BRPI0309981B1

BRPI0309981B1 - Método para a produção de ácido láctico ou um sal do mesmo por sacarificação e fermentação simultâneas de amido

Info

Publication number: BRPI0309981B1
Application number: BRPI0309981-4A
Authority: BR
Inventors: Roel Otto
Original assignee: Purac Biochem B.V.
Priority date: 2002-05-14
Filing date: 2003-05-13
Publication date: 2019-10-01
Also published as: US20080261285A1; CN1316031C; JP2005525120A; DE60314513T3; WO2003095659A1; EP1504109A1; CN1662653A; DE60314513D1; JP4405914B2; US20050176120A1; ATE365221T1; EP1504109B1; US20080261284A1; BR0309981A; AU2003240845A1; DE60314513T2; EP1504109B2; US8119376B2

Abstract

método para a produção de ácido láctico ou um sal do mesmo por sacarificação e fermentação simultâneas de amido. a presente invenção refere-se a um método para a produção de ácido láctico ou um sal do mesmo onde amido é submetido a um processo de sacarificação e fermentação simultâneas, o método compreendendo sacarificar o amido em um meio compreendendo pelo menos uma glicoamilase e simultaneamente fermentar o amido usando um microorganismo, e opcionalmente isolar o ácido láctico do meio, caracterizado pelo fato de ser usado um microorganismo produtor de ácido láctico moderadamente termofílico. a invenção refere-se ainda a um método para a realização do referido processo na presença de um microorganismo produtor de ácido láctico moderadamente termofílico, que tenha sido adaptado para ter seu desempenho máximo ao ph operacional.

Description

A presente invenção refere-se a um método para a produção de ácido láctico ou um sal do mesmo onde amido é submetido a um processo de sacarificação e fermentação simultâneas.

Os processos de fermentação são explorados para a produção de um vasto número de produtos de considerável interesse comercial e que são difíceis de ser sinteticamente produzidos. A fermentação é usada na indústria para produzir compostos simples entre os quais álcoois, tais como etanol e butanol; ácidos orgânicos tais como ácido cítrico, ácido itacônico, ácido (R)- ou (S)-láctico e ácido glucônico; cetonas; aminoácidos tais como ácido glutâmico e lisina; mas também compostos mais complexos como antibióticos, tais como penicilina e tetraciclina; enzimas, vitaminas, tais como riboflavina, vitamina B12 e beta-caroteno; e hormônios. Processos de fermentação também são usados na indústria de cerveja, vinho, laticínios, couro e tabaco.

Açúcar é o contribuinte mais importante para o preço de custo da produção de ácido láctico. Pode-se portanto obter grandes reduções no preço de custo da produção de ácido láctico se o processo de produção for alimentado com açúcar barato. Amido e hidrolisados parciais de amido, estes últimos também conhecidos como amido liqüefeito, que também podem ser purificados para dar produtos tais como maltooligossacarídeos ou maltodextrinas, representam essas fontes baratas. O termo amido liqüefeito significa amido que fora submetido ao processo de liquefação, o que significa fluidificação ácida, enzimática ou termoquímica de amido que leva a uma forma dissolvida ou solúvel. O termo maltooligossacarídeos significa maltossacarídeos compostos de ligações a-1,4-glicosídicas de unidades anidroglicose tendo um grau de polimerização (DP_n) de 2-50 (n) tal como maltose, maltotriose, maltotetraose ou maltopentaose e outras. O termo grau de polimerização ou DP_n significa o número de unidades anidroglicopiranose em um dado sacarídeo. Maltose, com dois resíduos de glicose com ligação α-1,4-glicosídica, pode ser chamada de DP₂; maltotriose com três resíduos de glicose com ligação a-1,4-glicosídica, pode ser chamada de DP₃e assim por diante. O termo maltodextrina significa um produto da hidrólise de amido tendo um DE menor que 20. O termo DE (equivalente de dextrose) significa o poder de redução (perda de elétrons devido à presença da função carbonila) expresso como D-glicose em uma base seca. O termo base seca significa a composição baseada na ausência de água. Por exemplo, um produto contendo 25% em peso do componente A, 25% em peso do componente B e 50% em peso de água conteria 50% em peso do componente A (ou B) em uma base seca. O termo ácido láctico significa ácido 2-hidroxi-propiônico em sua forma de ácido livre ou sal. A forma de sal do tipo lactato é especificamente chamada de sal do tipo lactato, por exemplo, como o sal de cálcio de ácido láctico ou lactato de cálcio. Sais de metal alcalino e de metal alcalino-terroso de ácido láctico são preferidos. O ácido láctico contém um átomo de carbono quiral, e por isso pode existir como enantiômero (R) e (S). O termo ácido láctico conforme usada neste relatório inclui os isômeros (R) e (S) puros, e misturas dos mesmos inclusive a mistura racêmica. O termo pureza enantiomérica para um excesso de isômero (S) significa pureza enantiomérica = 100% x [(isômero (S))/(isômero (R) + isômero (S))]. O termo pureza enantiomérica para um excesso de isômero (R) significa pureza enantiomérica = 100% x [(isômero (R))/(isômero (R) + isômero (S))].

Muitos microorganismos que são usados em processos de fermentação não conseguem fermentar amido, amido liqüefeito, maltodextrinas ou maltooligossacarídeos já que lhes falta o mecanismo enzimático para liqüefazer amido ou o mecanismo enzimático para sacarificação ou ambos. O termo sacarificação significa a hidrólise ácida ou enzimática de amido ou amido liqüefeito ou maltodextrinas ou maltooligossacarídeos que finalmente resulta na produção de D-glicose ou maltose ou maltooligossacarídeos pequenos ou misturas dos mesmos. Culturas de reforço desses microorganismos com preparações de α-amilases ou glicoamilases ou pululanase ou misturas das mesmas podem convenientemente resolver este problema de incompatibilidade. O termo α-amilase significa uma enzima pertencente à classe funcional com o número EC 3.2.1.1 e o nome vulgar glicogenase, diastase, α-amilase fúngica ou α-amilase bacteriana, e o nome técnico 1,4α-D-glicano glicanohidrolase. α-amilases despolimerizam parcialmente polissacarídeos contendo três ou mais D-glicose com ligação em 1,4-a por endohidrólise das ligações 1,4-a-glicosídicas. O termo glicoamilase significa uma enzima pertencente à classe funcional com o número EC 3.2.1.3 e o nome vulgar glicoamilase, γ-amilase, lisossoma, α-glicosidase, maltase ácida, exo-1,4-a-glicosidase, glicosima, AMG ou GAM, e o nome técnico 1,4-aD-glicano glicohidrolase. Glicoamilases hidrolisam resíduos terminais a-Dglicose com ligação em 1,4 sucessivamente das extremidades nãoredutoras das cadeias com liberação de β-D-glicose, e hidrolisam as ligações em a-1,6. O termo pululanase significa uma enzima pertencente à classe funcional com o número EC 3.2.1.41 e o nome vulgar dextrinase limite, enzima desramificadora ou amilopectina 6-glicanohidrolase, e o nome técnico a-dextrina-6-glicanohidrolase ou pululano 6-glicanohidrolase. Pululanases desramificaram o amido hidrolisando as ligações em a-1,6. O termo amido significa qualquer amido purificado ou bruto ou amido liqüefeito, ou qualquer material contendo amido ou amido liqüefeito. Amido de trigo, milho, centeio e batata são exemplos de amidos que podem ser proveitosamente aplicados na presente invenção.

Os sistemas que combinam a sacarificação de amido ou amido liqüefeito e a fermentação dos produtos da sacarificação (glicose, maltose, maltooligossacarídeos pequenos) são conhecidos como processos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Os sistemas SSF são consideravelmente promissores.

A fermentação de amido ou amido liqüefeito em ácido láctico é conhecida na técnica, por exemplo, pelo documento EP 354828 A1, onde encontra-se descrito um processo para a produção de ácido láctico, que inclui incubar Lactobacillus delbrueckii subsp lactis ou Lactobacillus rhamnosis em caldo de fermentação contendo amido de trigo liqüefeito e uma preparação de uma glicoamilase para produzir um caldo de fermentação contendo lactato. Hofvendahl et al. em Appl. Biochem. Biotechnol., 52: 163-169 (1999) descrevem um sistema SSF com Lactococcus lactis em amido de trigo contendo caldo de fermentação. Linko et al. em Enz. Microb. Technol., 19: 118123 (1996) descrevem um sistema SSF com Lactobacillus casei em amido de cevada contendo caldo de fermentação. A patente US 2588460 descreve um processo para produzir ácido láctico que inclui incubar Lactobacillus delbrueckii em amido de milho liqüefeito contendo caldo de fermentação e uma preparação de uma glicoamilase para produzir um caldo de fermentação contendo lactato. Mercier et al. em J. Chem. Technol. Biotechnol. 55: 111-121 (1992) descrevem um sistema SSF com Lactobacillus amylophilus em amido de milho liqüefeito contendo caldo de fermentação. Cheng et al. em J. Indust. MicrobioL, 7: 27-34 (1991) e Zhang et al. em Biotechnol. Letters, 13: 733-738 (1991) descrevem um sistema SSF com Lactobacillus amylovorus em amido de milho liqüefeito contendo caldo de fermentação. Na patente US 5464760 e WO 94/13826 estão descritos processos para produzir ácido láctico, que incluem incubar uma cultura mista de espécies de Lactobacillus produtoras de (R)- e (S)-ácido láctico em amido de batata liqüefeito contendo caldo de fermentação e uma preparação de uma glicoamilase para produzir caldo de fermentação contendo lactato. Tsai et al. em Appl. Biochem. Biotechnol., 70/72: 417-428 (1998) descrevem um sistema SSF com uma espécie de Lactobacillus em amido de batata contendo caldo de fermentação. O termo caldo de fermentação refere-se tanto aos meios na forma originalmente oferecida aos microorganismos como fonte de nutrientes, fatores de crescimento e carboidratos quanto aos meios produzidos depois de parte dos nutrientes, fatores de crescimento ou carboidratos originalmente oferecidos, ou todos eles, ter sido consumida e de os produtos de fermentação inclusive ácido láctico terem sido excretados no meio pelos microorganismos.

Apesar de microorganismos tais como a espécie Lactobacillus, a espécie Lactococcus, a espécie Streptococcus, a espécie Enterococcus e a espécie Sporolactobacillus serem produtores de ácido láctico, certas propriedades tornam estes microorganismos menos adequados para a produ ção industrial de ácido láctico, inclusive o fato de eles terem uma temperatura de crescimento na faixa de 30-50°C, com uma temperatura ideal a 3037°C, o que torna mais difícil evitar infecções em sistemas de fermentação em escala industrial, que comprometem a pureza enantiomérica do ácido láctico durante a fermentação, do que quando temperaturas mais altas podem ser usadas.

Constitui um dos objetivos desta invenção oferecer um método sem esta desvantagem dos processos SSF conhecidos.

Além disso, a faixa da temperatura de crescimento desses microorganismos não é consistente com a faixa da temperatura de aplicação da glicoamilase e pululanase, que está na faixa de 50-70°C, e da a-amilase, que está na faixa de 80-105°C. Uma fermentação láctica com os microorganismos operados como SSF a uma temperatura que é ideal para esses microorganismos é subideal para a atividade da enzima. Estas atividades reduzidas podem ser compensadas pela adição de mais glicoamilase, pululanase ou α-amilase ou misturas das mesmas, mas isto vai aumentar os custos. Ademais, esses organismos requerem uma considerável quantidade de nitrogênio orgânico no meio de fermentação, bem como substâncias promotoras de crescimento, de modo que o caldo fica mais caro e o ácido láctico fica mais difícil de ser purificado do quando se pode usar um meio de fermentação simples. Tendo em vista estas considerações, foi descoberto que bactérias produtoras de ácido láctico mais termofílicas e menos exigentes nutricionalmente são mais favoráveis.

A invenção refere-se portanto a um método para a produção de ácido láctico ou um sal do mesmo onde o amido é submetido a um processo de sacarificação e fermentação simultâneas, o método compreendendo sacarificar o amido em um meio compreendendo pelo menos uma glicoamilase e simultaneamente fermentar o amido usando um microorganismo, e opcionalmente isolar o ácido láctico do meio, caracterizado pelo fato de ser usado um microorganismo produtor de ácido láctico moderadamente termofílico.

O uso da espécie Bacillus moderadamente termofílico para a produção de ácido láctico a partir de açúcares simples tais como glicose e sacarose é bastante conhecido na técnica. O termo moderadamente termofílico significa cepas bacterianas que são capazes de crescer a temperaturas entre 30 e 65°C, com uma temperatura ideal entre 40 e 60°C, mais preferivelmente entre 50 e 60°C. As patentes US 5002881 e DE 4000942 descrevem processos para produzir ácido láctico que incluem incubar cepas de Bacillus coagulans a 48-54°C em um meio de fermentação simples contendo glicose ou sacarose como carboidrato para produzir um caldo de fermentação contendo lactato. A patente DE 4000942, Olsen em Kemisk, 25: 125-130 (1944) e Payot et al. em Enzyme Microb. Technol., 24: 191-199 (1999) descrevem uma fermentação láctica a 50-60°C sem condições estéreis com o Bacillus coagulans (isto é, Lactobacillus cereale) em meio de fermentação com sacarose como carboidrato para produzir um caldo contendo lactato. A patente 6022537 descreve um organismo amilolítico moderadamente termofílico, Bacillus thermoamylovorans, que é útil para produzir ácido láctico.

O uso de cepas produtoras de ácido láctico moderadamente termofílicas para a produção de ácido láctico a partir de amido (ou amido liqüefeito) com a tecnologia de SSF nunca foi descrito e agora verificou-se que ele resolve vantajosamente a incoerência de temperatura que existe o microorganismo e a glicoamilase ou pululanase e melhora esse problema para a α-amilase. Constitui uma outra vantagem da presente invenção que ácido láctico enantiomericamente puro ou um sal do mesmo pode ser agora preparado com facilidade. O termo enantiomericamente puro significa que a pureza enantiomérica é pelo menos 95%, de preferência pelo menos 98% e mais preferivelmente pelo menos 99%. O Bacillus coagulans e o Bacillus thermoamylovorans são excelentes produtores de lactato, e também possuem certas propriedades que à primeira vista tornaria esses organismos candidatos menos adequados para a produção de ácido láctico enantiomericamente puro a partir de amido ou amido liqüefeito. O Bacillus thermoamylovorans é heteroláctico, o que quer dizer que uma fração do substrato carboidrato é fermentado em produtos diferentes de ácido láctico (etanol, ácido acético e ácido fórmico), dessa forma reduzindo o rendimento do produto (mol de ácido láctico por mol de carboidrato) e tornando o ácido láctico produzido mais difícil de purificar. Combet-Blanc et al. em Appl. Environm. Microbiol., 65: 4582-4585 (1999); Appl. Environm. MicrobioL, 61: 656-659 (1995); e Internat. J. System. BacterioL, 45: 9-16 (1995) dizem que o rendi5 mento de lactato sobre a glicose é tipicamente da ordem de 88-92% (mol de ácido láctico por mol de glicose). Ademais, também foi descrito que a pureza enantiomérica do (S)-ácido láctico era de 98%. O Bacillus coagulans é homoláctico, o que quer dizer que o carboidrato é fermentado somente em ácido láctico. Outrossim, a patente DE 4000942 diz que a pureza enantio10 mérica do ácido láctico é de quase 100%. O Bacillus coagulans, por outro lado, pouco fermenta amido ou amido liqüefeito ou maltodextrinas ou maltooligossacarídeos. O Bacillus coagulans e o Bacillus thermoamylovorans têm um pH relativamente alto ideal (6,0-7,0) para a produção de ácido láctico, que é substancialmente mais alto em unidades de pH que a faixa de pH de 15 aplicação (operacional) preferida da glicoamilase (3,5-5). A faixa de pH de aplicação da glicoamilase não é portanto consistente com aquela do microorganismo. Uma fermentação láctica com o Bacillus coagulans e com o Bacillus thermoamylovorans operada como SSF a um pH ideal para o microorganismo reduz a atividade da glicoamilase. Isto pode ser compensado pela 20 adição de mais glicoamilase, mas vai aumentar os custos. Constitui portanto um outro objetivo da invenção oferecer um método para usar o sistema SSF adequado para uso de microorganismos produtores de ácido láctico moderadamente termofílicos tal como Bacillus coagulans. Esta cepa tem uma alta taxa de conversão de substrato e um alto rendimento de produção. Sabe-se 25 que em altas concentrações de glicose livre a glicoamilase pode dar uma reação invertida para produzir ligações em a-1,4, a-1,6 e a-1,3 de açúcares produtores de glicose, tais como maltose, isomaltose e nigerose, que são pouco ou nada fermentáveis por bactérias produtoras de ácido láctico moderadamente termofílicas (por exemplo, Reilly (1985): Enzymic degradation of 30 starch in: Starch Conversion Technology (van Beynum e Roels ed.), Marcei

Dekker Inc., New York, páginas 101-142). A aplicação de SSF com bactérias produtoras de ácido láctico moderadamente termofílicas impedem o acú8 mulo de glicose livre no caldo de fermentação, dessa forma impedindo ou reduzindo a taxa de reações de reversão e dessa forma impedindo o acúmulo de açúcares não fermentáveis tais como isomaltose e nigerose. Isto aumenta o rendimento de lactato sobre o amido ou amido liqüefeito e torna o ácido láctico presente no caldo de fermentação menos difícil de purificar.

Em uma modalidade preferida, o amido é sacarificado, fermentado e opcionalmente liqüefeito em uma mistura de glicoamilase e pelo menos uma de pululanase e a-amilase.

O presente processo resulta no fato de serem obtidos substancialmente menos açúcares residuais em comparação com processos de fermentação convencionais, tornando possível o isolamento direto de ácido láctico. A presente invenção oferece assim a vantagem de um procedimento de tratamento fácil e econômico, não mais precisando de uma completa etapa de extração para separar o ácido láctico dos açúcares residuais. Uma vantagem adicional do presente processo é a possibilidade de se usar amido bruto, uma vez que as baixas quantidades de açúcar residual não mais requerem o uso de amido purificado como produto de partida. Geralmente são facilmente obtidos teores de açúcar residual inferiores a 5 g/l, de preferência inferiores a 2 g/l com o processo da invenção.

Como indicado acima, a sacarificação é realizada por glicoamilases ou uma mistura de glicoamilase e α-amilase e/ou pululanase. A glicoamilase (EC 3.2.1.3, 1,4-a-glicano glicohidrolase) cliva principalmente as ligações a-1,4-glicosídicas nas extremidades não redutoras dos amidos e dos fragmentos deixados pela hidrólise da α-amilase. A glicoamilase é um exohidrolase e ataca a glicose contendo dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos predominantemente ligados por ligações a-1,4-glicosídicas, embora ligações a-1,6-glicosídicas e ligações a-1,3-glicosídicas sejam atacadas em proporções mais baixas. Isto é de considerável interesse industrial, uma vez que hidrolisados de amido depois de tratamento com a-amilase contêm ligações a-1,6-glicosídicas que devem ser clivadas caso se deseje obter rendimentos aceitáveis de glicose. Como a atividade de glicoamilase em relação a ligações a-1,6-glicosídicas é baixa, algumas preparações de glicoamilase comercialmente disponíveis contêm pululanase. Pululanase é uma enzima chamada de enzima desramificadora, que cliva as ligações a1,6-glicosídicas presentes no amido e no amido liqüefeito. Para sacarificar amido liqüefeito, glicoamilase contendo enzimas como componente principal bem como preparações combinadas contendo glicoamilase e pululanase pareceram adequadas para o processo de acordo com a presente invenção. Foi verificado que faixa ideal do pH de aplicação para glicoamilase e pululanase estava entre 3,5 e 5. Foi verificado que faixa ideal da temperatura de aplicação estava entre 55 e 70°C. Foi verificado que o efeito do lactato de cálcio e do pH sobre a atividade e a estabilidade da enzima não piorava progressivamente como resultado do acúmulo do produto da fermentação.

Ainda assim, é preferível adicionar as enzimas em pelo menos duas porções em relação ao desempenho global da fermentação do que em uma única adição no início do processo. Preparações de glicoamilase/pululanase comercialmente disponíveis (ex Genencor e Novo Nordisk) foram testadas. Todas continham atividade desramificadora considerável. AMG® E (ex Novo Nordisk), uma glicoamilase com elevada atividade desramificadora, Dextrozyme® E (contendo glicoamilase e pululanase) (ex Novo Nordisk) e Optimax® 7525 HP (contendo glicoamilase e pululanase) (ex Genencor) também foram testadas e mais uma vez não foram observadas grandes diferenças entre essas preparações. A Dextrozyme® E teve um desempenho ligeiramente inferior ao da AMG® E e ao da Optimax® 7525 HP em relação ao desempenho global da fermentação. A AMG® E e a Optimax® 7525 HP tiveram desempenhos quase idênticos e as duas preparações de enzima foram estudadas detalhadamente (vide Experimental).

A fermentação é realizada por um microorganismo produtor de ácido láctico moderadamente termofílico tal como microorganismos derivado de uma cepa de Bacillus coagulans, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus smithii, Geobacillus stearothermophilus, ou de misturas dos mesmos. Estes microorganismos são capazes de crescer a temperaturas entre 30 e 65°C. Assim sendo estes microorganismos se ajustam melhor para trabalhar às temperaturas operacionais ideais das enzimas e o processo de acordo com a invenção geralmente é conduzido a uma temperatura entre 30 e 70°C. O método da invenção geralmente é realizado a um pH entre 3 e 8,5, de preferência a um pH entre 5 e 6, mais preferivelmente a um pH entre 5,35 e 5,80, mais preferivelmente ainda a um pH entre 5,50 e 5,60.

É vantajoso adaptar o microorganismo produtor de ácido láctico termofílico à faixa de pH usada no processo. O pH tem forte influência sobre a atividade. As enzimas ficam progressivamente mais ativa em valores baixos de pH. No entanto, a faixa comum de pH em que o microorganismo produtor de ácido láctico moderadamente termofílico tem um desempenho ideal está entre 6,0 e 7. Portanto, é preferível usar um microorganismo produtor de ácido láctico moderadamente termofílico que tenha sido adaptado para ter seu desempenho máximo em pH baixo (entre 5 e 6, de preferência entre 5,35 e 5,80, ainda mais preferivelmente entre 5,35 e 5,80). A técnica para adaptar o microorganismo é conhecida na técnica. Adaptação ou aclimatação de bactérias produtoras de ácido láctico moderadamente termofílicas para melhorar o desempenho a um pH entre 5,35 e 5,8 foi efetuada realizando-se 40-50 transferências sucessivas em meio de fermentação a um pH igual 5,6.

Sacarificação e fermentação simultâneas podem ser realizadas em uma pasta fluida de milho ou em qualquer outra composição contendo amido. O referido amido pode ser liqüefeito ou não. Se for usada uma pasta fluida de amido não-liqüefeito ou qualquer outra composição contendo amido, a sacarificação e a fermentação podem ser combinadas com liquefação e também uma α-amilase pode estar presente no meio de fermentação.

Uma etapa completa de sacarificação pode levar até 72 horas. No entanto, é possível fazer uma pré-sacarificação de tipicamente 40-90 minutos e em seguida completar a sacarificação durante a fermentação. A referida etapa de pré-sacarificação pode ser conduzida a uma temperatura acima de 50°C, imediatamente antes da fermentação. O processo mais amplamente usado é um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) onde não existe o estágio de retenção para a sacarificação, o que significa que o organismo de fermentação e a(s) enzima(s) são adicionados juntos. No processo de acordo com a invenção, o microorganismo produtor de ácido láctico moderadamente termofílico e as enzimas também podem ser adicionados simultaneamente. Não é necessário dizer que o processo de acordo com a invenção também pode ser realizado por uma présacarificação seguida de sacarificação e fermentação simultâneas onde mais uma porção da enzima é adicionada com a adição do microorganismo produtor de ácido láctico moderadamente termofílico.

Uma pasta fluida de amido ou uma pasta fluida de um material contendo amido adequado ou de amido liqüefeito é introduzida em um fermentador. O inóculo microbiano e nutrientes também são introduzidos no fermentador. Durante a fermentação uma base adequada tal como hidróxido de cálcio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de magnésio, óxido de magnésio, amônia, hidróxido de amônio ou um carbonato adequado tal como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, hidrogenocarbonato de sódio, carbonato de potássio, hidrogenocarbonato de potássio, carbonato de magnésio, carbonato de amônio pode ser adicionado para controlar o pH.

Quando aplicado, na etapa de liquefação da invenção, o amido gelatinizado ou o material contendo amido é decomposto (hidrolisado) em maltodextrinas com um DE médio entre 10 e 30. O termo gelatinização significa o processo que transforma grânulos de amido em pasta de amido. A hidrólise pode ser realizada por tratamento com ácido ou enzimaticamente por tratamento com α-amilase. A α-amilase deriva de um microorganismo ou de uma planta, α-amilases preferidas são de origem fúngica ou bacteriana. Uma definição de α-amilase foi dada acima. O processo de liquefação enzimática pode ser realizado a um pH entre 5 e 6, de preferência entre 5,35 e 5,80, e mais preferivelmente entre 5,50 e 5,60. Assim sendo, a liquefação enzimática pode ser vantajosamente combinada com a pré-sacarificação ou com as sacarificação e fermentação simultâneas ou com ambas. Hidrólise ácida, apesar de não ser amplamente usada, também pode ser usada. A matéria-prima pode ser cereais triturados (inteiros) ou raízes raspadas, em pedaços (batata, tapioca), tubérculos, grãos inteiros, milho, sabugo de milho, trigo, cevada, centeio, sorgo, matérias-primas contendo açúcar tais como melaço, frutas, cana-de-açúcar ou beterraba, batatas, materiais contendo celulose tais como madeira e resíduos de plantas.

No entanto, pode-se usar uma corrente secundária do processamento de amido tal como o chamado amido Β. A liquefação é conhecida na técnica e não precisa de maiores esclarecimentos. Como mencionado acima, a liquefação também pode ocorrer em combinação com a sacarificação e fermentação.

Em uma modalidade preferida da invenção, a etapa de liquefação compreende as seguintes etapas:

1) a pasta fluida quente é aquecida até uma temperatura entre 60 e 95°C, de preferência entre 80 e 85°C, e pelo menos uma α-amilase é adicionada;

2) a pasta fluida é cozida por jato a uma temperatura entre 95 e 140°C, de preferência entre 105 e 125°C, para completar a gelatinização da pasta fluida;

3) a pasta fluida é resfriada para uma temperatura entre 60 e 95°C e mais α-amilase é adicionada para terminar a hidrólise.

O processo de liquefação pode ser realizado a um pH entre 5 e 6, em particular a um pH entre 5,35 e 5,80, mais preferivelmente a um pH entre 5,50 e 5,60.

Depois de sacarificação e fermentação combinadas, o ácido láctico formado é opcionalmente isolado do meio de fermentação e purificado quando necessário. Métodos convencionais de purificação/isolamento para o ácido láctico são destilação, extração, eletrodiálise, adsorção, troca iônica, cristalização e outros, e combinações dos métodos de purificação/isolamento acima mencionados. Destilação é a técnica mais comumente usada. No entanto, como explicado acima, com o processo de acordo com a invenção a formação de açúcares não fermentáveis é reduzida. Portanto, as etapas de isolamento ou purificação podem ser menos complicadas e às vezes até redundantes. Maiores detalhes sobre como realizar a destilação e outras técnicas para recuperação de ácido láctico são bastante conhecidos pelo versado na técnica. A invenção está ainda ilustrada pelas experiências a seguir, que foram incluídas sem contudo limitara invenção.

EXEMPLOS

Experiências de SSF

Meios e condições de cultura

O Bacillus coagulans em cultura que teve o pH ajustado em 5,65 foi cultivado em um reator agitado revestido com vidro, de 3 litros, equipado com controle de temperatura e pH (Applikon, Schiedam, Países Baixos). A cultura foi mantida como de rotina, transferindo-se a intervalos de 24 horas 180-200 ml de uma cultura em fermentação ativa para um fermentador con10 tendo uma batelada recém-preparada de meio de maltodextrina (vide Tabela

1). As fermentações foram feitas com maltodextrinas puras assim como com amido liqüefeito da Cargill Refinery em Blair (Nebraska, EUA) e xarope de glicose também da Cargill Refinery em Blair (Nebraska, EUA) (vide Tabela 1). Tabela 1

Composição do meio de fermentação para SSF e fermentações em glicose

Componente	Meio com amido liqüefeito	Meio com maltodextrina	Meio com glicose
Xarope de glicose DE 98, 51,7% de sólidos secos	-	-	800 g
Maltodextrina DE 11-14, 95% de sólidos secos	-	382 g	-
Amido liqüefeito DE 9-11, 35% de sólidos secos	1,1 I	-	-
Fosfato de diamônio	7g	7g	7,0 g
Giz (Whiting)	26,7 g	26,7 g	26,7 g
Extrato de levedura (65% DS)	3,4 g	3,4 g	3,4 g
Água desmineralizada (em I)	0,5 I	1,31	1,01
AMG E® (Novozymes), primeira porção no início da fermentação	0,65-0,7 ml	0,65-0,7 ml	-
AMG E® (Novozymes), segunda porção depois de 24 horas de fermentação	0,3-0,35 ml	0,3-0,35 ml

* ex Cargill, Blair, Nebraska, EUA.

A temperatura dos fermentadores foi controlada em 54-56°C por meio de banho de água circulante. O valor do pH foi um ajuste entre o pH ideal da enzima e o pH ideal para o Bacillus coagulans que foi adaptado em 5,65. A fermentação teve início a um pH 6,0 e como resultado da formação de ácido láctico permitiu uma queda. Atingido o pH de 5,55-5,75, o pH foi controlado pela adição automática de hidróxido de cálcio (250 g/l). Depois de 24 horas de fermentação, a cultura recebeu uma segunda porção de AMG E® (Novozymes). A fermentação foi deixada prosseguir até que cessasse a demanda de hidróxido de cálcio. Foi o que aconteceu depois de 3040 horas de incubação.

Resultados das experiências de SSF

O valor de referência para a fermentação SSF foi fixado pela fermentação com xarope de glicose (DE 98) como substrato. O estudo de SSF foi iniciado com uma preparação de maltodextrina da Roquette Freres (Glucidex® 12, DE 11-14) e terminou com sucesso. Duas preparações de glicoamilase foram extensivamente testadas: AMG E® da Novozymes (glicoamilase com alta atividade de desramificação) e Optimax® 7525 HP da Genencor (glicoamilase/pululanase). Uma fermentação SSF típica em maltodextrinas puras não continha açúcares residuais depois de 2 dias. Os açúcares residuais principais presentes eram glicose e isomaltose, no entanto, a uma concentração consistentemente mais baixa do que culturas equiparáveis que receberam xarope de glicose DE 98 como substrato. As concentrações de maltose eram baixas (< 50 mg/l) em comparação com as de culturas DE 98 operando a um pH de 6,4-6,6. Uma quantidade considerável de maltose foi introduzida na fermentação com a adição de Glucidex 12. O fato de que a maltose podia ser fermentada a um pH baixo foi uma descoberta importante. O rendimento de fermentação (mol de (S)-lactato produzido por mol de glicose consumida) foi ligeiramente maior que 100%. Ácidos orgânicos em caldo de SSF sem açúcar foram analisados e os níveis foram comparáveis com fermentações de Bacillus coagulans a um pH de 6,4-6,6. A um pH abaixo de 5,55 a fermentação SSF foi relativamente lenta. A um pH de 5,90 foi observado um aumento de 50% no açúcar residual total comparado com culturas operando a um pH entre 5,55 e 5,75. Resultados semelhantes foram obtidos usando o amido liqüefeito bruto. No estágio final, experiências de SSF bem-sucedidas foram feitas com hidrolisados de amido liqüefeito bruto. Não foram observadas diferenças entre a fermentação SSF em maltodextrinas purificadas e o amido liqüefeito da Cargill Refinery em relação ao tempo de fermentação. Ambas as fermentações SSF terminaram em 30-40 horas. As culturas contendo amido liqüefeito bruto ou maltodextrina como substrato continham tipicamente 180-200 g/l de (S)-ácido láctico. A pureza enantiomérica do ácido láctico foi maior que 99,5%.

Experiências de SSF usando vários microorganismos moderadamente termofílicos

Experiências de SSF foram conduzidas com Bacillus coagulans, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus smithii, Geobacillus stearothermophilus e uma mistura dos quatro. Aqui, as culturas foram desenvolvidas e usadas na sacarificação e fermentação combinadas de amido liqüefeito, usando o mesmo procedimento e as mesmas condições que aquelas usadas nas experiências de SSF acima descritas. Todos os microorganismos usados (inclusive a cultura mista) foram capazes de produzir ácido láctico com alta pureza ótica. Os resultados estão compilados na Tabela 2.

Tabela 2

SSF com vários microorganismos moderadamente termofílicos

Microorganismo	Rendimento de ácido láctico (g/l)	Pureza ótica (% de S-lactato)
Bacillus coagulans	35,5*	99,8
Bacillus smithii	18,3*	99,4
Bacillus thermoamylovorans	Ί4 4**	99,6
Geobacillus stearothermophilus	8,7**	99,3
Cultura mista de Bacillus coagulans, Bacillus smithii, Bacillus thermoamylovorans e Geobacillus stearothermophilus	13,9**	99,7

*) 4,5% de entrada de amido **) 1,6% de entrada de amido.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a produção de ácido láctico ou um sal do mesmo, onde amido é submetido a um processo de sacarificação e fermentação simultâneas, compreendendo:

sacarificar o amido em um meio compreendendo pelo menos uma glicoamilase, e no caso do amido estar em forma sólida, uma etapa de liquefação e, simultaneamente fermentar o amido em um pH de 5,35 a 5,80 e a uma temperatura de 50 a 60° C usando um microorganismo, e opcionalmente isolar o ácido láctico do meio, o referido método sendo caracterizado pelo fato de que um microorganismo produtor de ácido lático moderadamente termofílico é usado, o qual é adaptado a uma faixa de pH de 5,35 a 5,80 através da realização de transferências seriadas do microrganismo para um meio de fermentação em um pH de 5,6, e em que o referido microorganismo é derivado de uma cepa de Bacillus coagulans, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus smithii, Geobacillus stearothermophilus ou de uma misturas dos mesmos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o amido é sacarificado, fermentado e opcionalmente liquefeito em uma mistura de glicoamilase e pelo menos uma de pululanase e a-amilase.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é feito o ácido láctico ou um sal do mesmo com uma pureza enantiomérica maior que 95%.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH está entre 5,50 e 5,60.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a glicoamilase ou a mistura de glicoamilases com pelo menos uma de pululanase e α-amilase é adicionada em pelo menos duas porções.