BRPI0311201B1

BRPI0311201B1 - A method for inducing the expression of a nucleotide sequence of interest in a eukaryotic cell, a regulatory fusion protein, and a method for controlling the production of a product of a nucleotide sequence of interest in a eukaryotic cell

Info

Publication number: BRPI0311201B1
Application number: BRPI0311201-2A
Authority: BR
Inventors: P. Fandl James
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2002-05-29
Filing date: 2003-05-28
Publication date: 2017-08-08
Also published as: US7455988B2; US20030235886A1; EP1531666B1; JP2011152152A; AU2003237259B2; CA2485939A1; BRPI0311201B8; US20060107341A1; WO2003101189A1; US7514545B2; ES2439874T3; CA2485939C; AU2003237259A1; JP2005527227A; DK1531666T3; EP1531666A4; EP1531666A1; BR0311201A; JP4817657B2; MXPA04011679A

Abstract

"método para induzir a expressão de uma seqüência de nucleotídeos de interesse em uma célula eucariótica, seqüência de nucleotídeos isolada, proteína de fusão reguladora, célula eucariótica, animal transgênico, e, método para controlar a produção de um produto de uma seqüência de nucleotídeos de interesse em uma célula eucariótica". composições e métodos para a expressão indutível de genes em células eucarióticas. a expressão de uma seqüência de interesse é controlada por uma proteína de fusão reguladora que consiste de um domínio de bloqueio da transcrição e um domínio de ligação por ligando. quando o ligando cognato para o domínio de ligação por ligando está presente, a transcrição da seqüência de nucleotídeos de interesse é bloqueada. após a remoção do ligando cognato, a seqüência de nucleotídeos de interesse é transcrita. o método é útil para a produção em larga escala de um produto desejado em células eucarióticas.

Description

“MÉTODO PARA INDUZIR A EXPRESSÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DE INTERESSE EM UMA CÉLULA EUCARIÓTICA, PROTEÍNA DE FUSÃO REGULADORA, E, MÉTODO PARA CONTROLAR A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DE INTERESSE EM UMA CÉLULA EUCARIÓTICA” DECLARAÇÃO DOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 USC § 119(e) do Pedido Provisório U.S. n- 60/384.004, depositado em 29 de maio de 2002, pedido este que é especificamente incorporado como referência em sua totalidade neste pedido.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção diz respeito a métodos para a expressão indutível de genes em células eucarióticas. A invenção ainda inclui células capazes de expressão indutível de genes, animais transgênicos que incluam tais células, e sequências de nucleotídeos, e proteínas que compreendam proteínas de fusão reguladoras.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] Vários métodos para expressão controlada de uma sequência de nucleotídeos recombinante de interesse em uma célula, são conhecidos na técnica. Por exemplo, No et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 33463351, descrevem um sistema de expressão de genes indutível utilizando um transativador quimérico consistindo do receptor nuclear de eedisona fundido ao domínio de transativação VP16. Na presença do indutor, este transativador quimérico se liga às sequências de reconhecimento a montante de um promotor e estimula a transcrição de uma sequência de nucleotídeos de interesse. Na ausência do indutor, a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse é reduzida e dependente do nível basal da transcrição da sequência de nucleotídeos do promotor de interesse. Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5547-5551, descrevem um sistema para regular a expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse com base em uma proteína quimérica, tTA, consistindo da proteína repressora TetR fundida com o domínio de transativação de VP16. Semelhante ao sistema do eedisona, as sequências de DNA que especificam o sítio de ligação do DNA de TetR são introduzidas a montante do promotor de genes, de tal modo que a ligação da proteína de fusão VP16 de TetR estimule a transcrição do promotor e a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse. Outros sistemas alvejados para os sítios de ligação de DNA específicos próximos a um promotor mínimo para regulação alvejada da transcrição utilizando o domínio de transativação de VP16, foram também desenvolvidos, incluindo GAL4-VP16 (Sadowski et al. (1988) Nature 335: 563-564), LexA-VP16 (Brent et al. (1985) Cell 40: 729-736) e LacI-VP16 (Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3342-3356). Outros sistemas com base em TetR são descritos em Deuschle et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 1907-1914 e Yao et al. (1998) Hum. Gene Ther. 13: 1939-1950.

[0004] Os problemas resultantes da expressão defeituosa relacionada ao uso de um promotor mínimo têm conduzido a sistemas usando fusões dos domínios de ligação a esteróides dos receptores nucleares de glicocorticóides ou de estrogênios (ver, por exemplo, Mattioni et al. (1994) Methods Cell Biol. 43: 335-352; Louvion et al. (1993) Gene 131: 129-134; lida et al. (1996) J. Virol. 70: 6054-6059.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A presente invenção é direcionada a um sistema de expressão indutível rigorosamente regulado adequado para a produção em grande escala de uma molécula recombinante de interesse em célula eucariótica. Os componentes do sistema da presente invenção incluem uma proteína de fusão tendo um domínio de bloqueio da transcrição e um domínio de ligação de ligante; um operador que liga o domínio de bloqueio da transcrição da proteína de fusão para inibir a transcrição de uma sequência de nucleotídeos; e um promotor que está sob o controle do operador. Quando se deseja que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse seja inibida, o sistema inclui um ligante que é capaz de se ligar ao domínio de ligação de ligante da proteína de fusão, de tal modo que a proteína de fusão seja estabilizada. Quando seja desejável que a sequência de nucleotídeos de interesse seja expressa, o ligante é removido, o que resulta na desestabilização e degradação da proteína de fusão. Consequentemente, na ausência do ligante cognato, a proteína de fusão é removida do operador, e a inibição do operador do promotor que controla a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse é removia, dessa forma permitindo que a sequência de nucleotídeos de interesse seja expressa.

[0006] Em um primeiro aspecto, a invenção diz respeito a um método para induzir a expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula eucariótica, que compreende (a) prover uma célula eucariótica compreendendo (i) uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de fusão reguladora (RPR), em que a proteína de fusão consiste de (1) um domínio de bloqueio da transcrição capaz de inibir a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse, e (2) um domínio de ligação de ligante; (ii) um promotor operavelmente ligado à sequência de nucleotídeos de interesse e controlado por um operador que liga a proteína de fusão; (iii) um operador capaz de ligar o domínio de bloqueio da transcrição e a transcrição de bloqueio do promotor adjacente; (b) cultivar a célula da etapa (a) em uma densidade desejada na presença de um ligante que se liga ao domínio de ligação de ligante da proteína de fusão, em que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse seja inibida; e (c) remover o ligante da presença da célula, em que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse é induzida.

[0007] O domínio de bloqueio da transcrição é uma proteína capaz de ligar-se ao DNA e bloquear a transcrição de um promotor adjacente. Na forma de realização mais específica, o domínio de bloqueio da transcrição pode ser derivado de uma proteína bacteriana, bacteriófaga, eucariótica ou repressora da levedura. Nas formas de realização mais específicas, o domínio de bloqueio da transcrição se origina de uma proteína bacteriana ou repressora do bacteriófago. Em formas de realização ainda mais específicas, o domínio de bloqueio da transcrição se origina de uma proteína repressora selecionada do grupo consistindo de TetR, LexA, LacI, TrpR, Are e LambdaCl. Em outra forma de realização, o domínio de bloqueio da transcrição é derivado de uma proteína repressora eucariótica. Em uma forma de realização ainda mais específica, o domínio do repressor é derivado de GALA

[0008] Em outra forma de realização específica do método da invenção, o domínio de bloqueio da transcrição é uma enzima de restrição capaz de ligar, mas não de clivar, o DNA, e o operador é um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição. Em uma forma de realização mais específica, o domínio de bloqueio da transcrição é um Notl transformado.

[0009] Nas formas de realização específicas, o domínio de ligação de ligante origina-se de um receptor esteróide, tireóide ou retinóide. Em formas de realização mais específicas, o domínio de ligação de ligante deriva-se de um receptor de estrogênio e o ligante cognato é um estrogênio. Em uma forma de realização ainda mais específica, o receptor de estrogênio contém uma ou mais mutações, por exemplo as mutações T2, e o ligante cognato é tamoxifeno.

[0010] Uma variedade de células eucarióticas pode ser usada no método da invenção, incluindo, sem limitação, uma célula de levedura, tal como a Pichia pastoris, ou uma célula de mamífero, tal como uma célula de COS, CHO, 293, BHK ou NS0.

[0011] A presente invenção pode ser amplamente usada na transcrição de uma sequência de nucleotídeos de interesse, e o produto de interesse pode ser o produto da transcrição, por exemplo um mRNA ou RNA cataliticamente ativo, ou um produto de jusante resultante da sequência de nucleotídeos transcrita de interesse, por exemplo uma proteína ou fragmento de proteína, incluindo, sem limitação, um hormônio, um receptor ou fragmento de receptor, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um peptídeo ou proteína biologicamente ativos, uma enzima, uma proteína repressora, ou uma proteína de ligação a DNA.

[0012] Em um segundo aspecto, a invenção retrata uma sequência de nucleotídeos isolada codificando uma proteína de fusão reguladora (RPR), em que a proteína de fusão consiste de (1) um domínio de bloqueio da transcrição capaz de inibir a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse, e (2) um domínio de bgação de ligante, em que, na presença de um ligante cognato capaz de ligar o domínio de ligação de bgante, a proteína de fusão é estabilizada.

[0013] Em formas de realização separadas, o domínio de bloqueio da transcrição pode ser derivado de uma proteína repressora bacteriana, bacteriófaga, eucariótica ou de levedura. Em formas de realização mais específicas, o domínio de bloqueio da transcrição se origina de uma proteína repressora bacteriana ou bacteriófaga, tal como, por exemplo, TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc e LambdaCl. Em outra forma de realização, o domínio de bloqueio da transcrição é derivado de uma proteína repressora eucariótica, tal como, por exemplo, GALA Em outra forma de realização específica, o domínio de bloqueio da transcrição é a enzima de restrição mutada capaz de ligar-se, mas não de clivar, ao DNA, e o operador é um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição. Nesta forma de realização específica, por exemplo, o domínio de bloqueio da transcrição é Notl transformado.

[0014] Em formas de realização específicas, o domínio de ligação de ligante é derivado de um receptor esteróide, tiróide ou retinóide. Em formas de realização mais específicas, o domínio de ligação de ligante origina-se de um receptor de estrogênio, e o ligante cognato é um estrogênio. Em uma forma de realização ainda mais específica, o receptor de estrogênio contém uma ou mais mutações, por exemplo as mutações T2, e o ligante cognato é tamoxifeno.

[0015] Em um terceiro aspecto relacionado, a invenção caracteriza uma proteína de fusão reguladora (RPR), consistindo de (1) um domínio de bloqueio da transcrição capaz de inibir a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse, e (2) um domínio de ligação de ligante, em que, na presença de um ligante cognato capaz de ligar o domínio de ligação de ligante, a proteína de fusão é estabilizada. Em uma forma de realização específica, a proteína de fusão reguladora (RPR), consistindo essencialmente de (1) um domínio de bloqueio da transcrição capaz de inibir a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse, e (2) um domínio de ligação de ligante, em que, na presença de um ligante cognato capaz de ligar o domínio de ligação de ligante, a proteína de fusão é estabilizada.

[0016] Em um quarto aspecto, a invenção caracteriza uma célula eucariótica capaz de expressão indutível de uma sequência de nucleotídeos de interesse, compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de fusão reguladora, em que a proteína de fusão consiste de (1) um domínio de bloqueio da transcrição capaz de inibir a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse, e (2) um domínio de ligação de ligante; (ii) um promotor operavelmente ligado à sequência de nucleotídeos de interesse e controlado por um operador que liga a proteína de fusão; e (iii) um operador capaz de ligar o domínio de bloqueio da transcrição e a transcrição de bloqueio do promotor adjacente. Em uma forma de realização específica, a célula eucariótica da proteína de fusão consiste essencialmente de (1) um domínio de bloqueio da transcrição capaz de inibir a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse, e (2) um domínio de ligação de ligante; (ii) um promotor operavelmente ligado à sequência de nucleotídeos de interesse e controlado por um operador que liga a proteína de fusão; e (iii) um operador capaz de ligar o domínio de bloqueio da transcrição e a transcrição de bloqueio do promotor adjacente.

[0017] Em um quinto aspecto, a invenção delineia um animal transgênico compreendendo uma célula eucariótica capaz de expressão indutível de uma sequência de nucleotídeos de interesse, compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de fusão reguladora, em que a proteína de fusão consiste de (l) um domínio de bloqueio da transcrição capaz de inibir a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse, e (2) um domínio de ligação de ligante; (ii) um promotor operavelmente ligado à sequência de nucleotídeos de interesse e controlado por um operador que liga a proteína de fusão; e (iii) um operador capaz de ligar o domínio de bloqueio da transcrição e a transcrição de bloqueio do promotor adjacente.

[0018] Outros objetos e vantagens se tornarão evidentes de um exame da descrição detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0019] A Figura 1 representa a estrutura de pTE313, projetada para a expressão de TetR-ERLBi>T2 do promotor de CMV.

[0020] A Figura 2 representa a estrutura de pTE158, projetada para a expressão de FcyRI de um promotor de CMV que é regulado pelo repressor de tetracíclina.

[0021] A Figura 3 apresenta um esboço das duas estratégias usadas para isolar os clones Kl de CHO que expressaram o gene hFcyRI regulado pela RFP TetR-ERLBi)T2.

[0022] A Figura 4 apresenta histogramas de citometria de fluxo do clone Dl24 deK 1 -FcR/pTE313 de CHO cultivado na presença ou ausência de OHT, ou na presença de OHT e Dox, manchado com FITC-Fc.

[0023] A Figura 5 é um diagrama esquemãtico da proteína de fusão Arc2-ERLBDT2.

[0024] A Figura 6 é um diagrama esquemãtico do promotor híbrido CMV-MIE/AO (SEQ ID NO: 6) tendo operadores de arco em tandem imediatamente a jusante do promotor/íntensificador de CMV-MIE (TATA boxe), [0025] A Figura 7 apresenta histogramas de citometria de fluxo do clone €17 de KI-FeR/pTE534 de CHO cultivado na presença ou ausência de OHT, manchado com FITC-Fc.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] Ames que os métodos presentes sejam descritos, deve ficar entendido que esta invenção não fica limitada aos métodos particulares e às condições experimentais descritas, já que tais métodos e condições podem variar. Fica também entendido que a terminologia usada neste relatório tem por fim. descrever formas de realização particulares apenas, e não se pretende que seja limitatíva, tendo em vista que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0027] Como usadas neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente declare de outra forma. Assim, por exemplo, a referências a “um método” incluem um ou mais métodos, e/ou etapas do tipo aqui descrito e/ou que se tornem evidentes àquelas pessoas versadas na técnica após leitura desta apresentação, e assim por diante.

[0028] A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de experiência normal na técnica a que esta invenção pertence. Não obstante quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas neste relatório ficam aqui incorporadas como referência para descrever os métodos e/ou os materiais em conexão com os quais as publicações sejam citadas.

DESCRIÇÃO GERAL

[0029] A presente invenção baseia-se em parte no conceito de que a expressão de genes em células eucarióticas pode ser rigorosamente regulada com o uso de um promotor forte que seja controlado por um operador que, por sua vez, seja regulado por uma proteína de fusão reguladora (RFP). A RFP consiste essencialmente de um domínio de bloqueio da transcrição, e um domínio de ligação de ligante que regula sua atividade. Na presença do ligante cognato para o domínio de ligação de ligante, a RFP se liga ao operador, dessa forma impedindo a transcrição do GOI. Quando o ligante cognato é suprimido, a RFP é desestabilizada e a transcrição da sequência de nucleotídeos de interesse prossegue.

[0030] O sistema regulador descrito neste relatório provê vantagens específicas que combinam um controle de expressão rigorosamente regulado de uma sequência de nucleotídeos de interesse, com o isolamento de linhagens celulares capazes de expressão de alto nível da sequência de nucleotídeos de interesse adequadas para produção em larga escala. A expressão “rigorosamente regulada” denota que, na presença de um ligante que se liga ao domínio de ligação de ligante da proteína de fusão da invenção, a transcrição da sequência de nucleotídeos de interesse é substancialmente reduzida, por exemplo uma redução de 20 vezes na transcrição é obtida na presença do ligante em relação ao nível de transcrição observado na ausência do ligante. Em formas de realização mais específicas, o método da invenção obtém uma redução de pelo menos 50 vezes na transcrição na presença de ligante. Em formas de realização ainda mais específicas, o método da invenção obtém uma redução de 100 vezes ou mais na transcrição na presença do ligante. Exemplos dos graus de controle da transcrição obtidos pelos métodos da invenção são observados nas Figuras 4 e 7. O grau de regulação da transcrição obtido pelo método da invenção, que pode também ser estabelecido como uma diferença na expressão da sequência de nucleotídeos de interesse na ausência do ligante, é pelo menos 20 vezes maior, preferivelmente 50 vezes maior, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes maior, do que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse na presença do ligante.

[0031] O isolamento de linhagens celulares capazes de expressar uma sequência de nucleotídeos de interesse em altos níveis requer regulação rigorosa, mas a indução da sequência de nucleotídeos da expressão de interesse é preferivelmente realizada mediante remoção de um indutor, em vez da adição de um, é de substancial importância como um meio de reduzir o custo da produção em relação a um sistema que requeira a adição de um ligante durante a produção de larga escala. A presente invenção descreve um sistema regulador que satisfaz a estas exigências.

SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DE INTERESSE

[0032] Os métodos da invenção podem ser amplamente usados para controlar a transcrição de qualquer sequência de nucleotídeos de interesse. O método da invenção pode ser usado para produzir uma proteína desejada ou fragmento de proteína, incluindo, por exemplo, proteínas de fusão ou quiméricas ou peptídeos. Além disso, o produto de interesse pode ser um produto de transcrição, por exemplo um mRNA ou RNA cataliticamente ativo, ou um produto de jusante resultante da ação do produto de transcrição inicial.

[0033] As proteínas de interesse podem incluir, sem limitação, um hormônio, um receptor ou fragmento de receptor, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um peptídeo ou proteína biologicamente ativos, uma enzima, uma proteína repressora, ou uma proteína de ligação a DNA. PROMOTORES

[0034] “Promotor”, como aqui usado, indica uma sequência de DNA suficiente para dirigir a transcrição de uma sequência de DNA à qual ela está operavelmente ligada, isto é, ligada de uma tal maneira de modo a permitir a transcrição da sequência de nucleotídeos de interesse, quando os sinais apropriados estiverem presentes. A expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser colocada sob o controle de qualquer promotor ou elemento intensificador conhecido na técnica.

[0035] Promotores úteis que podem ser usados na invenção incluem, sem que a estes fiquem limitados, a região promotora prematura SV40, o promotor contido na repetição terminal longa de 3’ do vírus do sarcoma de Rous, as sequências reguladores do gene da metalotioneína, o promotor do citomegalovírus IE de camundongo ou humano [Gossen et al., (1995) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 89: 5547-5551); vetor de expressão de plantas compreendendo a região do promotor da nopalina sintetase, o promotor de RNA do vírus 35S mosaico da couve-flor, e o promotor da enzima fotossintética ribulose-bifosfato carboxilase; elementos promotores da levedura ou de outros fundos, tais como o promotor Gal 4, o promotor ADC (álcool desidrogenase), o promotor da PGK (fosfoglicerol cinase), o promotor da fosfatase alcalina, e as seguintes regiões de controle transcricional de animais, que apresentam especificidade tecidual e têm sido utilizadas em animais transgênicos: elastase I, insulina, imunoglobulina, vírus tumorais mamários de camundongos, albumina, α-fetoproteína, αΐ-antitripsina, β-globina e a cadeia-2 leve de miosina.

OPERADORES

[0036] Como aqui usado, “operador” indica uma sequência de DNA que é introduzida em um gene ou está perto dele de uma maneira tal que o gene pode ser regulado pela ligação da RFP ao operador e, como resultado, impede ou permite a transcrição do GOI. Diversos operadores em células procadóticas e bacteriófagas têm sido bem caracterizados (Neidhardt, ed. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology 2d. Vol. 2 ASM Press, Washington D.C. 1996). Estes incluem, sem que fiquem a estes limitados, a região do operador do gene LexA de E. coli, que liga o peptídeo LexA e os operadores da lactose e do triptofano, que liga as proteínas repressoras codificadas pelos genes LacI e trpR de E. coli. Estes também incluem os operadores de bacteriófagos dos genes lambda Pr e fago P22 ant/mnt ligam as proteínas repressoras codificadas pelo lambda cl e P22 arc. Em uma forma de realização alternativa, quando o domínio de bloqueio da transcrição da RFP é uma enzima de restrição, o operador é a sequência de reconhecimento para aquela enzima. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que o operador deve ficar localizado adjacente ou em 3’ ao promotor, de tal modo que ele seja capaz de controlar a transcrição pelo promotor. Por exemplo, a Patente U.S. n- 5.972.650, que é aqui incorporada por referência, especifica que as sequências tetO fiquem dentro de uma distância específica da TATA boxe. Em formas de realização específicas, o operador é preferivelmente colocado imediatamente a jusante do promotor. Em outras formas de realização, o operador é colocado dentro de 10 pares de base do promotor.

DOMÍNIO DE BLOQUEIO DA TRANSCRIÇÃO

[0037] Como aqui usado, um domínio de bloqueio da transcrição é qualquer domínio capaz de bloquear a transcrição como um resultado de sua interação com um operador. Um tal domínio pode ser derivado de bactérias, bacteriófago ou levedura, e inclui, mas sem limitar, aqueles repressores, ou seus derivados, cuja função depende da ligação de ligante, tal como TetR, LexA, LacI e Arc. Altemativamente, o domínio de bloqueio da transcrição pode ser derivado de células de mamíferos como descrito, por exemplo, em Yin et al. 1995 J. Virol. 69: 6209-6218, ou células de plantas, como descrito, por exemplo, em Wilde et al. 1994 Plant Mol. Biol. 24: 38. O domínio de bloqueio da transcrição pode também ser feito sinteticamente. Por exemplo, o domínio de bloqueio da transcrição pode ser uma enzima de transcrição que seja transformada de tal modo que ela não mais possa clivar o DNA. Em um tal caso, a sequência de reconhecimento para aquela enzima deve ser usada como o operador.

DOMÍNIO DE LIGAÇÃO DE LIGANTE

[0038] Embora a capacidade da proteína de fusão para interagir com o operador seja controlada pelo domínio de bloqueio da transcrição, a atividade da proteína de fusão é regulada pelo domínio de ligação de ligante. O domínio de ligação de ligante pode originar-se de qualquer polipeptídeo que, quando ligado ao seu ligante cognato, toma o polipeptídeo funcional, incluindo, por exemplo, estabilização do polipeptídeo. O domínio de ligação de ligante intenta incluir domínios de ligação de ligante de ocorrência natural, bem como seus derivados funcionais. Como aqui usado, “ligante cognato inclui os ligantes de ocorrência natural que liga os domínios de ligação ao ligante, assim como os seus derivados funcionais. Exemplos de tais domínios de ligação de ligante incluem, mas não ficam limitados a estes, os domínios de ligação de ligante de receptores esteróides, receptores glicocorticóides, receptores retinóides e receptores tireóides (Eilers et al. (1989) Nature 340: 66-68; Picard et al. (1988) Cell 54: 1073-1080). Os Exemplos 1 a 3 ilustram uma forma de realização da invenção, em que o domínio de bloqueio da transcrição da proteína de fusão é TetR e o domínio de ligação de ligante é o domínio de ligação de ligante do receptor de estrogênio com as mutações T2 (ERlbdT2; Feil et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 237: 752-757). Quando as sequências TetO foram colocadas a jusante e próximas ao promotor CMV-MIE forte, a transcrição da sequência de nucleotídeos de interesse (neste caso hFcYRI) do promotor de CMV-MIE/TetO foi bloqueado na presença de tamoxifeno e desbloqueado pela remoção do tamoxifeno. METODOLOGIAS DE SELEÇÃO CELULAR

[0039] Os métodos da invenção produzem células que têm um índice de produção elevado para uma sequência de nucleotídeos de interesse. Além dos métodos descritos na seção experimental abaixo, uma variedade de processos de seleção conhecidos na técnica pode ser usada. Em uma forma de realização preferida, o processo de seleção é a metodologia “FASTR” descrita na USSN 20020168702 publicada em 14 de novembro de 2002, aqui especificamente incorporada como referência. A metodologia FASTR é um método de triagem de alta produção para isolamento rápido de células que secretam uma proteína de fusão específica da citocina da invenção, mediante triagem direta da proteína de fusão.

ANIMAIS TRANSGÊNICOS

[0040] A presente invenção também considera a criação de mamíferos transgênicos que expressem as proteínas de fusão da invenção. Por exemplo, pode ser desejável regular a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse em um mamífero. Um gene que codifique as proteínas de fusão da invenção pode ser integrado no genoma de um mamífero de modo a regular a expressão de uma sequência de interesse cujo promotor tenha sido engendrado como sendo responsivo à proteína de fusão. Além disso, os animais transgênicos podem ser úteis como uma fonte de uma sequência de nucleotídeos de interesse.

[0041] Um animal transgênico pode ser produzido pela introdução de uma construção de ácido nucléico nos pró-núcleos masculinos de um oócito fertilizado, por exemplo por microinjeção, infecção retroviral, e permitindo-se que o oócito se desenvolva em um animal fêmea adotado com pseudogravidez. Qualquer uma das sequências reguladoras ou outras úteis nos vetores de expressão pode fazer parte da sequência transgênica. Sequência(s) reguladora(s) especifica(s) do tecido pode(m) ser operavelmente ligada(s) ao transgene para dirigir a expressão do transgene às células particulares.

KITS

[0042] A invenção também fornece um kit compreendendo um ou mais recipientes enchidos com pelo menos uma proteína de fusão da invenção. Opcionalmente associado com tal(is) recipiente(s) pode haver uma observação na forma prescrita por uma agência governamental regulando a fabricação, o uso ou a venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, observação esta que reflita (a) a aprovação pela agência, da fabricação, uso ou venda para administração humana, (b) diretrizes para uso, ou ambas. FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS

[0043] O Exemplo 1 descreve a construção dos plasmídeos pTE313, pTE084 e pTE158. O pTE313, foi projetado para expressão de alto nível de uma proteína de fusão reguladora TetR-ERLBoT2. Ele contém um primeiro cassete de expressão independente, que é o gene de fusão TetR-ERLBoT2 conduzido pelo promotor CMV-MIE, e o segundo cassete independente que é o gene de resistência à blasticidina conduzido pelo promotor SV40 (Figura 1). O pTE084 foi projetado para a expressão de alto nível de hFcyRI, o receptor superficial de celular de alta afinidade para o domínio do IgG humano. O pTE158 foi gerado pela colocação de dois operadores TetR em tandem imediatamente a jusante do promotor/intensificador CMV-MIE em pTE084. (Figura 2). As células Kl de CHO expressando o gene hFcyRI regulado pela RFP de TetR-ERLBDT2 após a transfecção com pTE313 foram geradas e identificadas como descrito no Exemplo 2.

[0044] Duas estratégias foram empregadas para isolar clones que expressavam o gene hFcyRI regulado pela RFP de TetR-ERLBDT2 após a transfecção com pTE313 (Figura 3). Ambas as estratégias iniciaram do mesmo conjunto de células obtido após a introdução da RFP de TetR-ERLBDT2 nas células Kl-FcR de CHO e isolamento (Exemplo 3). Estes resultados mostram claramente que a expressão de um gene recombinante pode ser rigorosamente regulada por TetR-ERLBoT2 e a indução da expressão pode ser obtida ou pela adição de doxiciclina na presença de tamoxifeno ou pela remoção do tamoxifeno (Figura 4). A indução da expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse pela remoção de uma molécula pequena do meio de cultura, facilmente obtida por diluição ou troca de meio, provê um meio de custo atrativo para induzir a expressão em larga escala. Além disso, estes dados mostram que a regulação rigorosa da expressão pode ser obtida pela proteína de fusão reguladora TetR-ERLBDT2.

[0045] Células Kl de CHO expressando hFcyRI conduzidas pelo promotor CMV-MIE/Arc02 foram geradas como descrito nos Exemplos 4 e 5. As linhagens celulares indutíveis reguladas por Atc-ERlbdT2 foram selecionadas à semelhança das estratégias apresentadas na Figura 3, e apresentarem regulação rigorosa em resposta à presença de OHT no meio de crescimento (Exemplo 6 e Figura 7).

EXEMPLOS

[0046] O seguinte exemplo é desenvolvido de modo a proporcionar àqueles de experiência normal na técnica uma apresentação e descrição completas de como produzir e usar os métodos e composições da invenção, e não se intenta limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços foram feitos para garantir precisão com respeito aos números usados (por exemplo quantidades, temperatura etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. A menos que de outra forma indicado, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é em graus centígrados, e a pressão é a atmosférica ou próxima a ela. EXEMPLO 1. CONSTRUÇÃO DE pTE313, pTE084 E pTE158 [0047] pTE313 foi construído pela ligação de um fragmento (embotado) de EcoR I de 975 pares de base a partir do pTA-ERlbd-T2 que codifica o domínio de ligação de ligante do receptor de estrogênio humano com as mutações T2 (ERlbdT2) (Feil et al. 1997 Biochem Biophys Res Commun 237: 752-757) no sítio de EcoR I (embotado, na região ligadora imediatamente a seguir do término C de TetR) de pcDNA6/TR (Invitrogen Cat. n- V-1025-20). As mutações de T2 G400V, M543A e L544A conferem especificidade para ligar o análogo de estradiol doxiciclina. A orientação apropriada do fragmento codificando ERlbdT2 em plasmídeos desejáveis resultante da ligação foi confirmada por determinação da sequência de DNA. Esta construção resultou em um gene codificando uma proteína de fusão consistindo de aminoácidos MI a S207 de TetR (acesso do Genbank AAF75608; SEQ ID NO:7) fundido aos aminoácidos N304 a V595 do receptor de estrogênio (acesso do Genbank P03372; SEQ ID NO:8). A proteína quimérica codificada por este gene também tem as mutações de T2 G400V, M543A e L544A no receptor de estrogênio. O plasmídeo pTE313 contém um cassete que é o gene de fusão TetR-ERLBDT2 conduzido pelo promotor CMV-MIE, e um segundo cassete que é o gene de resistência à blasticidina conduzido pelo promotor SV40 (Figura 1).

[00481 pTE084 foi construído pela ligação ao fragmento Xba I de 1.436 pares de base a partir de pCAElOO que codifica o FcyRI humano (número de acesso do GenBank M21Ü91; SEQ ID NO:9) no sítio Xba I de pRG821, um vetor que codifica o gene da neomicina fosfotransferase II (npi) que confere resistência a G418, A orientação do hFcgRI nos plasmídeos desejáveis resultantes da ligação foi examinada por mapeamento da restrição com Not I, Pst I, Eco RI e Stu I. Um fragmento de DNA codificando dois operadores de TerR em tandem foi colocado imediatamente a jusante do promotor/intensificador de CMV-MIE em pTE084 para gerar pTE158 (Figura 2). Neste plasmídeo, a transcrição de hFeyRI do promotor CMV-MIE foi regulada por TetR ou TetR-ERi.RpTl. EXEMPLO 2, CONSTRUÇÃO DE UM DERIVADO Kl DE CHO QUE EXPRESSA hFeyRI CONDUZIDO POR CMV-MIE/TetO.

[0049] Células Kl de CHO (3 x IO6 células) foram transfectadas com pTE158 com o uso de Lipofectamine® (Life Technologies; Rockville, MD), seguindo-se as sugestões do fabricante. As células foram colocadas no meio de cultura (10% de soro bovino fetal, 90% de F-2 de Ham, L-glutamina 2 mM; todos os reagentes foram da Life Technologies, Rockville, MD) contendo 500 ug/ml de G418 (Life Technologies) por 12 dias. As células resistentes a G418 foram tripsinizadas, reunidas e manchadas com IgG humano conjugado a FITC, fragmento Fe (FITC-hFc; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Resumidamente, as células cultivadas em placas de cultura de 10 cm foram lavadas uma vez com solução salina tamponada de fosfato (PBS) da Dulbecco sem cloreto de cálcio, e cloreto de magnésio (Life Technologies). Dois mililitros de tripsina 0,25 % (Life Technologies) foram adicionados a cada placa e incubados a 37 °C por 4 a 5 minutos. As placas foram redemoinhadas até que as células delas se separassem). Quatro mililitros do meio de cultura foram imediatamente adicionados a cada placa das células separadas. As células foram então coletadas por centrifugação em 1.000 x g por 4 minutos, depois recolocadas em suspensão em 4 ml de 2 ug/ml de FITC-hFc diluído em meio de cultura. As células foram depois colocadas em uma batedeira de plataforma e manchadas por uma hora em temperatura ambiente. Para remover FITC-hFc não ligado, as células foram lavadas por duas vezes com 8 ml de PBS. As células lavadas capazes de ligar FITC-hFc foram medidas por citometria de fluxo em um separador de células Moflo® (Cytomation; Fort Collins, CO). O FITC-hFc não manchou as células Kl de CHO parental não transfectadas, mas deu origem a uma distribuição de fluorescência no conjunto resistente a G418 transfectado de pTE158. O conjunto total de células fluorescentes da população resistente a G418 foi coletado por citometria de fluxo, expandido, depois analisado por citometria de fluxo quanto à expressão de hFcyRI. As células possuindo fluorescência mais elevada do que 15 % nesta população foram isoladas, reunidas em conjunto, e expandidas para produzir uma população de células resistentes a G418 que expressassem hFcyRI em níveis elevados. Esta população de células foi denominada Kl-FcR de CHO e foi usada para isolar um clone que expressasse o gene hFcyRI regulado pela RFP

TetR-ERLBDT2 após transfecção com pTE313. EXEMPLO 3. CONSTRUÇÃO DE LINHAGENS CELULARES Kl DE CHO COM EXPRESSÃO hFcyRI REGULADA POR TetR-ERLBDT2. 10050] Células Kl-FcR de CHO (2 x IO6 células) foram transfectadas com pTE313 usando-se Lipofectamine®. As células transfectadas foram selecionadas com 500 ug/ml de G418 e 10 ug/ml de blasticidina por 14 dias para selecionar ambos os plasmídeos, o pTE158 e o pTE313. Dois dias antes da análise por citometria de fluxo, as células foram incubadas em meio de cultura contendo tamoxifeno 200 nM (OHT) para estabilizar a atividade do TetR-ERLBDT2 e reprimir a expressão de hFcgRl. As células foram manchadas com FITC-hFc e aquelas células que possuíam a fluorescência mais baixa que 2 %, indicando repressão de hFcyRI, foram coletadas para produzir o conjunto Al. Este conjunto foi então usado como a fonte das células para as duas estratégias delineadas na Figura 3.

[0051J Os clones que expressavam hFcyRI regulado por TetR- ERlbj>T2 foram isolados manipulando-se a atividade de TetR-ERi.BnT2 pela presença ou ausência da doxiciclina (Dox). Uma estratégia envolveu o isolamento das células que expressavam altos níveis de hFcyRI na presença de OHT e Dox, seguido pelo isolamento de células que não expressavam na presença de OHT sem Dox. Aiternativamente, as células que expressavam baixos níveis de hFcyRI na presença de OHT sem Dox foram primeiro isoladas, depois as células de expressão elevada foram isoladas deste conjunto pela indução com Dox na presença de OHT. Ambas as estratégias utilizaram uma série de isolamentos celulares sob condições de indução alternada ou de repressão, c um isolamento final de células isoladas que expressavam altos níveis de hFCyRl na ausência tanto de OHT quanto de Dox (Figura 3).

[0052] O conjunto Al foi expandido por 7 dias na presença de OHT 200 nM, depois fragmentado em duas placas; uma placa continha meio com 1 ug/ml de Dox e a outra não. As células foram incubadas por três dias, depois manchadas com FITC-hFc para detectar a presença de hFCyRI. O máximo de 60 % de células positivas de hFCyRI da cultura induzida com 1 ug/ml de Dox foi isolado para produzir o conjunto BI 1, e as células com fluorescência de no mínimo 30 % foram isoladas das células cultivadas no meio sem Dox para produzir o conjunto B12. O conjunto Bll foi cultivado em tamoxifeno 200 mM sem Dox e as células com a fluorescência mais baixa do que 1 % foram coletadas para produzir o conjunto Cll. O conjunto B12 foi cultivado em OHT 200 mM e 1 ug/ml de Dox, e o máximo de 1 % de células positivas de hFCyRI foi coletado como um conjunto para produzir o conjunto C12. Tanto o conjunto Cll quanto o conjunto C12 foram então expandidos na ausência tanto de OHT quanto de Dox. As células que expressavam os mais elevados níveis de hFCyRI (máximo de 1 %) na ausência de OHT e de Dox, foram então separadas em placas de 96 reservatórios em uma célula por reservatório. Estas células deveríam ter baixa expressão não induzida de hFcyRI e altos níveis de hFcyRI quando induzidas pela remoção do OHT como uma consequência de se alternar o isolamento da expressão de hFcyRI induzida ou reprimida.

[0053] Após a expansão, dez clones individuais foram caracterizados quanto à indução de hFcyRI, mediante a remoção de OHT ou a adição de 1 ug/ml de Dox, por imunomanchamento com FITC-hFc e análise por citometria de fluxo. A análise de um clone (D124 do conjunto C12) não apresentou nenhum nível detectável de hFcyRI quando o OHT estava presente sem Dox, ao passo que altos níveis de expressão de hFcyRI foram observados na ausência de OHT e Dox. Além disso, a adição de Dox em 1 μg/ml às células cultivadas na presença de OHT também resultou em altos níveis de expressão de hFcyRI. O nível de expressão de hFcyRI neste clone, que resultou da indução ou pela remoção de OHT ou de 1 ug/ml de doxiciclina, na presença de OHT, foi indistinguível (Figura 4). EXEMPLO 4. CONSTRUÇÃO DE pTE528, pTE529 E pTE534.

[0054] O gene repressor de Arc do fago P22 codifica um repressor transcricional de 53 aminoácidos (Ml a A53 codificados pelos nucleotídeos 38.336 a 38.494 do DNA genômico do fago P22 (acesso do GenBank NC002371). A repressão da transcrição mediada por Arc envolve a adição sequencial de dímeros aos meios sítios do operador. Foi anterior mente mostrado que um dímero de cadeia única consistindo de duas proteína Arc conectada por um iigador de 15 aminoácidos linha afinidade mais elevada quanto ao DNA do operador de arc do que o repressor do tipo selvagem [Robinson et ai. (1996) Biochemistry 35: 109-116). Para tirar vantagem da maior afinidade do dímero de cadeia única para o DNA do operador, foi projetado um DNA sintético que codificava este dímero de Arc de cadeia única fundido a uma sequência His tag consistindo de 6 resíduos de histidina. Este fragmento de DNA Xhol/Notl sintético de 444 pares de base, foi clonado em pUCl 19 para produzir pUCl 19-Àrc2-His6 (Blueheron Technology Inc.). O gene diméríco Arc2 foi então exdsado deste plasmídeo e clonado nos sítios Xhol e Notl de pRG985, de tal modo que a expressão do gene Arc2 ficou dependente do íntron de promotor Ubc/p-globina, para produzir pTE528.

[0055] A proteína de fusão Afc2-ERlbdT2 (Figura 5) foi construída pela ligação de um fragmento BamH I de 3361 pares de base do pTE502, que contém o DNA codificando ERlbdT2 humano como descrito acima, aos sítios BamH í de pTE528 para produzir pTE529. A proteína de fusão Arc2-ERlbdTZ tinha o mesmo Iigador de 11 aminoácidos (AYSGSRELIRL) (SEQ ID NO: 1) entre o gene Arc2 e o gene ERi.BdT2 como entre TetR e ERi bdT2 em TetR-ERLBDT2 (SEQ ID NO: 3).

[0056] Para mudar os operadores Tet do promotor CMV-MIE/TO para os operadores Arc, codificados por 38.273 a 38.293 pares de base no genoma do fago P22 (acesso do Genbank NC002371), o pTE 158 foi usado como um padrão para ampliar um fragmento de DNA por PCR com o seguinte ajuste de iniciador (5’-GAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTT-3’ (SEQ ID NO: 4) e 5‘ G AG AG ATCTG AGTCG AC AT AGT AGAGTGC-TTCTATCATGAATAGTAGAGTGCTTCTATCATGAGCTCTGCTTATAT AGACCTCCCA-3 ’) (SEQ ID NO: 5). O produto da PCR, codificando operadores Àrc em tandem, foi digerido com Ndel e Sall nos mesmos sítios em pTE158. O promotor híbrido CMV-MIE/AO tem dois operadores are em tandem imediatamente a jusante do promotor/intensifícador CMV-MIE (Figura 6) (SEQ ID NO: 6), Consequentemente, o repressor transcricional Arc2- ERlbdT2 regulara a transcrição do hFcyRI do promotor CMV-MIE/AO em pTE534. EXEMPLO 5, CONSTRUÇÃO DE UM DERIVADO Kl DE CHO QUE EXPRESSA hFcyRI CONDUZIDO PELO PROMOTOR MIE/Arc02.

[0057] Células Kl de CHO (2 x 106} foram transfectadas com pTE534 usando-se Lipofectamine® como descrito acima. As células foram colocadas no meio de cultura (10 % de soro bovino fetal, 90 % de F-12 de Ham, L-glutamina 2 mM; todos os reagentcs foram da Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) contendo 400 ug/ml de G418 (Invitrogen Life Technologies) por 12 dias. As células resistentes a G418 foram tripsinizadas, reunidas e manchadas com 2 pg/ml de IgG humano conjugado a FITC, fragmento Fc (FITC-hFc) conforme descrito acima. O FITC-hFc não manchou as células Kl de CHO parentais não transfectadas. As células que expressavam hFcyRI ligaram-se a FITC-hFc e foram isoladas com base na sua fluorescência por citometria de fluxo em um separador celular Moflo®. As células com a fluorescência mais elevada de 3 % nesta população foram isoladas, reunidas e expandidas, Este conjunto positivo em hFcyRI foi enriquecido pela repetição do mancha mento da superfície celular com FITC-hFc e separando-se as células fluorescentes com o máximo de 30 % na população para produzir o conjunto B. As células do conjunto B que estavam entre o máximo de 20 % expressando hFcyRI foram isoladas para produzir o conjunto C. O conjunto C2 (CHOKl/pTE534) foi usado para gerar linhagens celulares indutíveis reguladas por oAre-ER.LBDT2. EXEMPLO 6. CONSTRUÇÃO DE LINHAGENS CELULARES Kl DE CHO COM A EXPRESSÃO DE hFcyRI DEPENDENTE DE Arc-ERlbdT2 [0058J Células KI/pTE534 de CHO (2 x 106/placa) foram transfectadas ou com pRG985, um vetor vazio, ou com pTE529 usando-se Lipofectamine®. As células transfectadas foram, selecionadas com 400 pg/ml de G418 e 10 pg/ml de puromicina na ausência de OHT por 14 dias. As células foram manchadas com FITC-hFc como descrito acima e analisadas por citometria de 'fluxo. As células transfectadas com pRG985 eram semelhantes às células parentais e tinham perfis de manchamento de hFcyRI semelhantes, quer ou não elas tivessem sido cultivadas na presença de OHT antes da analise. Ao contrário, a expressão de hFcyRI em células Kl/pTE534 de CHO transfectadas com pTE529 mostram resposta marcante à presença de OHT no meio de cultivo. Na ausência de OHT no meio de cultivo, a maioria das células G418 e resistentes à puromicina foi positiva quanto à expressão hFcyRI, e as células positivas a hFcyRI num máximo de 30 % foram separadas como um conjunto. Este conjunto foi expandido na presença de OHT por 10 dias, manchadas para expressão de hFcyRI e analisadas por citometria de fluxo. Mais de 70 % das células neste conjunto não expressaram hFcyRI na presença de OHT, e aquelas células expressando o mínimo de 30 % foram separadas como um conjunto. Estas células foram então expandidas na ausência de OHT no meio. As células que expressavam os mais elevados níveis de hFcyRI (máximo de 1 %) na ausência de OHT foram separadas em uma placa de 96 reservatórios em uma célula por reservatório.

[0059] Os clones que mostravam a regulação rigorosa em resposta à presença de OHT no meio foram caracterizadas por citometria de fluxo. A regulação de hFcyRI da regulação dependente de OHT nestes clones foi confirmada por imunomanchamento com FITC-hFc seguido pela análise de citometria de fluxo. Nenhum nível detectável de hFcyRI foi observado em um clone (07) quando OHT estava presente no meio, enquanto o cultivo na ausência de OHT induziu a expressão de hFcyRI nestes clones (Figura 7).

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para induzir a expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula eucariótica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) prover uma célula eucariótica compreendendo (i) uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de fusão reguladora (RPR), em que a proteína de fusão consiste de {I) um domínio de bloqueio da transcrição compreendendo um repressor Tet (TetR) (SEQ ID NO:7) ou um domínio repressor Are, e (2) um domínio de ligação de ligante compreendendo um domínio de ligação de ligante do receptor de estrogênio (ERlbd) (SEQ ID NO:8) ou um domínio de ligação de ligante do receptor de estrogênio (SEQ ID NO:8) que compreende uma mutação T2 (ERLbdT2) compreendendo aminoácidos N304 a V595 do receptor de estrogênio com substituições 0400V, M543A e L544A; (ii) um promotor operavelmente ligado à sequência dc nucleotídeos de interesse e controlado por um operador que liga a proteína de fusão; e (iii) um operador capaz de ligar o domínio de bloqueio da transcrição e de bloquear a transcrição a partir do promotor adjacente; (b) cultivar a célula da etapa (a) a uma densidade desejada na presença de um ligante que se liga ao domínio de ligação de ligante da proteína de fusão, em que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse seja inibida; e (c) remover o ligante da presença da célula, em que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse é induzida.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito ligante é um estrogênio.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito ligante é tamoxifeno.

4. Método de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo fato de que o promotor operavelmente ligado à sequência de nucleotídeos de interesse compreende uma sequência de promotor de CMV, SV40, vírus do sarcoma de Rous, metalotioneína, nopalina sintetase, RNA do vírus 35S mosaico da couve-flor, ribulose-bifosfato carboxilase; álcool desidrogenase, fosfoglicerol cinase, fosfatase alcalina, elastase I, insulina, imunoglobulina, vírus tumorais mamários de camundongos, albumina, α-fetoproteína, al-antitripsina, β-globina e a cadeia-2 leve de miosina.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o promotor é CMV-MIE.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula eucariótica é selecionada do grupo consistindo de uma célula de COS, CHO, 293, BHK ou NSO.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o operador é TetO ou ArcO.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o operador é colocado imediatamente a jusante do promotor.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o operador é colocado dentro de 10 pares de base do promotor.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse na ausência do ligante é pelo menos 20 vezes maior do que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse na presença do ligante.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse na ausência do ligante é pelo menos 50 vezes maior do que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse na presença do ligante.

12. Proteína de fusão reguladora, caracterizada pelo fato de que consiste de (1) um domínio de bloqueio da transcrição compreendendo (a) os aminoácidos M1-S207 do repressor Tet (TetR) (SEQ ID NO:7), ou (b) os aminoácidos Μ1-A53 da SEQ ÍD NO: 3, e (2) um domínio de ligação de ligante compreendendo (a) os aminoácidos N304-V595 do receptor de estrogênio (SEQ ID NO: 8), ou (b) os aminoácidos N304-V595 do receptor de estrogênio (SEQ ID NO:8) com uma ou mais substituições selecionadas de G400V, M543A, e L544A, em que, na presença de um ligante cognato capaz de ligar o domínio de ligação de ligante, a proteína de fusão é estabilizada.

13. Proteína de fusão reguladora de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender a sequência de SEQ ID NO: 3.

14. 'Método para controlar a produção de um produto de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula eucariótica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) prover uma célula eucariótica compreendendo (i) uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de fusão reguladora, em que a proteína de fusão consiste de (l) um domínio de bloqueio da transcrição compreendendo um repressor Tet (TetR) (SEQ ID NO:7) ou um domínio repressor Arc, e (2) um domínio de ligação de ligante compreendendo um domínio de ligação a ligante do receptor de estrogênio (ERlbd) (SEQ ID NO: 8) ou um domínio de ligação de ligante do receptor de estrogênio (SEQ ID NO:8) que compreende uma mutação T2 (ERLBpT2) compreendendo aminoácidos N304 a V595 do receptor de estrogênio com substituições G400V, M543A e L544A; (ii) um promotor operavelmente ligado à sequência de nucleotídeos de interesse e controlado por um operador que liga a proteína de fusão; e (iii) um operador capaz de ligar o domínio de bloqueio da transcrição e de bloquear a transcrição a partir do promotor adjacente; (b) cultivar a célula da etapa (a) em uma densidade desejada na presença de um ligante que se liga ao domínio de ligação de ligante da proteína de fusão, em que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse seja inibida; (c) remover o ligante da presença da célula, em que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse é induzida e o produto da sequência de nucleotídeos de interesse é produzido.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o produto da sequência de nucleotídeos de interesse é um RNA, uma proteína ou um fragmento de proteína.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse na presença do ligante é 100 vezes menor do que a expressão do nucleotídeo de interesse na ausência do ligante.