BRPI0309836B1 - método para a produção de etanol pela fermentação de uma l-arabinose - Google Patents

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Abstract

"levedura modificada que consome de l-arabinose". a presente invenção refere-se a um método para produzir uma cepa da levedura para a produção de etanol, onde uma cepa de levedura é modificada pela introdução e expressão de um gene araa (l-arabinose isomerase), um gene arab (l-ribuloquinase) e um gene arad (l-ribulose-5-p 4-epimerase), e apresenta mutações adicionais em seu genoma ou super-expressar um gene tal1 (transaldolase), por esta razão a possibilitando de consumir l-arabinose, como única fonte de carbono, e produzir etanol, bem como a um método para produzir etanol que utiliza tal cepa modificada.

Description

Campo Técnico
A presente invenção refere-se a uma cepa de levedura modificada, preferivelmente Saccharomyces cerevisiae, que consome L-arabinose produzindo etanol, bem como a um método para a produção de etanol.
Antecedentes da Invenção
Etanol combustível é considerado como uma alternativa adequada a combustíveis fósseis, e pode ser produzido a partir de biomassa vegetal, a qual é uma fonte de baixo custo e renovável, disponível em grandes quantidades. Por esta razão, biomassa celulósica, o que inclui resíduos agriculturais, resíduos de papel, cavacos de madeira, etc., é uma fonte ideal de açúcares disponível de forma abundante para a fermentação a etanol. Por exemplo, quando glicose é produzida a partir de cereais, são gerados subprodutos contendo hemicelulose consistindo principalmente nos açúcares pentose: arabinose e xilose (arabinoxilano). Estes são atualmente utilizados como alimento de baixo custo para gado. No entanto, esta fonte pode ser utilizada de uma forma mais proveitosa se for integrada em processamentos de amido existentes, os quais produzem derivados de etanol e amido.
No contexto da conversão de açúcares hemicelulósicos, a fermentabilidade de L-arabinose se torna de importância. Freqüentemente se tem por verdade que os hidrolisados gerados por pré-tratamento com ácido diluído, contêm apenas D-xilose porque este é o açúcar hemicelulósico mais
Petição 870160049229, de 05/09/2016, pág. 10/17
2/10 abundante. Resultando no fato da maioria dos estudos sobre conversão de hemicelulose focalizar na conversão de Dxilose. No entanto, hemicelulose como um heteropolissacarídeo contém pentosanas e hexosanas. Embora xilana seja a pentosana dominante e glucomanana a hexosana dominante, os níveis de arabinana são significativos em alguns materiais de biomassa. Em particular, os níveis de arabinana são significativos em espécies herbáceas onde represente até 10-20% dos carboidratos não glucanas totais. Biocatalisadores microbianos selecionados para desenvolver ou fermentar hidrolisados derivados de materiais com alto teor de arabinana devem, desta forma, ter a capacidade de fermentar L-arabinose bem como xilose, e preferivelmente também outros açúcares a etanol.
Muitos tipos de levedura, especialmente Saccharomyces cerevisiae e espécies relacionadas têm sido tradicionalmente utilizados para fermentar matéria a base de glicose a etanol, por fermentação anaeróbica, tendo em vista que são os microrganismos mais seguros e efetivos para a fermentação de açúcares a etanol. NO entanto, estas leveduras fermentadoras de glicose superiores são incapazes de fermentar xilose e L-arabinose, e são também incapazes de utilizar estes açúcares pentose para o crescimento. Umas poucas outras espécies de levedura, tais como Pichia stipitis e Cândida shehatae podem fermentar xilose a etanol; entretanto, não são tão efetivas quanto Saccarhomyces para fermentação de glicose e apresentam uma tolerância a etanol relativamente baixa. Desta forma, não são adequadas para produção industrial em larga escala de etanol a partir de biomassa. Algumas leveduras podem
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utilizar L-arabinose para o crescimento, mas nenhuma levedura pode fermentá-la a quantidades de etanol comerciais. Diferentemente de leveduras e fungos, a maioria das bactérias, incluindo E. coli e Bacillus subtilis, pode utilizar L-arabinose para crescimento aeróbico e é também capaz de fermentá-la, a vários produtos incluindo etanol. ‘
Sedlak & Ho, Enzyme Microb. Technol. 28, (2001), pgs. 16-24 descrevem a expressão de um operon araBAD de E. coli que codifica enzimas para o metabolismo de L-arabinose em Saccharomyces cerevisiae. A cepa expressa araA, araB e araD, mas é incapaz de produzir qualquer etanol.
Sumário da Invenção
Foi agora possível resolver-se este problema, pela criação de uma nova cepa da levedura Saccharomyces cerevisiae capaz de consumir L-arabinose, e produzir etanol.
Descrição detalhada da presente invenção
Surpreendentemente foi agora observado que é possível se superar o problema de ter-se uma levedura que consome Larabinose por meio da presente invenção, pela obtenção de um método para produzir uma cepa de levedura que utiliza Larabinose para a produção de etanol, método este que é caracterizado pelo fato de uma cepa de levedura ser modificada pela introdução e expressão de um gene araA de B. subtilis (L-arabinose isomerase), um gene araB de E. coli (1-ribuloquinase) e um gene araD de E. coli (Lribulose-5-Ρ 4-epimerase), e conter mutações adicionais em seu genoma ou super-expressar o gene TAL1 de S. cerevisiae
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(transaldolase), possibilitando que consuma L-arabinose, e produza etanol.
A invenção será descrita em maiores detalhes a seguir com referência a um número de experimentos descritos que explicam a natureza da invenção.
pedido engloba ainda a cepa JBY25-4M (DSM 15560) de Saccharomyces cerevisiae e a cepa JBY24-3T (DSM 15559) de Saccharomyces cerevisiae que foram depositadas no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen em 4 abril de 2003 pelo Tratado de Budapeste.
Primeiro, os genes araA (L-arabinose isomerase) , araB (L-ribuloquinase) e araD (L-ribulose-5-Ρ 4-epimerase) de E. coli foram clonados e super-expressos, por trás do fragmento promotor HXT7 forte, em vetores multicópia em S. cerevisiae cepas CEN.PK. Enquanto que o araA não produziu qualquer atividade de L-arabinose isomerase nas leveduras transformantes, a super-expressão do araB produziu até 0,7 U/mg de atividade da proteína L-ribuloquinase e o araD produziu até 0,13 U/mg de atividade da proteína L-ribulose5-P 4-epimerase. A transformação da CEN.PK2-1C com todas as três construções juntas não permitiu aos transformantes crescer em meio de L-arabinose. Foi demonstrado que a galactose permease de levedura (Gal2) é capaz de transportar L-arabinose [J. Bacteriol. 103, 671-678 (1970)]. A super-expressão simultânea de GAL2 por trás do promotor ADH1 em conjunto com os genes do metabolismo de Larabinose bacterianos também não permitiram aos transformantes crescer em meio de L-arabinose.
Segundo, a clonagem e super-expressão do gene araA de Bacillus subtilis por trás do fragmento promotor HXT7 forte
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• ·· · ·· ·· · · · ···· • · · · · ·· ····· · ·· · ·· · · · ♦ · · · · · · · · em vetores multicópia na cepa CEN.PK2-1C de S. cerevisiae resultaram em uma proteína ativa em levedura, que produziu atividade de L-arabinose isomerase na ordem de pelo menos alguns mU/mg de proteína. Similarmente, a super-expressão do gene araA de
Mycobacterium smegmatis por trás do fragmento promotor
HXT7 forte em um vetor multicópia na cepa CEN.PK2-1C de
S. cerevisiae produziu atividade de
Larabinose isomerase.
Então, os transformantes que expressavam os gene araA de B. subtilis em conjunto com os genes araB e araD de E. coli bem como o gene GAL2 de levedura, foram incubados em meio líquido (completo sintético ou completo sinté.tico/extrato de levedura . 0,1%/peptona 0,2%) com Larabinose como a única fonte de carbono por várias semanas. Após 4-5 dias de incubação, os transformantes começaram a crescer lentamente nestes meios, em contraste com uma cepa contendo apenas quatro vetores vazios. Assim que as células atingiram uma OD6oo de 3-4, foram incubadas em meio fresco a uma OÜ6oo de 0,3, e crescidas em seguida. O crescimento se tornou mais rápido após 10 dias. Estas observações indicam a ocorrência de mutações supressoras espontâneas possibilitando às células utilizar L-arabinose mais eficientemente. Pelo contrário, as células poderíam ter se tornado de alguma forma adaptadas à utilização de Larabinose.
De maneira a se distinguir entre mutações supressoras e um processo de adaptação, os transformantes mutantes foram cultivados em meio de glicose e então trocados novamente para um meio de arabinose. Os transformantes começaram a crescer em meio de arabinose com apenas uma
6/10 • · · « · · ·· · ·· · ··· ·· · · · ·· · ···· · ·· ·
curta fase lag, indicando que, de fato, apresentavam mutações especificas possibilitando às células crescer em arabinose. As atividades de todas estas três enzimas heterólogas foram determinadas em extratos brutos dos transformantes originais e mutantes. Enquanto que as atividades de L-ribulose-5-Ρ 4-epimerase e L-arabinose isomerase foram similares em ambas as . cepas., a atividade de L-ribuloquinase foi fortemente reduzida nos transformantes mutantes.
Quando os transformantes mutantes foram selecionados para perda de seus plasmideos, não mais foram capazes de crescer em arabinose. Os plasmideos foram isolados novamente e amplificados, em E. coli. Os plasmideos reisolados foram transformados em uma cepa CEN.PK2-1C do tipo selvagem. Quando o crescimento em arabinose destes novos transformantes foi comparado com os transformantes mutantes .originais, a fase lag em. meio de arabinose foi significativamente prolongada, indicando que ocorreram mutações genômicas adicionais nos transformantes mutantes, possibilitando a estes crescer eficientemente em arabinose. Diferentes combinações de plasmideos original e re-isolado foram transformadas na cepa JBY25 mutante. Ocorreu que a substituição dos plasmideos re-isolados GAL2, araD e araA pelos plasmideos originais correspondentes afetou apenas ligeiramente a capacidade de crescimento em arabinose. No entanto, a substituição de plasmideo re-isolado araB (Lribuloquinase) pelo plasmideo original correspondente resultou em crescimento em arabinose.
Quando o gene de L-ribuloquinase re-isolado completo foi seqüenciado, mostrou uma mutação que leva a uma troca
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··· do aminoácido 121 Asp por um
Asn no domínio açúcar quinase conservado da quinase.
determinação da cinética da enzima mutante, revelou que seu valor Km para L-ribulose foi aumentado e o Vmax reduzido.
Experimentos de crescimento com quinases do tipo selvagem e mutantes expressas a partir de plasmídeos centrômeros na cepa JBY25 em conjunto com os plasmídeos de isomerase re-isolados e de epimerase foram também realizados.
No caso da quinase mutante, este plasmídeo centrômero não conferiu um bom crescimento em arabinose aos transformantes.
No entanto, transformantes contendo a quinase do tipo selvagem em um plasmídeo centrômero mostraram um maior crescimento que aqueles transformados com a quinase super-expressa.
Esta é uma outra indicação de que a atividade reduzida da quinase é importante para um .
maior crescimento em L-arabinose.
Para se determinar se todos os quatro plasmídeos contendo os genes da L-arabinose isomerase de Bacillus subtilis,
L-ribuloquinase de E.
coli e L-ribolose-5-Ρ 4epimerase e Gal2 galactose permease de levedura, respectivamente, são necessários para o crescimento em Larabinose, a cepa mutante foi transformada com diferentes combinações de plasmídeos re-isolados e vazios (sem qualquer gene para metabolismo de L-arabinose) .
Os transformantes não contendo os genes da L-arabinose isomerase, L-ribuloquinase ou
L-ribulose-5-Ρ 4-epimerase, mas transformados com os outros três plasmídeos re-isolados não apresentaram qualquer crescimento em L-arabinose, indicando que estes genes sao absolutamente necessários à utilização de L-arabinose. Os transformantes não contendo
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galactose permease super-expressa são capazes de crescer em L-arabinose, mas com taxas de crescimento ligeiramente reduzidas quando em comparação com a cepa mutante contendo todos os quatro plasmideos re-isolados, indicando que a super-expressão de um transportador não é necessária para crescimento em L-arabinose, no entanto, pode aumentá-lo.
Para se testar quanto. :-a se apenas uma ou mais mutações no genoma da cepa CEN.PK2-1C do tipo selvagem possibilitam aos transformantes crescer em L-arabinose, e se esta(s) mutação(ões) é(são) recessiva(s) ou dominante (s), a cepa mutante e também a cepa do tipo selvagem, cada uma transformada com os quatro plasmideos para metabolismo de L-arabinose, foram cruzadas com uma cepa do tipo selvagem haplóide. Após o que, o crescimento em L-arabinose foi investigado. A cepa mutante diplóide exibiu um crescimento mais rápido em L-arabinose que a cepa diplóide de controle. No entanto, a cepa mutante diplóide não cresceu tanto quanto a cepa mutante haplóide transformada com os quatro plasmideos. A cepa mutante diplóide foi esporulada e foi realizada análise tétrade. Os resultados indicam que há mais de uma mutação no genoma da cepa com pelo menos uma sendo dominante e uma outra sendo recessiva.
Além disto, a super-expressão do gene TAL1 (transaldolase) de S. cerevisiae juntamente com o gene araA (L-arabinose isomerase) de B. subtilis, araB (Lribuloquinase) mutante de E. coli e araD (L-ribulose-5-Ρ 4epimerase) de E. coli resultou no crescimento em Larabinose na cepa CEN.PK-1C do tipo selvagem.
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Ά produção de etanol foi determinada com a cepa mutante JBY25 transformada com os quatro plasmideos reisolados e incubada em um meio de crescimento com 20 g/1 de L-arabinose. Sob condições de oxigênio limitado em uma cultura com OD6oo = 15-20, as taxas de produção de etanol atingiram até 0,06 g de etanol/g de peso seco hora.
Foi agora demonstrado que é possível transferir-se o método para produzir uma cepa de levedura que utiliza Larabinose para outras cepas de Saccharomyces cerevisiae que são diferentes das cepas CEN.PK.
Utilizou-se a cepa de S. cerevisiae W303 que não é relacionada com as cepas CEN.PK, e essa cepa foi transformada com os plasmideos que expressam o gene araA (L-arabinose isomerase) de B. subtilis, o gene araB mutante de E. coli com atividade reduzida (L-ribuloquinase), gene araD (L-ribulose-5-Ρ 4-epimerase) de E. coli, e gene TAL1 (transaldolase) de S. cerevisiae.
Os transformantes puderam crescer em um meio definido com L-arabinose como a única fonte de carbono, embora muito lentamente. Então, as células foram incubadas em meio líquido (completo sintético/extrato de levedura 0,1%/peptona 0,2%) com L-arabinose como a única fonte de carbono por vários dias. Após 4-5 dias de incubação, os transformantes começaram e crescer mais rapidamente neste meio, em contraste com a cepa W303 contendo apenas quatro vetores vazios. Assim que as células atingiram uma OÜ6oo de 3-4, foram inoculadas em meio fresco a uma OD6oo de 0,3, e crescidas em seguida. Finalmente, após 20 dias, isto resultou em uma cepa capaz de crescer em meio de L10/10
arabinose muito mais rapidamente, e capaz de fermentar Larabinose a etanol.
A invenção é uma cepa de levedura modificada que expressa os genes araA (L-arabinose isomerase) de B.
subtilis, araB (L-ribuloquinase D -N) mutante de E. coli e araD (L-ribulose-5-Ρ 4-epimerase) de E. coli, e apresenta .mutações adicionais em seu genoma ou super-expressa o gene TAL1 (transaldolase) de S. cerevisiae, a possibilitando consumir L-arabinose, utilizada como única fonte de 10 carbono, e produzir etanol.
Normalmente, o meio de crescimento irá conter cerca de 20 g de L-arabinose/1. Entretanto, o crescimento e produção de etanol irão ocorrer entre 2 e_ 200 g/1. Não há necessidade de açúcares adicionais, e, desta forma, a L15 arabinose pode ser utilizada sozinha. É possível que o coconsumo de xilose e arabinose possa funcionar, mas isto não foi ainda determinado.

Claims (7)

1. Método para a produção de etanol pela fermentação de uma L-arabinose utilizando uma cepa da levedura Saccharomyces cerevisiae, em um meio de crescimento contendo L-arabinose, em que dita cepa de levedura é modificada pela introdução e expressão de um gene B. subtilis araA (L-arabinose isomerase), um gene mutante araB de E. coli (L-ribuloquinase-D121-N) e um gene E. coli araD (L-ribulose-5-P-4-epimerase), e super-expressa um gene TAL1 de S. cerevisiae (transaldolase), por esta razão a possibilitando a consumir L-arabinose, caracterizado pelo fato de que a forma mutante da enzima Lribuloquinase de E. coli possui atividade reduzida, em que
a) é fornecido um meio de crescimento contendo uma L-arabinose; e
b) a referida Saccharomyces cerevisiae modificada é adicionada ao meio de crescimento contendo L-arabinose para a fermentação para etanol.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da cepa de Saccharomyces cerevisiae ser uma cepa CEN.PK, preferivelmente CEN.PK2-1C.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da cepa de Saccharomyces cerevisiae ser uma cepa W303 de Saccharomyces cerevisiae.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 a 4, caracterizado pelo fato da cepa de levedura ser adicionalmente modificada pela super-expressão do gene GAL2 de levedura.
Petição 870180132724, de 21/09/2018, pág. 9/17
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5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do gene araB ser colocado por trás de um promotor fraco. 6. Método de acordo com uma ou mais das
reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato das modificações serem obtidas por trás do fragmento promotor
HXT7 forte em vetores multicópia em cepas CEN.PK de S. cerevisiae. 7. Método de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato das
modificações serem obtidas por trás do fragmento promotor HXT7 forte em vetores multicópia em cepas W303 de S. cerevisiae.
8. Método de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato da quantidade de L-arabinose no meio de cultura ser de 2 a 200 g/l.
9. Método de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato da cepa ser a cepa JBY25-4M de Saccharomyces cerevisiae com número de acesso DSM 15560.
10. Método de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato da cepa ser a cepa JBY24-3T de Saccharomyces cerevisiae com número de acesso DSM 15559.
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