

A reação é realizada em recipientes universais de poliestireno de fundo cônico, com uma pequena barra agitadora magnética circular (aproximadamente 10 mm diâm.) em uma base agitadora magnética e equipada com uma combinação pH elétrodo de 12 mm diâm. (ou menor). Exemplo 3 a: Reação sem NHS

Colocar 5,0 ml de solução de sulfato de pentosano no vaso de reação, adicionar 1,0 ml de solução de hidrazida de biotina, agitar bem e registrar o pH. Um valor de 7-8 pode ser esperado. Adicionar 0,2 ml de solução EDC e, enquanto continuamente agitando, registrar o pH e adicionar alíquotas de 10 μΐ de HC1 IN por uma micro-seringa de vidro e agulha, registrando o pH após cada adição. Continuar as adições de ácido, até o pH alcançar a faixa de 5-6. Isto é necessário, visto que a reação gera íons OH. A reação deve permanecer transparente e incolor totalmente. Se qualquer precipitado branco de hidrazida de biotina for formado, então a concentração de DMSO deve ser aumentada, o valor alvo sendo >/= 50%. Deixar a reação por 2 - 3 h em temperatura ambiente (ou durante a noite se isto for mais conveniente).

Registrar o pH final da mistura de reação. Adicionar um volume igual de NaCl 1M para diluir o DMSO até 25% e deslocar a hidrazida ionicamente ligada e transferir o inteiro conteúdo para um tubo de diálise com comprimento de 35 cm de diâmetro de 2,2 cm. Observe-se que a concentração de DMSO é reduzida para 25%, para evitar avaria no tubo de diálise, o tubo devendo também ser testado com água antes de utilizar, para detectar quaisquer furos de alfinete, e deve ser somente cheio com 1/3, para permitir intumescimento na diálise. Dialisar durante a noite junto a 2 1 de água e repetir isto diversas vezes, quanto mais diálise melhor, visto que o sulfato de pentosano tende a reter fortemente os íons básicos por interação iônica não-covâlente, em virtude de sua forte carga negativa. Secar por congelamento a solução dialisada e registrar o peso seco. O produto final deve ser uma torta branca firme. As produções podem variar muito, porém 50 - 60% são típicas, a maioria da perda ocorre na diálise, devido à heterogeneidade MW do sulfato de pentosano e a perda com um MW menor do que 3.500.

Exemplo 3b: Reação com NHS

Esta reação é realizada essencialmente como acima, exceto que 1,0 ML (44 mg) de NHS é adicionado ao frasco de reação, antes da adição do reagente EDC, que inicia a reação. O pH inicial pode ser na faixa de 6 - 7 e deve ser ajustado com HC1 IN até aproximadamente pH 5-6. Controle de Qualidade Após calcular a recuperação do peso seco, preparar uma solução de 10 mg/ml em água e varrer o espectro de 200 a 400 nm. Picos devem ser vistos a 260 e 280 nm, embora um ou ambos possam ser ressaltos não-resolvidos. Esta adsorção é devida a resíduos de piridina incorporados dentro da molécula durante a etapa de sulfatação. Eles podem ser usados para monitorar a concentração de sulfato de pentosano, por exemplo, durante cromatografia. O pentosano pode ser monitorado por absorção UV a 260 nm ou em concentrações mais baixas pelo ensaio de metacromasia de Azul de Toluidina.

Exemplo 4: Remoção de Proteína príon de Plasma Remoção da proteína príon camuflada 1. 100 μΐ de contas superparamagnéticas revestidas com polissulfato de pentosano, preparadas, foram adicionadas a um de duas alíquotas de plasma humano recentemente preparadas reforçadas com PrPSc. Ambas as alíquotas foram incubadas com agitação por 1 hora em temperatura ambiente. 2. As contas foram então removidas da alíquota de plasma reforçada por captura magnética. Este sobrenadante, junto com a alíquota de plasma restante, foi então testado quanto a presença da proteína príon camuflada.

Teste das alíquotas reforçadas para a proteína príon camuflada 1. As duas alíquotas de plasma foram tratadas com proteinase K, sob condições que mostrou-se digerir a proteína príon normal, porém deixar a proteína camuflada intacta. Estas condições são facilmente determinadas empiricamente. As amostras tratadas com proteinase K foram então testadas quanto à presença da proteína príon camuflada, utilizando-se o kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia® imuno-baseado.

Resultados Após realizar a imunodetecção no ensaio Platelia® baseado em placa de micropoços, o sinal de cada poço foi medido em um comprimento de onda de 450 nm, utilizando-se uma leitora ELISA. A proteína príon camuflada pôde ser prontamente detectada na amostra de soro reforçada, que não tinha sido tratada com polissulfato de pentosano. Ao contrário, a amostra tratada com polissulfato de pentosano não forneceu sinal no teste, demonstrando não havia proteína príon camuflada detectável permanecendo nesta amostra.

Discussão Este experimento demonstra que o polissulfato de pentosano pode ser usado para remover eficazmente a proteína príon camuflada das amostras de interesse.

Exemplo 5: Investigação das condições dos detergentes permitindo a ligação específica de polissulfato de pentosano na proteína príon camuflada Introdução Biotina foi conjugada com polissulfato de pentosano utilizando-se métodos químicos padrão. O polissulfato de pentosano biotinilado foi usado para revestir as superparamagnéticas derivadas de estréptavidina. As contas revestidas foram então usadas para estabelecer condições de detergente sobre as quais o polissulfato de pentosano podería ligar-se à proteína príon camuflada, porém não na proteína príon celular normal. Método Preparação de contas magnéticas revestidas com polissulfato de pentosano. 1. 600 μΐ de contas superparamagnéticas de estreptavidina (Sigma-Aldrich Company Ltd., S-2415) foram lavadas por captura magnética em três consecutivos volumes de 1 ml de TBS (Tris 50 mM, 150 NaCl mM, pH 7,5). 2. As contas foram fínalmente ressuspensas em 540 μΐ de TBS, 5% (p/v) de albumina bovina (BSA) (Sigma-Aldrich Company Ltd., A-7906) e adicionados 60 μΐ de 10 ml/ml de polissulfato de pentosano biotinilado em TBS. As contas foram incubadas em temperatura ambiente por 1 h com agitação suave, para permitir que o polissulfato de pentosano revestisse as contas. 3. Após revestimento, as contas foram lavadas por captura magnética em três volumes consecutivos de 1 ml de tampão de fosfato 50 mM pH 8,4, 5% (p/v) BSA e, finalmente, ressuspensa em 60 μΐ do mesmo tampão. As contas estavam então prontas para uso.

Preparação dos homogeneizados de cérebro 1. Amostras de 300 - 500 mg de tecido de cérebro de bovino infectado por BSE e normal foram adicionadas aos tubos de moagem contendo contas de moagem como supridas no Kit de Purificação BSE (Bio-Rad). O líquido originalmente suprido nestes tubos do kit foi aspirado e descartado antes do uso. 2. Um volume de 150 mM NaCl, que foi calculado gerar um homogeneizado de cérebro de 50% (p/v) após homogeneização, foi adicionado em cada tubo. 3. Os tubos foram homogeneizados por 45 segundos em ajuste de velocidade de 6,5 em um ribolizador (comprado da Bio-Rad). 4. Os homogeneizados foram diluídos 5-vezes com 5% (p/v) BSÁ, tampão de fosfato 50 mM pH 8,4. 5. Alíquotas com volume de 45 μΐ de cada homogeneizado foram colocadas em tubos separados. 6. 5 μΐ de 20% (p/v) SDS (dodecil sulfato de sódio) (Sigma-Aldrich Company Ltd., L-5750) foram adicionados em cada tubo e misturados completamente. 7. 450 μΐ de 5% (p/v) BS A, tampão de fosfato 50 mM, pH 8,4, foram então adicionados a cada alíquota e misturados. 8. 50 μΐ de N-lauroilsarcosina (Sigma-Aldrich Company Ltd., L-9150), em várias concentrações de detergente, foram então adicionados a várias alíquotas e misturados. Um conjunto (um cérebro infectado por BSE e um não infectado) não tinha N-lauroilsarcosina adicionada.

Captura da proteína príon 1. 10 μΐ de contas superparamagnéticas revestidas com polissulfato de pentosano, preparadas, foram adicionadas a cada homogeneizado de cérebro diluído e incubados com agitação por 1 h em temperatura ambiente. 2. Cada reação foi então lavada por captura magnética com volumes 3X 200 μΐ de TBS.

Eluicão da proteína príon e imunodeteccão 1. As contas de cada reação foram ressuspensas em 10 μΐ de Cl (supridos com o kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia®). 2. 5 μΐ de 0,2% (p/v) SDS foram adicionados a cada suspensão de contas e misturados. 3. 5 μΐ de tiocianato de guanidina 1M (Sigma-Aldrich Company Ltd., G-9277) foram adicionados a cada suspensão de conta e misturados. 4. A reação foi aquecida a 100°C por 5 minutos. 5. 100 μΐ de R6 (suprido com o kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia®) foram adicionados e misturados. 6. 100 μΐ de cada eluado foram então usados no kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia®, utilizando-se o protocolo e reagentes supridos com este kit. Resumidamente, este kit envolve imunocaptura de proteína príon normal e/ou camuflada e imunodetecção com um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano silvestre Resultados Após realizar a imunodetecção no ensaio Platelia® baseado em placa de microtitulação, o sinal de cada poço foi medido em um comprimento de onda de 450 nm, utilizando-se uma leitora ELISA.

Em todas as concentrações de N-lauroilsarcosina havia uma discriminação entre Cérebro infectado por BSE e Cérebro normal. 0,2% de N-lauroilsarcosina foi a melhor concentração de detergente e permitiu que o polissulfato de pentosano se ligasse à e capturasse a proteína príon camuflada, sem: ligação ou captura da proteína príon normal. Na ausência de N-lauroilsarcosina, mesmo embora o detergente SDS estivesse presente, não havia discriminação de ligação de polissulfato de pentosano à proteína príon camuflada e príon normal. Sob estas condições, o polissulfato de pentosano ligoü tanto a proteína príon normal como camuflada.

Discussão 1. A especificidade de ligação do polissulfato de pentosano à proteína príon camuflada, sob estas condições de teste específicas, é depéndente da presença de N-lauroilsarcosina ou detergentes similares. Sem este detergente, o polissulfato de pentosano ligou-se tanto à proteína príon normal como camuflada.

Exemplo 6: Investigação das condições de t)H permitindo a ligação específica de polissulfato de pentosano à proteína príon camuflada Introdução Biotina foi conjugada com polissulfato de pentosano utilizando-se métodos químicos padrão. O polissulfato de pentosano biotinilado foi usado para revestir as superparamagnéticas derivadas de estreptavidina. As contas revestidas foram então usadas para estabelecer condições de pH sob as quais o polissulfato de pentosano pudesse ligar-se à proteína príon camuflada, porém não à proteína celular príon normal. Método Preparação de contas magnéticas revestidas com polissulfato de pentosano 1. Alíquotas de 1 ml de contas superparamagnéticas de estreptavidina (Sigma-Aldrich Company Ltd., S-2415) foram lavadas por captura magnética em três volumes consecutivos de 1 ml de TBS (Tris 50mM, NaCl 150 mM, pH 7,5). 2. Cada alíquota de contas foram finalmente ressuspensas em 1 ml de TBS e 5% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) (Sigma-Aldrich Company Ltd., A-7906) e 100 μΐ de 10 mg/ml de polissulfato de pentosano biotinilado em TBS adicionados. As contas foram incubadas em temperatura ambiente por 1 hora com agitação suave, para permitir que polissulfato de pentosano revestisse as contas. 3. Após revestimento, cada alíquota de contas foi lavada por captura magnética em três volumes consecutivos de 1 ml de 5% (p/v) BSA, tampão Tris 50 mM, pH 8,4. 4. Alíquotas de contas foram então ressuspensas em tampões de pH 5,7, 7,5, 8,4 e 9,6, todos contendo 5% (p/v) BSA.

Preparação dos homogeneizados de cérebro em tampões de vários pH 1. 300 - 500 mg de tecido de cérebro bovino infectado por BSE e normal foram adicionados a um tubo de moagem contendo contas de moagem, conforme supridas no Kit de Purificação BSE (Rio-Rad). O líquido originalmente suprido nestes tubos do kit foi aspirado e descartado antes do uso. 2. Um volume de NaCl 150 mM, que foi calculado gerar um homogeneizado de cérebro de 50% (p/v) após homogeneização, foi adicionado em cada tubo. 3. Os tubos foram homogeneizados por 45 segundos em ajuste de velocidade de 6,5 em um ribolizador (comprado da Bio-Rad). 4. 50 μΐ de cada homogeneizado foram diluídos 5-vezes em tampões de pH 5,7, 7,5, 8,4 e 9,6, todos contendo 5% (p/v) de BSA. 5. Volumes de 45 μΐ de cada homogeneizado diluído foram colocados em tubos separados. 6. 5 μΐ de 20% (p/v) SDS (dodecil sulfato de sódio) (Sigma-Aldrich Company Ltd., L-5750) foram adicionados a cada tubo e misturados completamente. 7. 450 μΐ de tampão do mesmo pH, como o tampão de diluição inicial, contendo 5% (p/v) de albumina bovina, foram então adicionados em cada e misturados. 8. 50 μΐ de 20% (p/v) de N-lauroilsarcosina (Sigma-Aldrich Company Ltd., L-9150) foram então adicionados e misturados.

Captura de contas dos homogeneizados de cérebro 1. 10 μΐ de contas superparamagnéticas revestidas com polissulfato de pentosano, preparados, em tampão do correspondente pH, foram adicionados a cada homogeneizado de cérebro diluído e incubados com agitáção por 1 h em temperatura ambiente. 2. Cada reação foi então lavada por captura magnética com voliimes de 3x 100 μΐ de TBS.

Eluição da proteína príon camuflada e imunodetecção 1. As contas de cada reação foram ressuspensas em 10 μΐ de Cl (supridos com o kit de detecção de BSE o-Rad Platelia®). 2. 5 μΐ de 0,2% (p/v) SDS foram adicionados a cada suspensão de contas e misturados. 3. 5 μΐ de tiocianato de guanidina 1M (Sigma-Aldrich Company Ltd., G-9277) foram adicionados a cada suspensão de conta e misturados. 4. A reação foi aquecida a 100°C por 5 minutos. 5. 100 μΐ de R6 (suprido com o kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia®) foram então adicionados e misturados. 6. 100 μΐ de cada eluado foram então usados no kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia®, empregando-se o protocolo e reagentes supridos com este kit. Resumidamente, este kit envolve imunocaptura de proteína príon normal e/ou camuflada e imunodetecção com um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano.

Resultados Após realizar a imunodetecção no ensaio Platelia® baseado em placa de microtitulação, o sinal de cada poço foi medido em um comprimento de onda de 450 nm, utilizando-se uma leitora ELISA.

Em um pH de 7,5 e mais baixo, as contas revestidas com polissulfato de pentosano puderam ligar-se tanto a proteína príon normal como camuflada. Em pHs de 9,6 e mais elevados, as contas revestidas com polissulfato de pentosano não puderam ligar-se a ambas as formas da proteína príon. Em pH 8,4, as contas revestidas com polissulfato de pentosano capturaram a proteína príon camuflada mas não capturaram a proteína príon normal. Neste pH o polissulfato de pentosano mostra especificidade para ligação à proteína príon camuflada.

Discussão A especificidade de ligação, sob as condições de teste, do polissulfato de pentosano à proteína príon camuflada é dependente do pH. Em pH 8,4, o polissulfato de pentosano liga-se à proteína príon camuflada, mas não pode ligar-se à proteína príon normal. Em pHs de 7,5 e inferiores, tanto a príon normal como camuflado são ligados, enquanto que em pHs de 9,6 e superiores, não há ligação da proteína príon camuflada ou normal. Portanto, para ligação específica do polissulfato de pentosano à proteína príon camuflada sob estas condições, um pH próximo a 8,4 deve ser usado.

Exemplo 7: Demonstração de captura específica de PrPres (PrPScf a um ligando nolianiônico de alta densidade de carga, empregando-se poliânions de mais baixa densidade de carga, competentes, nara seletivamente inibir a ligação de PrPc Fundamentos PrP pode ser ligado a poliânions imobilizados. Na ausência de poliânions competentes no tampão de captura, tanto PrPres como PrPc são capturados. Especificidade para captura de PrPres pode ser conseguida incluindo-se no tampão de captura um poliânion de mais baixa densidade de carga do que aquele do poliânion de captura. Neste exemplo, sulfato de dextrano é usado como o poliânion de captura de alta densidade de carga e N-lauròil sarcosina (que forma micelas detergentes multimoleculares) e polissulfato de pentosano ou fucoidan, são usados como os poliânions competentes de densidade de carga mais baixa. Método 1. Poços de microtitulação Maxisorp foram revestidos com sulfato de dextrano (500.000 mwt), seguindo-se procedimentos padrão. 2. 100 μΐ de homogeneizado de cérebro, contendo 1 mg de cérebro, 50 mM Tris pH 8,3, 1% (p/v) BSA, 1% (v/v) Triton X-100, foram adicionados aos poços revestidos. Em alguns casos este tampão de captura também continha 1% (p/v) de N-lauroil sarcosina, fucoidan, sulfato de dextrano ou várias concentrações de polissulfato de pentosano. 3. Após incubação por 2 horas para permitir captura de proteína príon, os poços foram lavados 3x com 50 mM Tris pH 8,3, 1% (p/v) BSA, 1% (v/v) Triton X-100. 4. Os poços foram então lavados x3 com PBS. 5. 100 μΐ de tiocianato de guanidínio 5M foram adicionados a cada poço e incubados 5 min a 4°C. 6. Os poços foram lavados 3x com PBS e em seguida proteína príon capturada detectada com o conjugado de proteína anti-príon do kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia®, observando-se o protocolo de kit. 7. Sinal desenvolvido foi medido em uma leitora ELISA a OD450.

Resultados Discussão Na ausência de poliânion competente no tampão de captura, o sinal total é mais baixo e não há diferença de sinal entre cérebro infectado ou normal, isto é, não há captura específica de PrPres. O sinal do cérebro infectado, entretanto, é aumentado incluindo-se um poliânion competente no tampão de captura e o sinal do correspondente cérebro normal ou não infectado é suprimido. Neste exemplo, a melhor diferenciação entre cérebro infectado e normal é conseguida pelo uso de 1% (p/v) de N-lauroil sarcosina no tampão de captura. Além disso, uma diferenciação entre cérebro infectado e normal pode ser conseguida com fucoidan ou polissulfato de pentosano. Com polissulfato de pentosano a diferenciação pode ser aumentada aumentando-se a concentração do poliânion competente, polissulfato de pentosano, no tampão de captura de 0,1 a 1 mg/ml. Como controle, se sulfato de dextrano for incluído no tampão de captura, o sinal, como esperado, é reduzido para segundo plano, quando ele compete para o e inibe a ligação do PrP ao sulfato de dextrano imobilizado.

Exemplo 8: Demonstração de captura específica de PrPres em uma superfície revestida por poliânion de alta densidade de carga Fundamentos Neste experimento foi demonstrado que PrPres podería ser especificamente capturado em uma superfície polianiônica. Neste exemplo, a superfície foi provida por poliestireno de anidrido maleico derivado. Poços polisorp e maxisorp não carregados foram usados como controle. Em outros experimentos foi demonstrado que estas superfícies não carregadas podem ser derivadas com sulfato de dextrano polianiônico e podem então ligar-se PrPres. Método 1. Poços de microplacas de poliestireno ativadas por anidrido maleico (Perbio Science UK Ltd., Cheshire) foram derivadas com TBS 5% (p/v) BSA por 60 min em temperatura ambiente. Isto gera uma superfície carregada com carboxila sobre o plástico (vide literatura do produto). Como controles não-carregados, poços polisorp e maxisorp (Nunc) foram também revestidos com um ligando de sulfato de dextrano polianiônico, empregando-se o procedimento descrito no Exemplo 9. 2. 100 μΐ de homogeneizado de cérebro, contendo 1 mg de cérebro infectado ou não infectado em 50 mM Tris pH 8,3, 1% (p/v) BSA, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (p/v) de N-lauroil sarcosina, fora m adicionados aos poços. 3. Após incubação por 2 horas para permitir captura de príons, os poços foram lavados x3 com 50 mM Tris pH 8,3, 1% (p/v) N-lauroil sarcosina. 4. Os poços foram então lavados x3 com PBS. 5. 100 μΐ de tiocianato de guanidínio 5M foram adicionados a cada poço e incubados 5 min a 4°C. 6. Os poços foram lavados 3x com PBS e em seguida príon capturado detectado com o conjugado anti-príon do kit de detecção de BSE Bio-Rad Platelia, seguindo-se o protocolo do kit. 7. O sinal desenvolvido foi medido em uma leitora ELISA a OD450.

Resultados Discussão A superfície de poliestireno aniônico, sob as condições usadas neste experimento, especificamente capturou PrPres. O plástico não carregado não tinha este efeito, exceto se tivesse sido revestido com um ligando polianiônico.

Exemplo 9: Estudo dos efeitos da diluição da amostra de cérebro positivo em amostra negativa.

Material Amostra Positiva: Uma suspensão de 25% de homogeneizado de cérebro, sabida ser positiva para PrPSc.

Amostra Negativa: Uma suspensão de 25% de homogeneizado de cérebro, sabida ser negativa para PrPSc.

Preparação Placas maxisorb foram revestidas de acordo com o seguinte protocolo de revestimento. 1 mg de Polibrene foi revestido sobre as placas de tampão de carbonato a pH 7,4 e deixado durante a noite e lavado 3 vezes com PBS. As placas foram então revestidas com 1 mg de sulfato de dextrano em PBS. Após 6 horas, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS, em seguida bloqueadas com 5% BSA pela adição de 400 μΐ de solução de 5% BSA e deixando-se por 30 minutos. As placas foram então lavadas 3 vezes com PBS e permitidas secar.

Preparação da amostra Preparação de diluição da amostra em cérebro negativo Preparação de diluição de amostra em água______________________________ Preparação da amostra antes da realização do ensaio 40 μΐ de amostra foram misturados com 60 μΐ de H20 e 25 μΐ \ de tampão de captura, 250 mM Tris pH 8,4, 5% BSA, 5% Triton X-100, 5% sarcOsila, 1,25 mg/ml tripsina.

Os ensaios foram realizados de acordo com o seguinte Protocolo de Ensaio: 1. Adicionar 100 μΐ de amostra para disseminar em placa e incubar em TA por 120 minutos. 2. Lavar X 3 com 50 mM Tris pH 8,4 +1% sarcosila e X3 com PBS. 3. Adicionar 100 μΐ de 4MGuSCN em 20% PEG e incubar por 10 minutos a 2 - 8°C. 4. Lavar X3 com PBS. 5. Adicionar 100 μΐ de conjugado de anticorpo de enzima Bio-Rad Platelia® e incubar a 2 - 8°C por 60 minutos. 6. Lavar X 5 com lavagem Bio-Rad Platelia. 7. Adicionar 100 μΐ de substrato Bio-Rad Platelia® e incubar por 30 minutos no escuro. 8. Adicionar 100 μΐ de solução de parada Bio-Rad Platelia® e ler. Disposição da Placa Os resultados obtidos foram como segue: Diluição de 10 mg de homogeneizado de cérebro em cérebro -ve Diluição de 10 mg de homogeneizado de cérebro em H20 Sumário Estes resultados são apresentados graficamente na Figura 1, que mostra as curvas de diluição para diluição de cérebro positivo com respectivamente água e cérebro negativo. As duas curvas são essencialmente iguais, demonstrando que a presença de material de cérebro negativo não interfere com o ensaio.

Exemplo 10: Captura de proteína tau agregada em cérebro de Alzheimer e controles normais de idade igualada Demonstrou-se que, sob condições definidas, vários agentes de captura seletivos são específicos para a captura de proteína príon patogênica agregada, de modo que o príon não agregado normal não é capturado. A proteína príon agregada tem uma estrutura de folha beta-pregueada extensa, enquanto o príon normal é na maior parte de estrutura de hélice alfa. Este exemplo demonstra que outras proteínas de folha beta-pregueada agregadas, tais como agregados tau, que são encontrados na Doença de Alzheimer, podem similarmente ser seletivamente capturados. Método 1. 25% (p/v) de homogeneizados da Alzheimer e cérebros de controle igualados em idade foram preparados em água destilada. 2. 4 μΐ de cérebro foram compostos até 100 μΐ em tampão de Captura (50 mM Tris pH 8,4, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (p/v) N-lauroil sarcOsina, 1% (p/v) BS A . 3. 25 pL de cérebro foram também compostos até 100 μΐ em tampão de Captura contendo 25 pg de Tripsina. 4. Alíquotas de 100 μΐ em duplicata de cérebro, preparadas como nas etapas 2 e 3 acima, foram adicionadas a poços de microtitulação revestidos com sulfato de dextrano e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. 5. Os poços foram então lavados três vezes com 50 mM Tris pH 8,4, 1 % (p/v) de N-lauroil sarcosina. 6. As amostras foram incubadas com um anticorpo monoclonal anti-tau em PBS 0,1 % (v/v) Tween 20. 7. Após 1 h em temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com PBS 0,1% (v/v) Tween 20. 8. Anticorpo primário imobilizado foi detectado com um conjugado de peroxidase de rábano silvestre IgG anti-camundongo, observando-se procedimentos padrão.

Resultados Resultados com o anticorpo anti-tau Discussão Sabe-se que os cérebros da maioria dos indivíduos idosos contêm tau agregado, porém na Doença de Alzheimer há mais destes agregados do que nos controles igualados em idade. Aqui, o agente de captura seletiva está capturando estes agregados. Neste exemplo, a digestão de tripsina diminui a ligação da proteína e reduz o sinal, porém, sob estas condições, não a reduz para segundo-plano. A relação de sinal após tratamento com tripsina para o sinal sem tratamento foi muito mais elevada nos cérebros de Alzheimer do que nos controles. Isto sugere que há mais agregados resistentes à protease da proteína tau no cérebro de Doença de Alzheimer, em comparação com os controles igualados em idade.

Exemplo 11: Efeito da titulação da tripsina sobre as amostras positivas PrPSc Método Placa revestida com sulfato de dextrano: 1 mg de brometo de hexadimetrina (Polibrene) (100 μΐ de 10 mg/ml em tampão de carbonato pH 7,4) foi revestido sobre placas Maxisorb e deixadas durante a noite a TA.

Cada placa foi então lavada 3 vezes com PBS e revestida com 1 mg de sulfato de dextrano (MW 500000) (10 mg/ml de matéria prima em tampão Tris pH 8,4) e deixada em TA por 4 h.

As placas foram então lavadas 3 vezes com PBS e então bloqueadas com 300 μΐ de 5% solução BSA em TBS e deixadas em TA por 30 minutos.

As placas foram então lavadas 3 vezes com PBS.

Tampão de Captura 250 mM de tampão Tris a pH 8,4, contendo 5% BSA, 5% Sarcosila, 5% Triton Amostra Cérebros fraca e fortemente positivos BI63 e SV10 (25% homogeneizado) foram tratados como segue, para prover amostras para ensaio. 25 μΐ de homogeneizado de cérebro + 25 μΐ de tampão de captura, 250 mM Tris pH 8,4, 5% BSA, 5% Triton X-100, 5% sarcosila, + 65 μΐ de H20. A esta amostra foram adicionados 10 μΐ de várias concentrações de Tripsina.

Tampão de Lavagem 50 mM Tris pH 8,4+1% sarcosila Método Protocolo de Ensaio 1. Adicionar 100 μΐ de amostra para disseminar em placa e incubar em TA por 120 minutos. 2. Lavar X 3 com 50 mM Tris pH 8,4 +1% sarcosila e X3 com PBS. 3. Adicionar 100 μΐ de 4MGuSCN (em 20% PEG) e incubar por 10 minutos a 2 - 8°C. 4. Lavar X3 com PBS. 5. Adicionar 100 μΐ de conjugado de anticorpo de enzima Bio-Rad Platelia® e incubar a 2 - 8°C por 60 minutos. 6. Lavar X 5 com lavagem Bio-Rad Platelia®. 7. Adicionar 100 μΐ de substrato Bio-Rad Platelia® e incubar por 30 minutos no escuro. 8. Adicionar 100 μΐ de solução de parada Bio-Rad Platelia® e ler.

Resultados 5 mg de cérebro Positivo Bi63 5 mg de cérebro Positivo SV10 Conclusão A presença de Tripsina parece ter aumentado o sinal. Também parece que uma larga faixa de concentração de Tripsina pode ser usada sem um efeito prejudicial sobre o ensaio.

Exemplo 12: Demonstração da ligação específica de PrPSc por nolicátions Método Este exemplo demonstra o uso de vários policátions para captura específica de PrPSc. Os ligandos foram passivamente revestidos sobre microplacas de poliestireno ou ativamente revestidos (isto é, ligados), onde apropriado, a placas de anidrido maleico.

Imobilizacão de agente de ligação seletiva Todos os agentes de ligação seletiva foram imobilizados durante a noite a 16 - 25°C em tampão de carbonato 50 mM pH 9,6 em uma concentração de 10 pg/ml. Após imobilização, os poços foram lavados x3 com PBS e então bloqueados com 5% (p/v) BSA em PBS por 30 min. Após bloqueio, os poços foram lavados x2 com PBS antes do uso. O estouro de estrela dendrímero PAMA, poli L-lisina e polietilenoimina, foi revestido sobre ambas microplacas Maxisorp e de anidrido maleico, enquanto que o polibrene e pDADMAC foram revestidos apenas sobre as placas Maxisorp.

Captura de PrPSc 1. Cérebro bovino infectado por BSE e não infectado foram homogeneizados em água destilada, observando-se protocolos comercialmente definidos. 2. 0,5 mg de cérebro homogeneizado foram capturados em poços revestidos com ligando em um volume total de 100 μΐ 50 mM Tris pH 8,3, 1% (p/v) de N-lauroil sarcosina, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (p/v) BSA, 0,5 mg/ml tripsina (pâncreas de suíno). 3. Após captura por 2 horas a 18 - 25°C, os poços foram lavados x3 com 50 mM Tris pH 8,3, 1% (p/v) N-lauroil sarcosina. 4. Os poços foram então lavados x3 com PBS e incubados por 10 min com 100 μΐ de tiocianato de guanidina 4M, 20% PEG 8000 a 4 - 8°C. 5. Os poços foram lavados x3 com PBS e então incubados com um conjugado de peroxidase de rábano silvestre anticorpo monoclonal anti-príon. 6. Após 60 min, os poços foram lavados x5 com PBS 0,1% (v/v) Tween20 e 100 μΐ substrato TMB adicionados. 7. Após 30 min, OD450 de cada reação foi medido e registrado (vide tabela abaixo).

Resultados * Aldrich 40903-0-mw 400.000 - 500.000 Discussão Os policátions estouro estrela de dendrímero PAMA funcionaram bem como ligandos específicos de PrP , quando passivamente revestidos em microplacas de poliestireno. O PDADMAC funciona melhor nesta série de agentes de ligação. A polietilenoimina funciona em algum grau quando imobilizada sobre microplacas de anidrido através de seus grupos amino.

Este experimento demonstra que uma variedade de poli cátions pode ser usada para especificamente capturar PrPSc de cérebro infectado sob as dadas condições de Tampão de Captura usadas. Estes agentes podem ser passiva ou ativamente imobilizados em superfícies de poliestireno. Outros experimentos demonstraram que sinal máximo de 20 mg de cérebro positivo pode ser obtido na presença de 1% (p/v) de N-lauroil sarcosina no Tampão de Captura; sem N-lauroil sarcosina o sinal é reduzido. Isto ilustra que os agentes de captura têm um melhor desempenho sob condições definidas de tampão. Exemplo 13: Captura de beta amilóide aeregado e tau em cérebro de Alzheimer e controles normais igualados em idade por agente de ligação policatiônico Fundamentos pDADMAC, sob condições definidas, foi mostrado ser específico para a captura de proteína príon patogênica agregada; príon não-agregado normal não é capturado. A proteína príon agregada tem uma extensa estrutura de folha beta-pregueada, enquanto que o príon normal é na maior parte de estrutura de hélice alfa. Postula-se que o agente de ligação pode reconhecer outras proteínas de folha beta-pregueada agregadas, tais como beta-amilóide e agregados tau, que são encontrados na Doença de Alzheimer. Os experimentos abaixo foram realizados a fim de investigar esta hipótese. Método 1. 25% (p/v) de homogeneizados de Alzheimer e cérebros de controle igualados em idade foram preparados em água destilada. 2. 80 μΐ de homogeneizado de cérebro foram compostos a 100 μΐ em tampão de Captura (50mM Tris pH 8,4, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (p/v) N-lauroil sarcosina, 1% (p/v) BS A) e adicionados em micropoços revestidos policatiônicos (formados revestindo-se os poços com poli (dialildimetil amônio cloreto) (pDADMAC), (Aldrich Chemical Company Inc., catálogo número 40.903-0). 3. Após incubação por 2 horas em temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com 50 mM Tris pH 8,4, 1% (p/v) N-lauroil sarcosina e então incubados com um anticorpo monoclonal anti-tau em PBS 0,1% (v/v) Tween20. 4. Após 1 hora em temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com PBS 0,1% (v/v) Tween20. 5. Anticorpo primário imobilizado foi detectado com um conjugado de peroxidase de rábano silvestre IgG anti-camundongo, observando-se procedimentos padrão.

Resultados Discussão O agente de ligação policatiônico possibilita a captura dos agregados tau. Quando o tau capturado é detectado com o anticorpo anti-tau, os cérebros de Doença de Alzheimer todos fornecem um alto sinal positivo, enquanto que os cérebros de controle negativo fornecem um baixo sinal negativo. Em conclusão, a captura com um policátion, sobre as condições especificadas, pode possibilitar diferenciação dos cérebros com Doença de Alzheimer daqueles cérebros sem a doença.

Exemplo 14: Efeito de diferentes nroteases e DNase sobre a inibição de matriz de captura pDADMAC de PrPSc Fundamento O efeito das diferentes proteases sobre a eficácia de captura da PrPSc em placas revestidas por policátion (formadas por revestimento dos poços com poli (dialildimetil amônio cloreto) (pDADMAC), (Aldrich Chemical Company Inc., número do catálogo 40.903-0)) foi investigado. Método 1. 80 μΐ de homogeneizado de cérebro foram preparados até 100 μΐ por adição de 20 μΐ de tampão de Captura (250 mM Tris pH 8,3, 5% (v/v) Triton X-100, 5% (p/v) N-lauroil sarcosina, 5% (p/v) BS A), contendo diferentes proteases e/ou DNase. 2. Os homogeneizados foram então adicionados a micropoços revestidos-policatiônico. 3. Após incubação por 2 h em temperatura ambiente, os poços foram lavados seis vezes com PBS. 4. 100 μΐ de tiocianato de Guanidina 4M, 20% (p/v) PEG foram adicionados em cada poço. 5. Após incubação por 10 minutos em temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com PBS. 6. 100 μΐ de conjugado de peroxidase de rábano silvestre de proteína anti-príon (diluído 1:1500 em PBS 0,1% (v/v) Tween 20 e 5% (p/v) BSA) foram adicionados. 7. Após 1 hora em temperatura ambiente, os poços foram lavados cinco vezes com PBS 0,1% (v/v) Tween 20. 8. Conjugado imobilizado foi detectado com solução TMB, observando-se protocolos padrão.

Resultados Avaliação dos efeitos da Quimotrinsina. Trinsina. DNase e Proteinase K em Tampão de Captura____________________________________________ Titulação de concentrações de Tripsina e Ouimotripsina em tampão de Captura Discussão Foi demonstrado que o ligando policatiônico, sob certas condições, é específico para ligação a PrPSc. Entretanto, o sinal pode ser reduzido por efeitos de matriz derivados de constituintes do homogeneizado de cérebro, que podem interferir com a ligação e reduzir o sinal. Este efeito de matriz pode ser reduzido e o sinal do cérebro infectado aumentado pelo uso de proteases. Este estudo mostra que a tripsina, quimotripsina e proteinase K são eficazes na remoção da inibição de matriz; a pronase (nas concentrações investigadas) é menos eficaz. A tripsina, em uma concentração de 6,25 - 1,15 mg/ml, é igualmente eficaz, enquanto que a quimotripsina é mais eficaz quando a concentração é aumentada. A DNase tem um efeito demonstrável, porém menor, na remoção da inibição de matriz.

Exemplo 15: Efeito do pH e do sal sobre a captura pDADMAC de Proteínas príon Fundamentos Os efeitos do pH e concentração de sal sobre a eficácia de captura de PrPSc em placas revestidas com policátion (formadas revestindo-se os poços com poli (dialildimetil amônio cloreto) (pDADMAC), (Aldrich Chemical Company Inc., catálogo número 40.903-0) foram investigados. Método 1. 80 μΐ de homogeneizado de cérebro foram preparados até 100 μΐ por adição de 20 μΐ de tampão de Captura (250 mM Tris, vide Tabela para pH, 5% (v/v) Triton X-100, 5% (p/v) N-lauroil sarcosina, 5% (p/v) BSA) e 6,25 mg/ml de Tripsina), contendo várias concentrações de sal e ajustados a vários pHs foram investigados. 2. Os homogeneizados foram então adicionados a micropoços revestidos-policatiônico. 3. Após incubação por 2 h em temperatura ambiente, os poços foram lavados seis vezes com PBS. 4. 100 μΐ de tiocianato de Guanidina 4M, 20% (p/v) PEG foram adicionados em cada poço. 5. Após incubação por 10 minutos em temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com PBS. 6. 100 μΐ de conjugado de peroxidase de rábano silvestre de proteína anti-príon (diluído 1:1500 em PBS 0,1% (v/v) Tween 20 e 5% (p/v) BS A) foram adicionados. 7. Após 1 hora em temperatura ambiente, os poços foram lavados cinco vezes com PBS 0,1% (v/v) Tween 20. 8. Conjugado imobilizado foi detectado com solução TMB, observando-se protocolos padrão e OD450 da reações medidas.

Resultados Efeito do pH

Efeito do Sal ______________________________________________ Discussão Quando o pH do tampão de captura é diminuído, o sinal do cérebro não-infectado aumenta, porém o sinal do cérebro infectado diminui. Em pHs maiores do que 8,0, a relação ótima de sinal positivo para negativo é obtida.

Quando a concentração de sal do tampão de Captura é aumentada, o sinal do cérebro infectado diminui progressivamente. Isto indica que uma baixa concentração de sal ou nenhum sal é a condição ótima para a captura de PrPSc.

Exemplo 16: Efeito de concentrações variáveis de N-lauroil sarcosina e protease sobre captura de pDADMAC de PrPSc Fundamentos O efeito de diferentes concentrações de N-lauroil sarcosina, na presença ou ausência de tripsina, na eficácia de captura de PrPSc em placas revestidas com policátions (formadas por revestimento dos poços com poli (dialildimetil amônio cloreto) (pDADMAC), Aldrich Chemical Company Inc., catálogo número 40.903-0)), foi investigado. Método 1. 80 μΐ de homogeneizado de cérebro infectado foram preparados até 100 μΐ, pela adição de 20 μΐ de tampão de captura (250 mM Tris pH 8,3, 5% (v/v) Triton X-100, 5% (p/v) BSA), contendo diferentes concentrações de protease e N-lauroil sarcosina. 2. Os homogeneizados foram então adicionados a micropoços revestidos por policatiônico. 3. Após incubação por 2 horas em temperatura ambiente, os poços foram lavados seis vezes com PBS. 4. 100 μΕ de tiocianato de guanidina, 20% (p/v) PEG foram adicionados em cada poço. 5. Após incubação por 10 minutos em temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com PBS. 6. 100 μΐ de conjugado de peroxidase de rábano silvestre de proteína anti-príon (diluído 1:1500 em PBS 0,1% (v/v) Tween 20 e 5% (p/v) BS A) foram adicionados. 7. Após 1 h em temperatura ambiente, os poços foram lavados cinco vezes com PBS 0,1% (v/v) Tween 20. 8. Conjugado imobilizado foi detectado com solução TMB, observando-se protocolos padrão.

Resultados Discussão Na ausência de N-lauroil sarcosina não há sinal do cérebro infectado com baixas concentrações de tripsina. Em concentrações mais elevadas de tripsina, entretanto, algum sinal é restaurado na ausência de N-lauroil sarcosina.

Embora a invenção tenha sido descrita com particular referência a suas versões preferidas, será observado que muitas modificações e variações dela são possíveis dentro do escopo geral da invenção. Qualquer variação da invenção, como explicitamente reivindicada, que opere da mesma maneira para produzir o mesmo resultado, é para situar-se dentro da proteção conferida pelo pedido.

Neste relatório, a menos que expressamente indicado de outro modo, a palavra "ou" é usada no sentido de um operador que declara um valor verdadeiro quando uma ou outra ou ambas das condições citadas são satisfeitas, o oposto a "exclusivo ou" do operador que requer que somente uma das condições seja satisfeita. A palavra compreendendo" é usada no sentido de "incluindo" em vez de significando "consistindo de".

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Processo para a ligação seletiva de uma forma anormal agregativa de uma proteína, na presença da forma normal não agregativa da proteína, caracterizado pelo fato de compreender contatar, sob condições de ligação seletiva, um material contendo ditas formas tanto anormal como normal com um agente de ligação que é poliglicosídeo poliiônico, poliamina ou polietilenoimina, tendo uma avidez de ligação para dita forma agregativa de dita proteína, quando presente na amostra, em que ditas condições de ligação seletiva incluem a presença de um agente de competição em solução, agente de competição esse tendo grupos iônicos tendo uma menor avidez de ligação para a forma anormal da proteína do que o material poliiônico e é selecionada de N-lauroil sarcosina, polissulfato de pentosano e fucoidano, e em que ditas condições de ligação seletiva incluem um de pH de 5,6 a 9.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o agente de ligação ser resistente a protease.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de uma protease estar presente durante dita ligação ou de dita proteína ser exposta à ação de uma protease após ser ligada.

4. Processo de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de o poliglicosídeo polianiônico ser um poliglicosídeo polissulfonado.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o poliglicosídeo polianiônico ser um derivativo de pentosano polianiônico ou derivativo de dextrano.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de o poliglicosídeo polissulfonado ser polissulfato de pentosano (PPS) ou sulfato de dextrano.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de dito material poliiônico ser brometo de hexadimetrina, dendrímero de PAMAM, poli L-lisina, pDADMAC ou polietilenoimina.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de o agente de competição ser N-lauroil sarcosina.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de o pH ser de 8 a 9.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de o pH ser de 8,2 a 8,6.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de dito agente de ligação, após ligação a dita forma anormal agregada da proteína, ser capturado com um agente de captura imobilizado.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de dito agente de captura ser uma lecitina ou um anticorpo reativo com dito agente de ligação.

13. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de dito agente de ligação ser provido com uma porção marcadora seletivamente ligável e dito agente de captura ligar-se a dita porção marcadora.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de o agente de ligação ser imobilizado em um meio sólido, antes da exposição à dita forma anormal da proteína.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de o meio ser um substrato tendo dito agente de ligação revestido sobre ele.

16. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de o agente de ligação ser provido com uma porção marcadora seletivamente ligável e ser imobilizado em dito meio sólido via dita porção marcadora.

17. Processo de acordo com a reivindicação 13 ou 16, caracterizado pelo fato de dita porção marcadora ligável ser biotina, fluoresceína, dinitrofenol, digoxirenina, um ácido nucleico ou seqüência análoga a ácido nucleico ou (His)6.

18. Processo ou ensaio quanto à presença de uma forma agregativa anormal de uma proteína de uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender a ligação de dita proteína de forma anormal, como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes, seguida pela determinação da existência ou grau de ligação da proteína ao agente de ligação.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de dita ligação ser qualitativa ou quantitativamente determinada pela condução de um imunoensaio para a forma agregativa da proteína.

20. Processo de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de a ligação da forma agregativa anormal da proteína ser conduzida seletivamente na presença da forma não-agregativa normal da proteína e a proteína de forma agregada ligada ser então separada da proteína de forma normal não-ligada e, em seguida, dita determinação da existência ou grau de dita ligação ser realizada.

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de dita forma anormal de uma proteína ser PrPSc e dita forma normal ser PrP0.

22. Processo para separar PrP^ de PrP°, caracterizado pelo fato de compreender seletivamente ligar PrPSc a um agente de ligação na presença de uma amida de aminoácido de um ácido graxo, em que o agente de ligação é um material poliiônico, uma poliamina ou uma polietilenoimina tendo avidez de ligação por PrPSc, em que a amida de aminoácido de um ácido graxo ser N-lauroil sarcosina e em que o processo é conduzido a uma faixa de pH de 5,6 a 9.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de ser conduzido em um pH de 8 a 9.