BRPI0311233B1

BRPI0311233B1 - métodos in vitro para triagem de um paciente para carcinoma hepatocelular (hcc), e para diagnosticar hcc em um paciente, bem como método e kit para detectar ou determinar o nível de gpc3 em uma amostra

Info

Publication number: BRPI0311233B1
Application number: BRPI0311233-0A
Authority: BR
Inventors: Jorge Filmus; Mariana Capurro
Original assignee: Sunnybrook Health Sciences Centre
Priority date: 2002-05-23
Filing date: 2003-05-22
Publication date: 2019-08-13
Also published as: JP2005526979A; CN1653336A; ES2324029T3; ZA200410077B; CA2482881A1; HK1074251A1; WO2003100429A2; DE60326567D1; JP4455324B2; AU2003229191A1; RU2004136285A; BRPI0311233A2; BRPI0311233B8; CA2482881C; EP1506406A2; WO2003100429A3; ATE425461T1; US20050233392A1; RU2319969C2; AU2003229191B2

Abstract

diagnóstico de carcinoma hepatocelular a invenção refere-se a um método para triar um paciente para hcc, determinando o nível de glipicano (gpc3) em uma amostra de fluido corporal do paciente. é proporcionado um método adicional para diagnosticar hcc .por meio da detecção de gpc3 em uma amostra de tecido hepático. também são proporcionados anticorpos os quais ligam especificamente ao gpc3.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se ao diagnóstico de HCC. Em particular, a invenção refere-se a anticorpos e métodos para determinar o nível de glipican-3 como um marcador para HCC.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Do início ao fim deste requerimento, são citadas várias referências para descrever mais plenamente o estado da técnica à qual diz respeito esta invenção. As descrições destas referências são incorporadas a este relatório por meio de referência na presente descrição.

O HCC (HCC) é o tumor de órgão sólido mais comum no mundo, sendo responsável por mais de 3 milhões de mortes anualmente (Parkin, et al., (1999) CA, Cancer J. Clin., 49: 33 - 64, e Okuda, et al., (1993), Neoplasms of the Liver in Diseases of the Liver, 7th edition 1236).

A incidência do HCC é crescente na maioria dos países do ocidente (Deuffic, et al., (1998), Lancet 351: 214 - 215). Embora não estejam disponíveis bons estudos epidemiológicos, dados do Health Canada indicam que o índice de morte por HCC nos homens quase dobrou durante os últimos 15 anos. A demografia dos pacientes com hepatite viral sugere que a incidência dobrará de novo nos próximos 10 anos (Zou, et al., (2000), Can. J. Gastroentetol., 14: 575-580).

HCC é geralmente assintomático nos estágios iniciais e tem uma grande propensão para invasão intravascular ou intrabiliar, mesmo quando o tumor primário é pequeno (Fong, et al., (2001), Cancer of the Liver and Biliary Tree. in Cancer; Principles & Practice of Oncology, 6th Edition, 1162 1199). Em conseqüência, HCC está geralmente em um estágio avançado quando é descoberto. Historicamente, somente 10 a 20 % dos HCCs são considerados ressecáveis por ocasião do diagnóstico (Fong, et al., (2001), Segue-se na folha 1a

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Cancer of the Liver and Biliary Tree in Cancer; Principies & Practice of

Oncology, 1162 - 1199). Mais recentemente, com a chegada dos programas

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aumentando, embora a maior parte dos pacientes ainda tenham doença incurável por ocasião do diagnóstico.

HCC está associado com lesão hepática crônica, essencialmente hepatite viral crônica e doença hepática alcoólica (Rustgi, (1987), Gastroenterol. Clin. North Am., 16: 545 - 551). A maior incidência de HCC é encontrada em áreas onde são endêmicos o vírus da hepatite B (HBV), e o vírus da hepatite C (HCV). No caso do HBV, foi demonstrado que o risco relativo de desenvolver HCC é 50 a 100 vezes maior em indivíduos com evidência de infecção crônica do que em indivíduos não-infectados (Beasley, et al., (1994), Epidemiology of hepatocellular carcinoma in Viral hepatitis and liver disease, 209). Diferentemente de outras causas de HCC, a cirrose por hepatite B crônica não é uma pré-condição necessária para o desenvolvimento de HCC. Não há estimativas de risco relativo com HCV crônico, mas a incidência de HCC em veículos cirróticos de HCV pode ser tão elevada quanto 5 % por ano, comparada a 0,5 % para veículos de HBV (Di Bisceglie, (1995), Semin. Liver Dis., 15; 64 - 69). Infecção persistente por HCV á a causa de 70 % dos casos de HCC no Japão, e a razão mais provável para o aumento da incidência de HCC na América do Norte é o aumento da disseminação de infecção por HCV na população (Hasan, et al., (1990), Hepatology, 12: 589 - 591 and El-Serag, et al., (1999), N. Engl. J. Med., 340: 745 750).

Vários produtos químicos têm sido relacionados com o desenvolvimento de HCC. O mais importante deles é o etanol, e o abuso de álcool tem sido relacionado com o HCC (Schiff, (1997), Hepatology, 26: 39S - 42S and Nalpas, et al., (1995), Alcohol, 12; 17 - 120). Acredita-se que o etanol produza HCC através do desenvolvimento de cirrose hepática ou como um co-carcinógeno com outros agentes tais como HBV e HCV. Aflatoxinas produzidas por vários fungos também têm sido ligadas ao HCC (Yu, (1995), J. Gastroenterol. HepatoL, 10: 674 - 682). Estes fungos tendem a crescer sobre grãos, amendoins, e outros produtos alimentícios, e são a causa mais freqüente de desperdício alimentar.

O diagnóstico do HCC é relativamente direto em pacientes com uma lesão ocupando espaço na ultrassonografia ou tomografia computadorizada (CT), e AFP sérica (AFP) de mais de 500 ng/ml (Fong, et al., (2001), in Cancer of the Liver and Biliary Tree in Cancer; Principies & Practice of Oncology, 6th Edition, 1162 - 1199). Em geral, no entanto, por ocasião em que estas condições são satisfeitas, o HCC é intratável, uma vez que com muita freqüência a AFP não está elevada diagnosticamente.

O diagnóstico por estudo por imagens de pequenas lesões é relativamente inacurado, quer por ultrassonografia, varredura por tomografia computadorizada ou MRI (Fong, et al., (2001), in Cancer of the Liver and Biliary Tree in Cancer: Principies & Practice of Oncology, 6th Edition, 1162 1199); e Murakami, et al., (1995), Detectability of hypervascular hepatocellular ca rei no ma by arterial phase images of MR and spiral CT. Acta Radiol., 36: 372 - 376 ). Em particular, as duas lesões que podem simular HCC radiologicamente são nódulos cirróticos e nódulos displásicos. A biópsia hepática de pequenas lesões também é insuficientemente sensível ou específica (Levy, et al., (2001), Ann. Surg., 234: 206 - 209). Mesmo com uma biópsia em agulha, um câncer bem-diferenciado pode ser difícil de distinguir de lesões benignas devido à quantidade limitada de material obtido geralmente por meio deste procedimento (Fong, et al., (2001), in Cancer of the Liver and Biliary Tree in Cancer: Principies & Practice of Oncology 6th Edition, 1162 1199). Portanto, apesar dos avanços na tecnologia do estudo por imagens, ainda persiste a necessidade de um marcador molecular adequado para distinguir HCC de lesões hepáticas benignas em casos difíceis.

O tamanho de um tumor é um fator de risco importante para a disseminação intra-hepática e metástase do HCC (Yuki, et al., (1990), Cancer, 66: 2174 -2179). Além disso, estão disponíveis muito mais opções de tratamento para pacientes com tumores pequenos. Tumores sintomáticos são geralmente grandes, e além da intervenção terapêutica. Outra situação onde seria útil um marcador sensível e específico para o HCC é a triagem de pacientes de risco, tais como veículos crônicos de HBV e indivíduos com HCV cirrótico. Embora esta triagem seja amplamente aplicada, ainda há alguns dados que sugerem que é eficaz para reduzir doença (Collier, et al., (1998), Hepatology, 27; 273 - 278). Uma das razões porque não foi demonstrado que a triagem é eficaz é que o teste sorológico usado atualmente, a saber, testes de AFP seqüenciais, têm baixa sensibilidade e especificidade (Coilier, et al., (1998), Viral Hepatitis Reviews, 4: 31-41). Portanto, são necessários sistemas de testes aperfeiçoados para melhorar a triagem para o HCC.

O único marcador molecular que tem sido amplamente usado para a triagem e o diagnóstico de HCC é a AFP (AFP). Esta proteína é sintetizada em grandes quantidades durante o desenvolvimento embrionário pelo saco vitelino e pelo fígado (Chan, et al., (1999), in Tumor Markers. in Tietz textbook of clinicai chemistry, 3rd, 722 - 749, Taketa, K (1990), Hepatology, 12: 1420-1432). A concentração da AFP diminui gradualmente depois do nascimento para <10 ng/ml em 12 a 18 meses. A AFP reaparece no soro materno durante a gravidez. O aumento da AFP circulante tem sido associado com HCC, carcinoma gástrico, câncer pulmonar, câncer pancreático, câncer do trato biliar, e carcinoma testicular (Chan, et al., (1999), in Tumor Markers. in Tietz textbook of clinicai chemistry, 3rd, 722-749).

Se níveis de AFP de 20 ng/ml ou maiores são considerados diagnósticos, 60 a 80 % dos casos de HCC são detectados mas, no caso de pequenos tumores, a sensibilidade é significativamente menor (40 %) (Trevisani, et al., (2001), J. Hepatol., 34 :570 - 575). Outro problema com o uso da AFP como um marcador para o HCC é sua falta de especificidade; aumentos significantes da AFP (20 a 200 ng/ml) são vistos em um número considerável de pacientes com doenças hepáticas crônicas (Coilier, et al., (1998), Viral Hepatitis Reviews, 4: 31 - 41). Foi reportado que 15 a 58 % dos pacientes com hepatite crônica, e 11 a 47 % com cirrose tiveram aumento da AFP de soro (Taketa, (1990), Hepatology, 12: 1420 - 1432). Portanto, não é incomum que os níveis de soro de AFP em pacientes com HCC e cirrose se sobreponham, o que confunde a interpreção dos resultados do teste da AFP. Conseqüentemente, a utilidade da medição da AFP como uma ferramenta de vigilância para pacientes em risco para HCC tem sido questionado (Sherman, (2001), J. Hepatol., 34: 603 - 605). Portanto, foi proposto que a única circunstância na qual a medição da AFP se justifica é para a confirmação de um diagnóstico inicial com base em uma técnica de estudo por imagens (Sherman, (2001), J. Hepatol., 34: 603 - 605).

Em vista da falta de confiabilidade dos níveis de AFP, a maior parte dos regimes de triagem incluem ultrassonografia, que é altamente sensível para massas hepáticas. No entanto, a ultrassonografia carece de especificidade; e não pode distinguir com certeza entre HCC, nódulo cirrótico e nódulo displásico quando as lesões são menores do que cerca de 2 cm.

Nos últimos anos, têm sido investigados vários novos marcadores potenciais para o HCC, mas não foi encontrado nada nitidamente superior à AFP (Seow, et al., (2001), Proteomics, 1: 1249 -1263). Por exemplo, a des-gama-carbóxi protrombina foi proposta como um potencial marcador. No entanto, esta molécula, como a AFP, não é útil para a detecção de tumores pequenos (Nomura, et al., (1999), Am. J. Gastroenterol., 94: 650 - 654).

Em 1997, Hsu et al., relataram que, realizando análise da apresentação de mRNA diferencial de fígado normal e HCC, eles identificaram um transcripto que estava sobre-regulado no HCC (Hsu, et al,, (1997), Cancer Res., 57: 5179 - 5184). Este transcripto, que eles denominaram MXR7, vem a ser o Glipican-3 (GPC3). GPC3 é um proteoglicano de sulfato de heparan que está ligado à superfície celular por uma cauda lipídica (Duenas Gonzales, et al., (1998), J. Cell. Biot., 141: 1407 -1414). Hsu et al. Descobriram que o mRNA do GPC3 estava expresso em 143 de 191 (74,8 %) carcinomas hepatocelulares primários e recorrentes, mas em somente 5 de 154 (3,2 %) fígados normais.

Um segundo estudo descobriu a super-expressão de mRNA de GPC3 em 75 % dos casos de HCC, mas não foi detectada super-expressão em hiperplasia nodular focal e fígado cirrótico (Zhu et al., (2001), Gut, 48, 558 - 564).

Estes estudos analisaram somente os níveis do mRNA e sabese que os níveis do mRNA não se correlacionam sempre com a expressão e secreção de proteína. Além disso, somente um número limitado de proteí

nas hepáticas são secretadas normalmente para a circulação.

Apesar destes resultados sugerirem que a análise do mRNA do GPC3 no tecido hepático pode ser útil para a detecção do HCC, este tipo de análise é invasiva, uma vez que requer o isolamento do tecido tumoral. Além disso, a análise do mRNA consome tempo e é difícil de realizar rotineiramente.

Portanto, há a necessidade de um marcador de soro o qual possa ser usado para triagem (isto é, o qual será positivo em uma elevada proporção de pacientes assintomáticos com carcinomas hepatocelulares pequenos). Em pacientes nos quais foi identificada pelo ultrassom uma lesão de massa pequena, o teste também deve ser capaz de separar de modo confiável pacientes com HCC dos pacientes com lesões não-malignas.

Em conclusão, há ainda a necessidade de melhores marcadores moleculares para o HCC, particularmente para a vigilância de populações de alto risco, tais como pacientes com HCV com diagnóstico estabelecido de cirrose. A pesquisa de semelhantes marcadores tem sido muito difícil devido ao alto grau de heterogeneidade que caracteriza os carcinomas hepatocelulares (Thorgeirsson, et al., (2002), Nature Genet., 31: 339 - 346). SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores descobriram um novo marcador de soro para o HCC, glipican-3 (GPC3), o qual proporciona uma base para um teste novo, rápido, conveniente e não-invasivo que oferece aumento da especificidade no diagnóstico do HCC.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, é proporcionado um método para triagem de um paciente para HCC (HCC) compreendendo:

obter uma amostra de fluido corporal do paciente; e determinar o nível de glipican-3 (GPC3) na amostra;

em que a presença de um nível detectável de GPC3 na amostra é sugestiva de HCC no paciente.

De acordo com outra modalidade da presente invenção, é proporcionado um anticorpo substancialmente purificado ou fragmento do mesmo o qual liga especificamente a GPC3 ou a um fragmento do mesmo.

De acordo com outra modalidade da presente invenção, é proporcionado um método para diagnosticar HCC em um paciente compreendendo:

obter uma amostra de tecido hepático do paciente; e determinar a presença de GPC3 na amostra de tecido;

em que a detecção de GPC3 na amostra é indicativa de HCC.

De acordo com outra modalidade da presente invenção, é proporcionado um método para detectar a presença de GPC3 em uma amostra, o método compreendendo:

contatar uma amostra com um anticorpo ou fragmento do mesmo o qual liga especificamente a GPC3 ou a um fragmento do mesmo para permitir a formação de um complexo anticorpo-GPC3, ou um complexo de fragmento de anticorpo-GPC3; e detectar o complexo de anticorpo-GPC3 ou de um fragmento de anticorpo-GPC3.

De acordo com outra modalidade da presente invenção, é proporcionado um método para determinar o nível de GPC3 em uma amostra, compreendendo:

contatar uma amostra com um anticorpo ou fragmento do mesmo o qual liga especificamente a GPC3 ou a um fragmento do mesmo para permitir a formação de um complexo de anticorpo-GPC3 ou de um fragmento de anticorpo-GPC3; e determinar o complexo de anticorpo-GPC3 ou de um fragmento de anticorpo-GPC3.

De acordo com outra modalidade da presente invenção, é proporcionado um kit para detectar ou determinar o nível de GPC3 em uma amostra compreendendo:

um anticorpo substancialmente purificado ou fragmento do mesmo o qual liga especificamente a GPC3 ou a um fragmento do mesmo. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

São descritas modalidades preferenciais da invenção com res

peito aos desenhos, em que:

A Figura 1 mostra fotomicrografias de 293 células transfectadas com GPC3 (Painéis C e D) e células de controle transfectadas com vetor somente (Painéis A e B), coradas com anticorpo monoclonal anti-GPC3 1G12. Os Painéis A e C são micrografias de contraste de fase e os Painéis B e D são micrografias fluorescentes.

A Figura 2 mostra uma análise Western blot (WB) de proteínas de 293 células transfectadas com somente vetor (EF) ou GPC3 com etiqueta HA (GPC3.) As membranas foram incubadas com anticorpo antiGPC3 1G12 ou anticorpo anti-HA (12CA5). Seta sólida: proteínas de núcleo de GPC3; seta aberta: formas glicanadas de GPC3; ponta da seta: um produto da divagem contendo término de N de GPC3 o qual não contém epitopo detectado por 1G12. Os números à direita correspondem a marcadores de peso molecular.

A Figura 3 mostra fotomicrografias de seções coradas imunohistoquimicamente de HCC usando anticorpo monoclonal 1G12. Painel A: 16X vista geral de HCC altamente GPC3-positivo (T) circundado por tecido hepático não-tumoral não-corado (N); Painel Β; 400X vista do mesmo tecido apresentando grânulos citoplasmáticos e tingimento da membrana.

A Figura 4 mostra a relação entre a concentração de GPC3 e a densidade ótica em um teste ELISA para GPC3.

A Figura 5 mostra níveis de GPC3 no soro de controles, pacientes com hepatite (H), pacientes com hepatite mais cirrose (H + LC) e pacientes com HCC (HCC), determinados por ELISA, os resultados apresentados representam a média de quadruplicatas. A importância da diferença entre os valores médios de GPC3 para os pacientes com HCC e os pacientes cirróticos é apresentada na parte superior da figura.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona um novo método para triagem de um paciente mamífero para HCC (HCC). Os inventores determinam que o proteoglicano da superfície celular GPC3 pode ser detectado na circulação, no soro ou no plasma, de pacientes com HCC, porém não ocorre em um nível detectável, isto é, um nível significativamente acima do basal, usando um teste padrão de importância conforme descrito neste relatório, no soro ou plasma de pacientes normais. Também foi demonstrado que pouco ou nenhum GPC3 pode ser detectado no soro ou plasma de pacientes sofrendo de hepatite ou de hepatite mais cirrose.

É proporcionado portanto um método conveniente, não-invasivo para triagem de um paciente para HCC determinando os níveis de GPC3 em um fluido corporal do paciente. Fluidos corporais adequados para teste incluem soro, plasma e sangue total. É preferencial a triagem do soro ou plasma.

Os níveis de GPC3 em um fluido corporal podem ser determinados por qualquer método adequado para medir esta proteína. Os métodos imunológicos para determinar os níveis de GPC3 são altamente convenientes, e os tipos de métodos adequados serão de conhecimento geral daqueles versados na técnica, e são posteriormente descritos neste relatório.

Por exemplo, anticorpos ou fragmentos de anticorpos os quais ligam especificamente a GPC3 humano proporcionam a base para uma variedade de métodos de teste à base de anticorpos para determinar GPC3. O HCC pode ser diagnosticado pondo um fluido corporal do paciente em contato com um anticorpo ou fragmento o qual liga especificamente a GPC3 sob condições que permitem a formação de um complexo anticorpo-GPC3 e em seguida detectando e/ou determinando o nível deste complexo. A quantidade de complexo de anticorpo-GPC3 se correlaciona com o nível de GPC3 na amostra.

O termo anticorpo, conforme usado neste relatório e caso nãoespecificado de outro modo, inclui um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo de cadeia única.

O termo fragmento de anticorpo significa uma porção de um anticorpo que apresenta a ligação específica do anticorpo original e inclui fragmentos Fab, F(ab')₂ e F_v.

Conforme usado neste relatório, diz-se que um anticorpo ou

fragmento de anticorpo liga especificamente a uma molécula alvo se o anticorpo ou fragmento de anticorpo reconhece e liga a molécula alvo mas não reconhece substancialmente e liga outras moléculas presentes em uma amostra contendo moléculas alvo.

Anticorpos quiméricos são anticorpos os quais contêm porções de anticorpos de diferentes espécies. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode ter uma região constante humana e uma região variável de outra espécie. Anticorpos quiméricos podem ser produzidos por métodos recombinantes de conhecimento geral, conforme descrito nas Patentes dos Estados Unidos N°s 5.354.847 e 5.500.362, e na literatura científica (Couto et al., (1993), Hybridoma, 12: 486 - 489).

Anticorpos humanizados são anticorpos nos quais somente as regiões determinantes de complementaridade, as quais são responsáveis por ligação antigênica e especificidade, são de uma origem não-humana, ao passo que essencialmente todo o restante da molécula de anticorpo é humana. Os anticorpos humanizados e sua preparação também são de conhecimento geral na técnica - veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos N°s 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761 e 5.693.762.

Anticorpos de cadeia única são sequências de polipeptídeos que são capazes de ligar especificamente um peptídeo ou epitopo, onde o anticorpo de cadeia única é derivado ou da cadeia leve ou da pesada de um anticorpo monoclonal ou policlonal. Anticorpos de cadeia única incluem polipeptídeos derivados de anticorpos humanizados, quiméricos ou totalmente humanos onde o anticorpo de cadeia única é derivado ou da cadeia leve ou da pesada do mesmo.

Anticorpos

Anticorpos Policlonais

De modo a preparar anticorpos policlonais, podem ser obtidos GPC3 purificado, humanos ou não-humanos.

GPC3 pode ser purificado a partir, por exemplo, da placenta humana por meio de métodos convencionais, por exemplo conforme descrito em Bonneh-Barkay et al., (1997), J. Biol. Chem., v. 272, pp. 12415 11

12421.

A proteína purificada pode, caso desejado, ser ligada a uma proteína de portador tal como hemocianina de keyhole limpet, conforme é de conhecimento geral na técnica, e é então misturada com adjuvante de Freund e injetada em coelhos ou outros animais de laboratório adequados.

Alternativamente, toda ou uma porção da proteína GPC3 pode ser sintetizada de modo recombinante em um hospedeiro adequado, tal como uma bactéria, por meio da expressão de uma sequência de DNA apropriada inserida em um veículo de clonagem adequado. DNA codificando GPC3 pode ser clonado por meio de métodos descritos previamente (Filmus et al., (1988), Molec. & Cell Biol., v. 8, pp. 4243 - 4249; Linsley et al., (1993), Ann. Rev. Immunol., v. 11, pp. 191 -212; Peach etal., (1994), J. Exp. Med., v. 180, pp. 2049 - 2058). GPC3 ou uma porção da mesma pode ser expressa como uma proteína de fusão por meio de métodos semelhantes.

Dois sistemas de expressão usados amplamente para produzir proteínas de fusão recombinantes em E. coli são glutationa-S-transferase ou fusões de proteínas de ligação de maltose usando a série pUR de vetores e fusões de trpE usando os vetores pATH.

A proteína GPC3 expressa pode ser então purificada, por exemplo usando uma coluna de glutationa, ligada a uma proteína de veículo caso desejado, e misturada com adjuvante de Freund (para ajudar a estimular a resposta do animal) e injetada em coelhos ou outros animais de laboratório apropriados. Depois de injeções de reforço em intervalos semanais, os coelhos ou outros animais de laboratório são em seguida sangrados e o soro isolado. O soro pode ser útil diretamente ou purificado antes do uso por meio de vários métodos incluzive cromatografia por afinidade empregando Proteína A-Sepharse, antígeno Sepharose ou Anti-mouse-lg-Sepharose.

Os anticorpos policlonais também podem ser preparados usando um fragmento de GPC3 como antígeno. Podem ser usados fragmentos de três ou mais aminoácidos consecutivos da seqüência de aminoácidos GPC3. Um fragmento de GPC3 compreendendo a seqüência de aminoácidos de terminal carbóxi de 70 aminoácidos, ou uma porção da mesma, é um

antígeno preferencial. Os fragmentos podem ser produzidos de modo recombinante, opcionalmente como proteínas de fusão, conforme descrito neste relatório. Os antígenos peptídicos referidos podem ser conjugados com hemocianina de keyhole limpet para aumentar a antigenicidade in vivo.

Anticorpos Monoclonais .

Anticorpos anti-GPC3 monoclonais também podem ser produzidos por meio de métodos convencionais depois de injetar em camundongos GPC3 purificado ou fragmentos do mesmo, opcionalmente como proteínas de fusão, obtidos conforme descrito acima para preparação de anticorpos 10 policlonais.

Em resumo, a proteína purificada ou o peptídeo purificado é injetado em camundongos em adjuvante de Freund, por exemplo por nove vezes durante um período de três semanas. O baço dos camundongos é removido e ressuspendido em salina tamponada com fosfato (PBS). As cé15 lulas esplênicas servem como uma fonte de linfócitos, alguns dos quais estão produzindo anticorpo da especificidade apropriada. Estes são então fundidos com uma célula parceira de mieloma permanentemente em crescimento, e os produtos da fusão, hibridomas, são colocados dentro de uma série de cavidades de cultura na presença de um agente seletivo tal como 20 HAT. As cavidades são em seguida triadas por ELISA para identificar as que contêm células produtoras de anticorpo específico para GPC3. Estas células são em seguida lamindas e depois de um período de crescimento, estas cavidades são novamente triadas para identificar células produtoras de anticorpos. São realizados vários procedimentos de clonagem até mais de 90 % 25 das cavidades conterem clones únicos os quais são positivos para produção de anticorpos. A partir deste procedimento, é estabelecida uma linhagem estável de clones, os quais produzem o anticorpo. O anticorpo monoclonal pode ser então purificado por meio de cromatografia por afinidade usando Proteína A Sepharose ou cromatografia de permuta iônica, bem como vari30 antes e combinações destas técnicas.

Em uma modalidade adicional, são preparados fragmentos de anticorpos, inclusive mas não-restrito a fragmentos F(ab)₂, F(ab¹)₂ θ F_v ou componentes de cadeia única de anticorpos monoclonais GPC3-específicos. Os fragmentos referidos podem ser gerados usando clivagem proteolítica de anticorpos anti-GPC3 intactos, por exemplo conforme descrito em Lin et al., (1978), PNAS, 75(6); 2649 - 2653, ou por meio de manipulação genética de genes codificando semelhantes fragmentos e fermentação de sistemas de produção transfectados que são capazes de secretar semelhantes fragmentos de anticorpos anti-GPC3.

São anticorpos anti-GPC3 de um antígeno de afinidade de no mínimo 1 x 10⁸.

Podem ser usados vários tipos de formatos de teste para analisar GPC3 em uma amostra. Estes incluem ELISA tipo sanduíche, radioimunoensaio, fluoroimunoensaio, dot-blot, dip-stick e Western Blot.

Em uma modalidade preferencial, é usado um anticorpo o qual liga especificamente a GPC3 ou a um fragmento do mesmo e carrega uma etiqueta detectável e o complexo GPC3-anticorpo resultante é determinado medindo a etiqueta detectável, determinando deste modo o nível de GPC3 na amostra. Alternativamente, é empregado um primeiro anticorpo específico para GPC3 ou um fragmento do mesmo, seguido por um segundo anticorpo específico para o primeiro anticorpo e carregando uma etiqueta a qual pode ser uma etiqueta diretamente detectável ou pode ser um componente de um sistema gerador de sinal. Tais anticorpos marcados e sistemas são de conhecimento geral na técnica.

A detecção e determinação da etiqueta ou do sinal gerado pelo sistema gerador de sinal, comparados com padrões de calibração adequados, permitem a determinação do complexo GPC3-anticorpo presente na amostra e deste modo de GPC3.

O segundo anticorpo carrega uma etiqueta a qual pode ser qualquer etiqueta diretamente detectável adequada ou um componente de qualquer sistema gerador de sinal adequado. Muitos exemplos destes são de conhecimento geral no campo do imunoensaio.

A marcação do segundo anticorpo com uma etiqueta detectável ou um componente de um sistema gerador de sinal pode ser realizada por

meio de técnicas de conhecimento geral na técnica. Exemplos de etiquetas que podem ser utilizadas para tornar um anticorpo detectável incluem radiol· sótopos, enzimas, substâncias fluorescentes e quimiluminescentes. Por exemplo, pode ser usado um elemento radioativo como uma etiqueta diretamente detectável; etiquetas radioativas típicas incluem os emissores-γ ¹²⁴l, ¹²⁵l, ¹²⁸l, e ¹³¹1. Também pode ser usada uma etiqueta fluorescente como uma etiqueta diretamente detectável; por exemplo, fluoroforos adequados incluem cumarina, íons de metais terrosos raros, quelatos ou complexos de quelatos, fluoesceína, rodamina e derivados de rodamina.

Etiquetas adequadas também incluem complexos metálicos, radicais livres estáveis, vesículas, lipossomas, partículas coloidais, partículas de látex, etiquetas de rotação, biotina/avidina e seus derivados.

Podem ser usados sistemas geradores de sinal ligados a enzima, inclusive fosfatase alcalina, amilase, luciferase, catalase, betagalactosidase, glucose oxidase, glucose-6-fosfato dehidrogenase, hexoquinase, peroxidase de rábano silvestre, lactamase, urease e malato dehidrogenase. A atividade da enzima pode ser detectada medindo a intensidade da absorvência, fluorescência ou luminescência depois de reagir a enzima com um substrato apropriado. Quando são usadas enzimas como uma etiqueta, a ligação entre enzima e anticorpo pode ser realizada por meio de métodos convencionais tais como os métodos do glutaraldeído, do ácido periódico e da maleimida.

Matrizes sólidas que atuam como suportes sólidos adequados para imobilizar um anticorpo incluem lâminas de microtítulo, tais como as obteníveis da Falcon Plastics, Oxnard, Calif., ou, por exemplo, lâminas de microtítulo de ELISA regular (Immulon II, Dynax, Chantilly, VA) e lâminas de microtítulo de ELISA revestidas com estreptavidina (Reacti-Bind, Pierce, Rockford, IL), e bandas de de microtítulo, tais como as obteníveis da Dynatech, Alexandria, VA. As cavidades das bandas ou as lâminas de microtítulo são feitas de material plástico transparente, preferencialmente polivinil cloreto ou poliestireno. Outras matrizes sólidas úteis para imobilização de anticorpos incluem tubos de poliestireno, bastões ou palhetas de qualquer tamanho

conveniente ou contas de poliestireno ou matrizes de poliacrilamida.

Os anticorpos podem ser imobilizados sobre um suporte sólido por meio de métodos convencionais os quais são de conhecimento geral na técnica, por exemplo conforme descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5.352.583. .

De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, uma amostra de um fluido corporal é posta em contato com um primeiro anticorpo o qual liga especificamente a GPC3 para formar um complexo, o primeiro anticorpo sendo imobilizado sobre um suporte sólido. Deixa-se tempo suficiente para permitir a ligação da GPC3 da amostra ao anticorpo imobilizado. Em seguida o suporte sólido é lavado e posto em contato com um segundo anticorpo o qual liga especificamente ao primeiro anticorpo e é marcado com uma etiqueta detectável ou tem fixado a este um sistema gerador de sinal. A etiqueta ou sinal gerado ligado ao suporte sólido é determinado, proporcionando uma medida do complexo presente na amostra, e deste modo determinando o nível de GPC3 na amostra.

De acordo com uma modalidade adicional, a amostra é posta em contato simultaneamente com o primeiro anticorpo imobilizado sobre o suporte sólido e o segundo anticorpo marcado.

Em uma modalidade adicional, o segundo anticorpo pode carecer de uma etiqueta ou de um componente sistema gerador de sinal e o segundo anticorpo ligado a suporte sólido é determinado por meio de um terceiro anticorpo portando uma etiqueta detectável ou um componente sistema gerador de sinal, o terceiro anticorpo ligando seletivamente ao segundo anticorpo ligado.

De acordo com uma modalidade adicional, a amostra é posta em contato, ou simultaneamente ou em etapas, com um primeiro anticorpo o qual liga especificamente a GPC3 e ao qual está fixado um membro de um par de captura e com um segundo anticorpo marcado o qual liga ao primeiro anticorpo. A mistura resultante é em seguida posta em contato com um suporte sólido sobre o qual é imobilizado o outro membro do par de captura. Depois de deixar tempo suficiente para o complexo marcado ligar ao suporte

sólido por meio de interação dos membros do par de captura, o suporte sólido é lavado e é determinada a quantidade de etiqueta ligada a este, para determinar o nível de GPC3 na amostra. Pares de captura adequados incluem biotina/estreptavidina. Outros pares adequados são de conhecimento das pessoas versadas na técnica. As especificidades dos anticorpos podem ser invertidas, o primeiro anticorpo ligando especificamente ao complexo e o segundo anticorpo marcado ligando especificamente a GPC3.

O método de triagem descrito neste relatório parece ser altamente específico para HCC, pelo fato de que GPC3 foi indetectável em amostras de indivíduos normais e pacientes com hepatite, e foi encontrado em níveis desprezíveis em pacientes ocasionais com hepatite mais cirrose.

Em testes usando pacientes com diagnóstico de HCC, a partir de 53 até 55 % dos pacientes tiveram níveis de soro detectáveis de GPC3, variando de 151 ng/ml a 2924 ng/ml.

Quando AFP de soro foi usado como um marcador de HCC nos mesmos pacientes, e 20 ng/ml foi usado como o limiar de anormalidade, foram detectados 59 % dos pacientes com HCC. Se o nível de limiar de AFP indicativo de doença for aumentado para 100 ng/ml, somente são detectados 32 % dos casos de HCC. Um nível de limiar de 20 ng/ml de AFP, no entanto, incluirá uma série de resultados falso positivos, uma vez que níveis de AFP maiores do que 20 ng/ml são vistos em muitas doenças hepáticas crônicas diferentes do HCC.

Os inventores descobriram que níveis elevados de GPC3 em pacientes com HCC não era bem correlacionado com níveis de AFP (Tabela 4). O método da invenção portanto proporciona uma útil ferramenta adicional para identificar casos de HCC não detectados por triagem de AFP. O método da invenção pode ser usado sozinho ou além da triagem de AFP por meio de métodos convencionais para melhorar a capacidade de identificar o HCC em um estágio precoce e tratável.

Em uma modalidade adicional da invenção, pode ser usada a triagem de GPC3 e AFP em combinação para proporcionar um teste combinando a especificidade de triagem para altos níveis de AFP com a aperfei çoada sensibilidade da triagem de GPC3. Por exemplo, conforme visto a partir dos dados da Tabela 4, se forem determinados os níveis de soro dé AFP e GPC3 e for usado um limiar de 100 ng/ml de AFP como o limiar de importância, 70 % dos pacientes com HCC apresentaram elevação de no mínimo um entre AFP e GPC3, em oposição a 32 % se for usado somente 100 ng/ml de AFP como marcador de HCC, ou 53 % se for usado somente GPC3 como marcador. Se forem considerados tanto AFP quanto GPC3 e for usado um valor de limiar de 20 ng/ml de AFP, 82 % dos pacientes apresentaram elevação de no mínimo um entre AFP e GPC3.

Os testes sorológicos de GPC3 da invenção são especialmente úteis para avaliação adicional de pacientes que apresentam indicações clínicas de uma massa hepática. Os testes também podem ser usados para triar populações de risco para HCC, por exemplo pacientes com hepatite B ou C crônica ou veículos.

Em uma modalidade adicional, a invenção proporciona um método imunohistoquímico para diagnosticar HCC examinando amostras de biópsia hepática de pacientes que apresentam uma massa hepática. Amostras de tecido hepático obtido por biópsia freqüentemente apresentam morfologia distorcida, tomando difícil o diagnóstico histológico convencional. Seções de tecido de semelhantes biópsias são coradas com anticorpos antiGPC3, conforme descrito nos exemplos neste relatório, e a detecção de GPC3 nas seções é indicativa de que a massa biopsiada é HCC. Os anticorpos anti-GP3 podem portar eles mesmos uma etiqueta detectável, tal como uma etiqueta fluorescente, ou o primeiro anticorpo anti-GPC3 pode ser detectado por um segundo anticorpo marcado detectavelmente.

A presente invenção também proporciona anticorpos os quais ligam especificamente a GPC-3. Anticorpos os quais ligam aos mesmos epítopos que estes anticorpos também são englobados dentro da invenção. Os anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulinas inclusive IgG, IgM, IgA, IgE e IgD e qualquer subclasse das mesmas.

Em uma modalidade adicional, a invenção proporciona um kit compreendendo um anticorpo substancialmente purificado ou fragmento do mesmo o qual liga especificamente a GPC3 ou a um fragmento do mesmo.

Em uma modalidade adicional, o kit é para um teste de sanduíche de dois-anticorpos padrão no qual um primeiro anticorpo GPC3específico captura GPC3 presente na amostra de fluido e um segundo anticorpo detecta a presença do GPC3 capturado. O anticorpo de captura é tipicamente imobilizado sobre uma fase sólida tal como uma placa ELISA, uma membrana de nitrocelulose, uma conta ou qualquer outro suporte conhecido na técnica. O anticorpo de detecção é ou diretamente marcado, com uma etiqueta colorimétrica ou radioisotópica ou é ele mesmo detectado por um anticorpo secundário, marcado, específico para o isótipo do anticorpo de detecção.

EXEMPLOS

Os exemplos são descritos para os fins de ilustração e não pretendem limitar o âmbito da invenção.

Métodos de química, biologia molecular, bioquímica de proteínas e peptídeos e imunologia referidos mas não descritos explicitamente nesta descoberta e exemplos são reportados na literatura científica e são de conhecimento geral das pessoas versadas na técnica.

MÉTODOS

Tecidos dos pacientes: Amostras de tecido hepático foram obtidas do Departamento de Patologia do Hospital Geral de Toronto. Todas as amostras hepáticas foram grandes blocos de tumores ressectados cirurgicamente e parênquima adjacente. Todo o tecido foi fixado em 10 % de formalina e embutido em parafina para exame histológico de rotina.

Soros dos pacientes: Foram obtidas amostras sangüíneas de 34 pacientes com HCC (veja a Tabela 3 para caracteísticas dos pacientes), 20 pacientes com hepatite mais cirrose hepática (12 com HCV e 8 com HBV), 18 pacientes com hepatite (12 com HCV, 1 com HCV mais HIV, 1 com HCV mais Talassemia, 1 co-infectado com HCV e HBV e 3 com HBV) (Hospital Geral de Toronto), e de 53 doadores de sangue saudáveis (Sunnybrook and Women's College Health Sciences Centre, Toronto, Canadá) sob um consentimento assinado dos pacientes. O HCC foi diagnosticado histologica19

mente quando a biópsia hepática estava disponível ou a partir de informação clínica seguindo as diretrizes da Associação Européia para Estudo de Doença Hepática²⁰. O soro foi imediatamente separado por meio de centrifugação e congelado a -20 °C. O soro dos pacientes que foram diagnosti5 cados com doença hepática não-maligna (hepatite com cirrose hepática e hepatite) por ocasião da coleta de soro somente foram incluídos neste estudo se não houvesse indicação de doença maligna 6 meses depois de semelhante coleta.

Linhagens celulares: As linhagens celulares de HCC HepG2, 10 Hep3B e PLC-PRF-5 foram cultivadas em meio essencial mínimo (MEM) com 10 % de soro de feto bovino (FBS) (Gibco BRL) e suplementado com solução de aminoácidos não-essenciais MEM e piruvato de sódio (1 mM). A linhagem celular 293 foi cultivada em DMEM e 10 % de FBS. Todas as linhagens celulares foram obtidas do American Type Culture Collection, e 15 foram mantidas a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5 % de CO₂.

Para coletar meio condicionado, as linhagens celulares foram cultivadas em alta densidade durante a noite na ausência de soro. O meio coletado foi concentrado usando filtros Centricon YM-10.000 (Milipore).

Transfecção de GPC3: A linhagem celular 293 foi transfectada com um DNAc²¹ de GPC3 com etiqueta de hemaglutinina A (HA) introduzido no vetor pEF (ou vetor vazio como controle), e as células transfectadas selecionadas com 800 gg/ml de G418 (Gibco BRL). Células expressando altos níveis de GPC3 foram sortidas por FACS depois de corar as células selecionadas por G418 com um 12CA5 Mab anti-HA e um anticorpo secundário 25 conjugado a FITC. As células sortidas foram em seguida expandidas em cultura de tecido.

Produção de anticorpos monoclonais de camundongo antiGPC3: Camundongos fêmeas Balb/C foram imunizados com uma única injeção i.p. de 50 μg de um fragmento de GPC3 marcado com His contendo 30 os últimos 70 aminoácidos da proteína de núcleo. O imunogênio foi emulsificado com adjuvante Titermax Gold (Cedarlane). Depois de 21 dias, os camundongos receberam reforço com 50 μg do mesmo imunogênio na ausên20 cia de adjuvante. Dois dias depois, as amostras de sangue foram colhidas ca veia da cauda, e foi obtido o soro correspondente. O título de anti-GPC3 nas amostras de soro foi estimado por meio de um ELISA usando como controle negativo o soro pré-imunizado dos mesmos camundongos. Esple5 nócitos obtidos dos dois camundongos com os maiores títulos foram fundidos com células de mieloma de camundongo SP2/0 Ag14 (relação 6:1) na presença de polietileno glicol 4000 (Sigma) usando procedimentos padrão. As células fundidas foram colocadas em lâminas de 96 cavidades e expandidas em a-MEM, 10 mM de Hepes, 50 μΜ de 2-mercaptoetano1, 20 % de 10 FBS suplementado com Nutridoma-CS (Roche) e hipoxantina, aminopterina e timidina (suplemento HAT, Gibco BRL). Para selecionar produtores de hibridomas os clones expandidos foram triados por ELISA, usando lâminas de 96 cavidades carregadas com 0,05 μg de imunogênio GPC3 por cavidade. As placas foram bloqueadas por 2 horas com 1 % de albumina de soro bo15 vino (BSA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), e foi adicionado meio condicionado de cada clone. A presença de anticorpos anti-GPC3 ligados ao antígeno foi detectada usando IgG anticamundongo de cabra e IgM anticamundongo de cabra conjugada a peroxidase de rábano silvestre (StressGen) com O-fenilenodiamina (Sigma) e peróxido de hidrogênio como 20 substratos. Os clones positivos foram em seguida adicionalmente expandidos, e foi testada sua capacidade para corar células 293 transfectadas com GPC3 por meio de imufluorescência. Os hibridomas positivos, isto é, 1G12 e 8H5, foram racionados duas vezes, e foi determinado seu isótipo (lgG1, K) usando Isostrip (Roche). Os anticorpos foram purificados de sobrenadantes 25 da cultura condicionada usando colunas de proteína A (kit Affi-Gel Protein A MAPS II, Bio-Rad).

Imunofluorescência: 293 Células transfectadas com GPC3 ou com vetor somente foram semeadas sobre lâminas tratadas com poli-Llisina, e fixadas com 4 % de paraformaldeído em PBS. Depois de 1 hora de 30 incubação com Mab anti-GPC3 ou IgG de camundongo normal (Santa Cruz Biotechnology) (15 μg/ml), as lâminas foram lavadas 3 vezes com PBS, e a ligação do primeiro anticorpo foi detectada com fragmento F(ab')2 de IgG anticamundongo de carneiro conjugada a FITC (StressGen).

Análise Western Blot. As células foram lisadas em tampão RIPA contendo inibidores da protease (2 mM de PMSF, 10 pg/ml de leupeptina, 10 μg/ml de aprotinina) por 30 minutos sobre gelo. As amostras de proteína foram rodadas sobre um gel a 6 % de SDS-poliacrilamida e transferidas para uma membrana de PVDF (Pall Corporation). As membranas foram bloqueadas em tampão de bloqueio (10 mM de Tris-HCL pH 8,0, 150 mM de NaCI 0,1 % de Tween20, 5 % de leite em pó sem gordura) durante 1 hora â temperatura ambiente, e em seguida incubadas com 1 μg/ml de Mab 1G12 ou 12CA5 durante a noite a 4 °C. Depois de incubação com anticorpo secundário de IgG anticamundongo de peroxidase de rábano silvestre durante uma hora, foram detectadas as bandas protéicas usando reagentes de quimoluminescência ECL (DuPont NEN).

Imunohistoquímica: Seções de tecido embutidas em parafina foram desparafinizadas com xileno e reidratadas em uma série graduada de soluções de etanol. Em seguida, foi realizada uma técnica de recuperação de antígeno aquecendo as lâminas em tampão de citrato a 10 mM pH 6 em um forno de microondas Kenmore (2 minutos em potência nível 10, 1,5 minuto em potência nível 6 e 2,5 minutos em potência nível 9, e repetindo estas três etapas duas vezes). As lâminas foram enxaguadas com água destilada, desidratadas em uma série graduada de etanol, e mergulhadas em 10 % de peróxido de hidrogênio em metanol durante 10 minutos para bloquear a peroxidase endógena. As lâminas foram reidratadas e foi feito imunotingimento usando o Mab anti-GPC3 a 20 μg/ml (ou IgG de camundongo normal e PBS como controles negativos) de acordo com as instruções do kit Histostain-SP (Zymed Laboratories) e o TSATM Biotin System (NEN Life Science Products). Seções seriais foram coradas com um anticorpo policlonal de coelho para AFP (Dako, A008) em uma diluição de 1/400. Peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio aquoso, e foi detectada ligação de anticorpo com o sistema Ultra HRP (ID Labs).

ELISA de sanduíche: Placas ELISA de 96 cavidades foram cobertas com 0,5 μg de Mab 1G12 anti-GPC3 em 50 μΙ de PBS por cavidade.

As palcas foram bloqueadas por 2 horas com 1 % de BSA em PBS, e 60 μΙ de amostras de soro diluído (1 : 3 em PBS) foram adicionadas e incubadas durante a noite a 4 °C. Depois de lavar o material não ligado com 0,1 % de BSA em PBS, GPC3 ligado foi detectado usando um anticorpo policlonal de ovelha anti-GPC3 ²², seguido por uma incubação com IgG antiovelha de asno conjugada a peroxidase de rábano silvestre (Sigma) usando Ofenilenodiamina (Sigma) e peróxido de hidrogênio como substratos. De modo a quantificar o GPC3 presente no soro, uma curva de calibração de GPC3 purificado adicionado à mesma diluição de uma combinação de soro normal foi feita em paralelo. Para determinar a presença de GPC3 no soro normal, a curva de calibração de GPC3 foi feita em PBS. Cada amostra foi medida três vezes por quadruplicatas.

Análise estatística: A importância de diferenças entre os grupos foi determinada pelo teste de Mann-Whitney.

Concentração sorológica de AFP: Os níveis de AFP em amostras de soro paralelas foram determinados por um kit ELISA disponível comercialmente (Axsym, Abbott).

EXEMPLO 1: Produção e caracterização de Anticorpos Policlonais para GPC3

Uma porção do DNAc de GPC3 clonado (Filmus et al., supra) codificando os 70 aminoácidos de terminal de C consecutivos de GPC3 humana foi expressa como uma proteína de fusão glutationa-S-transferase em um sistema de expressão E. coli convencional.

A proteína de fusão, purificada sobre uma coluna de glutationa, foi usada para imunizar ovelhas, usando um protocolo padrão. Os anticorpos policlonais foram purificados por afinidade contra o imunogênio de 70 aminoácidos, por meio de métodos convencionais, conforme descrito em Antibodies, a Laboratory Manual, (1988), Ed. Harlow et al., Cold Spring Harbor. Os anticorpos policlonais foram usados para estudos Western blot e da imunoprecipitação.

EXEMPLO 2: Produção de Hibridomas produtores de Anticorpos Monoclonais para GPC3

O mesmo imunogênio, uma proteína de fusão-GST incluindo os 70 aminoácidos de terminal de C de GPC3 humana, foi usado para aumentar anticorpos monoclonais. Esta região de 70 aminoácidos é a menos conservada entre as espécies e foi portanto usada para gerar anticorpos específicos para GPC3 humana. Foram produzidos hibridomas usando métodos de conhecimento das pessoas versadas na técnica, por exemplo conforme descrito em Kohler e Milstein, Nature, 256: 495 - 497, (1975).

Em resumo, camundongos fêmeas Balb/C foram imunizados com uma única injeção i.p. contendo 50 gg de um fragmento de GPC3 humana de 70 aminoácidos de terminal carboxila com etiqueta His emulsificado com adjuvante Titermax Gold® (Cedarlane). Depois de 21 dias, os camundongos receberam reforço de 50 gg do mesmo imunogênio na ausência de adjuvante. Dois dias depois, foram colhidas amostras de sangue da veia da cauda, e foi colhido o soro dos camundnogos. O título de anti-GPC3 nas amostras de soro foi testado por meio de um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) usando como controle negativo o soro pré-imunizado dos mesmos camundongos. Esplenócitos obtidos dos dois camundongos com maior título foram fundidos com células de mieloma de camundongo SP2/0 Ag14 (relação de 6:1) com polietileno glicol 4000 usando procedimentos padrão¹ (Parkin, D.M., Pisani, P. & Ferlay, J., Global cancer statistics. CA. Cancer J. Clin., 49, 33 - 64, 1, (1999). As células fundidas foram laminadas em placas de 96 cavidades em a-MEM, 10 mM de Hepes, 50 μΜ de 2mercaptoetanol, 20 % de FBS suplementado com Nutridoma-CS® (Roche) como fonte de fatores de crescimento e hipoxantina, aminopterina e timidina para selecionar os híbridos. Os clones obtidos foram triados por meio de ELISA, usando placas de 96 cavidades carregadas com 0,05 pg de fragmento de GPC3 de terminal carboxila/ cavidade. As placas foram bloqueadas por 2 horas com 1 % de albumina sérica bovina (BSA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), e incubadas com os sobrenadantes da cultura condicionada. A ligação do primeiro anticorpo foi detectada usando IgG anti-camudongo de cabra e IgM anti-camudongo de cabra conjugadas a peroxidase de rábano silvestre (StressGen®) com O-fenilenodiamina e peró

xido de hidrogênio como substratos. Os clones positivos foram triados novamente por meio de imunofluorescência usando células transfectadas com GPC3. Os hibridomas selecionados (1G12 e 8H5) foram clonados duas vezes, seu isótipo determinado (lgG1, K) usando Isostrip® (Roche) e foram purificados dos sobrenadantes da cultura condicionada usando kit de comatografia de coluna.de proteína A Affi-Gel Protein A MAPS II, (Bio-Rad®).

Anticorpos produzidos pelos hibridomas foram triados contra os 70 fragmentos de aminoácidos GPC3 usando um ELISA. Em seguida clones positivos foram testados para sua capacidade para corar especificamente células GPC3-transfectadas. Dois hibridomas (1G12 e 8H5) produziram anticorpos que apresentaram imunocoloração forte e específica de células GPC3-transfectadas.

A Figura 1 ilustra o tingimento de 293 células com anticorpos 1G12, seguido por um segundo anticorpo fluorescente. Os Painéis A e C são micrografias de contraste de fase e os Painéis B e D são micrografias fluorescentes. Os Painéis A e B apresentam 293 células transfectadas com o vetor somente, ao passo que os Painéis C e D apresentam células transfectadas com o vetor contendo GPC3. Neste exemplo, as células foram coradas na presença de 10 μg/ml de anticorpo monoclonal (mAb) 1G12. O Painel D demonstra claramente o tingimento específico com mAb 1G12. Não é visto tingimento nas células transfectadas com o vetor somente (painel B). EXEMPLO 3: Caracterização de Anticorpos Monoclonais

A especificidade dos dois anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas 1G12 e 8H5 foi confirmada por meio de análise Western blot de lisados protéicos de células trasnfectadas com GPC3 com etiqueta HA. Conforme mostrado na Figura 2, o anticorpo 1G12 detectou a banda correspondente à proteína núcleo GPC3, e a mancha correspondente à forma glicanada de GPC3. Como um controle, foi realizado um Western blot paralelo com um anticorpo anti-HA (12CA5).

EXEMPLO 4: GPC3 em seções de tecido

Seções de parafina de tumor de HCC e células não-malignas circundantes foram coradas imunohistoquimicamente com anticorpo mono

clonal anti-GPC3 1G12 conforme descrito acima. O anticorpo anti-GPC3 foi detectado usando um segundo anticorpo de imunoglobulina anticamundongo biotinilada e o segundo anticorpo ligado foi detectado usando estreptavidina conjugada a peróxido de rábano silvestre.

A Figura 3 mostra que o anticorpo monoclonal anti-GPC3, 1G.12, ligou fortemente a células tumorais, mas não liga de modo algum com os hepatócitos normais. Além da presença prevista de GPC3 na membrana celular, também é visto tingimento importante no citoplasma. O tingimento citoplasmático foi principalmente granular e próximo à superfície celular. Ocasionalmente foi observado tingimento perinuclear. Células nãoparenquimais foram geralmente negativas, com a exceção de macrófagos. Estes resultados indicam que anticorpos monoclonais anti-GPC3 podem ser usados para diagnosticar HCC em seções de tecido hepático por meio de detecção de GPC3.

EXEMPLO 5: Determinação in vitro da expressão de GPC3 em lesões malignas e benignas

A Tabela 1 resume os resultados de um estudo imunohistoquímico de anticorpos monoclonais para GPC3 reagindo com quinze carcinomas hepatocelulares diferentes. Doze (80 %) destes carcinomas hepatocelulares reagiram com os anticorpos monoclonais para GPC3. Houve alguma variação no número de células coradas que reagiram com o mAb anti-GPC3 em cada tumor. Células positivas geralmente se aglomeraram em regiões semelhantes a clone. Em todos os casos, as células hepáticas não-malignas circundando o tumor foram negativas.

Tabela 1. Expressão de GPC3 em HCC.

N° Acc. de HCC's	mAb1G12	mAb 8H5	% de célula positivas
2188-961	3	3	70
21914-	3	3	80
4865-99	3	3	90
7530-93 A	3	3	100
7590-98 B	3	2	90
28828-99 A	3	-	100
12056-97	2	2	40-60

N° Acc. de HCC's	mAb1G12	mAb 8H5	% de célula positivas
19626-98 A	1	1	1-5
18891-96 ^;	1	1	5
6301-99 B	1	1	20
2978-97 B	1	1	1
5940-96	1	1	5-10
21424-98 A	0	0	-
10355-97 D	0	0	-
10865-01 C	0	0	-

A Tabela 2 mostra um resumo dos resultados de reações de um anticorpo monoclonal anti-GPC3 com tecidos hepáticos malignos e nãomalignos. 6 adenomas hepáticos e 9 displasias hepáticas foram negativos para GPC3. .

Tabela 2. Expressão de GPC3 em tecidos hepáticos não-malignos

Tipo de Tecido Hepático	Número de tipos de tecido testados	Expressão de GPC3 (%)
HCC	23	19(83%)
Alto grau de displasia	3	0 (0 %)
Baixo grau de displasia	6	0 (0 %)
Adenoma hepatocelular	6	0 (0 %)
Fígado normal	34	0 (0 %)

Os dados indicam que GPC3 não é expresso no fígado normal e em lesões benignas, ao passo que a maioria dos carcinomas hepatocelulares expressam níveis detectáveis de glipican-3.

EXEMPLO 6: Teste imunolóqico para detecção de GPC3

Foi usado um ELISA de sanduíche para determinar GPC3 no soro de pacientes diagnosticados com HCC. Para o ELISA, placas de 96 cavidades foram revestidas com anticorpo monoclonal anti-GPC3 1G12, e uma alíquota de soro de teste foi adicionada. O material não ligado foi removido por lavagem, e GPC3 ligado foi detectado usando anticorpos poli15 clonais de ovelha anti-GPC3 preparados como no Exemplo 1, complexada diretamente ou indiretamente a um reagente de detecção útil para detectar a presença do complexo imune. A densidade ótica da amostra foi medida e comparada com os resultados de uma curva padrão. A Figura 4 ilustra a

curva padrão para o teste. Os resultados do teste foram lineares dentro do alcance testado.

Foi estabelecido um protocolo para colher soro de pacientes que estavam sendo tratados para HCC no Hospital Geral de Toronto, e dos 5 quais foi obtido ó consentimento por escrito. Em um estudo preliminar, foi colhido soro de 9 pacientes com diagnóstico de HCC estabelecido. O soro normal de 38 doadores de sangue também foi colhido e reunido, os níveis de GPC3 foram determinados por um teste ELISA de sanduíche, usando diluição a 1 : 3 (soro : PBS) da amostra. Cada amostra foi analisada em 10 quadruplicata. A concentração de GPC3 foi obtida comparando a densidade ótica obtida de cada amostra com uma curva padrão gerada adicionando várias quantidades de GPC3 à mesma diluição de uma mistura de soro normal.

A Tabela 3 resume os resultados do estudo. Cinco dos nove 15 pacientes com HCC (55 %) tiveram valores de GPC3 que foram significativamente elevados. Nenhum destes pacientes teve níveis significativamente elevados de AFP. GPC3 não foi detectável em qualquer uma das amostras normais.

Tabela 3.

N° do paciente	Nível de GPC3 (ng/ml)	Erro padrão	P
1	100,6	17,7	0,0027 (*)
2	292,4	16,7	<0,0001 (*)
4	84,9	19,3	0,0081 (*)
5	0	9,6	NS
6	75,4	9,0	0,0014 (*)
7	14,9	3,5	NS
8	44,4	54,3	NS
9	102,6	12,9	0,0001 (*)
10	0	12,9	NS
Mistura de soro normal	0	10,1

* significativamente diferente do soro normal

Foram conduzidos estudos adicionais usando um ELISA de sanduíche para medir os níveis de soro de GPC3 em 53 indivíduos saudáveis, 18 pacientes com hepatite, 20 com hepatite mais cirrose, e 34 com HCC. Foi visto que GPC3 foi indetectável em todos os indivíduos saudáveis e que 18 dos 34 pacientes com HCC (53 % de sensibilidade) tiveram níveis 5 significativamente elevados de GPC3 de soro, com valores variando de 151 a 2924 ng/ml (Fig. 5 e Tabela 4). Além disso, GPC3 foi indetectável em todos os pacientes com hepatite e foi detectado em somente 1 de 20 (5 %) pacientes com hepatite mais cirrose, em um nível de 117 ng/ml (95 % de especificidade). Análise estatística usando o teste de Mann-Whitney mos10 trou que os níveis de soro médios (ng/ml) de GPC3 em pacientes com HCC é significativamente maior do que os dos pacientes com hepatite mais cirrose, hepatite e doadores saudáveis e não houve diferença importante entre os três últimos grupos.

EXEMPLO 7: Comparação dos níveis de GPC3 e AFP

Os níveis de soro de AFP foram medidos na mesma série de 34 pacientes com HCC descritos no Exemplo 6, usando um kit ELISA disponível comercialmente (Axsym, Abbott). A Tabela 4 mostra uma comparação dos valores de AFP e GPC3 obtidos.

Tabela 4: Concentração sérica de GPC3 e AFP em pacientes com HCC

N° do paciente	GPC3 (ng/ml)	AFP (ng/ml)	Etiologia
1	2924	133	HBV
2	2295	12	HCV
3	1758	<5	HBV
4	1065	34	HCV
5	1026	14	HCV
6	1006	30	HBV
7	849	14	HCV
8	783	23	HBV e HCV
9	755	<5	HBV
10	445	14428	Desconhecido
11	433	10	HBV
12	351	7809	HCV
13	252	8629	HCV

N° do paciente	GPC3 (ng/ml)	AFP (ng/ml)	Etiologia
14	235	1628	HCV
15	214	78	Alcoólico
¹⁶	211	<5	Alcoólico
17	184	5	HBV
18	151	40	Alcoólico
19	47	52000	Alcoólico
20	26	1516	HCV
21	0	8	HBV
22	0	30	HBV
23	0	<5	HBV
24	0	15	HBV
25	0	<5	HBV
26	0	488	Desconhecido
27	0	5	Alcoólico
28	0	2603	Desconhecido
29	0	194	HBV
30	0	13	HBV, HIV
31	0	67	HCV
32	0	27	HBV
33	0	74	HCV
34	0	1900	HCV

A presente invenção não está limitada às características das modalidades descritas neste relatório, mas inclui todas as variações e modificações dentro do âmbito das reivindicações.

Claims

1. Método in vitro para triagem de um paciente para carcinoma hepatocelular (HCC) compreendendo:

determinar o nível de glipicano-3 (GPC3) na amostra de fluido corporal de um paciente, em que a presença de um nível detectável de GPC3 na amostra é sugestiva de HCC no paciente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente determinar o nível de alfafetoproteína (AFP) na amostra, em que no mínimo um de um nível detectável de GPC3 na amostra e um nível de AFP maior do que o nível de AFP de pacientes de controle normais na amostra é sugestivo de HCC no paciente.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o nível de AFP da amostra é maior do que 20 ng/ml.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o nível de AFP da amostra é maior do que 100 ng/ml.

5. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o nível de GPC3 da amostra é determinado por um método imunológico.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o método emprega um anticorpo ou fragmento de anticorpo o qual se liga especificamente a GPC3 humana ou a um fragmento da mesma.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento se liga especificamente a um epítopo dentro dos 70 aminoácidos consecutivos carboxi-terminais de GPC3 humana.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo policlonal.

9. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo monoclonal.

10. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado

Petição 870190009451, de 29/01/2019, pág. 8/15 pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um fragmento selecionado dentre o grupo consistindo em Fab, F(ab')2 e Fv.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo carrega um marcador detectável.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é detectado usando um segundo anticorpo o qual se liga especificamente ao anticorpo anti-GPC3 ou fragmento de anticorpo e compreende um componente de um sistema gerador de sinal.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GPC3 ou fragmento é fixado a um substrato sólido, a amostra é posta em contato com o substrato sólido para permitir que GPC3 na amostra se ligue ao anticorpo anti-GPC3 ou fragmento fixado, o substrato sólido é lavado e o GPC3 ligado é determinado usando um segundo anticorpo o qual se liga especificamente ao anticorpo anti-GPC3 ou fragmento de anticorpo e compreende um componente de um sistema gerador de sinal.

14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo é conjugado a peroxidase de rábano silvestre.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a

14, caracterizado pelo fato de que o nível de AFP é determinado por um teste ELISA.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

15, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal é soro ou plasma.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

16, caracterizado pelo fato de que o paciente é um paciente humano.

18. Método in vitro para diagnosticar HCC em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende:

determinar a presença de GPC3 em uma amostra de tecido hepático de um paciente;

Petição 870190009451, de 29/01/2019, pág. 9/15 em que a detecção de GPC3 na amostra é indicativa de HCC.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a presença de GPC3 na amostra de tecido é determinada pondo seções do tecido em contato com um anticorpo ou fragmento de anticorpo o qual se liga especificamente a GPC3 humana e detectando o anticorpo anti-GPC3 ou fragmento ligado à seção de tecido.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GPC3 ligado ou fragmento é determinado usando um segundo anticorpo o qual se liga especificamente ao anticorpo anti-GPC3 ou fragmento e compreende um componente de um sistema gerador de sinal.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo é biotinilado.

22. Método in vitro para detectar a presença de GPC3 em uma amostra, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

pôr uma amostra em contato com um anticorpo ou fragmento do mesmo o qual se liga especificamente a GPC3 ou a um fragmento do mesmo para permitir a formação de um complexo anticorpo-GPC3, ou um complexo de fragmento de anticorpo-GPC3; e detectar o complexo de anticorpo-GPC3 ou de um fragmento de anticorpo-GPC3.

23. Método para determinar o nível de GPC3 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:

pôr uma amostra em contato com um anticorpo ou fragmento do mesmo o qual se liga especificamente a GPC3 ou a um fragmento do mesmo para permitir a formação de um complexo de anticorpo-GPC3 ou de um fragmento de anticorpo-GPC3; e determinar o complexo de anticorpo-GPC3 ou de um fragmento de anticorpo-GPC3.

24. Kit para detectar ou determinar o nível de GPC3 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:

um anticorpo substancialmente purificado ou fragmento do

Petição 870190009451, de 29/01/2019, pág. 10/15 mesmo o qual liga especificamente a GPC3 ou a um fragmento do mesmo.

25. Kit, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo se liga especificamente a GPC3 humana ou a um fragmento da mesma.

26. Kit de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento liga especificamente a um epítopo dentro dos 70 aminoácidos consecutivos carboxi-terminais de GPC3 humana.

27. Kit de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo policlonal.

28. Kit de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo monoclonal.

29. Kit, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é um fragmento selecionado dentre o grupo consistindo em Fab, F(ab')2 e Fv.

30. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente meios para detectar ou determinar a quantidade de um complexo GPC3-anticorpo ou um complexo de GPC3-fragmento de anticorpo.