BRPI0314435B1 - composição de melhoramento de pão, método para preparar um produto de padaria, método para aumentar o volume da carcaça de um produto de padaria e produto de padaria - Google Patents

Abstract

"utilização de enzimas da família 8 com atividade xilanolitíca na cozedura". a presente invenção descreve um método para o melhoramento de uma massa de farinha e/ou produtos de padaria por adição de uma composição de melhoramento de pão ou de massa de farinha, contendo uma enzima com atividade xilanolítica pertencente às hidrolases de glicosídeo da família 8. enzimas preferenciais são a xilanase psicrofílica obtida a partir de pseudoalteromonas haloplanktis ou a xilanase y mesofílica obtida a partir de bacillus halodurans c-125.

Description

"COMPOSIÇÃO DE MELHORAMENTO DE PÃO, MÉTODO PARA PREPARAR UM PRODUTO DE PADARIA, MÉTODO PARA AUMENTAR O VOLUME DA CARCAÇA DE UM PRODUTO DE PADARIA E PRODUTO DE PADARIA" Campo da invenção [001] A presente invenção respeita a um método e a uma composição para o melhoramento de produtos de padaria que compreende, pelo menos, uma enzima com atividade xilanolitica obtida a partir da hidrolase de glicosideo da família 8. Numa concretização da invenção tal enzima com atividade xilanolitica é também caracterizada pelo fato de haver uma inversão de configuração durante a hidrólise. Em concretizações específicas da invenção tal enzima com atividade xilanolitica é uma xilanase psicrofílica obtida a partir da Pseudoalteromonas haloplanktis ou uma xilanase mesofílica obtida a partir da Bacillus halodurans.

Estado da técnica anterior [002] As xilanas são heteropolissacarídeos que formam a maior parte da hemicelulose presente na biomassa das plantas. A estrutura principal destes polissacarídeos é uma cadeia de resíduos de β 1-4 xilopiranosil ligados. Muitos grupos laterais diferentes podem ligar-se a esses resíduos, tais como resíduos de acetila, de arabinosila e de glucuronosila. Os compostos fenólicos tais como os ácidos ferúlicos ou hidroxicinâmicos também estão envolvidos através de ligação de éster na ligação cruzada das cadeias de xilana ou na ligação entre a xilana e as cadeias de lignina por exemplo.

[003] As endoxilanases (ou endo-β-Ι,4-xilanases) hidrolisam especificamente a estrutura da hemicelulose. Em alguns casos, os grupos laterais podem dissimular a cadeia principal por bloqueio estérico. Foram descritas diferentes atividades de xilanases. A sua especificidade em relação ao seu substrato varia de umas para as outras. Algumas são mais ativas em arabinoxilanas insolúveis. O comprimento dos oligômeros produzidos também depende do tipo de xilanase considerado.

[004] As hidrolases de glicosideos (anteriormente conhecidas como celulase da familia D) foram classificadas em 91 famílias (http;//afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/) baseadas em homologias sequenciais, características mecânicas e estruturais. Uma vez que as dobras das proteínas são melhor conservadas do que as suas sequências, algumas das famílias podem ser agrupadas em "clãs" (Henrissat B. 1991, Biochem. J. Vol. 280, p. 309) . As endo-beta-1,4-xilanases são geralmente classificadas nas famílias 10 (anteriormente família F) e 11 (anteriormente família G) e descobriu-se que têm frequentemente uma relação inversa entre o seu pi e o peso molecular. As xilanases da família 10 (EXslO) são maiores e, mais complexas, enquanto que as xilanases da família 11 (EXsll) são menores. Ademais, existe uma diferença significativa na estrutura e nas propriedades catalíticas de ambas as famílias. As EXslO apresentam um dobra em barril (a / β)8, têm cerca de 40% de estruturas α-helix e pertencem ao clã GH-A (Dominguez et al., 1995, Nat. Struct. Biol. Vol. 2, p. 569) enquanto as EXsll exibem uma conformação dobrada β-geleia, têm cerca de 3-5% de estruturas de α-helix e pertencem ao clã GH-C (Tõrrõnen et al. , 1994, EMBO J. Vol. 13, p. 2498) . As EXslO têm um local de ligação ao substrato menor e uma especificidade para o substrato mais baixa, têm frequentemente atividade de endoglucanase e produzem oligossacarídeos menores comparativamente às EXsll, que têm uma afinidade mais elevada para xilanas não substituídas (Biely et al. , 1997, J. Biotechnol. Vol. 57, p. 151) . Todas as xilanases de ambas as famílias caracterizadas até à data retêm a configuração anomérica do oxigênio glicosídico após hidrólise na qual dois glutamatos funcionam como resíduos catalíticos (Jeffries, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 7, p. 337).

[005] As xilanases são utilizadas em várias áreas industriais como nas indústrias da polpa, do papel, alimentar e de padaria. Outras aplicações relacionam-se com os setores dos sumos e das cervejas. As xilanases também podem ser utilizadas no processo de separação do trigo. Os efeitos tecnológicos observados são, entre outros, descoloração melhorada da polpa, redução da viscosidade dos alimentos ou alterações das características da massa de farinha.

[006] A utilização de xilanases (também designadas por hemicelulases ou pentosanases) na cozedura é bem conhecida há já alguns anos. Estas enzimas de condicionamento de massa de farinha podem melhorar a estabilidade e a moldabilidade da massa de farinha, assim como o crescimento no forno e a estrutura do miolo. Outros efeitos das enzimas são um volume de pão maior e um miolo mais fofo.

[007] O mecanismo de ação das xilanases na preparação do pão ainda não está claramente esclarecido. Existem cerca de 3 a 4% de pentosanas na farinha de trigo. Estas pentosanas conseguem absorver grandes quantidades de água (até 30%). Esta absorção de água contribui para as propriedades da massa de farinha assim como para a qualidade do produto final. A hidrólise parcial das pentosanas através de pentosanases em oligossacarídeos de cadeia curta solúveis em água aumenta a capacidade de ligação à água. Há também uma forte interação das pentosanas com a fração de glúten da farinha para formar uma rede. As pentosanases podem ajudar a relaxar esta rede forte e rigida e, consequentemente, permitem que o dióxido de carbono formado pelo fermento expanda melhor a massa de farinha.

[008] Têm sido utilizados muitos tipos de preparações de hemicelulase como ingredientes ativos de cozedura e estão comercialmente disponíveis. São produzidos através de fermentação microbiana utilizando vários microrganismos como fontes de enzimas. Algumas destas enzimas também são produzidas por microrganismos modificados geneticamente. Todas as utilizações documentadas de xilanases com um efeito positivo no volume específico de produtos de padaria, referem-se a xilanases pertencentes a hidrolases de glicosídeos da Família 10 ou da Família 11 como anteriormente definido.

[009] Exemplos de xilanases para cozedura são as xilanases obtidas a partir de Bacillus Subtilis e Aspergillus niger.

[0010] Existe uma variedade de métodos para avaliar a atividade da xilanase numa preparação enzimática. Exemplos de tais métodos de determinação da atividade da xilanase são a medição da libertação de açúcar reduzido a partir da xilana (Miller G.L. 1959, Anal. Chem. Vol. 31, p. 426) ou a medição da libertação de compostos corados a partir de substratos modificados (por exemplo, AzoWAX ou Xilazime AX da Megazime). No entanto, não se encontrou uma correlação direta entre a atividade xilanolítica encontrada nas várias preparações enzimáticas e o efeito na cozedura. Resultados relacionados com a dosagem podem ser observados, até certo ponto, relativamente a uma única enzima, mas a mesma dosagem para duas xilanases de diferentes origens não confere o mesmo resultado à massa de farinha ou ao pão. Várias razões podem explicar isto: as diferenças na especificidade do substrato, as diferenças na temperatura e no pH ótimos, ...

[0011] É de grande interesse desenvolver novas preparações enzimáticas, tais como agentes ou composições de melhoramento do pão, com propriedades novas ou melhoradas. Uma destas propriedades pode ser o fato de a fração de xilanase ser o menor possível (em termos de peso de enzimas necessárias para obter um resultado particular na cozedura).

[0012] Foi recentemente descrita uma xilanase obtida a partir da bactéria da Antártida Pseudoalteromonas haloplanktis (Collins, T. et al. 2002. Uma nova xilanase da Família 8: caracterização funcional e físico-química. J.Biol. Chem. Vol. 277-38, p. 35133; Collins, T. et al. 2003, Atividade, estabilidade e flexibilidade em glicosidases adaptadas a ambientes térmicos extremos. J. Mol. Biol. Vol. 328, p. 419; Van Petegem F. et al., 2002. Análise preliminar por raio-X e cristalização de uma xilanase obtida da psicrofila Pseudoalteromonas haloplanktis. Ata Crystallogr D Biol Crystallogr. Vol. 58 (Pt 9), p. 1494-6) . Esta enzima é uma enzima psicrofílica típica e apresenta uma elevada atividade catalítica a baixa temperatura. Não é homóloga para xilanases da família 10 ou 11 mas tem 20 a 30% de identidade com as hidrolases de glicosídeos membros da família 8 (anteriormente família D) , uma família que compreende essencialmente endoglucanases mas também liquenases e quitosanases. Ademais, um FingerPRINTScan contra PRINTS utilizando o programa de pesquisa InterPro Scan (Zdobnov e Apweiler, 2001, Bioinformatics Vol. 17, p. 847) indicou que a sequência isolada continha a impressão digital das hidrolases de glicosil da família 8 e resíduos da família 8 que são estritamente conservados em 20 enzimas da família 8 analisadas.

[0013] Contrariamente às EXslO e EXsll, esta xilanase da família 8 (EXs8) possui quer elevado pH, quer elevado peso molecular. As propriedades estruturais e catalíticas são diferentes das EXslO e EXsll. As Exs8 apresentam um (oí/oí) 6 invólucro de barril com 13 α-hélices e 13 β-fios e pertencem ao clã GH-M (Van Petegem et al. , 2003, A estrutura de uma xilanase da família 8 adaptada ao frio a uma resolução de 1,3 A. Adaptações estruturais ao frio e investigação do local ativo. J. Biol. Chem. Vol. 278(9), p. 7531-9). Estas enzimas não têm atividade de endoglucanase, quitosanase ou de liqueninase e parecem ser funcionalmente semelhantes às EXsll, sendo mais ativas em xilo-oligossacarídeos de cadeia longa.

[0014] Em contraste com outras EXslO e EXsll conhecidas que retêm a configuração, as glico-hidrolases da família 8 (Fierobe et al. , 1993. Eur J. Biochem. Vol. 217, p. 557; http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/) tendem a hidrolisar o substrato com inversão da configuração anomérica do oxigênio glicosídico após hidrólise na qual um glutamato e um aspartato funcionam como resíduos catalíticos. Isto foi mostrado por exemplo para a xilanase psicrofílica obtida a partir da Pseudoalteromonas haloplanktis (Van Petegem et al., 2003, J. Biol. Chem., Vol. 278 (9), p. 7531-9; Collins, T. et al. 2002. Uma nova xilanase da família 8: caracterização funcional e físico-química. J. Biol. Chem. Vol. 277 (38), p. 35133). Já foram descritas outras xilanases pertencentes às hidrolases de glicosideos da familia 8 (Yoon, K-H., 1998, Clonagem molecular de um gene KK-1 da xilanase de Bacillus sp. e caracterização do produto do gene. Biochem. Mol. Biol. International. 45(2), p. 337; xilanase Y de Bacillus halodurans C-125 código de acesso GenBank/GenPept™ BAB05824). Estas xilanases apresentam homologias sequenciais entre elas assim como com a xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis como descrito por Collins et al (2002, vide acima).

[0015] A lista das enzimas pertencentes às hidrolases de glicosideos da familia 8 é regularmente atualizada (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).

Objetivos da invenção [0016] A presente invenção visa providenciar preparações enzimáticas novas tais como composições de melhoramento do pão.

[0017] A presente invenção também visa providenciar um novo método para a obtenção de produtos de padaria melhorados através de tais preparações de enzimas.

Sumário da invenção [0018] Foi surpreendentemente verificado que uma enzima com atividade xilanolitica e pertencente a hidrolases de glicosideos da familia 8 tinha um efeito positivo nas propriedades da massa de farinha ou nas propriedades dos produtos de padaria quando era adicionada durante a mistura da massa de farinha.

[0019] Também foi surpreendentemente verificado que uma enzima com atividade de xilanase e que hidrolisa com inversão da configuração anomérica tinha um efeito positivo nas propriedades da massa de farinha ou nas propriedades dos produtos de padaria quando foi adicionada durante a mistura da massa de farinha.

[0020] Foi ainda surpreendentemente verificado que a utilização de enzimas conforme acima descritas aumenta o volume do pão.

[0021] Verificou-se também que a utilização de algumas de tais enzimas com atividade xilanolitica obtidas a partir de hidrolases de glicosideos da familia 8, as EXs8, tornam possivel a utilização de menos enzimas para o mesmo efeito nas propriedades da massa de farinha ou do pão comparativamente às xilanases presentemente conhecidas.

[0022] Uma concretização especifica desta invenção respeita às enzimas com atividade xilanolitica obtidas a partir de hidrolases de glicosideos da familia 8 e à sua utilização na indústria do pão como acima descrito.

[0023] Uma concretização particular da invenção respeita a uma xilanase psicrofilica da familia 8 obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis e a uma xilanase Y mesofilica da familia 8 obtida a partir de Bacillus halodurans. Estas enzimas são xilanases que hidrolisam com inversão da configuração anomérica.

[0024] As xilanases preferenciais são as obtidas a partir das estirpes Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a, e Bacillus halodurans C-125 ou as obtidas a partir do gene correspondente expresso num hospedeiro adequado.

[0025] Preferencialmente, a composição de melhoramento do pão que compreende pelo menos uma enzima da invenção é adicionada durante a mistura da massa de farinha.

[0026] Tal composição de melhoramento do pão também pode compreender outros agentes de melhoramento do pão selecionados de entre uma lista constituída por outras enzimas, emulsionadores, oxidantes, leite em pó, gorduras, açúcares, aminoácidos, sais, proteínas (glúten, locais de ligação de celulose) ou suas misturas.

[0027] Essas outras enzimas podem ser selecionadas de entre uma lista constituída por alfa-amilases, beta-amilases, amilases maltogênicas, outras xilanases, proteases, oxidase de glucose, oxido-redutases, glucanases, celulases, transglutaminases, isomerases, lipases, fosfolipases, pectinases ou suas misturas.

[0028] Tal alfa-amilase é preferencialmente obtida a partir de Aspergillus oryzae.

[0029] As enzimas com atividade xilanolítica segundo a invenção podem ser utilizadas em tal composição de melhoramento de pão sob a forma de extrato de células, de extrato de células livre ou de proteína purificada.

[0030] As enzimas da invenção podem ser misturadas com outros ingredientes e ser utilizadas sob a forma de um pó seco ou de um granulado, em particular um granulado não desempoado, ou sob a forma de um líquido, preferencialmente com um ou mais estabilizadores tais como polióis, açúcares, ácidos orgânicos ou álcoois açucarados.

[0031] Um outro aspecto da invenção respeita aos produtos de padaria obtidos ou susceptíveis de serem obtidos quando se utiliza uma enzima da invenção.

[0032] Um aspecto adicional da invenção respeita às composições de melhoramento do pão que compreendem pelo menos uma das enzimas da invenção.

[0033] Ainda um outro aspecto da invenção respeita a um método para aumentar o volume da carcaça de um produto de padaria, que compreende a etapa de adicionar, durante a mistura da massa de farinha de tal produto de padaria, uma quantidade suficiente de uma enzima com atividade xilanolitica selecionada de entre o grupo constituído por xilanases de hidrolase de glicosídeo da família 8, eventualmente enzimas com atividade xilanolitica que hidrolisam com inversão de configuração. É possível utilizar qualquer combinação ou mistura das enzimas acima descritas numa massa de farinha ou produto de padaria para qualquer das finalidades acima descritas.

Breve descrição das figuras [0034] A figura 1 representa o efeito de quantidades crescentes de xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a no volume de pãezinhos crocantes belgas;

[0035] A figura 2 mostra uma eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida de várias amostras de xilanase (quantidade de enzima carregada proporcional à quantidade utilizada na cozedura, o mesmo fator de proporcionalidade para todas as enzimas).

Banda 1: marcadores de peso molecular.

Bandas 2-5: quantidade de xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis (2-3) e de xilanase de Bacillus subtilis (4-5) necessária para tratar respectivamente 0,333 (2, 4) e 0,166 Kg (3, 5) de farinha de trigo.

[0036] As figuras 3A e B representam a sequência de nucleotídeos do gene da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis (A) e da correspondente xilanase (B);

[0037] A figura 4 representa a xilanase Y obtida a partir da estirpe Bacillus halodurans C-125.

[0038] A invenção será descrita mais detalhadamente nos exemplos e concretizações seguintes com referência aos desenhos anexos. As concretizações e exemplos particulares não pretendem de modo algum limitar o âmbito da invenção tal como reivindicada.

Descrição detalhada da invenção [0039] A presente invenção respeita, em particular, à utilização, na cozedura, de enzimas da familia 8 com atividade xilanolitica, para melhorar, entre outros aspectos, o volume da carcaça. Tais enzimas podem ter outras atividades, mas a atividade xilanolitica deve ser tal que a enzima seja adequada aos objetivos da presente invenção. A. Preparação de algumas enzimas preferenciais segundo a invenção [0040] As enzimas com atividade xilanolitica obtidas a partir de hidrolases de glicosil da familia 8 podem ser obtidas de várias fontes (veja-se, por exemplo, http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/ para uma perspectiva global). Algumas das enzimas foram descritas na literatura cientifica e podem, portanto, ser obtidas através da utilização das técnicas descritas nas publicações correspondentes. Abaixo, descreve-se mais detalhadamente a preparação de algumas enzimas preferenciais segundo a invenção. A.l. Xilanase obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a [0041] A xilanase obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a foi descrita em Collins T et al. (2002.

Uma nova xilanase da familia 8: caracterização funcional e fisico-quimica. J. Biol. Chem. Vol. 277(38), p. 35133).

Collins et al. descreve a preparação por cultura liquida de uma estirpe recombinante de Escherichia coli que transporta o gene da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a clonado num plasmideo de expressão.

[0042] A sequência de nucleotideos do gene da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis está disponível, assim como também o está a correspondente sequência de aminoácidos (número de acesso EMBL AJ427921, sequência aqui incluída por referência à mesma, figuras 3A-B, SEQ ID No.s 6-7). A enzima tem um peso molecular de 46000Da, um ponto isoeléctrico de aproximadamente 9,5, uma temperatura ótima de 35°C e um pH ótimo entre 5,3 e 8. É uma xilanase verdadeira tendo xilotriose e xilotetraose por principais produtos de reação da hidrólise da xilana após incubação prolongada.

[0043] A preparação em bruto ou purificada desta xilanase pode ser obtida começando-se pelo cultivo de qualquer das estirpes recombinantes de tipo selvagem num meio apropriado para exprimir a enzima, seguido eventualmente de uma ou várias etapas de purificação, tais como, mas não apenas, a centrifugação, o rompimento de células, a microfiltração, a ultrafiltração, a precipitação, a cromatografia líquida, a secagem a frio, ... A.2. Xilanase Y obtida a partir de Bacillus halodurans C-125 [0044] A sequência da xilanase Y da família 8 obtida a partir da estirpe Bacillus halodurans C-125 (ATCCCBAA-125) está disponível sob o código de acesso GenBank/GenPept™ BAB05824 (sequência aqui incluída por referência à mesma, figura 4, SEQ ID N° . 8) . A sequência de ADN correspondente está disponível como parte da sequência do genoma completo da estirpe Bacillus halodurans C-125 (código de acesso AP001514, sequência aqui incluida por referência à mesma).

[0045] A xilanase obtida a partir de Bacillus halodurans C-125 pode ser obtida começando-se pelo cultivo da estirpe num meio apropriado para exprimir a xilanase, seguido de uma ou várias etapas de purificação tais como, mas não apenas, a centrifugação, o rompimento de células, a microfiltração, a ultrafiltração, a precipitação, a cromatografia liquida, a secagem a frio.

[0046] Alternativamente, a xilanase obtida a partir de Bacillus halodurans C-125 pode ser obtida começando-se pela clonagem do gene correspondente, utilizando-se técnicas bem conhecidas tais como a amplificação por PCR, a ligação a um vetor e a transformação num hospedeiro microbiano. Após esta etapa, a xilanase pode ser vantajosamente expressa num hospedeiro adequado, colocando-se o gene sob o controlo de sequências de controlo apropriadas, tais como, mas não somente, promotores e terminadores, e inserindo-se esta construção de ADN numa célula que permita a expressão do gene.

[0047] Numa concretização especifica da presente invenção o gene da xilanase será sobreexpresso em tal célula.

[0048] A presente invenção, contudo, não se restringe às enzimas acima mencionadas, antes se estendendo a outras enzimas com atividade xilanolitica pertencentes às hidrolases de glicosidases da familia 8. Estas enzimas são produzidas por células vivas microbianas e não microbianas, tais como, mas não apenas, plantas ou animais. As enzimas podem ser obtidas diretamente de culturas de células vivas e/ou de amostras ou podem ser produzidas por estirpes recombinantes ou células hospedeiras. O gene que codifica a enzima em causa pode ser um gene sintético.

[0049] Por "estirpe recombinante" ou por "célula hospedeira recombinante" entende-se uma estirpe que tem incorporada a sequência de nucleotideos de tais enzimas com atividade xilanolitica pertencentes às hidrolases de glicosidases da familia 8.

[0050] Vantajosamente, as células hospedeiras recombinantes são selecionadas de entre o grupo constituído pelo universo microbiano, preferencialmente as bactérias ou os fungos, incluindo o fermento e, mais preferencialmente, Bacillus.

[0051] Preferencialmente, a dita estirpe recombinante é capaz de sobreexprimir a dita sequência de nucleotideos e permite, vantajosamente, uma elevada produção da referida xilanase.

[0052] As enzimas com atividade xilanolitica produzidas segundo a presente invenção podem ser utilizadas diretamente para o objetivo da presente invenção e/ou podem sofrer uma ou mais purificações ou (mais) etapas de cultura. Numa concretização particular da invenção, as enzimas podem ser usadas sob a forma pura.

[0053] Os métodos de preparação possíveis para as enzimas segundo a invenção incluem, entre outros, a preparação ou purificação a partir de culturas de microrganismos, recombinantes ou não, em matrazes com agitação ou em fermentadores, a preparação ou purificação a partir de culturas imobilizadas, a extração e/ou purificação a partir de células vivas (plantas, ...), B. Aplicação da enzima [0054] A enzima com atividade xilanolitica segundo a presente invenção, purificada ou não purificada, é particularmente adequada enquanto agente de melhoramento do pão. Os agentes de melhoramento do pão são produtos que podem melhorar ou aumentar a textura, o sabor, os efeitos anti-ressequimento, a moleza, a moleza do miolo durante o armazenamento, a frescura, a moldabilidade da massa de farinha e o volume do produto final. Preferencialmente, a dita enzima com atividade xilanolitica melhora a facilidade de manuseamento da massa de farinha e/ou aumenta o volume especifico do produto de padaria final. "Produto de padaria" visa incluir qualquer produto preparado a partir da massa de farinha, em particular um produto de padaria fermentado. A massa de farinha é obtida a partir de qualquer tipo de farinha ou cereal (baseada, por exemplo, no trigo, centeio, cevada, aveia ou milho). Preferencialmente, a massa de farinha é preparada com trigo ou com misturas incluindo trigo.

[0055] Um dos aspectos da presente invenção consiste em mostrar que as enzimas com atividade xilanolitica pertencentes à familia 8 podem ser vantajosamente utilizadas numa fórmula de melhoramento do pão.

[0056] Numa outra concretização da presente invenção, mostra-se que uma enzima com atividade xilanolitica pertencente às hidrolases de glicosideos da familia 8 aumenta o volume da carcaça de um produto de padaria.

[0057] Numa outra concretização da presente invenção, mostra-se que a quantidade de uma enzima da familia 8, com atividade xilanolitica, necessária para obter um resultado particular na cozedura é excepcionalmente menor que a quantidade geralmente utilizada quando se trabalha com enzimas disponíveis comercialmente.

[0058] Num aspecto adicional, a presente invenção respeita ao efeito aditivo da dita enzima com atividade xilanolitica com outras enzimas, em particular com uma alfa-amilase, preferencialmente uma alfa-amilase obtida a partir de Aspergillus oryzae. A dita enzima com atividade xilanolitica pode ser utilizada em combinação com outros agentes de melhoramento do pão tais como, mas não apenas, enzimas, emulsionantes, oxidantes, leite em pó, gorduras, açúcares, aminoácidos, sais, proteínas (glúten, locais de ligação de celulose), sendo tais agentes de melhoramento bem conhecidos dos técnicos da especialidade. Exemplos de enzimas são, embora não somente, as alfa- amilases, beta-amilases, amilases maltogênicas, xilanases, proteases, oxidase de glucose, oxido-redutases, glucanases, celulases, transglutaminases, isomerases, lipases, fosfolipases, pectinases, etc.

[0059] A enzima com atividade xilanolitica segundo a presente invenção pode ser utilizada sob diversas formas. Podem ser usadas diretamente no processo células que exprimem a enzima, tais como fermentos, fungos, bactérias Archea ou bactérias. A dita enzima pode ser utilizada como um extrato de células, um extrato de célula livre (isto é, porções das células hospedeiras que foram submetidas a uma ou mais etapas de rompimento, centrifugação e/ou extração) ou como uma proteína purificada. Qualquer uma das formas acima descritas pode ser utilizada em combinação com outra enzima sob qualquer uma das formas acima descritas. Tais células, extratos de células, extratos de células livres ou enzimas podem ser misturados com diferentes ingredientes, por exemplo, sob a forma de um pó seco ou de um granulado, em particular um granulado não desempoado, sob a forma de um liquido, por exemplo com estabilizadores tais como polióis, açúcares, ácidos orgânicos, álcoois açucarados, segundo métodos estabelecidos.

Exemplos Exemplo 1: Preparação da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a [0060] A xilanase obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis foi obtida como descrito (Collins et al, 2002, veja-se acima) a partir de uma cultura liquida de uma estirpe recombinante de Escherichia coli transformada com um vetor de ADN contendo o gene correspondente Exemplo 2; Preparação da xilanase a partir de Bacillus halodurans C-125 Estirpe bacteriana e condições de cultura [0061] Cultivou-se Bacillus halodurans C-125 (ATCC BAA- 125) em meio Alkaline Bacillus (10g/l de glucose, 5g/l de extrato de fermento (Difco), 10g/l de Bato Tryptone (Difco), lg/1 de K2HPO4, 0,2g/l de MgSC>4, 10g/l de Na2C0g) suplementada com 10g/l de xilana de madeira de bétula (Sigma) durante 72 horas a 37°C. Após centrifugação durante lh a 18000g e 4°C, o sobrenadante foi concentrado por precipitação com 80% de sulfato de amónio e ressuspenso em 20mM de MOPS a um pH de 8,0. Esta fração representa a fração de extrato bruto que será utilizada nos testes de cozedura.

Clonagem e sobre expressão do gene da xilanase Y

[0062] O ADN genómico foi extraído e purificado a partir de culturas com 16 horas, cultivadas a 37°C em meio Alkaline Bacillus modificado como acima descrito, com o kit de Purificação de ADN Genómico Wizard® (Promega). Baseado na sequência publicada (acesso GenBank/GenPept™ AP001514), todo o gene de xilanase Y foi amplificado por PCR utilizando-se polimerase VENT (Biolabs Inc, Bervely, MA, USA) com a sequência iniciadora sentido. 5' -GGGCATATGAAGAAAACGACAGAAGG TG-3', SEQ ID N°.: 1 contendo um local Nde I (sublinhado) e com a sequência iniciadora anti-sentido. 5' -GGCTCGAGCTAG TGTTCCTCTTCTTG- 3', SEQ ID N°.: 2 contendo um local Xho I (sublinhado) e o códon de terminação (a itálico).

[0063] Após 3 minutos de desnaturação inicial a 95°C, realizaram-se 25 ciclos de amplificação utilizando-se um aparelho Progene (Techne Cambridge, UK) . Cada ciclo incluiu desnaturação a 95°C durante 1 min, hibridização a 52°C durante 30 segundos e extensão a 72°C durante 1,5 minutos.

[0064] O produto de PCR foi clonado num vetor PCRScript Amp SK(+) (Stratagene), utilizando-se o procedimento recomendado pelo fornecedor, e utilizado para transformar as células ultracompetentes Kan Epicurian Coli XLlO-Gold® . A seleção azul-branco permitiu a seleção de colônias brancas que transportavam o fragmento de PCR. A preparação de plasmideo purificado (plasmideo Nucleospin, Macherey-Nagel) foi sequenciada num sequenciador de ADN ALF (Pharmacia Biotech). A sequenciação do fragmento inserido foi levada a cabo utilizando-se as sequências iniciadoras universais T7 e RP assim como as seguintes sequências de iniciação: 5' -GTGCGGATGAAGGAATGTC-3', SEQ ID N°.: 3 5' -GTATGGTCCATCAACAGAGG-3', SEQ ID N°.: 4 5' -GATGGCATAAAAATCCTGG-3'. SEQ ID N°.: 5 [0065] A sequência obtida era idêntica à sequência publicada que poderia ser obtida a partir do GenBank/genPept™ com o número de acesso AP001514.

[0066] O gene da xilanase Y, uma vez clonado no PCRScript Amp SK(+), foi então extirpado com Nde I e Xho I e ligado ao vetor de clonagem pET 22b(+) (Novagen). O plasmideo recombinante resultante foi transformado para células E. coli BL21 (DE3) (Stratagene).

Produção da xilanase Y recombinante da familia 8 a partir de Bacillus halodurans C-125.

[0067] Quinze ml de uma pré-cultura com cinco horas (37°C) das células E. coli BL21 (DE3) que transportam o gene da xilanase foram centrifugados a lOOOOg durante 1 minuto e o disco sedimentar foi ressuspenso em 900ml de caldo Terrific (12g/l de Bato triptona (Difco), 24g/l de extrato de fermento (Difco), 4ml/l de glicerol, 12,54g/l de K2HPO4, 2,31g/l de KH2PO4) contendo 200pg/ml de ampicilina num matraz de 3 litros com agitação. A cultura foi incubada a 37 °C e a 250rpm até se ter alcançado uma absorvência a 550nm entre 3-4, após o que a expressão da enzima foi induzida com lmM de isopropil-l-tio-p-galactopiranosideo. Após 15 horas adicionais de incubação a 37°C as células foram colhidas por centrifugação a 18000g durante 30 minutos a 4°C, ressuspensas em 50nM de BICINE contendo lOmM de NaCl, rompidas num rompedor de células pré-refrigerado (Constant Systems Ltd, Warwick, UK) a 28Kpsi e centrifugadas a 40.000g durante 30 minutos.

Produção da xilanase recombinante de Bacillus halodurans C-125, da familia 8 [0068] As células de uma pré-cultura com cinco horas (37°C) das células E. coli BL21 (DE3) que transportam o gene da xilanase foram colhidas por centrifugação a lO.OOOg durante 1 minuto e utilizadas para inocular cinco litros (15ml de pré-cultura por litro de cultura) de caldo Terrific (12g/l de Bato triptona (Difco), 24g/l de extrato de fermento (Difco), 4ml/l de glicerol, 12,54g/l de K2HPO4, 2,31g/l de KH2PO4) contendo 200pg/ml de ampicilina. A cultura foi incubada a 37°C e a 250rpm até se ter alcançado uma absorvência de 550nm entre 3-4, após o que a expressão da enzima foi induzida com lmM de isopropil-l-tio-β-galactopiranosideo. Após 4 horas adicionais de incubação a 37°C as células foram colhidas por centrifugação a 18000g durante 20 minutos a 4°C, ressuspensas em 20mM de MOPS (Sigma), rompidas num rompedor de células pré-refrigerado (Constant Systems Ltd.) a 28Kpsi e centrifugadas a 40.000g durante 30 minutos. O ADN cromossomático foi removido por tratamento com 0,2% de sulfato de protamina (Calbiochem) e centrifugação a 40.000g durante 30 minutos. Adicionaram-se, então, 25 unidades de benzonase (Merck, Darmstadt, Alemanha) e a solução foi utilizada em testes de cozedura.

Exemplo 3; Efeito da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a na cozedura de pãezinhos crocantes belgas [0069] Foram realizados testes de cozedura para demonstrar o efeito positivo da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a na cozedura. O efeito positivo foi avaliado pelo aumento do volume do pão por comparação com uma referência que não continha tal enzima.

[0070] A xilanase foi testada nos pãezinhos crocantes belgas que todos os dias são produzidos em grande escala na Bélgica. O processo descrito é bem conhecido por qualquer padeiro experiente e é obvio para um técnico na especialidade que os mesmos resultados podem ser obtidos utilizando-se equipamento de outros fornecedores.

[0071] Os ingredientes utilizados são enunciados no quadro 1 abaixo: Quadro 1 (1): Uma unidade de xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis é definida como a quantidade de enzimas necessárias para libertar lpmole de açúcar reduzido (expresso como x i1o se} a partir da xilana de madeira de bétula a 30QC e com um pH de 4,5 (Método Melson-Somogyi) [0072] Qs ingredientes forara misturados durante 2 minutos a baixa velocidade e durante 8 minutos a alta velocidade num misturador Diosna SP24 . A temperatura final da massa de farinha assim como as temperaturas de levedura e de delineamento foram de 25°C, Após descansar durante 15 minutos a 25°C, a massa de farinha voltou a ser trabalhada manualmente e descansou durante mais 10 minutos. Mais tarde, prepararam-se pedaços de massa de farinha com 2 kg que ficaram em delineamento durante 10 minutos. Qs pedaços de massa de farinha com 2 Kg foram divididos e preparados utilizando uma Eberhardt Optímat, Foram obtidos pedaços redondos de massa de farinha com 66g, Após um novo período de descanso de 5 minutos, os pedaços de massa de farinha foram cortados por pressão e submetidos a uma etapa final de delineamento durante 70 minutos. Os pedaços de massa de farinha foram cozidos a 230°C num forno com vapor MIWE Condo™ (Michael Wenz-Arnstein-Alemanha). Mediu-se o volume de 6 pâezinhos, utilizando-se o método do afastamento das sementes de colza habitualmente utilizado.

[0073] Os resultados são· apresentados no· quadro 2 abaixo: _____________________Quadro 2_____________________ [0074] Uma representação gráfica do efeito da xilanase é mostrada na figura 1.

[0075] Estes resultados mostram que a xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis tem um efeito positivo no volume do pão.

Exemplo 4: Comparação de quantidades de xilanase utilizada na cozedura [0076] A quantidade relativa de xilanases necessárias para se obter o mesmo efeito no volume que no teste dos pâezinhos crocantes belgas descrito no exemplo 3 foi comparada por eletroforese em gel de SDS-poIiacrilamida.

[0077] As xilanases testadas e os seus respectivos níveis de utilização na cozedura foram os seguintes: a xilanase obtida a partir de Pseudoa1teromonas haloplanktis TAH3a (30 unidades de P. Haloplanktis /100 kg de farinha); - a xilanase obtida a partir de Bacillus subtilis (Belase B210 (BELDEM S.A, Bélgica) — 3g/100 kg de farinha). Quantidades de enzimas correspondentes à quantidade necessária para tratar 0,333 kg e 0,166 kg de farinha, e resultando no mesmo aumento de volume, foram carregadas num gel para eletroforese em SDS-poliacrilamida "Ready Gel" (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) pré-vazado em 12% Tris HCL, e ensaiadas num dispositivo "Mini Protean II" (BIO-RAD) segundo o processo do fabricante. As proteínas foram coradas com azul de Coomassie utilizando um procedimento padrão.

[0078] Uma imagem do gel corado é mostrada na figura 2.

[0079] Pode concluir-se por esta imagem que a quantidade de xilanase obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a necessárias na cozedura é significativamente mais baixa comparativamente à outra.

Exemplo 5; Efeito da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a em pães argentinos [0080] Foram realizados testes de cozedura para demonstrar o efeito positivo das xilanases da família 8 na cozedura numa outra receita diferente da utilizada no exemplo 3, tal como, por exemplo, em pães argentinos. 0 efeito positivo foi avaliado pelo aumento do volume do pão comparado a uma referência que não continha a enzima e pela extensão do corte na superfície do pão.

[0081] As enzimas da invenção foram testadas nos pães argentinos que são tipicamente pães compridos que necessitam de um longo período de delineamento (17 horas a 20°C) . O processo descrito é bem conhecido por qualquer padeiro experiente e é óbvio para um técnico na especialidade que os mesmos resultados podem ser obtidos utilizando-se equipamento de outros fornecedores, [0082] Os ingredientes utilizados são enunciados no quadro 3 abaixo: Quadro 3 (1) : 0 melhorador padrão utilizado contém: alfa amilase fúngica (Fungamyl 75.000/ Novozymes} lg/100 kg de farinha/ 1Og de vitamina C, Azodicarbonamido 2g/100 kg de farinha.

Isto é um exemplo de um melhorador padrão. As quantidades absolutas e relativas de aditivos podem variar em função de uma adaptação local à farinha de trigo e ao processo. (2) : Uma unidade de xilanase é definida como a quantidade de enzimas necessárias para libertar lpmoie de açúcar reduzido (expresso como xilose) a partir da xilana de madeira de bétula a 3Q°C e com um pH de 4,5 (método liei son-Somogy i) .

[0083] Os ingredientes foram misturados durante 2 minutos a baixa velocidade e durante 1 minutos a alta velocidade num misturador Diosna SP24, A temperatura final da massa de farinha durante o descanso foi de 25°C, enquanto que durante o delineamento foi de 2Q°C. Após descansar durante 20 minutos a 25°C, a massa de farinha voltou a ser trabalhada manualmente e descansou durante 17 horas a 20°C durante o delineamento. Mais tarde, prepararam-se pedaços de massa de farinha com 2 kg que ficaram em delineamento durante 10 minutos. Os pedaços de massa de farinha com 0,35 Kg foram divididos e preparados utilizando um Bertrand R8/L8 (+/- 30 cm) e submetidos a uma etapa final de delineamento durante 17 horas. Os pedaços de massa de farinha foram cozidos a 210°C durante 3 0 min num forno com vapor MIWE Condo™ (Michael Wenz-Arnstein-Alemanha). Mediu-se o volume dos pães argentinos, utilizando-se o método do afastamento das sementes de colza habitualmente utilizado.

[0084] Os resultados são apresentados no quadro 4 abaixo: Quadro 4 [0085] Estes resultados mostram que a xilanase da família 8 tem um efeito positivo na confecção de pão com um longo periodo de delineamento a baixa temperatura (isto é, 20°C). A quantidade de enzima comercial (Bel'ase B210, vide acima) aqui utilizada é 3 vezes mais elevada do que a dosagem ótima requerida conforme se descreve no exemplo 3 para pâezinhos crocantes belgas, enquanto que a quantidade necessária de xilanase da família 8 permaneceu inalterada. Também existe uma diferença entre a concentração de enzimas necessárias para otimizar a extensão do corte e a necessária para um aumento de volume ótimo.

Exemplo 6; Efeito, na cozedura, de várias enzimas da invenção versus outras enzimas [0086] Foram realizados testes de cozedura para demonstrar o efeito positivo, na cozedura, de várias enzimas com atividade xilanolitica pertencentes às hidrolases de glicosideos da família 8. O efeito positivo foi avaliado pelo aumento de volume do pão comparativamente a uma referência que não continha tais enzimas assim como a uma preparação de enzimas comercial (Bel'ase B210, vide acima).

[0087] A xilanase obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a foi preparada e purificada como se descreve no exemplo 1. A xilanase Y obtida a partir de Bacillus halodurans C-125 foi preparada a partir de uma estirpe Escherichia coli recombinante como se descreve no exemplo 2.

[0088] O método utilizado para avaliar o desempenho das duas enzimas foi um pequeno teste de cozedura que consistiu na preparação de massa de farinha com lOOg de farinha.

[0089] O procedimento descrito é bem conhecido dos técnicos na especialidade e é óbvio que os mesmos resultados podem ser obtidos utilizando-se equipamento de outros fornecedores.

[0090] Os ingredientes utilizados são enunciados no quadro 5 abaixo: Quadro 5 (1): Uma unidade de xilanase é definida como a quantidade de enzimas necessárias para libertar l piriole de açúcar reduzido (expresso como xilose) a partir da xilana da madeira de bétula a 30°C e com um pH de 4,5 (método Nelson-Somogyi) .

Os ingredientes foram misturados durante 4,5 minutos num misturador National. Foram pesados 150g de pedaços de massa de farinha e ficaram a descansar durante 20 minutos a 25°C em caixas plásticas, As massas de farinha voltaram a ser trabalhadas durante mais 20 minutos. 0 tempo final de delineamento foi de 50 minutos a 36°C. Qs pedaços de massa de farinha foram, então, cozidos a 225°C durante 20 minutos. Mediu-se o volume dos pães, utilizando-se o método do afastamento das sementes de colza habitualmente utilizado.

[0091] Os resultados são apresentados no quadro 6 abaixo: Quadro 6 [0092] Estes resultados mostram que o efeito positivo das enzimas da invenção não está restringido à xilanase de Pseudóalteromonas haloplanktis TAH3a. Do mesmo modo, outras preparações de enzimas com atividade xilanolítica pertencentes â hidrolase de glicosídeo da família 8 podem melhorar as propriedades do pão (aqui demonstrado para a xilanase de Bacillus halodurans C-125, outros resultados não são mostrados}.

REIVINDICAÇÕES

Claims (17)

1. Composição de melhoramento de pão, para aumentar o volume da carcaça de um produto de padaria ou para aumentar a extensão do corte na superfície de um produto de padaria, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma enzima com atividade xilanolitica selecionada de entre o grupo constituído por hidrolases de glicosideo da familia 8.

2 . Composição de melhoramento de pão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a dita enzima hidrolisar com inversão de configuração.

3. Composição de melhoramento de pão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de a dita enzima ser uma xilanase obtida a partir de uma estirpe de Pseudoalteromonas haloplanktis.

4. Composição de melhoramento de pão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de a dita estirpe de Pseudoalteromonas haloplanktis ser a Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a e a xilanase preferivelmente obtida ter a sequência de aminoácidos da SEQ I NO:7.

5. Composição de melhoramento de pão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de a dita enzima ser uma xilanase obtida a partir de uma estirpe de Bacillus halodurans.

6. Composição de melhoramento de pão, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de a dita estirpe de Bacillus halodurans ser a Bacillus halodurans C-125 e a xilanase preferivelmente obtida ter a sequênia de aminoácidos da SEQ ID NO:8.

7. Composição de melhoramento de pão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de a dita composição de melhoramento compreender adicionalmente um outro agente de melhoramento de pão que é selecionado de entre uma lista constituída por outras enzimas, emulsionadores, oxidantes, leite em pó, gorduras, açúcares, aminoácidos, sais, proteínas (glúten, locais de ligação de celulose) ou suas misturas.

8. Composição de meloramento de pão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de as citadas outras enzimas serem selecionadas de entre uma lista constituída por alfa-amilases, beta-amilases, amilases maltogênicas, outras xilanases, proteases, oxidase de glucose, oxido-redutases, glucanases, celulases, transglutaminases, isomerases, lipases, fosfolipases, pectinases ou suas misturas.

9. Composição de melhoramento de pão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de a citada alfa-amilase ser uma alfa-amilase obtida a partir de Asperglllus oryzae.

10. Composição de melhoramento de pão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de a referida enzima com atividade xilanolítica estar presente como um extrato de células, um extrato de células livre ou como uma proteína purificada.

11. Composição de melhoramento de pão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizada pelo fato de a citada enzima com atividade xilanolítica ser misturada com outros ingredientes sob a forma de um pó seco ou de um granulado, em particular um granulado não desempoado, ou sob a forma de um líquido, preferencialmente com um ou mais estabilizadores tais como polióis, açúcares, ácidos orgânicos ou álcoois açucarados.

12. Método para preparar um produto de padaria, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de adicionar à massa de farinha do referido produto de padaria uma composição de melhoramento, conforme definida nas reivindicações de 1 a 11.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de a dita composição de melhoramento de pão ser adicionada durante a mistura da massa de farinha.

14. Método para aumentar o volume da carcaça de um produto de padaria, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de adicionar, durante a etapa da mistura da massa de farinha de tal produto de padaria, entre 25 e 12000 unidades de uma enzima com atividade xilanolitica, sendo que uma unidade de xilanase é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 μπιοίε de açúcar reduzido (expresso como xilose) a partir da xilana da madeira de bétula a 30°C e um pH de 4,5, sendo dita enzima selecionada a partir do grupo constituído das xilanases de hidrolase de glicosideo da familia 8.

15. Método para aumentar o volume da carcaça de um produto de padaria, ou para aumentar a extensão do corte na superfície de um produto de padaria, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de adicionar, durante a mistura da massa de farinha de tal produto de padaria entre 25 e 12000 unidades de uma enzima com atividade xilanolitica, sendo que uma unidade de xilanase é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 pmole de açúcar reduzido (expresso como xilose) a partir da xilana da madeira de bétula a 30°C e um pH de 4,5, a referida enzima sendo selecionada do grupo constituído por xilanases de hidrolase de glicosideo da família 8, de hidrolases de glicosídeos da familia 8 que hidrolisam com inversão de configuração e/ou de uma combinação das mesmas.

16. Produto de padaria, caracterizado pelo fato de ser obtido pelo método definido em qualquer uma das reivindicações de 12 a 15.

17. Produto de padaria, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser um pão argentino com uma extensão de corte aumentada.